Wykorzystanie zasobów CyVerse do transkryptomiki porównawczej de novo organizmów nieobjętych modelem
9 maja 2017
Ten protokół przedstawia porównawczy proces tworzenia transkryptomu i adnotacji de novo dla początkujących bioinformatyków. Przepływ pracy jest dostępny bezpłatnie całkowicie za pośrednictwem CyVerse i połączony przez magazyn danych. Używany jest wiersz poleceń i graficzne interfejsy użytkownika, ale cały potrzebny kod jest dostępny do skopiowania i wklejenia.
Ogólnym celem tej procedury jest ocena, zestawienie, adnotacja i porównanie różnicowej ekspresji genów za pomocą transkryptomiki De Novo, zaczynając od surowych plików FASTQ. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania z zakresu biologii porównawczej i molekularnej, w tym które transkrypty znajdują się wewnątrz organizmu, co te transkrypty robią wewnątrz tych organizmów i jakie są różnice między warunkami eksperymentalnymi. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia interaktywne środowisko.
Zapewnia zasoby obliczeniowe na żądanie i pozwala naukowcom na natychmiastowe rozpoczęcie analizy danych sekwencyjnych RNA. Metoda ta jest szczególnie przydatna dla naukowców porównujących eksperymenty w obrębie jednego organizmu, który obejmuje wiele tkanek, warunków, punktów czasowych, aby zrozumieć, jak zmieniają się systemy biologiczne. Metoda ta koncentruje się na organizmach niemodelowych bez genomów, ale może być również stosowana do organizmów z dostępnymi zestawami genomów, nawet tych, które mają dziesiątki lub setki tysięcy rusztowań w swoim złożeniu.
Aby rozpocząć, uzyskaj dostęp do atmosfery w środowisku odkrywania. Poproś o bezpłatne konto CyVerse, przechodząc do strony rejestracji. Użyj instytucjonalnego adresu e-mail, aby zarejestrować konto.
Następnie przejdź do zakładki aplikacji i usług i poproś o dostęp do Atmosphere. Dostęp do środowiska odnajdywania jest przyznawany automatycznie. Zaloguj się do środowiska odnajdywania, w skrócie DE. Następnie wybierz kartę Dane, aby wyświetlić menu zawierające wszystkie foldery w magazynie danych.
Utwórz główny folder projektu, w którym będą przechowywane wszystkie dane skojarzone z projektem. Znajdź pasek narzędzi w górnej części okna danych i wybierz Plik, Nowy folder. Nie używaj spacji ani znaków specjalnych w nazwach folderów ani żadnych nazw plików wejściowych i wyjściowych.
Zamiast tego w razie potrzeby użyj podkreśleń lub myślników. Prześlij nieprzetworzone pliki sekwencji FASTQ i folder, 1_Raw_Sequence, do podfolderu o nazwie Folder A_Raw_Reads. W przypadku plików o rozmiarze mniejszym niż dwa gigabity użyj funkcji prostego przesyłania magazynu danych, aby przejść do paska narzędzi okna danych, klikając przycisk Dane na głównym pulpicie DE.
Wybierz opcję Prześlij, Proste przesyłanie z komputera. Następnie wybierz przycisk Przeglądaj, aby przejść do nieprzetworzonych plików sekwencjonowania FASTQ na komputerze lokalnym. Oceń przekazane odczyty sekwencjonowania nieprzetworzonego za pomocą aplikacji FastQC w Niemczech. Wybierz przycisk Aplikacje na głównym pulpicie DE, aby otworzyć okno zawierające wszystkie aplikacje analityczne dostępne w DE. Przeszukaj okno w poszukiwaniu narzędzia FastQC na pasku narzędzi wyszukiwania w górnej części okna.
Otwórz wersję wieloplikową, jeśli istnieje więcej niż jeden plik FASTQ. Wybierz pozycję Plik i utwórz nowy folder, a następnie wybierz ten folder jako folder wyjściowy. Załaduj pliki odczytu FASTQ do okna narzędzi o nazwie Wybierz dane wejściowe i wybierz pozycję Uruchom analizę.
Wyszukaj programowalną aplikację Trimmomatic w DE i otwórz ją. Prześlij folder z surowymi plikami odczytu FASTQ do sekcji ustawień. Wybierz, czy pliki sekwencjonowania są pojedyncze, czy sparowane.
Użyj standardowego pliku kontrolnego dostarczonego po wybraniu przycisku Przeglądaj i wklejeniu ścieżki do pliku w polu wyświetlania. Wybierz plik kontrolny Trimmomatic i uruchom analizę. Aby uzyskać wysokiej jakości odczyty sekwencji przycinania, wyszukaj i otwórz aplikację Sickle w DE. Wybierz przycięte odczyty FASTQ jako odczyty wejściowe i zmień nazwę plików wyjściowych.
