Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów
4 lutego 2017
Ten artykuł opisuje metodę badania metabolizmu komórkowego w złożonych społecznościach wielu typów komórek, wykorzystując kombinację śledzenia stabilnych izotopów, sortowania komórek w celu izolowania określonych typów komórek oraz spektrometrii mas.
Ogólnym celem tej metody jest wykorzystanie śledzenia izotopów do pomiaru metabolizmu posortowanych populacji złożonych społeczności komórkowych. Dzięki tej metodzie możemy badać różnice metaboliczne między subpopulacjami złożonych społeczności komórkowych, a także współpracę metaboliczną między tymi subpopulacjami. Główną zaletą tej techniki jest to, że łącząc śledzenie izotopów z sortowaniem komórek, możemy uzyskać bardziej wiarygodną miarę metabolizmu, a także możemy zweryfikować, jak wiarygodna jest metoda.
Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ łączy ona różne techniki, a sposób obchodzenia się z komórkami i długość procedury mogą wpływać na metabolizm komórkowy. Do ekstrakcji metabolitów z szalki należy najpierw wyhodować komórki na sześciodołkowej płytce w stabilnym pożywce hodowlanej znakowanej izotopami, zawierającej dializowane suplementy. Gdy komórki osiągną 75% konfluencji, przepłucz studzienki dwa razy 500 mikrolitrami zimnego HBSS zawierającego równomiernie oznakowaną glukozę.
Następnie dodaj 600 mikrolitrów 100% wstępnie schłodzonego metanolu z suchego lodu do każdej studzienki i przenieś płytkę do suchego lodu. Użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć komórki, a następnie ostrożnie przenieś ekstrakty z każdej studzienki do indywidualnych probówek mikrowirówek. Przechowuj komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy spektrometrii mas.
Do ekstrakcji metabolitów posortowanych komórek, hoduje się komórki w 100-milimetrowym naczyniu w znakowanej pożywce hodowlanej z dializowanymi suplementami, tak aby osiągnęły 75% zbiegu do dnia sortowania. W celu znakowania impulsowego komórek posortowanych w cyklu komórkowym, należy hodować komórki w nieznakowanej pożywce zawierającej dializowane suplementy, aż osiągną 75% konfluencji. Następnie znakuj komórki pulsacyjnie przez dwie godziny, zastępując pożywkę świeżo znakowaną pożywką hodowlaną.
Opłucz naczynie ciepłym HBSS zawierającym jednolicie oznakowaną glukozę i odłącz komórki za pomocą 1,5 mililitra trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po czterech minutach dezaktywuj trypsynę trzema mililitrami lodowatego HBSS zawierającego znakowaną glukozę i dializowane suplementy, a następnie przenieś komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić osad w HBSS zawierający znakowaną glukozę, dializowane suplementy i EDTA w stężeniu od jednego do dwóch razy od 10 do sześciu komórek na mililitr i przefiltrować komórki przez sitko o grubości 40 mikronów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
Przenieś komórki do pięciomililitrowej probówki i posortuj je na cytometrze przepływowym. W celu ekstrakcji metabolitów z pozorowanych posortowanych komórek, należy usunąć resztki i posortować tylko singlety. W celu ekstrakcji metabolitów z komórek posortowanych w cyklu komórkowym, należy usunąć szczątki i dublety, a następnie posortować komórki na G1 i SG2M, w oparciu o fluorescencję sondy gemininy.
Pod koniec sortowania zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach lodowatej wody destylowanej, aby uzyskać jednorodny granul. Następnie szybko wyekstrahuj metabolity, dodając 540 mikrolitrów metanolu schłodzonego suchym lodem. Przechowywać próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy LCMS.
Ekstrakcja metabolitów z posortowanych komórek musi być dobrze zaplanowana z wyprzedzeniem, a prace eksperymentalne muszą być zakończone tak szybko, jak to możliwe, w celu zminimalizowania zmian metabolicznych. Do analizy wyekstrahowanych metabolitów należy najpierw wybrać pewną liczbę metabolitów o odpowiadających im dostępnych wzorcach, które wykazują piki dobrej jakości próbki. Następnie należy sprawdzić jakość pików, uważając, aby nie uwzględnić fałszywych izotopów.
Oblicz izotop masowy z naszych frakcji dla próbek oznaczonych izotopami, dzieląc powierzchnię piku każdego izotopu masowego z naszej frakcji przez całkowite powierzchnie pików wszystkich izotopów masowych z naszych frakcji. Następnie oblicz oznaczone frakcje węgla do wzbogacenia węgla-13, korzystając ze wzoru na wzbogacenie węgla. Na koniec oblicz znakowane frakcje azotu do wzbogacania azotu-15 przy użyciu wzoru na wzbogacanie azotu.
W tym reprezentatywnym eksperymencie 66 metabolitów wybranych z analizy danych było obecnych w pozorowanych posortowanych komórkach, z których 60 wydawało się być oznaczonych podobnym izotopem masy z naszych rozkładów między ekstraktami z talerzy a makietami posortowanymi komórkami. Na przykład izotop masy z naszego rozkładu glutaminianu jest podobny między posortowanymi ekstraktami z naczynia i makiety, co wskazuje, że izotop masy glutaminianu z naszej dystrybucji jest również wiarygodny w posortowanych populacjach komórek. Analiza komórek HELA posortowanych na etapy cyklu komórkowego G0, G1 lub SG2M przy użyciu sondy gemininy FUCCI ujawnia znakowanie cytydyny w obu populacjach z wyższym wzbogaceniem w stadium SG2M, co jest zgodne ze zwiększoną syntezą nukleotydów de novo podczas fazy S.
