Name: Wytwarzanie retrowirusa z wadami replikacyjnymi przez przejściową transfekcję komórek 293T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:22:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania retrowirusów z wadami replikacyjnymi poprzez przejściową transfekcję komórek 293T. Technika ta umożliwia modelowanie chorób nowotworowych u myszy poprzez wprowadzanie ludzkich onkogenów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
<li>Wieczorem przed transfekcją wysiać komórki 293T w zagęszczeniu 3-5x106 komórek/6 cm płytka do hodowli tkanek. Uwaga: Używamy komórek 293T ze względu na łatwość transfekcji i wysoką wydajność jako komórek produkujących wirusy. Komórki te nie są zdolne do pakowania wirusa, dopóki nie zostanie wprowadzony plazmid pomocniczy. </li>
<li>Następnego ranka ostrożnie usunąć pożywkę i zastąpić ją 4 ml pożywki dla komórek 293T zawierającej 25 mM chlorochiny. Inkubować przez 1 hr. Uwaga: płytka powinna być w około 80% konfluenta. </li>
<li>W międzyczasie przygotować w probówkach 5 ml mieszaninę do produkcji wirusa dla 2 płytek jednocześnie:<ol>
<li>2 x 10 mg konstrukcyjnego plazmidu retrowirusowego</li>
<li>2 x 5 mg konstrukcji pakującej (EcoPak), </li>
<li>2 x 62 ml CaCl</li>
<li>uzupełnić do 1 ml sterylną wodą ddH2O Uwaga: Podczas gdy plazmid retrowirusowy koduje interesujący nas onkogen oraz marker, EcoPak koduje gag-pol-env. Wraz z komórkami 293T będą one produkować ekotropowy retrowirus (RV) specyficzny dla komórek myszy, który nie infekuje komórek ludzkich. Wykazano, że zarówno chlorochina, jak i CaCl2 zwiększają wydajność transfekcji. </li>
</ol></li>
<li>Do mieszaniny dodawać kroplami 1 ml sterylnego 2x HBS, delikatnie wstrząsając probówką na wortexie.</li>
<li>Bezzwłocznie dodać ten roztwór do 2 płytek, po 1 ml na każdą, ostrożnie, kropla po kropli. </li>
<li>Inkubować przez 7 do 11 hrs.</li>
<li>Wieczorem (7 do 11 hrs później) ostrożnie usunąć pożywkę i bardzo delikatnie zastąpić ją 5 ml świeżej pożywki dla komórek 293T. Inkubować do południa następnego dnia. Uwaga: ten krok jest istotny, ponieważ należy usunąć chlorochinę z komórek. Chlorochina jest toksyczna przy dłuższym czasie ekspozycji. Roztwór na płytkach wydaje się mętny z powodu bardzo drobnego, przypominającego pył wytrącania składników mieszaniny transfekcyjnej. Uwaga: Ważne jest, aby wszystkie wymiany pożywek przeprowadzać z najwyższą ostrożnością, ponieważ komórki zostały uwrażliwione przez chlorochinę i mogą łatwo odkleić się od płytki. </li>
<li>Następnego dnia, 18 do 24 hrs przed odzyskaniem wirusa (około południa), ostrożnie usunąć pożywkę i bardzo delikatnie zastąpić ją 3 ml świeżej pożywki dla komórek 293T. Inkubować przez noc (O/N).</li>
<li>Trzeciego ranka (18 do 24 hrs później) delikatnie odessać pożywkę z płytek za pomocą strzykawki 10 ml z igłą 18 G. Ten nadsącz zawiera retrowirusa.</li>
<li>Zamienić igłę na filtr strzykawkowy 45 mm, kilkakrotnie odwrócić strzykawkę, aby dobrze wymieszać roztwór, przepuścić nadsącz przez filtr i rozdzielić na aliquoty do probówek kriogenicznych. Uwaga: Alternatywnie, jeśli przygotowywanych jest 3 lub więcej płytek z wirusem, połączyć wszystkie nadsącze tego samego wirusa w 50 ml probówce stożkowej. Dobrze wymieszać, a następnie rozdzielić nadsącze zawierające retrowirusa do probówek kriogenicznych poprzez filtrację. </li>
<li>Probówki zawierające nadsącze z wirusem przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.</li>
</ol>

