Name: Skuteczna metoda izolacji wysoce oczyszczonego RNA z nasion do zastosowania w ilościowej analizie transkryptomu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Poznaj metodę izolacji wysoce oczyszczonego RNA z nasion roślin zawierających oleje, białka i polifenole. Ta technika umożliwia analizę ekspresji genów w badaniach biologii zbóż.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy personelowi Zakładu Genomiki Funkcjonalnej oraz Zakładu Spektrografii i Bioobrazowania, Głównego Ośrodka Badawczego NIBB oraz Ośrodka Badawczego Roślin Modelowych, Centrum Zasobów Biologicznych NIBB.

1. Ekstrakcja całkowitego RNA z nasion roślin
<ol>
	<li>Przygotuj zestawy buforowe, kolumny wirujące, probówki polipropylenowe o pojemności 1,5 i 2,0 ml oraz probówki polipropylenowe o pojemności 1,5 ml bez nukleaz.</li>
	<li>Dodać 1% (w/v) poliwinylopirolidon klasy biologii molekularnej (zwany dalej PVP) do buforu do lizy komórek w celu ekstrakcji RNA i energicznie wirować. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 25 °C do całkowitego rozpuszczenia. Po 20 minutach inkubacji delikatnie wymieszaj bufor, obracając probówkę do góry nogami, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Przed użyciem przechowywać w temperaturze pokojowej (15-25 °C).</li>
	<li>Zbierz owoce z roślin Arabidopsis thaliana i umieść je w probówkach polipropylenowych o pojemności 1,5 ml na lodzie. Umieść owoce na aluminiowych płytkach utrzymywanych w temperaturze 4 °C i odizoluj nasiona od owoców pod mikroskopem stereoskopowym.
	<ol>
		<li>Umieść izolowane nasiona (około 200 nasion) w probówkach polipropylenowych o pojemności 1,5 ml, które były przechowywane w aluminiowym stojaku na lodzie i natychmiast umieść probówki w ciekłym azocie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij rurki z ciekłego azotu i umieść je z powrotem na aluminiowym stojaku na lodzie. Dodać 100 μl buforu zawierającego 1% PVP i odwirowywać przez 1 minutę w temperaturze 1 000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Homogenizować próbkę za pomocą tłuczka ze stali nierdzewnej za pomocą młynka silnikowego przez 60 s, trzymając probówkę w aluminiowym stojaku na lodzie.</li>
	<li>Dodać 550 μl buforu zawierającego 1% PVP, delikatnie wymieszać bufor, obracając probówkę do góry dnem i inkubować przez 10 minut w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 8 000 x g w temperaturze 25 °C i przenieść 550 μl supernatantu do nowej probówki polipropylenowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przez 5 minut przy 10 000 x g w temperaturze 25 °C i przenieść 450 μl supernatantu do nowej probówki polipropylenowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Użyć supernatantu jako lizatu komórkowego do ekstrakcji RNA. Następnie postępuj zgodnie z procedurą opisaną w instrukcjach producenta w dostępnym na rynku zestawie.</li>
	<li>Eluować RNA przy użyciu minimalnej objętości buforu elucyjnego, aby zapewnić wystarczająco wysokie stężenie RNA do monitorowania wzorców ekspresji transkryptów niskiego poziomu. Przechowuj RNA w głębokiej zamrażarce do czasu użycia.</li>
</ol>
2. Weryfikacja jakości RNA
<ol>
	<li>Rozmrozić całe RNA, wymieszać przez delikatne stukanie i umieścić probówkę w aluminiowym stojaku na lodzie.</li>
	<li>Zmierz stężenie RNA, stosunek A260/A280 i stosunek A260/A230 za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego.</li>
	<li>Rozcieńczyć całkowite RNA w wodzie wolnej od RNaz do końcowego stężenia 70 ng/μl.</li>
</ol>
3. Odwrotna transkrypcja całkowitego RNA z nasion
<ol>
	<li>Rozmrozić całkowite zestawy RNA i z zestawu komercyjnego. Trzymaj enzymy z zestawu na lodzie po delikatnym stuknięciu. Przygotuj probówki polipropylenowe o pojemności 0,2 ml bez nukleazy.</li>
	<li>Dodać 5 μl całkowitego RNA, 1 μl startera Oligo dT (50 μM) i 1 μM losowego 6-mera (50 μM) do probówki polipropylenowej o pojemności 0,2 ml na lodzie.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C i umieścić na lodzie.</li>
	<li>Następnie postępuj zgodnie z procedurą opisaną w instrukcjach producenta w zestawie do odwrotnej transkrypcji-PCR.</li>
	<li>Przed użyciem umieść produkty odwrotnej transkrypcji na lodzie.</li>
</ol>
4. Ilościowa analiza PCR w czasie rzeczywistym
<ol>
	<li>Skonstruuj plazmidy zawierające docelowe sekwencje genów przy użyciu protokołu producenta.</li>
	<li>Dostosuj stężenia do 100-500 000 kopii/μl dla matryc DNA dla krzywych standardowych.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwory cDNA (1:100) wodą destylowaną.</li>
	<li>Dodać 2 μl rozcieńczonych roztworów cDNA i plazmidy dla krzywych wzorcowych do mieszanki głównej z ilościowego zestawu do PCR w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Skonfiguruj PCR w czasie rzeczywistym, używając następujących warunków cyklicznych: 95 °C przez 30 s, a następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 5 s i 60 °C przez 35 s.</li>
	<li>Przeanalizuj liczbę kopii zgodnie z instrukcjami producenta systemu PCR w czasie rzeczywistym.</li>
</ol>