Uwzględnij ustawienia jakości w opcjach. Otwórz najnowszą wersję instancji Atmosphere, przechodząc do strony wiki. Wybierz łącze do najnowszej wersji obrazu Trinity and Trinotate.
Wybierz przycisk Zaloguj się, aby uruchomić, a następnie nazwij instancję Atmosphere. Wybierz rozmiar wystąpienia medium3 lub large3. Uruchom instancję i poczekaj, aż się zbuduje.
Jeśli obraz Atmosphere nie zostanie uruchomiony, możesz spróbować ubiegać się o mniejszą instancję lub możesz złożyć wniosek do Jetstream o większą alokację. Wszystkie szczegóły znajdują się na towarzyszącej wiki. Przenieś pliki wyjściowe Trinity do folderu 3_Assembly w DE i oznacz folder etykietą A_Trinity_de_novo_assembly.
Uruchomienie Trinity wymaga znajomości wiersza poleceń i kilku dni, a nawet tygodni na wykonanie dużych analiz. Dostępne są darmowe zasoby, które są połączone na wiki, aby pomóc zrozumieć wiersz poleceń. Nadaj każdemu zmontowanemu transkryptomowi podfolder w folderze A_Trinity_de_novo_assembly.
Użyj unikalnych nazw, w tym nazw naukowych organizmów i zabiegów związanych z każdym transkryptomem, a następnie utwórz kolejny podfolder o nazwie Folder B_rnaQUAT_Output w folderze 3_Assembly. Otwórz aplikację o nazwie De Novo rnaQUAST. Nazwij analizę i wybierz Folder B_rnaQUAST_Output jako folder wyjściowy.
Wyszukaj dekoder transkrypcji i uruchom transdekoder na pliku wyjściowym De Novo Trinity Assembly fasta w środowisku odnajdywania. Otwórz aplikację deseq2 w DE.Name analizy i wybierz folder wyjściowy jako 4_Differential_Expresssion. W sekcji Dane wejściowe wybierz plik tabeli zliczeń z przebiegu zestawu Trinity.
Wybierz również kolumnę, w której można znaleźć nazwy kontigów. Wprowadź nagłówki kolumn z pliku tabeli danych zliczań, aby określić, które kolumny są porównywane. Umieść przecinki między każdym z warunków.
Nie dołączaj pierwszego nagłówka kolumny, który zawiera nazwy kontigów. W przypadku replik powtórz tę samą nazwę. W drugim wierszu podaj nazwy dwóch warunków, które mają zostać porównane.
Dopasuj nazwy nagłówków kolumn podane w pierwszym wierszu. Poniżej przedstawiono systematyczne porównanie odczytów sekwencjonowania po każdym kroku przetwarzania wstępnego. Po przycięciu odczyt powinien mieć mniej skośną zawartość GC i zawartość sekwencji oraz mieć większą proporcję do odczytów z wysokim wynikiem jakości.
Do złożenia transkryptomów De Novo niezbędne są odczyty wysokiej jakości. Wyniki szybkiej kontroli jakości zależą od sekwencjonowanych organizmów i próbek. Poprzez jednolitość we wszystkich próbkach, które będą porównywane w dalszej kolejności, głównym celem odczytów przetwarzania wstępnego.
rnaQUAST wykorzystuje kod boost do generowania statystyk podsumowujących dotyczące zespołów na podstawie znanych genów rdzeniowych w kladach taksonomicznych. Dokładność asemblerów ujawnia się na podstawie liczby niezgodności na transkrypt oraz liczby transkryptów pasujących do genów kanonicznych. Ostatnie cztery przedstawione tutaj wykresy cząstkowe zawierają sumariczne dane statystyczne dotyczące długości kontigu i izoformy, a także pokrycie oczekiwanych izoform.
NAx reprezentuje procent kontigów o długości dłuższej niż długość osi y. Frakcja złożona to najdłuższy pojedynczy złożony transkrypt podzielony przez jego długość. Gdzie frakcja pokryta jest procentem kompletnie złożonych izoform transkryptu, zgodnie z oczekiwaniami dla rdzeniowych genów prokariotycznych lub eukariotycznych z BUSCO.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak składać i wprowadzać transkryptomy. Dodatkowo protokół ten pozwoli Ci wykryć różnicową ekspresję genów między dwoma stanami. Ogólnie rzecz biorąc, ludzie mają problemy z pakietami bioinformatycznymi, ponieważ jest ich tak wiele, jest wiele ustawień i zmiennych z nimi związanych, a zwykle musisz mieć wiedzę na temat wiersza poleceń, aby faktycznie wykonać.
Ważne jest, aby oznaczyć i uporządkować dane wejściowe i wyniki analizy, aby inni badacze mogli zrozumieć, co zostało zrobione. Należy dołączyć kroki, które zostały wykonane, wersje programu i przykładowe informacje. Pomiń także wszelkie spacje w nazwach folderów lub plików.