<ol><li>DuBridge, R. B., Tang, P., Hsia, H. C., Leong, P. M., Miller, J. H., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mutation+in+human+cells+by+using+an+Epstein-Barr+virus+shuttle+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system.</a> Mol Cell Biol. 7, 379-387 (1987).</li>
<li>Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+expression+in+embryonic+stem+cells+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral expression in embryonic stem cells and hematopoietic stem cells.</a> Mol Cell Biol. 20, 7419-7426 (2000).</li>
<li>Finer, M. H., Dull, T. J., Qin, L., Farson, D., Roberts, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kat%3A+A+high-efficiency+retroviral+transduction+system+for+primary+human+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">kat: A high-efficiency retroviral transduction system for primary human T lymphocytes.</a> Blood. 83, 43-50 (1994).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70, 5701-5705 (1996).</li>
<li>Pear, W. S., Miller, J. P., Xu, L., Pui, J. C., Soffer, B., Quackenbush, R. C., Pendergast, A. M., Bronson, R., Aster, J. C., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+induction+of+a+chronic+myelogenous+leukemia-like+myeloproliferative+disease+in+mice+receiving+P210+bcr%2Fabl-transduced+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow.</a> Blood. 92, 3780-3792 (1998).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90, 8392-8396 (1993).</li>
<li>Stocking, C., Kollek, R., Bergholz, U., Ostertag, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+terminal+repeat+sequences+impart+hematopoietic+transformation+properties+to+the+myeloproliferative+sarcoma+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Long terminal repeat sequences impart hematopoietic transformation properties to the myeloproliferative sarcoma virus.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 82, 5746-5750 (1985).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Models of chronic myeloid leukemia.</a> Curr Oncol Rep. 3, 228-237 (2001).</li>
<li>Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+pathogenesis+of+BCR-ABL%2B+leukemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Studying the pathogenesis of BCR-ABL+ leukemia in mice.</a> Oncogene. 21, 8643-8651 (2002).</li>
</ol>

Cztery kluczowe punkty zapewnią sukces w przygotowaniu dobrego zapasu wirusa:    
<ol>
<li>Komórki produkcyjne 293T muszą być w bardzo dobrym stanie, co oznacza, że były pasażowane w regularnych odstępach czasu, nigdy nie dopuszczono do ich przerośnięcia, a wysiewano je z optymalną gęstością 3,5-5 milionów na 6 cm płytkę do hodowli tkanek, aby w dniu transfekcji rano osiągnęły konfluencję na poziomie 80% powierzchni płytki.&nbsp; </li>
<li>Dodatek chlorochiny poprawia wydajność transfekcji i późniejszy mi...

<table><tbody><tr><td>komórki 293T</td><td>linia komórkowa</td><td></td><td></td><td>Przesiewać w stosunku 1:3 do 1:4 co 3 dni, w przeciwnym razie będą miały tendencję do agregowania się podczas ponownego wysiewania i wykażą gorszą wydajność transfekcji.</td></tr><tr><td>pożywka dla komórek 293T</td><td></td><td></td><td></td><td>DMEM/hi-glu + 10 % FBS + 1% Pen/Strep + 1% L-Glutamine (opcjonalnie 1% NEAA). Roztwory do hodowli tkankowej pozyskujemy od CellGro.</td></tr><tr><td>plazmid z kodującym DNA</td><td></td><td></td><td></td><td>Oczyszczony dwukrotnie za pomocą CsCl. Szkielet MSCV, kodujący onkogen i wybrany marker (Neo, GFP itp.)</td></tr><tr><td>EcoPak</td><td></td><td></td><td></td><td>zwany również pMCV-Ecopac: ekotropowy plazmid pakujący, kodujący gag-pol-env</td></tr><tr><td>2x HBS</td><td></td><td></td><td></td><td>Na 500 ml: 8,0 g NaCl + 0,37 g KCl + 106,5 mg Na2HPO4 (bezwodny; 201,1 mg w przypadku 7xH2O) + 1,0 g dekstrozy (D-glukozy) + 5,0 g proszku HEPES. Rozpuścić w 450 ml dH2O (milli-Q), dostosować pH do 7,05 za pomocą NaOH, a następnie uzupełnić do 500 ml dH2O. Przefiltrować sterylnie przez filtr 0,45 &amp;#x03BC;. Przechowywać w temperaturze pokojowej, szczelnie zamknięte.</td></tr><tr><td>2M CaCl2</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miliQ H2O</td><td></td><td></td><td></td><td>filtrowana sterylnie</td></tr><tr><td>Chlorochina</td><td></td><td></td><td></td><td>Zatłoczenie 1000x to 25 mM w PBS- (bez Ca2+/Mg2+), przechowywane w -20C. Dodawać świeżo do pożywki w razie potrzeby.</td></tr><tr><td>płytki 6 cm</td><td></td><td></td><td></td><td>do hodowli tkankowej</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td></td><td>do hodowli tkankowej. Ustawiony na 37C, 10% CO2.</td></tr><tr><td>sterylne strzykawki 10 cc</td><td></td><td></td><td></td><td>Sterylne. Jedna na typ wirusa.</td></tr><tr><td>igły 18G</td><td></td><td></td><td></td><td>jednorazowe, jedna na typ wirusa.</td></tr><tr><td>filtry strzykawkowe 45 um</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plastikowe probówki 5 ml</td><td></td><td></td><td></td><td>Sterylne, do mieszania roztworu do transfekcji, dla maksymalnie 2 płytek jednocześnie (2 ml). Stosujemy probówki Falcon.</td></tr><tr><td>probówki stożkowe 50 ml</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>krioprobówki</td><td></td><td></td><td></td><td>2 i 4 ml, na alikwoty wirusa.</td></tr><tr><td colspan="5">&lt;p&gt;Wszystkie odczynniki używane w transfekcji muszą być filtrowane sterylnie (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2x HBS, miliQ H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O) i utrzymywane w warunkach sterylnych.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