<ol><li>Hills, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+storage-product+synthesis+in+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of storage-product synthesis in seeds.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 302-308 (2004).</li>
<li>Li-Beisson, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acyl-lipid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Acyl-lipid metabolism.</a> Arabidopsis Book. 11, e0161(2013).</li>
<li>Bates, P. D., Stymne, S., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+pathways+in+seed+oil+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical pathways in seed oil synthesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 16 (3), 358-364 (2013).</li>
<li>Santos-Mendoza, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+gene+regulatory+networks+that+control+seed+development+and+maturation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Deciphering gene regulatory networks that control seed development and maturation in Arabidopsis.</a> Plant J. 54 (4), 608-620 (2008).</li>
<li>Durrett, T. P., Benning, C., Ohlrogge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+triacylglycerols+as+feedstocks+for+the+production+of+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Plant triacylglycerols as feedstocks for the production of biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 593-607 (2008).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Plastidic+DEAD-box+RNA+helicase+22%2C+HS3%2C+is+essential+for+plastid+functions+both+in+seed+development+and+in+seedling+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Plastidic DEAD-box RNA helicase 22, HS3, is essential for plastid functions both in seed development and in seedling growth.</a> Plant Cell Physiol. 54 (9), 1431-1440 (2013).</li>
<li>Kanai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+of+oil+biosynthesis+during+the+mid-phase+of+seed+development+enhances+oil+content+in+Arabidopsis+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Extension of oil biosynthesis during the mid-phase of seed development enhances oil content in Arabidopsis seeds.</a> Plant Biotechnol J. 14 (5), 1241-1250 (2016).</li>
<li>Dekkers, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+reference+genes+for+RT-qPCR+expression+analysis+in+Arabidopsis+and+tomato+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of reference genes for RT-qPCR expression analysis in Arabidopsis and tomato seeds.</a> Plant Cell Physiol. 53 (1), 28-37 (2012).</li>
<li>Salzman, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+RNA+isolation+method+for+plant+tissues+containing+high+levels+of+phenolic+compounds+or+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">An improved RNA isolation method for plant tissues containing high levels of phenolic compounds or carbohydrates.</a> Plant Mol Biol Rep. 17 (1), 11-17 (1999).</li>
<li>Vicient, C. M., Delseny, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+total+RNA+from+Arabidopsis+thaliana+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of total RNA from Arabidopsis thaliana seeds.</a> Anal Biochem. 268 (2), 412-413 (1999).</li>
<li>Wang, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high+quality+RNA+from+cereal+seeds+containing+high+levels+of+starch%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high quality RNA from cereal seeds containing high levels of starch.</a> Phytochem Analysis. 23 (2), 159-163 (2012).</li>
<li>Birtic, S., Kranner, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+high-quality+RNA+from+polyphenol-%2C+polysaccharide-+and+lipid-rich+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochem+Analysis%22%5BJournal%5D)">Isolation of high-quality RNA from polyphenol-, polysaccharide- and lipid-rich seeds.</a> Phytochem Analysis. 17 (3), 144-148 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Profile ekspresji genów przyczyniają się do naszego zrozumienia fizjologii roślin; w związku z tym opracowano specyficzne metody izolacji RNA dla każdego warunku próbki9-12. Zbadaliśmy procesy, które zostały zahamowane podczas izolacji RNA z nasion i stwierdziliśmy, że wiązanie RNA z błonami krzemionkowymi było poważnie zahamowane. Duże ilości oleju, białek i polifenoli hamują izolację RNA. Zmodyfikowaliśmy proces ekstrakcji RNA, aby usunąć te związki za pomocą roztworu do lizy przed procesem wiązania RNA z me...

