Produkcja retrowirusa z defektem replikacyjnym poprzez przejściową transfekcję komórek 293T

Jesteśmy w Instytucie Badań nad Onkologią Molekularną w Tufts New England Medical Center. Nazywam się Christina Lesco i jestem stypendystką podoktorską w laboratorium dr. Ricka Vana. Nasz zespół zajmuje się badaniem ludzkiej leukemii mielogennej, CML oraz chorób podobnych do CML.

Modelujemy tę ludzką chorobę u myszy, wprowadzając ludzki onkogen za pomocą wektora retrowirusowego. Pierwszym krokiem w celu wprowadzenia tego ludzkiego onkogenu do komórek myszy jest wytworzenie samego wirusa. Następnym krokiem będzie właściwe mianowanie wirusa.

Oto moja płytka z zapasem komórek 293T. Muszę wypłukać medium za pomocą PBS. Komórki 293T są komórkami adherentnymi, jednak nie przylegają bardzo silnie, więc każdy ruch musi być wykonany bardzo delikatnie. Po wypłukaniu zastąpimy PBS trypsyną.

Aby zneutralizować komórki z płytki, musimy umieścić ją z powrotem w inkubatorze na około trzy minuty. Po tych dwóch lub trzech minutach komórki będą znajdować się w zawiesinie. Następnie dodamy kilka kolejnych ml zwykłego medium.

To zneutralizuje trypsynę. Na tym etapie pipetujemy zawiesinę góra-dół, aby upewnić się, że wszystkie komórki są dobrze zawieszone; przenosimy zawiesinę do probówki 50 ml, a następnie odliczamy komórki w obecności błękitu trypanu, używając komory countingowej do ręcznego zliczenia. Przygotowuję teraz rozcieńczenie zgodnie z obliczeniami, a następnie wysieję 3×10⁶ komórek na płytkę.

W 4 ml pożywki upewniamy się, że komórki są dobrze rozłożone na płytkach, a następnie umieszczamy płytki z powrotem w inkubatorze na 16 do 18 godzin, zazwyczaj do następnego ranka. Znajdujemy się obecnie w 48. godzinie po infekcji wirusem GFP. Chloroquina jest stosowana w celu zwiększenia poboru DNA, który wprowadzimy do komórek.

Ostrożnie odessaliśmy pożywkę z komórek, które przylgnęły do płytek, delikatnie przechylając je na bok. W tym momencie umieścimy płytki z powrotem w inkubatorach na około jedną godzinę. W międzyczasie przygotujemy mieszaninę DNA do aplikacji na komórki; jedna grupa wykazuje ekspresję genu oporności na neomycynę, a druga wykazuje ekspresję GFP. Stosuję DNA XI w celu kontroli całego procesu transfekcji.

Na koniec dodajemy chlorek wapnia. Zastosowanie chlorku wapnia znacznie zwiększa wydajność transfekcji. Minęła jedna godzina; pobieramy płytki z medium zawierającym chlorochinę i dodajemy roztwór do transfekcji.

Ostatnim krokiem jest dodanie 1 ml sterylnego 2x HBS, wprowadzając roztwór 2x HBS powoli, kropla po kropli. W tym samym czasie należy mieszać próbkę w wirówce wortex, aby zapobiec wytrącaniu osadu. Następnie należy niezwłocznie rozdzielić 1 ml roztworu na odpowiednią płytkę, również robiąc to kropla po kropli.

Na tym etapie komórki 2 9 3 T są mocno uczulone, ze względu na zastosowanie pożywki z chlorochiną. Musimy upewnić się, że cały obszar jest pokryty, i przesuwać płytki jak najmniej; opisz płytkę, podając nazwę naniesionego konstruktu, a następnie powtórz czynność dla kolejnego konstruktu.

W tym momencie należy umieścić płytki w inkubatorze na okres od 7 do 11 godzin. Czas ten nie powinien być krótszy niż 7 ani dłuższy niż 11 godzin, ponieważ komórki są bardzo uwrażliwione przez chlorochinę i po tym czasie będzie konieczna wymiana medium. Jest to obecnie około 30 godziny po transfekcji.

Jest to nasza ostatnia zmiana pożywki na tym etapie; komórki 2 9 3 C3 T osiągnęły konfluencję. Ponownie musimy zachować szczególną ostrożność podczas aplikacji nowej pożywki przy ściance płytki. Używam strzykawki 10 ml z igłą.

Zastąpię igłę filtrem, aby dokładnie wymieszać medium; w tym momencie zebraliśmy wirusa, którego możemy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu użycia. Pierwszym krokiem jest właściwe miareczkowanie wirusa. Podczas produkcji wirusa występuje kilka krytycznych etapów, z których pierwszym jest uzyskanie odpowiedniej koncentracji komórek 293T.

Wysiewamy je w zagęszczeniu 10^6 komórek na płytkę, ponieważ po 18 godzinach osiągną one około 80% konfluencji. Pozostawia to im czas na dalszy wzrost, dzięki czemu 24 godziny po transfekcji będą w 100% konfluentne. Wykazano, że jest to niezwykle istotne dla uzyskania wysokiego miana wirusa.

Kolejnym krokiem jest zastosowanie chlorochiny; użycie chlorochiny uwrażliwia komórki 2 9 3, a wszelkie wymiany medium muszą być przeprowadzane bardzo delikatnie, aby cała warstwa komórek 2 9 3 T nie oddzieliła się od płytki. Wreszcie, DNA wykorzystywane do produkcji wirusa musi być niezwykle czyste. Stosujemy DNA w pasmach (C banded).

Po uzyskaniu wirusa przechowujemy go w temperaturze -80 °C. Zazwyczaj monitorujemy go raz, ponieważ każda rozmrażka obniża miano wirusa dwukrotnie. Dlatego zamrażamy uzyskany wirus i przechowujemy go do czasu wykonania właściwego oznaczenia miana wirusa.

W zależności od zastosowanych wirusów możemy mieć albo ekspresję GFP wraz z wirusem w celu śledzenia faktycznie zainfekowanych komórek, albo oporność na neomycynę. Bardzo ważne jest również dokładne oznaczenie miana wirusa przed jego użyciem, aby umożliwić porównanie wyników między eksperymentami lub różnymi mutantami.