Drosophila Przygotowanie i obrazowanie podłużne funkcji serca in vivo przy użyciu optycznej mikroskopii koherentnej (OCM)
12 grudnia 2016
Tutaj opisane są eksperymentalne protokoły przygotowania Drosophila na różnych etapach rozwoju i wykonywania podłużnego optycznego obrazowania uderzeń serca Drosophila za pomocą niestandardowego systemu optycznej mikroskopii koherentnej (OCM). Zmiany morfologiczne i dynamiczne serca można scharakteryzować ilościowo, analizując parametry strukturalne i funkcjonalne serca na podstawie obrazów OCM.
Ogólnym celem tej procedury jest zobrazowanie funkcji serca Drosophila podłużnie in vivo przy użyciu techniki optycznej mikroskopii koherentnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie rozwoju strukturalnego i funkcjonalnego serca Drosophila, dostarczając wskaźników, takich jak zmiany średnicy serca, częstości akcji serca i okresu aktywności serca podczas metamorfozy Drosophila. Główną zaletą tej techniki jest to, że optyczna mikroskopia koherentna jest w stanie nieinwazyjnie obrazować serca małych zwierząt z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.
Technika ta może pomóc w ujawnieniu mechanizmów chorób serca u ludzi i ich związku z rozwojem serca ze względu na podobieństwa genetyczne, które istnieją między Drosophila a kręgowcami. Metodę tę można również zastosować do innych systemów, takich jak stymulacja optogenetyczna do badania lub leczenia osłabionej funkcji rozrusznika serca w modelach zwierzęcych. Podczas produkcji muszek do tego eksperymentu, pozwól reprodukcyjnym muchom rodzicielskim na łączenie się w pary i składanie jaj w świeżej fiolce przez osiem godzin.
W ten sposób lęg złożonych jaj rozwinie się w muchy w podobnym wieku. Aby zamontować larwę do obrazowania OCM, najpierw przygotuj czystą stronę za pomocą kawałka taśmy dwustronnej. Wypchnij wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza pod taśmą.
Następnie za pomocą miękkiej szczoteczki usuń z fiolki larwę o odpowiedniej wielkości. Umieść larwę na czystej chusteczce. Usuń przyklejone do niego jedzenie za pomocą zwilżonej szczotki, a następnie pozostaw do wyschnięcia.
Teraz, pod mikroskopem szerokiego pola, potwierdź stadium rozwojowe larwy. Następnie ustaw larwę stroną grzbietową skierowaną do góry w celu zamontowania. Następnie opuść lepką szkiełko na larwę i użyj umiarkowanego nacisku, aby przymocować ją do taśmy.
Umieść zamontowaną larwę na regulowanym stoliku systemu OCM wzdłuż kierunku poprzecznego y, stroną grzbietową skierowaną do góry. Mały otwór w stadium utrzymuje larwę poza kontaktem z płaszczyzną stadium. Szerokie światło rurki serca znajduje się od segmentów A5 do A8. Korzystając z obrazów w czasie rzeczywistym na komputerze, znajdź tylną część rurki serca i przesuń stolik do przodu, aż segment A7 będzie widoczny.
Teraz ustaw parametry akwizycji obrazu. Użyj 100 skanów A na skan B i użyj 100 skanów B. Następnie ustaw napięcie skanera tak, aby obejmowało około 0,28 milimetra w kierunku poprzecznym x i ustaw je na 0 woltów w kierunku poprzecznym y.
Następnie zablokuj ścieżkę wiązki próbki ciemną szmatką i kliknij przycisk Start w oprogramowaniu, aby uzyskać dane o szumie tła do odejmowania tła. Aby zbierać poprzeczne obrazy w trybie M, dostosuj parametry do 128 skanów A na skan B i użyj 4 096 skanów B. Następnie dostosuj napięcie, aby pokryło 0,28 milimetra w kierunku x i 0 woltów w kierunku y, jak poprzednio.