W tym eksperymencie izotop masy z naszego rozmieszczenia wykazywał ten sam wzór w obu frakcjach posortowanych w cyklu komórkowym, co sugeruje, że używany jest ten sam szlak syntezy, ale jest bardziej aktywny na etapie SG2M, co pokazuje, że różnice metaboliczne są łatwo wykrywalne tą metodą, nawet między blisko spokrewnionymi subpopulacjami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak wyodrębnić metabolity z posortowanych frakcji i zrozumieć zastrzeżenia. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkim obchodzeniu się z komórkami podczas sortowania i ekstrakcji metabolitów, ponieważ sposób i czas obchodzenia się z komórkami może wpływać na ich metabolizm.
Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu pięciu godzin. Tę procedurę można zastosować do innych typów komórek. Na przykład podzbiory komórek odpornościowych we krwi lub różne typy komórek w guzie, przy użyciu różnych sond, przeciwciał lub metod barwienia do sortowania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje metodę badania metabolizmu komórkowego w złożonych społecznościach wielu typów komórek. Technika łączy śledzenie stabilnych izotopów, sortowanie komórek i spektrometrię masową w celu analizy różnic metabolicznych i współpracy między subpopulacjami.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Metabolizm komórkowy
- Śledzenie izotopów
- Spektrometria mas
Tło
- Zrozumienie metabolizmu w złożonych społecznościach komórek jest kluczowe dla różnych badań biologicznych.
- Śledzenie izotopów pozwala na szczegółową analizę szlaków metabolicznych.
- Sortowanie komórek pomaga odizolować określone typy komórek dla dokładniejszych pomiarów.
- Spektrometria masowa zapewnia wrażliwe wykrywanie metabolitów.
Cel badania
- Zmierzenie metabolizmu posortowanych populacji w złożonych społecznościach komórkowych.
- Badanie różnic metabolicznych między subpopulacjami.
- Zbadanie współpracy metabolicznej między różnymi typami komórek.
Zastosowanie metod
- Hodowla komórek w pośrednictwie stabilnego izotopu.
- Sortowanie określonych typów komórek za pomocą technik sortowania komórek.
- Zastosowanie spektrometrii masowej do analizy metabolitów.
- Walidacja niezawodności metody poprzez wizualne demonstracje.
Główne wyniki
- Zwiększone zrozumienie różnic metabolicznych w subpopulacjach komórek.
- Wykazane współpraca w metabolizmie między różnymi typami komórek.
- Walidacja niezawodności połączonej metody.
- Dostarczenie wizualnego szkieletu dla procedury i jej wpływu na metabolizm komórek.
Wnioski
- Metoda oferuje solidne podejście do badania metabolizmu komórkowego.
- Łączenie śledzenia izotopów z sortowaniem komórek daje niezawodne dane metaboliczne.
- Ta technika może być zastosowana w różnych dziedzinach badań dotyczących złożonych interakcji komórkowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method addresses a key challenge in discovery biology: obtaining reliable metabolic measurements from heterogeneous cell populations without introducing sorting-induced artifacts. By leveraging stable isotope tracing and mass isotopomer distributions (MIDs), it enables de-risking of target validation through more confident assessment of subpopulation-specific pathway activity. The approach supports predictive confidence in early discovery by distinguishing true metabolic differences from procedural noise, informing go/no-go decisions in portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by revealing metabolic differences between subpopulations, such as elevated nucleotide synthesis in SG2M versus G1 phases.
- Operational Value: Provides a validation step using mock-sorted controls to confirm that MIDs remain unaltered by sorting stress, ensuring data integrity before downstream analysis.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by confirming pathway consistency (e.g., nucleotide synthesis) while quantifying activity differences across closely related states.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, reproducible MID readouts from sorted fractions that are amenable to high-resolution mass spectrometry and scalable across sample sets.
- Screening Readiness: Prepares validated biological systems for compound evaluation by establishing baseline metabolic profiles in defined subpopulations.
- Platform Reuse: The workflow—combining isotope labeling, sorting, and LC-HRMS—can be adapted to immune subsets or tumor microenvironments using alternative probes or staining methods.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase metabolic profiling to preclinical validation by enabling consistent measurement of pathway activity in sorted populations across experimental models.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates prioritization of targets or mechanisms based on subpopulation-specific metabolic dependencies, reducing false leads in later stages.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, providing metabolic resolution that complements genomic and proteomic subpopulation analysis.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by isolating metabolic signals specific to sorted subpopulations, such as cell cycle phases.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative metabolite enrichment data that enable reliable comparison of compound effects across defined fractions.
- Analytics: Generates mass isotopomer distributions and labeled carbon/nitrogen fractions that serve as stable, time-integrated readouts for pathway flux assessment.
- Translational Research: Enables continuity from sorted population analysis in vitro to preclinical models by preserving metabolic state fidelity through MID-based validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for metabolic phenotyping of any sortable subpopulation, reducing redundant method development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in heterogeneous systems.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through internal controls (mock-sorted samples) that verify methodological robustness.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling earlier, more accurate go/no-go decisions based on subpopulation-specific metabolic dependencies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by highlighting metabolic vulnerabilities in distinct cell states, informing combination therapy or biomarker strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stable isotope labeling, flow cytometry sorting, and LC-HRMS data analysis for metabolite enrichment calculations.
- Depends on access to cell sorters, mass spectrometry platforms, and isotope-labeled media with dialyzed supplements.
- Necessitates standardized handling procedures to minimize metabolic drift during sorting and extraction, particularly for time-sensitive samples.
- Involves adaptation considerations when applying the method to primary cells or tissues with varying fragility or sorting efficiency.
- Includes practical limitations such as the need for rapid metabolite extraction post-sort to prevent ex vivo metabolic alterations, as noted in the protocol.
