Skuteczna metoda izolacji wysoce oczyszczonego RNA z nasion do zastosowania w ilościowej analizie transkryptomu

Ogólnym celem tej procedury jest ekstrakcja RNA o wysokiej czystości z nasion roślin. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii zbóż, takie jak zrozumienie profili genów zawierających oryginalne transkrypty w nasionach. Główną zaletą tej techniki jest to, że naukowcy są w stanie przygotować wysoko oczyszczone RNA z niewielką modyfikacją metody opartej na kolumnie spinowej.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ duża ilość olejów, białek, węglowodanów i polifenoli na przednim sicie utrudnia wyizolowanie wysoko oczyszczonego RNA; Procedurę zademonstruje Kazumi Hikino, technik z naszego laboratorium. Aby rozpocząć eksperyment, dodaj jeden procent wagowy na objętość klasy biologii molekularnej PVP do buforu do lizy komórek w celu ekstrakcji RNA i energicznie wiruj mieszaninę. Inkubuj PVP przez 20 minut w temperaturze 25 stopni Celsjusza, aby całkowicie się rozpuścił.

Po 20 minutach inkubacji delikatnie wymieszaj bufor, obracając probówkę do góry nogami, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków. Zbierz owoce z roślin Arabidopsis thaliana i umieść je w dwóch 1,5-milimetrowych rurkach polipropylenowych na lodzie, a następnie umieść owoce na aluminiowych płytkach utrzymywanych w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyizoluj nasiona z owoców pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie umieść około 200 izolowanych nasion w 1,5-mililitrowych probówkach polipropylenowych, które były wcześniej przechowywane w aluminiowym stojaku na lodzie i natychmiast umieść probówki w ciekłym azocie.

Wyjmij rurki z ciekłego azotu i umieść je z powrotem na aluminiowym stojaku na lodzie. Dodaj 100 mikrolitrów jednoprocentowego buforu PVP do każdej probówki i odwiruj probówki przez jedną minutę w temperaturze 1000 razy G, w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu homogenizować próbkę za pomocą tłuczka ze stali nierdzewnej za pomocą młynka silnikowego przez 60 sekund, trzymając probówkę w aluminiowym stojaku na lodzie; następnie dodaj 550 mikrolitrów buforu 100% PVP i delikatnie odwróć probówkę do góry nogami, aby wymieszać i inkubować probówkę.

Po inkubacji odwirować roztwór, a następnie przenieść 550 mikrolitrów supernatantu do nowej 1,5-milimetrowej probówki polipropylenowej i odwirować supernatant. Przenieś 450 mikrolitrów supernatantu do nowej rurki polipropylenowej o średnicy 1,5 milimetra. Użyj supernatantu jako lizatu komórkowego do ekstrakcji RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu.

Przygotuj aluminiowy stojak na lodzie i rozmrozić całą mieszankę RNA, delikatnie stukając, a następnie umieść probówkę na stojaku. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Następnie rozcieńczyć całkowite RNA w wodzie wolnej od RNaz.

Rozmrozić całkowite zestawy RNA i z zestawu komercyjnego, enzymy z zestawu trzymać na lodzie po delikatnym stuknięciu. Przygotuj wysterylizowane probówki polipropylenowe o pojemności 0,2 mililitra wolne od nukleaz do późniejszej analizy. Na lodzie połącz pięć mikrolitrów całkowitego RNA, jeden mikrolitr lub 50 mikromolów startera oligo DT i jeden mikrolitr lub 50 mikromolowy losowy sześciomerowy w probówce polipropylenowej o pojemności 0,2 mililitra.

Inkubuj mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, a następnie umieść probówkę na lodzie. Dostosuj stężenia plazmidów dla matryc DNA dla krzywych standardowych. Następnie rozcieńczyć roztwory CDNA w stosunku jeden do 100 wodą destylowaną, a następnie dodać dwa mikrolitry rozcieńczonych roztworów CDNA i wcześniej przygotowane plazmidy dla krzywych wzorcowych do mieszanki głównej z ilościowego zestawu do PCR w czasie rzeczywistym.

Na koniec skonfiguruj PCR w czasie rzeczywistym i włóż próbki. Całkowite RNA wyizolowano z około 1000 nasion przy użyciu różnych stężeń buforu do lizy komórek, PVP. Ilości i czystość wyizolowanych RNA pokazują, że 1,0% PVP jest najskuteczniejszym stężeniem do izolowania dużych ilości oczyszczonego RNA z nasion.

Stężenia, proporcje A260 i A280 oraz stosunki A260 A230 RNA wyizolowane z 200 nasion wykazały, że ta metoda była najlepsza w izolowaniu wysoce oczyszczonego RNA z ośmiu i 12 dni po kwitnieniu lub nasion DAF. Chociaż ilości transkryptów pomarszczonego i cukrozależnego są stosunkowo niskie w rozwijających się nasionach, możliwe było wykrycie zmian ekspresji między nasionami na różnych etapach rozwoju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym; Ta metoda jest również odpowiednia dla innych nasion oleistych, jak pokazano w tej tabeli. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią roślin do zbadania profili ekspresji genów w wysokim stężeniu przechowywanych rezerw, takich jak nasiona i owoce.