Następnie uzyskaj obrazy w poprzecznym trybie M segmentu A7 rurki serca muchy. Podczas procesu zapisywania danych zablokuj wiązkę obrazowania ciemną szmatką, aby zminimalizować ekspozycję na światło próbki próbki. Zobrazuj serce pięć razy, aby uzyskać wiarygodny pomiar czynności serca.
Aby zebrać obrazy trójwymiarowe, użyj 400 skanów A na skan B, 800 skanów B i użyj napięcia dla 1,7 milimetra na stronie poprzecznej x i około 4 milimetrów na stronie poprzecznej y. Następnie przesuń stolik mikroskopu, aby obserwować całą muchę i dostosuj ostrość, aby zobaczyć wyraźne obrazy. Aby usunąć larwę, użyj mokrej, miękkiej szczotki, aby przenieść ją do nowej fiolki ze świeżym pokarmem w celu dalszego rozwoju i badania podłużnego.
Szerokie światło rurki serca pozostaje w segmentach od A5 do A8 w stadium poczwarki PD1. W PD1 postaraj się zobrazować segment A7, tak jak to zrobiono z larwami w stadium L2 i L3. Stadium poczwarki PD1 jest identyfikowane przez białe poczwarkę.
To okno czasowe jest idealne do wykonywania obrazowania optycznego wczesnej poczwarki, ponieważ wysoka przezroczystość prowadzi do większej penetracji światła dla obrazowania OCM. Wyczyść poczwarkę szczoteczką, jeśli do ciała przykleił się pokarm. Za pomocą mokrej szczotki zamontuj poczwarkę na małym szklanym szkiełku i trzymaj grzbietową stronę skierowaną do góry.
Zjeżdżalnia powinna pasować do rurki muchowej, aby zachować rozwój zwierzęcia we własnej komorze. Osusz nadmiar wody z poczwarki, a następnie umieść ją na scenie z poczwarką skierowaną do góry i przystąp do obrazowania segmentu A7, tak jak to miało miejsce w przypadku larwy. Po zobrazowaniu przenieś szklane szkiełko z poczwarką do probówki w celu ciągłej hodowli.
Po etapie PD1, zaczynając od PD2, między segmentami A1 i A4 zaczyna rozwijać się stożkowa komora. Ponieważ poczwarki stają się stopniowo coraz bardziej nieprzezroczyste, głębokość penetracji systemu obrazowania ulega zmniejszeniu. W PD2 skorupa poczwarki staje się żółtawa, a ciało jest mniej przezroczyste niż PD1.
W PD3 kolor poczwarki jest jeszcze nieco ciemniejszy niż w stadium PD2. Na etapie PD4 można zaobserwować czarne paski wewnątrz skorupy. Niektóre PD4 rozwiną się w dorosłe osobniki, a inne wejdą w stadium PD5.
Na etapie PD5 czarne paski są jeszcze bardziej widoczne. Podnieś poczwarkę PD2 za pomocą pęsety i zamontuj ją na szkiełku. W systemie OCM znajdź przedni koniec rurki serca, a następnie przesuń się o około 50 mikronów w kierunku tylnej, aby znaleźć segment A1 rurki serca.
Należy pamiętać, że w stadium PD2 stożkowa komora serca jest bardzo mała i może jeszcze nie bić. Kontynuuj obrazowanie zgodnie z wcześniejszym opisem. Powtórz tę samą procedurę dla obrazowania Drosophila w stadiach PD3, PD4 i PD5.
Na początek przenieś dorosłą muchę do pustej fiolki o objętości około 45 mililitrów. Następnie zanurz bawełniany aplikator w roztworze znieczulającym i włóż różdżkę do fiolki z bawełnianą końcówką tuż pod bawełnianym korkiem. Poczekaj trzy minuty.
