Name: Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Poznaj metodę pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów i spektrometrii mas. Technika ta umożliwia badanie różnic metabolicznych oraz współpracy między typami komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Anasowi Kamlehowi za cenną pomoc w optymalizacji metod spektrometrii mas oraz Annice von Vollenhoven za pomoc w sortowaniu komórek. Badania te były wspierane przez Szwedzką Fundację Badań Strategicznych (grant nr 1). FFL12-0220) oraz Strategiczny Program Badań nad Rakiem (IR, RN); Szwedzka Fundacja Płuco-Sercowa (CEW, HG); oraz Fundacja Mary Kay (JW, MJ).

1. Ekstrakcja metabolitów
<ol>
	<li>Ekstrakcja z naczynia hodowlanego
	<ol>
		<li>Hodować komórki w płytce 6-dołkowej w trzech powtórzeniach w pożywce hodowlanej znakowanej stabilnymi izotopami + dializowanej suplementacji (surowica lub inne suplementy wzrostu), aż komórki osiągną 75% konfluencji. 
		UWAGA: W tym przypadku hodowano komórki HeLa przez 48 h w pożywce RPMI zawierającej 40% U-13C-glukozy, 70% U-13C, 15N2-glutaminy oraz 5% dializowanej FBS (płodowej surowicy bydlęcej). Dializowaną FBS stosuje się w celu usunięcia metabolitów o niskiej masie cząsteczkowej, które mogłyby zanieczyścić pożywkę znakowaną. Zaleca się hodowanie komórek z dializowanymi suplementami przed właściwym eksperymentem, aby upewnić się, że komórki rosną prawidłowo w danej pożywce. Suplementy dializuje się w 0,15 M roztworze NaCl przez noc, używając membrany dializacyjnej typu „snake skin”.</li>
		<li>W dniu ekstrakcji usunąć pożywkę hodowlaną, przepłukać dołki dwukrotnie 500 µL zimnego HBSS, a następnie go odessać. 
		UWAGA: W tym przypadku należy użyć HBSS zawierającego 40% U-13C-glukozy, ponieważ znajduje się ona również w pożywce hodowlanej.</li>
		<li>Dodać 600 µL 100% metanolu uprzednio schłodzonego na suchym lodzie.</li>
		<li>Przenieść naczynie na suchy lód i zebrać materiał komórkowy za pomocą skrobaka do komórek.</li>
		<li>Ostrożnie przenieść pipetą ekstrakty komórkowe do probówki do mikrocentryfugi i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy spektrometrią mas.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja z komórek poddanych pozornej sortowaniu (mock sorted)
	<ol>
		<li>Hodować komórki w szalce 100 mm w trzech powtórzeniach w pożywce hodowlanej znakowanej stabilnymi izotopami + dializowanej suplementacji. 
		UWAGA: W tym przypadku hodowano komórki HeLa przez 48 h w szalce 100 mm, ponieważ do uzyskania 500 000 posortowanych komórek potrzebna była duża liczba komórek (~4 x 106). Taka liczba ekstraktów z komórek HeLa była niezbędna do uzyskania dokładnych pomiarów metabolitów. Stosowano pożywkę RPMI zawierającą 40% U-13C-glukozy, 70% U-13C, 15N2-glutaminy oraz 5% dializowanej FBS.</li>
		<li>W dniu ekstrakcji usunąć pożywkę hodowlaną, przepłukać dołki 1,5 mL ciepłego HBSS, a następnie go odessać.</li>
		<li>Odłączyć komórki, dodając 1,5 mL trypsyny/EDTA na 4 min w temperaturze 37 °C. Kolejne kroki należy wykonywać w temperaturze 4 °C lub w lodzie.</li>
		<li>Dezaktywować trypsynę, dodając 3 mL lodowatego HBSS (zrównoważonego roztworu soli Hanksa) + dializowanej suplementacji.</li>
		<li>Zebrać komórki do probówki 15 mL i wirować przy 750 x g przez 3 min.</li>
		<li>Resuspendować osad w HBSS + dializowanej suplementacji + 1 mM EDTA do stężenia 1-2 x 106 komórek/mL, przefiltrować przez sitka komórkowe 40 µm w celu uzyskania pojedynczych komórek i przenieść do probówki 5 mL.</li>
		<li>Posortować komórki za pomocą sortera komórkowego, bramkując wyłącznie singlety, a następnie wirować posortowane komórki przy 750 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: W tym przypadku sortowano komórki HeLa z prędkością 1 000 zdarzeń/s, przy ciśnieniu urządzenia 27 psi i przy użyciu dyszy 100 µm. Komórki HeLa są duże, dlatego powinny być sortowane przy niskiej częstotliwości zdarzeń i z użyciem dużej dyszy, aby uzyskać jak najbardziej nienaruszony osad. Przez cały czas sortowania komórki należy utrzymywać w blokach chłodzących, aby ograniczyć metabolizm. Szczegółowy opis procedury sortowania przedstawiono wcześniej12.</li>
		<li>Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 50 µL lodowatej dH2O, aby uzyskać jednorodny osad przed dodaniem metanolu. Bezpośrednie dodanie zimnego metanolu do osadu powoduje powstanie zwartego grudkowatego osadu, który jest trudny do resuspendowania.</li>
		<li>Wyekstrahować metabolity, dodając 540 µL metanolu przechowywanego na suchym lodzie, i przechowywać ekstrakty w temperaturze -80 °C do czasu analizy chromatografią cieczową z wysokorozdzielczą spektrometrią mas (LC-HRMS).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja z komórek posortowanych według cyklu komórkowego
	<ol>
		<li>Hodować komórki w szalce 100 mm w trzech powtórzeniach w pożywce hodowlanej + dializowanej suplementacji. 
