Wykonywanie chromatografii cienkowarstwowej 1D

Chromatografia cienkowarstwowa lub TLC to metoda chromatograficzna stosowana do rozdzielania mieszanin związków nielotnych, powszechnie stosowana w chemii organicznej.

TLC wykonuje się na płycie z podłożem szklanym lub plastikowym. Linia bazowa jest zaznaczona na tabliczce wraz z etykietami. Badaną mieszaninę i związki odniesienia rozpuszcza się w odpowiednim rozpuszczalniku i nakłada w małych miejscach w pobliżu dolnej krawędzi płytki TLC. Talerz umieszcza się w słoiku, a rozpuszczalnik? (Faza ruchoma) ?oddziela mieszaninę na podstawie właściwości fizycznych każdego składnika.

Pomimo faktu, że bardziej wymagające użycia instrumentów techniki separacji mają większą zdolność rozdzielczą niż TLC, to właśnie szybkość i niski koszt sprawiają, że TLC jest atrakcyjną techniką analizy jakościowej w locie. Ten film zademonstruje przygotowanie, działanie i analizę chromatografii cienkowarstwowej.

Techniki chromatograficzne obejmują fazę stacjonarną i ruchomą. W TLC faza stacjonarna składa się z cienkiej warstwy materiału przymocowanej do płytki. Materiał jest substancją polarną, taką jak żel krzemionkowy. Faza ruchoma to niepolarna ciecz, która przemieszcza się w górę warstwy adsorpcyjnej poprzez działanie kapilarne. Gdy faza ruchoma przesuwa się w górę płytki, ciągnie się wzdłuż składników każdego punktu, które są następnie rozdzielane na podstawie polaryzacji.

Związki, które są mniej polarne, spędzą więcej czasu w fazie ruchomej, gdy są one wciągane na płytkę. Związki, które są bardziej polarne, są bardziej przyciągane do fazy stacjonarnej i dlatego nie będą się przemieszczać tak daleko w górę płytki.

Separacja odbywa się w pojemniku do wywoływania. Mogą to być słoiki z pokrywkami lub zlewki pokryte folią aluminiową. Użyj najmniejszego dostępnego pojemnika, który pomieści płytkę TLC, aby przyspieszyć separację.

Faza ruchoma lub rozpuszczalnik rozwijający się powinna być tak niepolarna, jak to tylko możliwe, aby zapewnić dobrą separację. Pokazano tutaj serię eluotropową dla żelu krzemionkowego, listę typowych faz ruchomych w kolejności zwiększania mocy ekstrakcyjnej.

Jednocześnie można testować kilka faz ruchomych. Rozpuszczoną próbkę należy kilkakrotnie umieścić na czystej płytce w odległości co najmniej 2 cm od siebie. Nałóż wystarczającą ilość fazy ruchomej do każdego miejsca, aby utworzyć okrąg o średnicy 1-2 cm.

Zaznacz odległość, jaką pokonuje faza ruchoma. Jeśli faza ruchoma nie jest wystarczająco polarna, próbka pozostanie blisko miejsca początkowego. Jeśli faza ruchoma jest zbyt polarna, cała próbka będzie migrować wraz z czołem rozpuszczalnika. Odpowiednia faza ruchoma pokaże dobrze oddzielone pierścienie, przy czym najbardziej zewnętrzny pierścień będzie znajdował się około 50% odległości od czoła rozpuszczalnika.

W razie potrzeby dwie mieszające się fazy ruchome można mieszać w różnych proporcjach, aby uzyskać pożądane właściwości. W tym przypadku mieszanina octanu etylu i heksanu w stosunku 1:1 była zbyt polarna, ale mieszanina w stosunku 1:20 została odpowiednio oddzielona.

Po wybraniu fazy ruchomej jesteś gotowy do rozpoczęcia opracowywania płytki.

Aby rozpocząć procedurę, przytnij dostępną w handlu płytkę TLC do żądanego rozmiaru. Jeśli talerz ma szklany podkład, naciąć go nożem do szkła i ostrożnie przełamać wzdłuż linii.

Ołówkiem zaznacz linię bazową około 1 cm od spodu płytki. Zaznacz miejsce, w którym próbki zostaną zauważone wzdłuż linii. Upewnij się, że plamy znajdują się co najmniej 1 cm od krawędzi i 3 mm od siebie. Oznacz je odpowiednio.

Próbki stałe muszą być rozpuszczone w odpowiednim rozpuszczalniku. Typowe rozpuszczalniki to heksany, octan etylu lub dichlorometan. Użyj najmniej polarnego rozpuszczalnika, który rozpuści próbkę.

Pobrać mieszaninę próbki/rozpuszczalnika za pomocą szklanej kapilary. Delikatnie dotknij końcówki w żądane miejsce na płytce TLC i natychmiast ją wyjmij. Ważne jest, aby nie zakłócać fazy stacjonarnej.

Utrzymuj miejsce tak małe, jak to możliwe, ponieważ prowadzi to do lepszej separacji. Jeśli potrzebna jest większa próbka, plamki mogą być nakładane kolejno w każdym miejscu. Pozostawić rozpuszczalnik do wyschnięcia między aplikacjami. Strumień powietrza może być używany do suszenia mniej lotnych rozpuszczalników.