Rośliny wytwarzają nasiona, które dają początek następnemu pokoleniu. Nasiona gromadzą duże ilości rezerw magazynowych, takich jak oleje, węglowodany i białka, do wzrostu po kiełkowaniu. Ludzie wykorzystują rezerwy do przechowywania nasion jako źródła pożywienia i paszy dla zwierząt, a zatem nasiona roślin są jednym z głównych dostawców jadalnej materii organicznej na całym świecie. Zwiększenie plonów nasion jest ważnym wyzwaniem w nauce o roślinach.
Ponieważ rezerwy do przechowywania nasion są komercyjnie cennym źródłem żywności i materiałów przemysłowych, mechanizmy molekularne leżące u podstaw regulacji metabolizmu tych rezerw zostały szeroko zbadane1-6. Dalsze wyjaśnienie tych mechanizmów będzie przydatne w zwiększaniu plonów nasion w uprawach. Nasiona rozwijają się w jajnikach roślin po zapłodnieniu i dojrzewają przez szereg etapów rozwojowych1,6,7. Dalsze zrozumienie mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw rozwoju nasion wymaga szczegółowych, precyzyjnych profili ekspresji genów z serii rozwijających się nasion, które mają zostać wyprodukowane. Jednak duże ilości olejów, białek, węglowodanów i polifenoli w nasionach roślin utrudniają wyizolowanie wysoko oczyszczonego RNA, co uniemożliwia precyzyjne profilowanie ekspresji genów.
Tutaj wprowadzamy skuteczną metodę izolacji RNA z nasion oleistych zawierających duże ilości olejów, białek i polifenoli. Za pomocą tej metody naukowcy będą w stanie przygotować wysoce oczyszczone RNA. Takie RNA będzie przydatne do monitorowania zmian transkrypcyjnych w kluczowych genach kontrolujących metaboliczną regulację rezerw magazynowych nasion w rozwijających się i dojrzałych nasionach oleistych.

<table><tbody><tr><td>RNeasy Plant Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>poliwinylopirolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5288-100G</td><td></td></tr><tr><td>HOMOGENIZATOR S-303</td><td>AS ONE</td><td>1-1133-02</td><td></td></tr> Zestaw odczynników <tr><td>NanoDrop Lite</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-NDL-US-CAN</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript RT (idealny czas rzeczywisty)</td><td>TAKARA</td><td>RR037A</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Zestaw do szybkiego qPCR</td><td>Kapa biosystems</td><td>KK4601</td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczna metoda izolacji wysoce oczyszczonego rna z nasion do zastosowania w ilościowej analizie transkryptomu

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Nasiona roślin gromadzą duże ilości rezerw magazynowych zawierających biodegradowalną materię organiczną. Ludzie polegają na zapasach nasion do przechowywania żywności i materiałów przemysłowych. Profile ekspresji genów są potężnymi narzędziami do badania regulacji metabolicznej w komórkach roślinnych. Dlatego do hodowli roślin wymagane są szczegółowe, dokładne profile ekspresji genów podczas rozwoju nasion. Pozyskiwanie wysoce oczyszczonego RNA jest niezbędne do produkcji tych profili. Potrzebne są skuteczne metody izolowania wysoce oczyszczonego RNA z nasion. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania RNA z nasion zawierających duże ilości olejów, białek i polifenoli, które mają działanie hamujące izolację RNA o wysokiej czystości. Nasza metoda umożliwia uzyskanie wysoko oczyszczonego RNA z nasion bez użycia fenolu, chloroformu lub dodatkowych procesów oczyszczania RNA. Ta metoda ma zastosowanie do Arabidopsis, nasion rzepaku i soi. Nasza metoda będzie przydatna do monitorowania wzorców ekspresji transkryptów niskiego poziomu w rozwijających się i dojrzałych nasionach.

W pierwszej kolejności zbadano optymalne stężenie PVP, wykorzystując dojrzałe nasiona Arabidopsis. Całkowite RNA wyizolowano z około 1 000 nasion zgodnie z powyższym protokołem, stosując bufor do lizy komórek zawierający 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% lub 2,0% PVP. Po homogenizacji i wirowaniu zebrano supernatant, unikając warstwy olejowej i resztek nasion (Rycina 1A).
<img alt="Proces ekstrakcji oleju; probówka...

Udało nam się ustalić metodę izolacji RNA z nasion roślin zawierających duże ilości olejów, białek i polifenoli, które mają działanie hamujące izolację RNA o wysokiej czystości. Nasza metoda jest odpowiednia do monitorowania ekspresji genów z transkryptami niskiego poziomu w nasionach.

