2.13: Wykonywanie chromatografii cienkowarstwowej 1D

1. Płyty TLC

1. Typowymi adsorbentami TLC są żel krzemionkowy, tlenek glinu i celuloza. Płytki TLC są dostępne na rynku o różnych właściwościach. Wybierz płytkę TLC i przytnij ją do odpowiedniego rozmiaru (około 5 cm x 5 cm jest wystarczające do większości zastosowań). W przypadku płytek TLC na szklanym podłożu naciąć szkło za pomocą linijki i noża do szkła, a następnie ostrożnie rozbić wzdłuż linii.

2. Plamienie

1. Rozpuścić próbkę w odpowiednim rozpuszczalniku, aby uzyskać około 1% roztwór. Jeśli to możliwe, rozpuszczalnik powinien być niepolarny. Frakcje chromatografii kolumnowej i inne rozcieńczone roztwory mogą być stosowane bez rozcieńczania, jeżeli substancja rozpuszczona występuje w stężeniu między 0,2% a 2,0%.
2. Zaznacz linię bazową ołówkiem około 1,0 cm od spodu płytki. Umieść plamy w odległości co najmniej 1,0 cm od krawędzi talerza i odpowiednio je oznacz.
3. Plamy można nakładać za pomocą szklanej kapilary. Aby dostrzec płytkę TLC, zanurz kapilatę w roztworze, aby wciągnąć niewielką ilość płynu. Delikatnie dotknij końcówki w żądane miejsce na płytce TLC i natychmiast ją wyjmij.
4. Alternatywnie, nakładaj plamy za pomocą strzykawki o pojemności mikrolitrów, dostarczając około 1 μl roztworu na każdą aplikację.
5. Plamki mogą być nanoszone kolejno w każdym miejscu, uważając, aby nie naruszyć powierzchni adsorbentu przez spottera. Pozostawić rozpuszczalnik do wyschnięcia pomiędzy aplikacjami.

3. Wybór rozpuszczalnika rozwijającego

1. Dla dobrej separacji zaleca się stosowanie jak najmniej polarnego rozpuszczalnika. Typowe rozpuszczalniki do TLC to heksan, octan etylu, dichlorometan i metanol (Tabela 1).
2. Wygodnym sposobem na znalezienie odpowiedniej fazy ruchomej jest wykrycie płytki TLC z próbką. Nałóż wystarczającą ilość rozpuszczalnika bezpośrednio na miejsce, aby utworzyć krąg rozpuszczalnika o średnicy 1–2 cm. Zaznacz obwód koła. Po wizualizacji odpowiedni rozpuszczalnik pokaże dobrze oddzielone pierścienie, przy czym najbardziej zewnętrzny pierścień będzie znajdował się około 50% odległości od środka do czoła rozpuszczalnika.
3. Może być konieczne dostosowanie polarności fazy ruchomej poprzez wybór dwóch mieszalnych rozpuszczalników i przetestowanie ich w różnych proporcjach. Przykładami powszechnych mieszanin są heksany z octanem etylu i dichlorometan z metanolem.

4. Rozwój

1. Umieścić nakrapianą płytkę TLC w komorze wywoływania zawierającej odpowiedni rozpuszczalnik wywołujący. Linia rozpuszczalnika powinna znajdować się poniżej linii podstawowej zaznaczonej na płytce TLC.
2. Komora wywoływania może być słoikiem z pokrywką lub zlewką pokrytą folią aluminiową lub folią z tworzywa sztucznego. Użyj najmniejszego dostępnego pojemnika, który pomieści płytkę TLC.
3. Nie dopuścić do tego, aby rozpuszczalnik dotarł do górnej krawędzi płytki. Gdy czoło rozpuszczalnika (granica, na której kończy się mokra część adsorbentu) znajduje się w odległości 5–10 mm od górnej części płytki, wyjmij płytkę TLC z komory wywoływania i zaznacz ołówkiem czoło rozpuszczalnika, zanim rozpuszczalnik wyschnie.