		UWAGA: W tym przypadku hodowano komórki HeLa zawierające sondę Geminin Fucci Green (mAG1-hGem)13, która umożliwia sortowanie komórek w fazie G1 (negatywne) i SG2M (pozytywne). Komórki można hodować w pożywce do śledzenia stabilnych izotopów przez wymagany czas. Tutaj hodowano je przez 46 h w pożywce nieznakowanej, a następnie 2 h przed rozpoczęciem sortowania zmieniono pożywkę na RPMI zawierającą 40% U-13C-glukozy i 70% U-13C, 15N2-glutaminy. Zastosowano to w celu umożliwienia badania faz cyklu komórkowego, co wymaga krótkiego znakowania pulsacyjnego.</li>
		<li>W dniu ekstrakcji usunąć pożywkę hodowlaną, przepłukać dołki 1,5 mL ciepłego HBSS, a następnie go odessać.</li>
		<li>Odłączyć komórki, dodając 1,5 mL trypsyny/EDTA na 4 min w temperaturze 37 °C. Kolejne kroki należy wykonywać w temperaturze 4 °C lub w lodzie.</li>
		<li>Dezaktywować trypsynę, dodając 3 mL lodowatego HBSS + dializowanej suplementacji.</li>
		<li>Zebrać komórki do probówki 15 mL i wirować przy 750 x g przez 3 min.</li>
		<li>Resuspendować osad w HBSS + dializowanej suplementacji + 1 mM EDTA do stężenia 1-2 x 106 komórek/mL, przefiltrować przez sitka komórkowe 40 µm w celu uzyskania pojedynczych komórek i przenieść do probówki 5 mL.</li>
		<li>Posortować komórki za pomocą sortera komórkowego, odrzucając debris i dublety, a następnie bramkując na wybrany marker komórkowy; posortowane komórki wirować przy 750 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: W tym przypadku sortowano komórki HeLa z prędkością 1 000 zdarzeń/s, przy ciśnieniu urządzenia 27 psi i przy użyciu dyszy 100 µm. Przez cały czas sortowania komórki należy utrzymywać w blokach chłodzących, aby obniżyć tempo metabolizmu.</li>
		<li>Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 50 µL lodowatej dH2O, aby uzyskać jednorodny osad przed dodaniem metanolu. Bezpośrednie dodanie zimnego metanolu do osadu powoduje powstanie zwartego grudkowatego osadu, który jest trudny do resuspendowania.</li>
		<li>Wyekstrahować metabolity, dodając 540 µL metanolu przechowywanego na suchym lodzie, i przechowywać ekstrakty w temperaturze -80 °C do czasu analizy LC-HRMS.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza spektrometrią mas
Uwaga: W tym miejscu opisujemy protokół analizy ekstraktów komórkowych w systemie LC-HRMS. Do analizy ekstraktów komórkowych można zastosować dowolne metody metabolomiczne. Analiza pełnego skanu (full scan) może być przydatna do wykrywania szerokiego zakresu metabolitów.
<ol>
	<li> skalibrować instrument, używając referencyjnej mieszaniny kalibracyjnej do spektrometrii mas.</li>
	<li>rozmrozić ekstrakty komórkowe na lodzie przez 30 min i wymieszać w wortexie przez 15 s.</li>
	<li>przenieść 100 µL ekstraktu komórkowego do filtra wirówkowego i wirować przez 10 min przy 13,000 x g w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>wstrzyknąć 12.5 µL filtratu do systemu LC-HRMS.</li>
	<li>rozdzielić metabolity przy użyciu kolumny do zwitterionowej chromatografii cieczowej z oddziaływaniem hydrofilowym (ZIC-HILIC) (150 mm x 4.6 mm, wielkość cząstek 5 µm) wyposażonej w kolumnę guardingową ZIC-HILIC (20 mm × 2.1 mm), stosując elucję gradientową z użyciem 0.1% kwasu mrówkowego w wodzie (rozpuszczalnik A) i acetonitrylu (rozpuszczalnik B). Rozpocząć elucję gradientową od 20% rozpuszczalnika A i zwiększać do 80% w ciągu 17 min. Utrzymać ten procent przez 4 min przy przepływie 400 µL min-1, temperaturze kolumny 23 °C oraz temperaturze tacy z próbkami 4 °C.</li>
	<li>do detekcji metabolitów użyć instrumentu sprzężonego z rozdzielaniem chromatograficznym, jako źródła jonizacji zastosować podgrzewany rozpylacz elektrosprayowy (H-ESI II) w trybie dodatnim i ujemnym oraz tryb akwizycji full scan przy rozdzielczości masy 70,000 Full Width Half Maximum (FWHM) (m/z 200).</li>
	<li>użyć azotu (czystość &gt;99.995%) jako gazu osłonowego i pomocniczego przy przepływach odpowiednio 45 i 10 a.u. (jednostki umowne), ustawić temperaturę waporyzatora na 350 °C oraz napięcie elektrosprayowe na 4 kV w trybie dodatnim i -3.5 kV w trybie ujemnym.</li>
</ol>
3. Analiza danych
<ol>
	<li>Wybierz grupę metabolitów, dla których dostępne są standardy i które wykazują piki dobrej jakości w próbkach. Piki dobrej jakości charakteryzują się wysokim stosunkiem sygnału do szumu. Ważne jest zweryfikowanie jakości pików i upewnienie się, że nie uwzględniono fałszywych izotopów. Piki izotopowe, które różnią się kształtem i/lub czasem retencji, są prawdopodobnie fałszywe.</li>
	<li>Dla próbek znakowanych izotopowo oblicz frakcje izotopomerów masy (MI), dzieląc pole piku każdego MI przez sumę pól pików wszystkich MI.</li>
	<li>Oblicz frakcje znakowanego węgla/azotu, odpowiednio wzbogacenie w 13C i 15N, zgodnie z wzorem: 
	<img alt="Wzór na obliczanie wzbogacenia: Σx=0^n (x * Mlx)/n. Równanie matematyczne do analizy danych." src="/files/ftp_upload/55011/55011eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1"> 
	gdzie n to całkowita liczba atomów węgla (lub odpowiednio azotu) w metabolicie, a MIx to frakcja MI dla x. 
	UWAGA: Wszystkie obliczenia można przeprowadzić przy użyciu języków programowania.</li>
</ol>