produkcja retrowirusa z defektem replikacyjnym poprzez przejściową transfekcję komórek 293t

Production of Replication-Defective Retrovirus by Transient Transfection of 293T cells

Nasze laboratorium bada ludzkie choroby mieloproliferacyjne indukowane przez onkogeny takie jak Bcr-Abl lub onkogeny pochodne od receptorów czynników wzrostu (ZNF198-FGFR1, Bcr-PDGFRα itp.). Jesteśmy w stanie modelować i badać chorobę o charakterze ludzkim w naszym modelu mysim, transplantując komórki szpiku kostnego uprzednio zainfekowane retrowirusem wykazującym ekspresję interesującego nas onkogenu. Defektywny replikacyjnie retrowirus kodujący ludzki onkogen oraz marker (GFP, RFP, gen oporności na antybiotyk itp.) jest wytwarzany za pomocą protokołu przejściowej transfekcji z wykorzystaniem komórek 293T, ludzkiej linii komórkowej nabłonka nerkowego przekształconej przez produkt genu E1A adenowirusa. Komórki 293 posiadają niezwykłą właściwość wysokiej podatności na transfekcję fosforanem wapnia (CaPO4), przy czym z łatwością można osiągnąć wydajność transfekcji na poziomie do 50-80%. W tej procedurze przeprowadzamy kotransfekcję komórek 293 wektorem retrowirusowym wykazującym ekspresję interesującego nas onkogenu oraz plazmidem kodującym funkcje pakowania gag-pol-env, takie jak pojedyncze konstrukty pakujące kat lub pCL, w tym przypadku plazmid EcoPak. Wstępna transfekcja jest dodatkowo usprawniana poprzez zastosowanie chlorochiny. Materiał wirusa ekotropowego, zebrany jako nadsącz z hodowli 48 godz. po transfekcji, może być przechowywany w temperaturze -80°C i wykorzystywany do infekcji linii komórkowych w badaniach transformacji i badaniach in vitro lub pierwotnych komórek, takich jak komórki szpiku kostnego myszy, które mogą następnie zostać użyte do transplantacji w naszym modelu mysim.

Niniejsza technika przedstawia efektywny sposób przygotowania defekcyjnych replikacyjnie zapasów retrowirusów kodujących ludzki onkogen, które następnie wykorzystano do indukowania choroby mieloproliferacyjnej w modelu mysim.

Produkcja retrowirusa z defektem replikacyjnym poprzez przejściową transfekcję komórek 293T

Nasze laboratorium bada ludzkie choroby mieloproliferacyjne wywoływane przez onkogeny takie jak Bcr-Abl lub onkogeny pochodzące z receptorów czynników wzrostu (ZNF198-FGFR1, ...

Jesteśmy w Instytucie Badań nad Onkologią Molekularną w Tufts New England Medical Center. Nazywam się Christina Lesco i jestem stypendystką podoktorską w laboratorium dr. Ricka Vana. Nasz zespół zajmuje się badaniem ludzkiej leukemii mielogennej, CML oraz chorób podobnych do CML.Modelujemy tę ludzką chorobę u myszy, wprowadzając ludzki onkogen za pomocą wektora retrowirusowego. Pierwszym krokiem w celu wprowadzenia tego ludzkiego onkogenu do komórek myszy jest wytworzenie samego wirusa. Następnym krokiem będzie właściwe mianowanie wirusa.Oto moja płytka z zapasem komórek 293T. Muszę wypłukać medium za pomocą PBS. Komórki 293T są komórkami adherentnymi, jednak nie przylegają bardzo silnie, więc każdy ruch musi być wykonany bardzo delikatnie. Po wypłukaniu zastąpimy PBS trypsyną.Aby zneutralizować komórki z płytki, musimy umieścić ją z powrotem w inkubatorze na około trzy minuty. Po tych dwóch lub trzech minutach komórki będą znajdować się w zawiesinie. Następnie dodamy kilka kolejnych ml zwykłego medium.To zneutralizuje trypsynę. Na tym etapie pipetujemy zawiesinę góra-dół, aby upewnić się, że wszystkie komórki są dobrze zawieszone; przenosimy zawiesinę do probówki 50 ml, a następni

production-replication-defective-retrovirus-transient-transfection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Produkcja defektu replikacji retrowirusa przez przejściową transfekcję komórek 293T