5. Wizualizacja

1. Kolorowe plamy można natychmiast zwizualizować i oznaczyć ołówkiem. Często plamy nie są widoczne i dlatego muszą być uwidocznione inną metodą.
2. Często adsorbent TLC zawiera wskaźnik fluorescencyjny. Plamy można wizualizować za pomocą ręcznej lampy ultrafioletowej (UV). Związki, które wygaszają fluorescencję, pojawią się jako ciemne plamy, gdy płytka zostanie naświetlana krótkofalowym (254 nm) światłem UV. Związki fluorescencyjne będą wytwarzać jasne plamy po naświetlaniu światłem UV o odpowiedniej długości fali. Zaznacz środek każdego miejsca ołówkiem.
3. Plamy można również uwidocznić, nakładając odczynnik lub barwnik do wizualizacji na płytkę TLC. Odczynnik wizualizujący można nakładać zanurzając płytkę w odczynniku lub przecierając płytkę wacikiem nasączonym odczynnikiem niekorozyjnym.
4. 20% roztwór kwasu fosfomolibdenowego w etanolu jest przydatny do wizualizacji większości związków organicznych. Plamy pojawiają się po podgrzaniu talerza opalarką lub w piekarniku.
5. Inne odczynniki mogą być używane do wizualizacji określonych klas związków. Na przykład odczynnik ninhydryny jest używany do wizualizacji aminokwasów, a 2,4-dinitrofenylohydrazyna do aldehydów i ketonów.

6. Analiza

1. Współczynnik opóźnienia (R_f) to stosunek odległości, jaką związek pokonuje w górę płytki TLC, do odległości, jaką pokonuje rozpuszczalnik. Można to określić, mierząc odległość od linii podstawowej do środka plamki i dzieląc wartość przez odległość od linii podstawowej do czoła rozpuszczalnika.
   
2. R_f związku jest charakterystyczny dla jego właściwości fizycznych i zależy od takich czynników, jak temperatura, wielkość próbki oraz grubość i aktywność adsorbentu, temperatura i wielkość próbki.
3. Aby potwierdzić, że nieznany jest identyczny ze znanym związkiem, na tej samej płytce TLC należy dostrzec wzorzec. Identyczne substancje będą miały tę samą cechę R_f.

Chromatografia cienkowarstwowa lub TLC to metoda chromatograficzna stosowana do rozdzielania mieszanin związków nielotnych, powszechnie stosowana w chemii organicznej.

TLC wykonuje się na płycie z podłożem szklanym lub plastikowym. Linia bazowa jest zaznaczona na tabliczce wraz z etykietami. Badaną mieszaninę i związki odniesienia rozpuszcza się w odpowiednim rozpuszczalniku i nakłada w małych miejscach w pobliżu dolnej krawędzi płytki TLC. Talerz umieszcza się w słoiku, a rozpuszczalnik? (Faza ruchoma) ?oddziela mieszaninę na podstawie właściwości fizycznych każdego składnika.

Pomimo faktu, że bardziej wymagające użycia instrumentów techniki separacji mają większą zdolność rozdzielczą niż TLC, to właśnie szybkość i niski koszt sprawiają, że TLC jest atrakcyjną techniką analizy jakościowej w locie. Ten film zademonstruje przygotowanie, działanie i analizę chromatografii cienkowarstwowej.

Techniki chromatograficzne obejmują fazę stacjonarną i ruchomą. W TLC faza stacjonarna składa się z cienkiej warstwy materiału przymocowanej do płytki. Materiał jest substancją polarną, taką jak żel krzemionkowy. Faza ruchoma to niepolarna ciecz, która przemieszcza się w górę warstwy adsorpcyjnej poprzez działanie kapilarne. Gdy faza ruchoma przesuwa się w górę płytki, ciągnie się wzdłuż składników każdego punktu, które są następnie rozdzielane na podstawie polaryzacji.

Związki, które są mniej polarne, spędzą więcej czasu w fazie ruchomej, gdy są one wciągane na płytkę. Związki, które są bardziej polarne, są bardziej przyciągane do fazy stacjonarnej i dlatego nie będą się przemieszczać tak daleko w górę płytki.