<ol><li>Gregersen, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+eQTLs+in+the+human+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific eQTLs in the human immune system.</a> Nat. Genet. 44 (5), 478-480 (2012).</li>
<li>Heppner, G. H. <a target="_blank" href="http://cancerres.aacrjournals.org/content/44/6/2259">Tumor heterogeneity.</a> Cancer Res. 44 (6), 2259-2265 (1984).</li>
<li>Prat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cell+lines+derived+from+breast+cancers+and+normal+mammary+tissues+for+the+study+of+the+intrinsic+molecular+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res.+Treat%22%5BJournal%5D)">Characterization of cell lines derived from breast cancers and normal mammary tissues for the study of the intrinsic molecular subtypes.</a> Breast Cancer Res. Treat. 142 (2), 237-255 (2013).</li>
<li>Magistretti, P. J., Allaman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cellular+Perspective+on+Brain+Energy+Metabolism+and+Functional+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A Cellular Perspective on Brain Energy Metabolism and Functional Imaging.</a> Neuron. 86 (4), 883-901 (2015).</li>
<li>Angelini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-presenting+dendritic+cells+provide+the+reducing+extracellular+microenvironment+required+for+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Antigen-presenting dendritic cells provide the reducing extracellular microenvironment required for T lymphocyte activation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 1491-1496 (2002).</li>
<li>Koukourakis, M. I., Giatromanolaki, A., Harris, A. L., Sivridis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+metabolic+pathways+between+cancer+cells+and+stromal+cells+in+colorectal+carcinomas%3A+A+metabolic+survival+role+for+tumor-associated+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of metabolic pathways between cancer cells and stromal cells in colorectal carcinomas: A metabolic survival role for tumor-associated stroma.</a> Cancer Res. 66 (2), 632-637 (2006).</li>
<li>Hollenbaugh, J. A., Munger, J., Kim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+profiles+of+human+immunodeficiency+virus+infected+CD4%2B+T+cells+and+macrophages+using+LC-MS%2FMS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Metabolite profiles of human immunodeficiency virus infected CD4+ T cells and macrophages using LC-MS/MS analysis.</a> Virology. 415 (2), 153-159 (2011).</li>
<li>Richardson, G. M., Lannigan, J., Macara, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+FACS+perturb+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Does FACS perturb gene expression.</a> Cytom. Part A. 87 (2), 166-175 (2015).</li>
<li>Moussaieff, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+metabolic+mapping+of+cell+types+in+plant+roots%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">High-resolution metabolic mapping of cell types in plant roots.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (13), E1232-E1241 (2013).</li>
<li>Johnson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+signature+of+colon+cancer+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metab%22%5BJournal%5D)">A metabolic signature of colon cancer initiating cells.</a> Cancer Metab. 2, 32(2014).</li>
<li>Roci, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolite+Profiling+and+Stable+Isotope+Tracing+in+Sorted+Subpopulations+of+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolite Profiling and Stable Isotope Tracing in Sorted Subpopulations of Mammalian Cells.</a> Anal. Chem. 88 (5), 2707-2713 (2016).</li>
<li>Shapiro, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+H+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , Wiley-Liss. New York. (2003).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Noack, S., Wiechert, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24708998">Quantitative metabolomics: A phantom.</a> Trends Biotechnol. 32 (5), 238-244 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasza metoda opiera się na zasadzie, że MID w metabolitach komórkowych odzwierciedlają "historię" aktywności metabolicznej komórki. Umożliwia to zbadanie aktywności metabolicznej w subpopulacji komórek, tak jak zachodziła ona w złożonej społeczności komórek, przed procedurą sortowania komórek. W przeciwieństwie do tego, obszary pików metabolitów różnią się znacznie między ekstraktami z posortowanych komórek a bezpośrednią ekstrakcją z szalki hodowlanej11. Częściowo wynika to z faktu, że różny skła...