W celu wytworzenia lentiwirusów wektory DNA są transfekowane do ludzkich komórek 293. Po zbiorze i skoncentrowaniu naddatku miano wirusa jest określane na podstawie ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru przepływowego.

Produkcja lentiwirusa

Lentiwirusy są cennym narzędziem badawczym w analizie funkcji genów; jednak badacze mogą chcieć uniknąć produkcji pantropowych lentiwirusów kodujących znane lub podejrzewane onkogeny. Jako alternatywę przedstawiamy bezpieczniejszy protokół wykorzystania ektropowych lentiwirusów w komórkach ludzkich zmodyfikowanych w celu ekspresji ektropowego receptora mSlc7a1.

Transdukcja komórek ludzkich ekotropowym lentiwirusem w kompleksie z polimerem w celu zwiększenia bezpieczeństwa biologicznego

W niniejszym protokole opisujemy produkcję, oczyszczanie i miareczkowanie wektorów lentiwirusowych. Przedstawiamy przykład dostarczania genów za pomocą wektora lentiwirusowego do pierwotnych hodowli neuronów i astrocytów. Nasze metody mogą mieć zastosowanie również do innych typów komórek in vitro oraz in vivo.

Produkcja wektorów lentiwirusem do transdukcji komórek ośrodkowego układu nerwowego

Interferencja RNA (RNAi) posiada wiele zalet w porównaniu z nokautem genów i jest szeroko stosowana jako narzędzie w badaniach nad funkcjami genów. Wynalezienie technologii RNAi opartej na wektorach DNA umożliwiło długotrwałe i indukowalne wyciszanie genów, a także zwiększyło wykonalność wyciszania genów in vivo.

Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w badaniu funkcji genów w nowotworach

Tutaj używamy transdukcji retrowirusowej i transfekcji konkategomerycznej, aby stworzyć linię komórkową, która może wyrażać składniki wektora lentiwirusowego (LV) przy braku tetracykliny. Ten LV koduje GFP i jest pseudotypowany glikoproteiną SVGmu, która jest specyficzna dla receptora na komórkach dendrytycznych.

Linia komórkowa regulowana tetracykliną wytwarza wektory lentiwirusowe o wysokim mianie, które są specyficznie ukierunkowane na komórki dendrytyczne

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Opisujemy protokół amplifikacji miejsc integracji retrowirusowej z genomowego DNA zakażonych komórek, sekwencjonowania amplifikowanych połączeń wirus-gospodarz, a następnie mapowania tych sekwencji do genomu referencyjnego. Opisujemy również techniki ilościowego określania rozmieszczenia miejsc integracji w odniesieniu do różnych adnotacji genomowych za pomocą BEDTools.

Amplifikacja, sekwencjonowanie nowej generacji i mapowanie genomowego DNA miejsc integracji retrowirusowej

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Przedstawiamy 9-dniowy protokół transdukcji i ekspansji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej makaków rezusów, który daje komórki o doskonałej koekspresji interesujących genów w liczbie wystarczającej do badań infuzyjnych skuteczności komórek.

Transdukcja i ekspansja pierwotnych limfocytów T w ciągu dziewięciu dni z utrzymaniem fenotypu pamięci centralnej

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół generowania i oczyszczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem przy użyciu zoptymalizowanej metody chromatografii powinowactwa opartej na heparynie. Przedstawia proste, skalowalne i ekonomiczne podejście, eliminując potrzebę ultrawirowania. Otrzymane wektory wykazują wysoką czystość i aktywność biologiczną, co dowodzi ich wartości w badaniach przedklinicznych.

Izolacja wektorów wirusowych związanych z adenowirusem za pomocą jednoetapowego i częściowo zautomatyzowanego protokołu chromatografii powinowactwa do heparyny

Poznaj metodę wytwarzania retrowirusów z wadami replikacyjnymi poprzez przejściową transfekcję komórek 293T. Technika ta umożliwia modelowanie chorób nowotworowych u myszy poprzez wprowadzanie ludzkich onkogenów.

Produkcja retrowirusa z defektem replikacyjnym poprzez przejściową transfekcję komórek 293T

Przeglądaj więcej filmów