Płytka TLC jest teraz gotowa do opracowania. Umieść kawałek bibuły filtracyjnej na dnie słoika, aby zwiększyć ciśnienie pary. Dodaj fazę ruchomą do głębokości, która nie osiąga linii podstawowej. Zakręć słoik, gdy nie jest używany, aby opary rozpuszczalnika nie wydostawały się na zewnątrz.

Ostrożnie umieść nakrapianą płytkę TLC w słoiku do wywoływania. Upewnij się, że faza mobilna znajduje się poniżej linii bazowej. Obserwuj postępy na froncie rozpuszczalników? Krawędź natarcia fazy mobilnej? ponieważ będzie się szybko przesuwać w górę talerza.

Nie pozwól, aby faza ruchoma dotarła do górnej krawędzi płytki, ponieważ pasma próbki zaczną się rozszerzać poprzez dyfuzję. Gdy czoło rozpuszczalnika zbliży się do góry, wyjmij płytkę z komory wywoływania i zaznacz czoło rozpuszczalnika ołówkiem, zanim rozpuszczalnik wyschnie.

Jeśli związki nie są zabarwione, do wizualizacji plam można użyć lampy UV. Związek zablokuje fluorescencję tła płytki. Ustaw lampę na ustawienie fali krótkiej i oświetl suchą płytę. Za pomocą ołówka obrysuj wszelkie miejsca widoczne pod lampą. Za pomocą ołówka obrysuj wszelkie miejsca widoczne pod lampą.

Inną możliwą techniką wizualizacji jest użycie nadmanganianu potasu, środka utleniającego. Za pomocą pęsety zanurz płytkę w plamie z nadmanganianu.

Usuń i zetrzyj nadmiar roztworu ręcznikiem papierowym. W dygestorium ostrożnie podgrzej płytę opalarką, aby uwidocznić plamy. Użyj ołówka, aby zaznaczyć wszelkie pojawiające się miejsca.

Po wizualizacji plam interesującą nas substancję można porównać ze standardami, jak pokazano tutaj. W tym przykładzie niewiadomą jest 1,3-difenylopropynon, element budulcowy syntezy organicznej. Porównując pasmo ze znanym wzorcem i chlorkiem benzoilu, jednym z materiałów wyjściowych, można zidentyfikować produkt.

Współczynnik opóźnienia lub Rf służy do identyfikacji nieznanego związku. Rf to stosunek odległości, jaką związek pokonuje w górę płytki TLC, do odległości, jaką pokonuje faza ruchoma. Współczynnik określa się, mierząc odległość od linii podstawowej do punktu i dzieląc przez odległość od linii podstawowej do czoła rozpuszczalnika.

Rf danego związku zależy od warunków zastosowanych w eksperymencie, w tym od wyboru rozpuszczalnika, grubości i aktywności adsorbentu, temperatury i wielkości próbki. Należy zadbać o to, aby czynniki te były spójne między eksperymentami.

Istnieje kilka zastosowań chromatografii cienkowarstwowej.

W tym przykładzie zbadano zawartość triacyloglicerydów w gruczołach łojowych nietoperzy. Frakcja powierzchniowa lipidów została najpierw oddzielona przez polarność na płytce TLC. Pasmo triacyloglicerydu zostało następnie usunięte z płytki za pomocą szpatułki. Proszek krzemionkowy przeniesiono do probówki mikrowirówkowej z rozpuszczalnikiem. Po odwirowaniu fazę stacjonarną pozostawiono na dnie probówki, podczas gdy związki pozostały rozpuszczone w rozpuszczalniku. Triacyloglicerydy zostały następnie oddzielone przez inną właściwość fizyczną. W tym przypadku drugim wymiarem separacji była wielkość molekularna.

TLC może być również stosowany do monitorowania postępu reakcji chemicznej. W tym przykładzie materiał wyjściowy reakcji został użyty jako wzorzec i przebiegał wraz z roztworem reakcyjnym na płytce TLC. Proces ten powtarzano w określonych odstępach czasu w trakcie reakcji. W miarę postępu reakcji pasmo materiału wyjściowego zmniejszało się, a pasmo produktu powiększało się. Gdy nie nastąpiła żadna zmiana pasm lub cały materiał wyjściowy został zużyty, reakcja była zakończona. ?

Wreszcie, płytki TLC mogą być używane w testach biologicznych. W tym przykładzie związki oddzielono od koniczyny czerwonej za pomocą TLC. Każda prążek została następnie umieszczona na bakteriach rosnących na płytkach agarowych. Cząsteczki, które wykazywały zahamowany wzrost bakterii, były dalej analizowane pod kątem ich właściwości przeciwdrobnoustrojowych.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do chromatografii cienkowarstwowej. Powinieneś teraz zrozumieć teorię leżącą u podstaw separacji, jak wybrać odpowiednią fazę ruchomą do swojego eksperymentu oraz jak ustawić i obsługiwać płytkę TLC. Dzięki za oglądanie!