Wyższe organizmy zawierają złożone społeczności różnych typów komórek, które współpracują ze sobą, aby realizować bardziej złożone funkcje. Na przykład guzy zawierają nie tylko komórki rakowe, ale także fibroblasty, komórki tworzące naczynia krwionośne, a często nacieki komórek odpornościowych1; Krew zawiera złożoną mieszaninę kilkudziesięciu podtypów komórek odpornościowych<klasa SUP="xref">2; A nawet hodowane linie komórkowe mogą składać się z wielu subpopulacji, takich jak podtypy luminalne i podstawowe komórek raka piersi3. Co więcej, różne typy komórek, które współistnieją, mogą wykazywać "współpracę" metaboliczną. Na przykład uważa się, że w mózgu astrocyty przekształcają glukozę w mleczan, który jest następnie "podawany" neuronom utleniającym ten substrat4; Limfocyty T są w niektórych kontekstach zależne od sąsiednich komórek dendrytycznych jako źródła cysteiny5; a komórki rakowe mogą współpracować z powiązanymi fibroblastami w nowotworach6. Aby zrozumieć zachowanie metaboliczne takich systemów, konieczne jest oddzielenie i zmierzenie aktywności metabolicznej różnych obecnych typów komórek.
Zdecydowanie najczęściej używaną metodą rozdzielania typów komórek jest sortowanie komórek aktywowane fluorescencją. Metoda ta ma szerokie zastosowanie, pod warunkiem, że typ komórki lub stan zainteresowania może być "znakowany" za pomocą przeciwciał fluorescencyjnych, ekspresji zmodyfikowanych białek fluorescencyjnych lub innych barwników. Jedną z opcji jest początkowe rozdzielenie typów komórek za pomocą sortera komórek, ponowne wyhodowanie poszczególnych uzyskanych typów komórek, a następnie przeprowadzenie badań metabolizmu tych kultur7. Jest to jednak możliwe tylko wtedy, gdy typ lub fenotyp komórki jest stabilny w warunkach hodowli i nie może uchwycić przejściowych zachowań, takich jak stany cyklu komórkowego, ani współpracy metabolicznej w kokulturach. W takich przypadkach metabolizm musi być mierzony bezpośrednio na posortowanych komórkach. Jest to trudne, ponieważ procedura sortowania komórek poddaje komórki stresom, które mogą zniekształcić ich metabolizm8, a wiemy tylko o kilku badaniach wykorzystujących to podejście9,10. W szczególności odkryliśmy, że główne metabolity, takie jak aminokwasy, mogą wyciekać z komórek przechowywanych w buforze do sortowania komórek, tak że pomiary bezwzględnej obfitości metabolitów nie są już wiarygodne11 (chociaż względne porównanie między posortowanymi frakcjami może być nadal cenne).
Aby obejść te problemy, przed sortowaniem oznaczamy komórki stabilnymi izotopami i skupiamy się na MIDach w metabolitach komórkowych, a nie na obfitości metabolitów. Ponieważ MID powstają w dłuższych skalach czasowych, krótkoterminowe narażenie na warunki sortowania powinno mieć na nie mniejszy wpływ. Określamy ilościowo MID za pomocą spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości z pełnym skanowaniem, która jest wystarczająco czuła, aby dostarczyć danych na temat setek metabolitów, zaczynając od około 500 000 posortowanych komórek, co wymaga około 30-60 minut czasu sortowania komórek. Porównuje się kontrolę "pozorowaną sortowaną" (komórki przeszły przez przyrząd do sortowania komórek bez bramkowania żadnej określonej populacji) a ekstrakcją metabolitów bezpośrednio z szalki hodowlanej w celu zapewnienia, że obserwowane MID są reprezentatywne dla tych w oryginalnej hodowli. W zależności od wyboru znaczników stabilnych izotopów, za pomocą tej metody można badać różne szlaki metaboliczne.