Separacja odbywa się w pojemniku do wywoływania. Mogą to być słoiki z pokrywkami lub zlewki pokryte folią aluminiową. Użyj najmniejszego dostępnego pojemnika, który pomieści płytkę TLC, aby przyspieszyć separację.

Faza ruchoma lub rozpuszczalnik rozwijający się powinna być tak niepolarna, jak to tylko możliwe, aby zapewnić dobrą separację. Pokazano tutaj serię eluotropową dla żelu krzemionkowego, listę typowych faz ruchomych w kolejności zwiększania mocy ekstrakcyjnej.

Jednocześnie można testować kilka faz ruchomych. Rozpuszczoną próbkę należy kilkakrotnie umieścić na czystej płytce w odległości co najmniej 2 cm od siebie. Nałóż wystarczającą ilość fazy ruchomej do każdego miejsca, aby utworzyć okrąg o średnicy 1-2 cm.

Zaznacz odległość, jaką pokonuje faza ruchoma. Jeśli faza ruchoma nie jest wystarczająco polarna, próbka pozostanie blisko miejsca początkowego. Jeśli faza ruchoma jest zbyt polarna, cała próbka będzie migrować wraz z czołem rozpuszczalnika. Odpowiednia faza ruchoma pokaże dobrze oddzielone pierścienie, przy czym najbardziej zewnętrzny pierścień będzie znajdował się około 50% odległości od czoła rozpuszczalnika.

W razie potrzeby dwie mieszające się fazy ruchome można mieszać w różnych proporcjach, aby uzyskać pożądane właściwości. W tym przypadku mieszanina octanu etylu i heksanu w stosunku 1:1 była zbyt polarna, ale mieszanina w stosunku 1:20 została odpowiednio oddzielona.

Po wybraniu fazy ruchomej jesteś gotowy do rozpoczęcia opracowywania płytki.

Aby rozpocząć procedurę, przytnij dostępną w handlu płytkę TLC do żądanego rozmiaru. Jeśli talerz ma szklany podkład, naciąć go nożem do szkła i ostrożnie przełamać wzdłuż linii.

Ołówkiem zaznacz linię bazową około 1 cm od spodu płytki. Zaznacz miejsce, w którym próbki zostaną zauważone wzdłuż linii. Upewnij się, że plamy znajdują się co najmniej 1 cm od krawędzi i 3 mm od siebie. Oznacz je odpowiednio.

Próbki stałe muszą być rozpuszczone w odpowiednim rozpuszczalniku. Typowe rozpuszczalniki to heksany, octan etylu lub dichlorometan. Użyj najmniej polarnego rozpuszczalnika, który rozpuści próbkę.

Pobrać mieszaninę próbki/rozpuszczalnika za pomocą szklanej kapilary. Delikatnie dotknij końcówki w żądane miejsce na płytce TLC i natychmiast ją wyjmij. Ważne jest, aby nie zakłócać fazy stacjonarnej.

Utrzymuj miejsce tak małe, jak to możliwe, ponieważ prowadzi to do lepszej separacji. Jeśli potrzebna jest większa próbka, plamki mogą być nakładane kolejno w każdym miejscu. Pozostawić rozpuszczalnik do wyschnięcia między aplikacjami. Strumień powietrza może być używany do suszenia mniej lotnych rozpuszczalników.

Płytka TLC jest teraz gotowa do opracowania. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej na dnie słoika, aby zwiększyć ciśnienie pary. Dodaj fazę ruchomą do głębokości, która nie osiąga linii podstawowej. Zakręć słoik, gdy nie jest używany, aby opary rozpuszczalnika nie wydostawały się na zewnątrz.

Ostrożnie umieść nakrapianą płytkę TLC w słoiku do wywoływania. Upewnij się, że faza mobilna znajduje się poniżej linii bazowej. Obserwuj postępy na froncie rozpuszczalników? Krawędź natarcia fazy mobilnej? ponieważ będzie się szybko przesuwać w górę talerza.