Skuteczna metoda izolacji wysoce oczyszczonego RNA z nasion do zastosowania w ilościowej analizie transkryptomu

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Ogólnym celem tej procedury jest ekstrakcja RNA o wysokiej czystości z nasion roślin. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii zbóż, takie jak zrozumienie profili genów zawierających oryginalne transkrypty w nasionach. Główną zaletą tej techniki jest to, że naukowcy są w stanie przygotować wysoko oczyszczone RNA z niewielką modyfikacją metody opartej na kolumnie spinowej.Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ duża ilość olejów, białek, węglowodanów i polifenoli na przednim sicie utrudnia wyizolowanie wysoko oczyszczonego RNA; Procedurę zademonstruje Kazumi Hikino, technik z naszego laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, dodaj jeden procent wagowy na objętość klasy biologii molekularnej PVP do buforu do lizy komórek w celu ekstrakcji RNA i energicznie wiruj mieszaninę. Inkubuj PVP przez 20 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby całkowicie się rozpuścił.Po 20 minutach inkubacji delikatnie wymieszaj bufor, obracając probówkę do góry nogami, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Zbierz owoce z roślin Arabidopsis thaliana i umieść je w dwóch 1,5-milimetrowych rurkach polipropylenowych na lodzie, a nast

an-efficient-method-for-isolation-highly-purified-rna-from-seeds-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Informujemy o skutecznej i prostej metodzie izolowania zarodków we wczesnych stadiach rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana. W ciągu 1 godziny do 4 godzin można wyizolować do 40 zarodków, w zależności od dalszej aplikacji. Procedura jest odpowiednia do transkryptomu, metylacji DNA, ekspresji genów reporterowych, barwienia immunologicznego i fluorescencyjnych analiz hybrydyzacji in situ.

Skuteczna i szybka izolacja zarodków we wczesnym stadium rozwoju z nasion Arabidopsis thaliana

Ten protokół opisuje metodę ekstrakcji małych RNA z ludzkiej surowicy. Zastosowaliśmy tę metodę do wyizolowania mikroRNA z surowicy nowotworowej do zastosowania w macierzach DNA, a także w ilościowym PCR singleplex. W protokole wykorzystuje się odczynniki tiocyjanianu fenolu i guanidyny z modyfikacjami w celu uzyskania wysokiej jakości RNA.

Izolacja małych niekodujących RNA z ludzkiej surowicy

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Opisano procedurę tandemowej izolacji RNA (TRIP) w celu odzyskania endogennie utworzonych kompleksów mRNA-białko. W szczególności kompleksy RNA-białko są sieciowane in vivo, poliadenylowane RNA są izolowane z ekstraktów z kulkami oligo(dT), a poszczególne mRNA są wychwytywane za pomocą zmodyfikowanych oligonukleotydów antysensownych RNA. Białka związane z mRNA są wykrywane za pomocą analizy immunoblot.

Procedura izolacji tandemowego RNA oparta na oligonukleotydach w celu odzyskania eukariotycznych kompleksów mRNA-białko

Przedstawiono metodę profilowania transkryptomu zbóż. Profilowanie ekspresji genów w oparciu o mikromacierze rozpoczyna się od wyizolowania wysokiej jakości całkowitego RNA z ziaren zbóż i jest kontynuowane wraz z generowaniem cDNA. Po znakowaniu cRNA i hybrydyzacji mikromacierzy podawane są zalecenia dotyczące wykrywania sygnału i kontroli jakości.

Uzyskiwanie wysokiej jakości danych transkryptomicznych z nasion zbóż za pomocą zmodyfikowanej metody profilowania ekspresji genów

Ten protokół ma na celu wyizolowanie specyficznych dla typu komórki translujących rybosomalnych mRNA za pomocą mysiego modelu NuTRAP.

Izolowanie RNA specyficznych dla typu komórki z zatrzaskowo mrożonych próbek tkanek heterogenicznych bez sortowania komórek

Ten protokół opisuje metodę oczyszczania eukariotycznych polisomów z nienaruszonych guzków soi. Po sekwencjonowaniu można wykorzystać standardowe potoki do analizy ekspresji genów do identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji na poziomie transkryptomu i translatomiu.

Oczyszczanie polisomów z guzków symbiotycznych soi

Opisujemy prostą, ale wysoce powtarzalną metodę izolowania zewnątrzkomórkowego RNA z powierzchni liści i apoplastu roślin Arabidopsis.

Przewodnik krok po kroku dotyczący izolacji i analizy powierzchni liści i apoplastycznego RNA przy użyciu rozet Arabidopsis

Protokół ten umożliwia początkową kontrolę jakości eksperymentów RNA-seq dla biologów laboratoryjnych z ograniczonym doświadczeniem w bioinformatyce.

Rup (RNA-seq Benchmark Assessment Pipeline) – Kontrola jakości eksperymentów masowych RNA-seq u eukariontów

Poznaj metodę izolacji wysoce oczyszczonego RNA z nasion roślin zawierających oleje, białka i polifenole. Ta technika umożliwia analizę ekspresji genów w badaniach biologii zbóż.

Skuteczna metoda izolacji wysoce oczyszczonego RNA z nasion do zastosowania w ilościowej analizie transkryptomu

Przeglądaj więcej filmów