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>INFLUX (sorter inFlux v7)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-13C-Glukoza</td><td>Izotopy Cambridge</td><td>40762-22-9 / GLC-018</td><td></td></tr><tr><td>U-13C,15N2-glutamina</td><td>Izotopy Cambridge</td><td>CNLM-1275-H-0,1</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (JT Baker), klasa HPLC</td><td>Filtry</td> odśrodkowe VWR <td>BAKR8402.2500</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree - MC - VV. Durapore PVDF 0,1 i mikro; m</td><td>Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3,000 UHPLC</td><td>Thermo Fisher naukowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>spektrometr masowy Q-Exactive Orbitrap</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merk-Sequant ZIC HILIC (150 mm x 4,6&nbsp; mm, 5 i mikro; m)</td><td>Merck KGaA</td><td>1.50444.0001</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna ochronna Merk-Sequant ZIC HILIC (20 mm x 2,1 mm)</td><td>Merck KGaA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl Optima LC-MS, szkło bursztynowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-212</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q woda</td><td>Millipore</td><td></td><td>Produkowane w systemie gradientowym Milli-Q</td></tr><tr><td>Myrsyra 99,5% Optima (kwas mrówkowy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11423423</td><td></td></tr><tr><td>X100 Fiolka z nakrętką 1,5 ml, 8-425 32x11,6 mm, bursztynowa, 100 sztuk</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>10560053</td><td></td></tr><tr><td>X100 Lock Skruv Vitt PTFE Opakowanie 8-425 (nakrętki)</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>12458636</td><td></td></tr><tr><td>ProteoMass LTQ/FT-Hybrid ESI Poz. Tryb Cal Mix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MSCAL5</td><td>Zestaw kalibracyjny</td></tr><tr><td>SNAKESKIN 10K MWCO&nbsp;</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>88245</td><td></td></tr><tr><td>Mathematica v.10&nbsp;</td><td>Badania Wolframa</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów

A Method for Measuring Metabolism in Sorted Subpopulations of Complex Cell Communities Using Stable Isotope Tracing

Typy komórek ssaków wykazują wyspecjalizowany metabolizm i istnieje wiele dowodów na to, że różne współistniejące typy komórek angażują się we współpracę metaboliczną. Co więcej, nawet kultury jednego typu komórek mogą zawierać komórki w różnych stanach metabolicznych, takich jak komórki w stanie spoczynku lub cyklu życia. Metody pomiaru aktywności metabolicznej takich subpopulacji są cennymi narzędziami do zrozumienia metabolizmu komórkowego. Złożone populacje komórek są najczęściej rozdzielane za pomocą sortera komórek, a subpopulacje wyizolowane tą metodą mogą być analizowane metodami metabolomicznymi. Jednak problem z tym podejściem polega na tym, że procedura sortowania komórek poddaje komórki stresom, które mogą zniekształcić ich metabolizm.
Aby przezwyciężyć te problemy, doszliśmy do wniosku, że rozkłady masowych izotopomerów (MID) metabolitów z komórek hodowanych za pomocą stabilnych izotopowych składników odżywczych będą prawdopodobnie bardziej stabilne niż bezwzględne stężenia metabolitów, ponieważ MID powstają w dłuższych skalach czasowych i powinny być mniej podatne na krótkotrwałe narażenie na warunki sortowania komórek. W tym miejscu opisujemy metodę opartą na tej zasadzie, łączącą sortowanie komórek z chromatografią cieczową ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości (LC-HRMS). Procedura polega na analizie trzech rodzajów próbek: (1) ekstraktów metabolitów uzyskanych bezpośrednio z populacji złożonej; (2) ekstrakty z "pozorowanych posortowanych" komórek przepuszczonych przez urządzenie do sortowania komórek bez bramkowania żadnej określonej populacji; oraz (3) wyciągi z faktycznie posortowanych populacji. Próbne posortowane komórki są porównywane z bezpośrednią ekstrakcją w celu sprawdzenia, czy MID rzeczywiście nie są zmieniane przez samą procedurę sortowania komórek, przed analizą rzeczywistych posortowanych populacji. Pokazujemy przykładowe wyniki z komórek HeLa posortowanych według fazy cyklu komórkowego, ujawniając zmiany w metabolizmie nukleotydów.