Nie pozwól, aby faza ruchoma dotarła do górnej krawędzi płytki, ponieważ pasma próbki zaczną się rozszerzać poprzez dyfuzję. Gdy czoło rozpuszczalnika zbliży się do góry, wyjmij płytkę z komory wywoływania i zaznacz czoło rozpuszczalnika ołówkiem, zanim rozpuszczalnik wyschnie.

Jeśli związki nie są zabarwione, do wizualizacji plam można użyć lampy UV. Związek zablokuje fluorescencję tła płytki. Ustaw lampę na ustawienie fali krótkiej i oświetl suchą płytę. Za pomocą ołówka obrysuj wszelkie miejsca widoczne pod lampą. Za pomocą ołówka obrysuj wszelkie miejsca widoczne pod lampą.

Inną możliwą techniką wizualizacji jest użycie nadmanganianu potasu, środka utleniającego. Za pomocą pęsety zanurz płytkę w plamie z nadmanganianu.

Usuń i zetrzyj nadmiar roztworu ręcznikiem papierowym. W dygestorium ostrożnie podgrzej płytę opalarką, aby uwidocznić plamy. Użyj ołówka, aby zaznaczyć wszelkie pojawiające się miejsca.

Po wizualizacji plam interesującą nas substancję można porównać ze standardami, jak pokazano tutaj. W tym przykładzie niewiadomą jest 1,3-difenylopropynon, element budulcowy syntezy organicznej. Porównując pasmo ze znanym wzorcem i chlorkiem benzoilu, jednym z materiałów wyjściowych, można zidentyfikować produkt.

Współczynnik opóźnienia lub Rf służy do identyfikacji nieznanego związku. Rf to stosunek odległości, jaką związek pokonuje w górę płytki TLC, do odległości, jaką pokonuje faza ruchoma. Współczynnik określa się, mierząc odległość od linii podstawowej do punktu i dzieląc przez odległość od linii podstawowej do czoła rozpuszczalnika.

Rf danego związku zależy od warunków zastosowanych w eksperymencie, w tym od wyboru rozpuszczalnika, grubości i aktywności adsorbentu, temperatury i wielkości próbki. Należy zadbać o to, aby czynniki te były spójne między eksperymentami.

Istnieje kilka zastosowań chromatografii cienkowarstwowej.

W tym przykładzie zbadano zawartość triacyloglicerydów w gruczołach łojowych nietoperzy. Frakcja powierzchniowa lipidów została najpierw oddzielona przez polarność na płytce TLC. Pasmo triacyloglicerydu zostało następnie usunięte z płytki za pomocą szpatułki. Proszek krzemionkowy przeniesiono do probówki mikrowirówkowej z rozpuszczalnikiem. Po odwirowaniu fazę stacjonarną pozostawiono na dnie probówki, podczas gdy związki pozostały rozpuszczone w rozpuszczalniku. Triacyloglicerydy zostały następnie oddzielone przez inną właściwość fizyczną. W tym przypadku drugim wymiarem separacji była wielkość molekularna.

TLC może być również stosowany do monitorowania postępu reakcji chemicznej. W tym przykładzie materiał wyjściowy reakcji został użyty jako wzorzec i przebiegał wraz z roztworem reakcyjnym na płytce TLC. Proces ten powtarzano w określonych odstępach czasu w trakcie reakcji. W miarę postępu reakcji pasmo materiału wyjściowego zmniejszało się, a pasmo produktu powiększało się. Gdy nie nastąpiła żadna zmiana pasm lub cały materiał wyjściowy został zużyty, reakcja była zakończona. ?

Wreszcie, płytki TLC mogą być używane w testach biologicznych. W tym przykładzie związki oddzielono od koniczyny czerwonej za pomocą TLC. Każda prążek została następnie umieszczona na bakteriach rosnących na płytkach agarowych. Cząsteczki, które wykazywały zahamowany wzrost bakterii, były dalej analizowane pod kątem ich właściwości przeciwdrobnoustrojowych.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do chromatografii cienkowarstwowej. Powinieneś teraz zrozumieć teorię leżącą u podstaw separacji, jak wybrać odpowiednią fazę ruchomą do swojego eksperymentu oraz jak ustawić i obsługiwać płytkę TLC. Dzięki za oglądanie!