Dorosła mucha będzie znieczulana przez dwie i pół do trzech i pół minuty, w zależności od jej wielkości. Teraz przygotuj szklane szkiełko z kawałkiem taśmy dwustronnej. Następnie za pomocą miękkiej szczoteczki przesuń znieczuloną muchę na szkiełko grzbietową stroną skierowaną do góry.
Pod mikroskopem szerokokątnym oddziel skrzydełka za pomocą pęsety i przyklej je do taśmy, odsłaniając w ten sposób obszar serca do obrazowania. Teraz użyj wcześniej opisanej techniki obrazowania, aby zobrazować segment A1 serca i poświęcić muchę na końcu eksperymentu. Podłużne obrazowanie serca przeprowadzono przy użyciu muszek szczepowych z jedną kopią sterownika 24B-GAL4.
W stadiach larwalnych rurka serca zaczyna się w tylnej części brzucha A8 z szerszym światłem i kończy się w przednim odcinku grzbietowym A1 o węższej średnicy. Pod koniec PD2 w segmencie od A1 do A4 zaczęła rozwijać się komora stożkowa. Tętno muchy określono ilościowo na podstawie poprzecznych obrazów OCM w trybie M.
Co ciekawe, w stadiach poczwarki serce od czasu do czasu przestawało bić. Ogólnie rzecz biorąc, bicie serca znacznie zwolniło od stadium larwalnego do stadium poczwarki, a następnie znacznie wzrosło od poczwarki do dorosłego osobnika. Od czasu tego rozwoju technika ta dała naukowcom zajmującym się kardiologią rozwojową nowe narzędzie do badania wpływu różnych genów na rozwój serca w modelach Drosophila.
Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby uważnie śledzić rozwój Drosophila, aby tworzyć obrazy na każdym etapie rozwoju.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje protokoły przygotowania Drosophila na różnych etapach rozwoju oraz prowadzenia podłużnego obrazowania optycznego bicia serca z wykorzystaniem specjalistycznego systemu mikroskopii optycznej koherencyjnej (OCM). Badanie w sposób ilościowy charakteryzuje morfologiczne i dynamiczne zmiany w sercu poprzez analizę parametrów strukturalnych i funkcjonalnych serca na podstawie obrazów OCM.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Obrazowanie serca
- Biologia rozwoju
Wstęp
- Muszka owocówka (Drosophila) służy jako organizm modelowy do badania rozwoju serca.
- Mikroskopia optycznej koherencji umożliwia nieinwazyjne obrazowanie serc małych zwierząt.
- Technika ta zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną i czasową.
- Zrozumienie funkcji serca Drosophila może dostarczyć cennych informacji na temat chorób serca u ludzi.
Cel badania
- Obrazowanie funkcji serca Drosophila in vivo w badaniu podłużnym.
- Wyznaczenie parametrów średnicy serca, częstości akcji serca oraz aktywności podczas metamorfozy.
- Badanie podobieństw genetycznych między Drosophila a kręgowcami w procesie rozwoju serca.
Zastosowane metody
- Przygotowanie Drosophila na różnych etapach rozwoju.
- Obrazowanie podłużne z wykorzystaniem specjalistycznego systemu mikroskopii optycznej koherencyjnej.
- Analiza parametrów strukturalnych i funkcjonalnych serca na podstawie obrazów OCM.
- Zastosowanie techniki w innych systemach, takich jak stymulacja optogenetyczna.
Główne wyniki
- Ilościowa charakterystyka zmian morfologicznych serca.
- Ocena częstości akcji serca i okresu aktywności podczas metamorfozy.
- Ujawnianie mechanizmów rozwoju serca i patologii.
- Potencjalne zastosowania w badaniu osłabionej funkcji rozrusznika.
Wnioski
- Technika OCM jest skuteczna w nieinwazyjnym obrazowaniu serc Drosophila.
- Wyniki mogą przyczynić się do zrozumienia ludzkich chorób serca.