Jako przykład opisujemy tutaj eksperyment badający metabolizm komórek HeLa posortowanych zgodnie z fazą cyklu komórkowego. Aby oznakować szeroki zakres głównych metabolitów zarówno w atomach węgla, jak i azotu, hodowaliśmy komórki przez 48 h, wykorzystując jako znaczniki U-13C-glukozę oraz U-13C, 15N-glutaminę. W celu uzyskania bogatych rozkładów MID dla eksperymentu walidacyjnego, wybraliśmy tutaj mieszaninę 40% U-13C-glukozy i 70% U-13</s...

Ten artykuł opisuje metodę badania metabolizmu komórkowego w złożonych społecznościach wielu typów komórek, wykorzystując kombinację śledzenia stabilnych izotopów, sortowania komórek w celu izolowania określonych typów komórek oraz spektrometrii mas.

Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów

Mammalian cell types exhibit specialized metabolism, and there is ample evidence that various co-existing cell types engage in metabolic cooperation. ...

Ogólnym celem tej metody jest wykorzystanie śledzenia izotopów do pomiaru metabolizmu posortowanych populacji złożonych społeczności komórkowych. Dzięki tej metodzie możemy badać różnice metaboliczne między subpopulacjami złożonych społeczności komórkowych, a także współpracę metaboliczną między tymi subpopulacjami. Główną zaletą tej techniki jest to, że łącząc śledzenie izotopów z sortowaniem komórek, możemy uzyskać bardziej wiarygodną miarę metabolizmu, a także możemy zweryfikować, jak wiarygodna jest metoda.Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ łączy ona różne techniki, a sposób obchodzenia się z komórkami i długość procedury mogą wpływać na metabolizm komórkowy. Do ekstrakcji metabolitów z szalki należy najpierw wyhodować komórki na sześciodołkowej płytce w stabilnym pożywce hodowlanej znakowanej izotopami, zawierającej dializowane suplementy. Gdy komórki osiągną 75% konfluencji, przepłucz studzienki dwa razy 500 mikrolitrami zimnego HBSS zawierającego równomiernie oznakowaną glukozę.Następnie dodaj 600 mikrolitrów 100% wstępnie schłodzonego metanolu z suchego lodu do każdej studzienki i przenieś płytkę do suchego lodu. Użyj skrobaka do komórek, aby odłączyć komórki, a następnie ostrożnie przenieś ekstrakty z każdej studzienki do indywidualnych probówek mikrowirówek. Przechowuj komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy spektrometrii mas.Do ekstrakcji metabolitów posortowanych komórek, hoduje się komórki w 100-milimetrowym naczyniu w znakowanej pożywce hodowlanej z dializowanymi suplementami, tak aby osiągnęły 75% zbiegu do dnia sortowania. W celu znakowania impulsowego komórek posortowanych w cyklu komórkowym, należy hodować komórki w nieznakowanej pożywce zawierającej dializowane suplementy, aż osiągną 75% konfluencji. Następnie znakuj komórki pulsacyjnie przez dwie godziny, zastępując pożywkę świeżo znakowaną pożywką hodowlaną.Opłucz naczynie ciepłym HBSS zawierającym jednolicie oznakowaną glukozę i odłącz komórki za pomocą 1,5 mililitra trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po czterech minutach dezaktywuj trypsynę trzema mililitrami lodowatego HBSS zawierającego znakowaną glukozę i dializowane suplementy, a następnie przenieś komórki do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania. Ponownie zawiesić osad w HBSS zawierający znakowaną glukozę, dializowane suplementy i EDTA w stężeniu od jednego do dwóch razy od 10 do sześciu komórek na mililitr i przefiltrować komórki przez sitko o grubości 40 mikronów, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.Przenieś komórki do pięciomililitrowej probówki i posortuj je na cytometrze przepływowym. W celu ekstrakcji metabolitów z pozorowanych posortowanych komórek, należy usunąć resztki i posortować tylko singlety. W celu ekstrakcji metabolitów z komórek posortowanych w cyklu komórkowym, należy usunąć szczątki i dublety, a następnie posortować