Nowe narzędzia i nowe wersje narzędzi są stale integrowane, ale stare wersje narzędzi są również zachowywane. Wszystkie zmiany zostaną zarejestrowane na towarzyszącej wiki. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody bioinformatyczne, takie jak analiza sieciowa, wzbogacanie GO i identyfikacja szlaków metabolicznych, aby pomóc odpowiedzieć na pytania, takie jak zmienność fenotypu, warunki zmieniające profile ekspresji i identyfikacja genów będących przedmiotem zainteresowania dla genomiki funkcjonalnej.
Przegląd
Ten protokół opisuje workflow dla de novo składania i adnotacji transkryptomu, zaprojektowany dla początkujących bioinformatyków. Zapewnia interaktywne środowisko do analizy danych RNA-Seq, dostępne poprzez CyVerse.
Kluczowe Elementy Badań
Obszar Nauki
- Bioinformatyka
- Biologia Porównawcza
- Biologia Molekularna
Wprowadzenie
- Skupienie się na organizmach niemodelowych bez genomów.
- Ma zastosowanie do organizmów z dostępnymi kompletacjami genomów.
- Dotyczy analizy różnicowej ekspresji genów.
- Wykorzystuje interfejs wiersza poleceń i interfejsy graficzne.
Cel Badania
- Ocena i porównanie ekspresji genów poprzez transkryptomikę.
- Zrozumienie systemów biologicznych w różnych warunkach.
- Zapewnienie ustrukturyzowanego podejścia dla początkujących badaczy.
Metody Użyte
- Dostęp do CyVerse i Discovery Environment.
- Przesyłanie i przetwarzanie surowych plików FASTQ.
- Wykorzystywanie narzędzi takich jak FastQC, Trimmomatic i DESeq2.
- Przeprowadzanie składania z użyciem Trinity i rnaQUAST.
Główne Wyniki
- Poprawa jakości odczytów sekwencjonowania po przetwarzaniu.
- Ustrukturyzowany wynik dla analizy różnicowej ekspresji.
- Interaktywne środowisko ułatwiające natychmiastową analizę danych.
Wnioski
- Zapewnia kompleksowy workflow dla analizy transkryptomu.
- Wzmacnia zrozumienie ekspresji genów w różnych warunkach.
- Dostępne zasoby dla początkujących bioinformatyków.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
This workflow enables biopharma R&D teams to generate high-quality transcriptomic data from non-model organisms, supporting target validation in underexplored biological systems. By providing an interactive, cloud-based environment for de novo assembly and differential expression analysis, it reduces barriers to mechanistic de-risking in early discovery. The approach enhances predictive confidence when studying organism-specific responses to experimental perturbations, informing portfolio prioritization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in non-model organisms lacking reference genomes.
- Operational Value: Supports functional target validation through annotation of differentially expressed genes.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by clarifying genetic responses to experimental conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized transcriptome assemblies for reliable downstream functional analysis.
- Operational Value: Generates quantitative count data suitable for assay reproducibility and cross-condition comparison.
- Scalability: Leverages cloud resources to handle large RNA-Seq datasets without local infrastructure burden.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase transcriptomic insights to preclinical validation via functional annotation.
- Biomarker Alignment: Enables identification of condition-specific genes with potential as translational biomarkers.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing conserved or divergent pathway activations.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing and pathway clarification before lead identification efforts.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing through pairwise comparison of transcriptomic states across experimental conditions.
- Screening: Delivers assay-ready transcriptome assemblies with quantified expression levels for compound screening readiness.
- Analytics: Provides differential expression outputs and functional annotations that allow teams to compare biological responses.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by linking expression changes to annotated gene functions and pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable cloud-based capability for transcriptomic analysis across multiple projects and organisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in non-model systems.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through structured, version-controlled workflows on CyVerse.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid, no-cost access to advanced computational resources.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering actionable insights into organism-specific biological responses.
Implementation Considerations
- Requires foundational knowledge of command-line interfaces and RNA-Seq data handling.
- Depends on access to CyVerse Discovery Environment and Atmosphere for computational execution.
- Necessitates cross-team standardization in file naming, folder organization, and version tracking.
- Involves adaptation across diverse non-model systems with varying genome complexity and annotation availability.
- Limited to pairwise comparisons; not suited for multifactor experimental designs without workflow modification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Set Up the Project, Upload Raw Sequencing Reads, and Assess Reads Using FastQC
3:31
Trim and Quality Filter Raw Reads to Yield High Quality Sequence
4:32
De Novo Transcriptome Assembly Using Trinity in Atmosphere
6:42
Pairwise Differential Expression Using DESeq2 in the DE
7:38
Results: FastQC and rnaQUAST Reports
9:24
Conclusion
