Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów

Ogólnym celem tej metody jest wykorzystanie śledzenia izotopów do pomiaru metabolizmu posortowanych populacji złożonych społeczności komórkowych. Dzięki tej metodzie możemy badać różnice metaboliczne między subpopulacjami złożonych społeczności komórkowych, a także współpracę metaboliczną między tymi subpopulacjami. Główną zaletą tej techniki jest to, że łącząc śledzenie izotopów z sortowaniem komórek, możemy uzyskać bardziej wiarygodną miarę metabolizmu, a także możemy zweryfikować, jak wiarygodna jest metoda.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ łączy ona różne techniki, a sposób obchodzenia się z komórkami i długość procedury mogą wpływać na metabolizm komórkowy. Do ekstrakcji metabolitów z szalki należy najpierw wyhodować komórki na sześciodołkowej płytce w stabilnym pożywce hodowlanej znakowanej izotopami, zawierającej dializowane suplementy. Gdy komórki osiągną 75% konfluencji, przepłucz studzienki dwa razy 500 mikrolitrami zimnego HBSS zawierającego równomiernie oznakowaną glukozę.

Następnie dodaj 600 mikrolitrów 100% wstępnie schłodzonego metanolu z suchego lodu do każdej studzienki i przenieś płytkę do suchego lodu. Użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć komórki, a następnie ostrożnie przenieś ekstrakty z każdej studzienki do indywidualnych probówek mikrowirówek. Przechowuj komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy spektrometrii mas.

Do ekstrakcji metabolitów posortowanych komórek, hoduje się komórki w 100-milimetrowym naczyniu w znakowanej pożywce hodowlanej z dializowanymi suplementami, tak aby osiągnęły 75% zbiegu do dnia sortowania. W celu znakowania impulsowego komórek posortowanych w cyklu komórkowym, należy hodować komórki w nieznakowanej pożywce zawierającej dializowane suplementy, aż osiągną 75% konfluencji. Następnie znakuj komórki pulsacyjnie przez dwie godziny, zastępując pożywkę świeżo znakowaną pożywką hodowlaną.

Opłucz naczynie ciepłym HBSS zawierającym jednolicie oznakowaną glukozę i odłącz komórki za pomocą 1,5 mililitra trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po czterech minutach dezaktywuj trypsynę trzema mililitrami lodowatego HBSS zawierającego znakowaną glukozę i dializowane suplementy, a następnie przenieś komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić osad w HBSS zawierający znakowaną glukozę, dializowane suplementy i EDTA w stężeniu od jednego do dwóch razy od 10 do sześciu komórek na mililitr i przefiltrować komórki przez sitko o grubości 40 mikronów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.

Przenieś komórki do pięciomililitrowej probówki i posortuj je na cytometrze przepływowym. W celu ekstrakcji metabolitów z pozorowanych posortowanych komórek, należy usunąć resztki i posortować tylko singlety. W celu ekstrakcji metabolitów z komórek posortowanych w cyklu komórkowym, należy usunąć szczątki i dublety, a następnie posortować komórki na G1 i SG2M, w oparciu o fluorescencję sondy gemininy.

Pod koniec sortowania zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach lodowatej wody destylowanej, aby uzyskać jednorodny granul. Następnie szybko wyekstrahuj metabolity, dodając 540 mikrolitrów metanolu schłodzonego suchym lodem. Przechowywać próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy LCMS.

Ekstrakcja metabolitów z posortowanych komórek musi być dobrze zaplanowana z wyprzedzeniem, a prace eksperymentalne muszą być zakończone tak szybko, jak to możliwe, w celu zminimalizowania zmian metabolicznych. Do analizy wyekstrahowanych metabolitów należy najpierw wybrać pewną liczbę metabolitów o odpowiadających im dostępnych wzorcach, które wykazują piki dobrej jakości próbki. Następnie należy sprawdzić jakość pików, uważając, aby nie uwzględnić fałszywych izotopów.

Oblicz izotop masowy z naszych frakcji dla próbek oznaczonych izotopami, dzieląc powierzchnię piku każdego izotopu masowego z naszej frakcji przez całkowite powierzchnie pików wszystkich izotopów masowych z naszych frakcji. Następnie oblicz oznaczone frakcje węgla do wzbogacenia węgla-13, korzystając ze wzoru na wzbogacenie węgla. Na koniec oblicz znakowane frakcje azotu do wzbogacania azotu-15 przy użyciu wzoru na wzbogacanie azotu.

W tym reprezentatywnym eksperymencie 66 metabolitów wybranych z analizy danych było obecnych w pozorowanych posortowanych komórkach, z których 60 wydawało się być oznaczonych podobnym izotopem masy z naszych rozkładów między ekstraktami z talerzy a makietami posortowanymi komórkami. Na przykład izotop masy z naszego rozkładu glutaminianu jest podobny między posortowanymi ekstraktami z naczynia i makiety, co wskazuje, że izotop masy glutaminianu z naszej dystrybucji jest również wiarygodny w posortowanych populacjach komórek. Analiza komórek HELA posortowanych na etapy cyklu komórkowego G0, G1 lub SG2M przy użyciu sondy gemininy FUCCI ujawnia znakowanie cytydyny w obu populacjach z wyższym wzbogaceniem w stadium SG2M, co jest zgodne ze zwiększoną syntezą nukleotydów de novo podczas fazy S.

W tym eksperymencie izotop masy z naszego rozmieszczenia wykazywał ten sam wzór w obu frakcjach posortowanych w cyklu komórkowym, co sugeruje, że używany jest ten sam szlak syntezy, ale jest bardziej aktywny na etapie SG2M, co pokazuje, że różnice metaboliczne są łatwo wykrywalne tą metodą, nawet między blisko spokrewnionymi subpopulacjami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak wyodrębnić metabolity z posortowanych frakcji i zrozumieć zastrzeżenia. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkim obchodzeniu się z komórkami podczas sortowania i ekstrakcji metabolitów, ponieważ sposób i czas obchodzenia się z komórkami może wpływać na ich metabolizm.

Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu pięciu godzin. Tę procedurę można zastosować do innych typów komórek. Na przykład podzbiory komórek odpornościowych we krwi lub różne typy komórek w guzie, przy użyciu różnych sond, przeciwciał lub metod barwienia do sortowania.