- Metodę tę można dostosować do różnych układów eksperymentalnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Podłużne obrazowanie in vivo funkcji serca Drosophila z wykorzystaniem mikroskopii optycznej koherencyjnej umożliwia ilościową ocenę dynamiki strukturalnej i funkcjonalnej serca na różnych etapach rozwoju. Podejście to wspiera walidację celów i ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkryć, dostarczając powtarzalnych, wysokorozdzielczych danych fenotypowych istotnych dla mechanizmów ludzkich chorób serca. Metoda ta zwiększa wiarygodność prognostyczną w modelach przedklinicznych dzięki standaryzowanemu, nieinwazyjnemu monitorowaniu częstotliwości akcji serca, okresu aktywności serca oraz zmian morfologicznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie zmian częstotliwości akcji serca oraz okresu aktywności kardiologicznej podczas metamorfozy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalne, nieinwazyjne obrazowanie funkcji serca bez konieczności preparowania tkanek lub ich barwienia.
- Wartość prognostyczna: Wspiera przesiew fenotypowy modyfikatorów genetycznych wpływających na rozwój i funkcję serca.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskanie ilościowych pomiarów zmiennych zależnych, w tym częstotliwości akcji serca, okresu aktywności serca oraz średnicy serca na podstawie obrazów OCM w trybie M i 3D.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzację testu dzięki spójnym parametrom obrazowania i segmentacji odcinków rurki serca od A5 do A8.
- Skalowalność: Wspiera podłużny plan badań z powtarzalnymi sesjami obrazowania w stadiach larwalnym, poczwarki i imago.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez powiązanie dynamiki serca Drosophila z konserwatywnymi szlakami genetycznymi wspólnymi dla kręgowców.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia ekstrapolację wyników między gatunkami dzięki wysokiej ortologii genów związanych z chorobami serca.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez identyfikację etapów rozwojowych z zaburzoną funkcją serca.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesami biologii odkrywczej, dostarczając ilościowych odczytów funkcjonalnych, które wspierają etapy walidacji celu i identyfikacji związków wiodących.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez podłużne śledzenie parametrów funkcji serca podczas metamorfozy.
- Screening: Dostarcza gotowe do analizy systemy biologiczne ze znormalizowanymi protokołami montażu i obrazowania w celu spójnego pozyskiwania danych.
- Analityka: Generuje histogramy częstości akcji serca i okresów aktywności kardiologicznej, filmy w trybie M oraz obrazy en face/przekroje osiowe do analizy porównawczej stanów.
- Badania translacyjne: Łączy fenotypy kardiologiczne Drosophila z mechanizmami chorób ludzkich poprzez wspólne szlaki molekularne.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę obrazowania, którą można zastosować w różnych etapach rozwojowych i modelach genetycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad rozwojem serca dzięki obrazowaniu funkcjonalnemu o wysokiej rozdzielczości czasowo-przestrzennej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność poprzez standaryzację przygotowania larw i pociorek, montażu oraz parametrów obrazowania specyficznych dla danego stadium.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową dzięki możliwości wczesnego wykrywania fenotypów serca, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów genetycznych z uwzględnieniem ryzyka na podstawie ilościowych trajektorii funkcji serca.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obchodzeniu się z Drosophila, określaniu stadiów rozwojowych oraz obsłudze mikroskopii optycznej koherencyjnej.
- Zależność od niestandardowego systemu OCM z konfigurowalnymi częstotliwościami skanowania A-scan/B-scan oraz kontrolą napięcia skanera.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja procedur montażowych i identyfikacji stadiów rozwojowych (L2/L3, PD1–PD5).
- Wymagane jest uwzględnienie adaptacji obrazowania w nieprzezroczystych stadiach rozwojowych ze względu na postępującą melanizację poczwarki.
- Ograniczenie wynikające ze zmniejszającej się głębokości penetracji w późniejszych stadiach poczwarki, co wymaga strategii obrazowania dostosowanych do danego stadium.
