Wykonywanie chromatografii cienkowarstwowej 1D

1. Płyty TLC

1. Typowymi adsorbentami TLC są żel krzemionkowy, tlenek glinu i celuloza. Płytki TLC są dostępne na rynku o różnych właściwościach. Wybierz płytkę TLC i przytnij ją do odpowiedniego rozmiaru (około 5 cm x 5 cm jest wystarczające do większości zastosowań). W przypadku płytek TLC na szklanym podłożu naciąć szkło za pomocą linijki i noża do szkła, a następnie ostrożnie rozbić wzdłuż linii.

2. Plamienie

1. Rozpuścić próbkę w odpowiednim rozpuszczalniku, aby uzyskać około 1% roztwór. Jeśli to możliwe, rozpuszczalnik powinien być niepolarny. Frakcje chromatografii kolumnowej i inne rozcieńczone roztwory mogą być stosowane bez rozcieńczania, jeżeli substancja rozpuszczona występuje w stężeniu między 0,2% a 2,0%.
2. Zaznacz linię bazową ołówkiem około 1,0 cm od spodu płytki. Umieść plamy w odległości co najmniej 1,0 cm od krawędzi talerza i odpowiednio je oznacz.
3. Plamy można nakładać za pomocą szklanej kapilary. Aby dostrzec płytkę TLC, zanurz kapilatę w roztworze, aby wciągnąć niewielką ilość płynu. Delikatnie dotknij końcówki w żądane miejsce na płytce TLC i natychmiast ją wyjmij.
4. Alternatywnie, nakładaj plamy za pomocą strzykawki o pojemności mikrolitrów, dostarczając około 1 μl roztworu na każdą aplikację.
5. Plamki mogą być nanoszone kolejno w każdym miejscu, uważając, aby nie naruszyć powierzchni adsorbentu przez spottera. Pozostawić rozpuszczalnik do wyschnięcia pomiędzy aplikacjami.

3. Wybór rozpuszczalnika rozwijającego

1. Dla dobrej separacji zaleca się stosowanie jak najmniej polarnego rozpuszczalnika. Typowe rozpuszczalniki do TLC to heksan, octan etylu, dichlorometan i metanol (Tabela 1).
2. Wygodnym sposobem na znalezienie odpowiedniej fazy ruchomej jest wykrycie płytki TLC z próbką. Nałóż wystarczającą ilość rozpuszczalnika bezpośrednio na miejsce, aby utworzyć krąg rozpuszczalnika o średnicy 1–2 cm. Zaznacz obwód koła. Po wizualizacji odpowiedni rozpuszczalnik pokaże dobrze oddzielone pierścienie, przy czym najbardziej zewnętrzny pierścień będzie znajdował się około 50% odległości od środka do czoła rozpuszczalnika.
3. Może być konieczne dostosowanie polarności fazy ruchomej poprzez wybór dwóch mieszalnych rozpuszczalników i przetestowanie ich w różnych proporcjach. Przykładami powszechnych mieszanin są heksany z octanem etylu i dichlorometan z metanolem.

4. Rozwój

1. Umieścić nakrapianą płytkę TLC w komorze wywoływania zawierającej odpowiedni rozpuszczalnik wywołujący. Linia rozpuszczalnika powinna znajdować się poniżej linii podstawowej zaznaczonej na płytce TLC.
2. Komora wywoływania może być słoikiem z pokrywką lub zlewką pokrytą folią aluminiową lub folią z tworzywa sztucznego. Użyj najmniejszego dostępnego pojemnika, który pomieści płytkę TLC.
3. Nie dopuścić do tego, aby rozpuszczalnik dotarł do górnej krawędzi płytki. Gdy czoło rozpuszczalnika (granica, na której kończy się mokra część adsorbentu) znajduje się w odległości 5–10 mm od górnej części płytki, wyjmij płytkę TLC z komory wywoływania i zaznacz ołówkiem czoło rozpuszczalnika, zanim rozpuszczalnik wyschnie.

5. Wizualizacja

1. Kolorowe plamy można natychmiast zwizualizować i oznaczyć ołówkiem. Często plamy nie są widoczne i dlatego muszą być uwidocznione inną metodą.
2. Często adsorbent TLC zawiera wskaźnik fluorescencyjny. Plamy można wizualizować za pomocą ręcznej lampy ultrafioletowej (UV). Związki, które wygaszają fluorescencję, pojawią się jako ciemne plamy, gdy płytka zostanie naświetlana krótkofalowym (254 nm) światłem UV. Związki fluorescencyjne będą wytwarzać jasne plamy po naświetlaniu światłem UV o odpowiedniej długości fali. Zaznacz środek każdego miejsca ołówkiem.
3. Plamy można również uwidocznić, nakładając odczynnik lub barwnik do wizualizacji na płytkę TLC. Odczynnik wizualizujący można nakładać zanurzając płytkę w odczynniku lub przecierając płytkę wacikiem nasączonym odczynnikiem niekorozyjnym.
4. 20% roztwór kwasu fosfomolibdenowego w etanolu jest przydatny do wizualizacji większości związków organicznych. Plamy pojawiają się po podgrzaniu talerza opalarką lub w piekarniku.
5. Inne odczynniki mogą być używane do wizualizacji określonych klas związków. Na przykład odczynnik ninhydryny jest używany do wizualizacji aminokwasów, a 2,4-dinitrofenylohydrazyna do aldehydów i ketonów.

6. Analiza

1. Współczynnik opóźnienia (R_f) to stosunek odległości, jaką związek pokonuje w górę płytki TLC, do odległości, jaką pokonuje rozpuszczalnik. Można to określić, mierząc odległość od linii podstawowej do środka plamki i dzieląc wartość przez odległość od linii podstawowej do czoła rozpuszczalnika.
   
2. R_f związku jest charakterystyczny dla jego właściwości fizycznych i zależy od takich czynników, jak temperatura, wielkość próbki oraz grubość i aktywność adsorbentu, temperatura i wielkość próbki.
3. Aby potwierdzić, że nieznany jest identyczny ze znanym związkiem, na tej samej płytce TLC należy dostrzec wzorzec. Identyczne substancje będą miały tę samą cechę R_f.