komórki na G1 i SG2M, w oparciu o fluorescencję sondy gemininy.Pod koniec sortowania zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach lodowatej wody destylowanej, aby uzyskać jednorodny granul. Następnie szybko wyekstrahuj metabolity, dodając 540 mikrolitrów metanolu schłodzonego suchym lodem. Przechowywać próbkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy LCMS.Ekstrakcja metabolitów z posortowanych komórek musi być dobrze zaplanowana z wyprzedzeniem, a prace eksperymentalne muszą być zakończone tak szybko, jak to możliwe, w celu zminimalizowania zmian metabolicznych. Do analizy wyekstrahowanych metabolitów należy najpierw wybrać pewną liczbę metabolitów o odpowiadających im dostępnych wzorcach, które wykazują piki dobrej jakości próbki. Następnie należy sprawdzić jakość pików, uważając, aby nie uwzględnić fałszywych izotopów.Oblicz izotop masowy z naszych frakcji dla próbek oznaczonych izotopami, dzieląc powierzchnię piku każdego izotopu masowego z naszej frakcji przez całkowite powierzchnie pików wszystkich izotopów masowych z naszych frakcji. Następnie oblicz oznaczone frakcje węgla do wzbogacenia węgla-13, korzystając ze wzoru na wzbogacenie węgla. Na koniec oblicz znakowane frakcje azotu do wzbogacania azotu-15 przy użyciu wzoru na wzbogacanie azotu.W tym reprezentatywnym eksperymencie 66 metabolitów wybranych z analizy danych było obecnych w pozorowanych posortowanych komórkach, z których 60 wydawało się być oznaczonych podobnym izotopem masy z naszych rozkładów między ekstraktami z talerzy a makietami posortowanymi komórkami. Na przykład izotop masy z naszego rozkładu glutaminianu jest podobny między posortowanymi ekstraktami z naczynia i makiety, co wskazuje, że izotop masy glutaminianu z naszej dystrybucji jest również wiarygodny w posortowanych populacjach komórek. Analiza komórek HELA posortowanych na etapy cyklu komórkowego G0, G1 lub SG2M przy użyciu sondy gemininy FUCCI ujawnia znakowanie cytydyny w obu populacjach z wyższym wzbogaceniem w stadium SG2M, co jest zgodne ze zwiększoną syntezą nukleotydów de novo podczas fazy S.W tym eksperymencie izotop masy z naszego rozmieszczenia wykazywał ten sam wzór w obu frakcjach posortowanych w cyklu komórkowym, co sugeruje, że używany jest ten sam szlak syntezy, ale jest bardziej aktywny na etapie SG2M, co pokazuje, że różnice metaboliczne są łatwo wykrywalne tą metodą, nawet między blisko spokrewnionymi subpopulacjami. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobre pojęcie o tym, jak wyodrębnić metabolity z posortowanych frakcji i zrozumieć zastrzeżenia. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o szybkim obchodzeniu się z komórkami podczas sortowania i ekstrakcji metabolitów, ponieważ sposób i czas obchodzenia się z komórkami może wpływać na ich metabolizm.Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu pięciu godzin. Tę procedurę można zastosować do innych typów komórek. Na przykład podzbiory komórek odpornościowych we krwi lub różne typy komórek w guzie, przy użyciu różnych sond, przeciwciał lub metod barwienia do sortowania.

a-method-for-measuring-metabolism-sorted-subpopulations-complex-cell

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano profilowanie stabilnych izotopów za pomocą analizy chromatografii gazowej sprzężonej ze spektrometrią mas w celu badania przepływu metabolitów pośrednich u nicienia Caenorhabditis elegans. Szczegółowo przedstawiono metody oceny wzbogacenia izotopowego w dwutlenku węgla, kwasach organicznych i aminokwasach po ekspozycji na izotopy, zarówno podczas rozwoju na płytkach agarowych, jak i w okresie dorosłości w hodowli ciekłej.

Stabilne profilowanie izotopowe strumieni metabolicznych produktów pośrednich u Caenorhabditis elegans w stadium rozwojowym i dorosłym

Znakowanie izotopem 13C jest użyteczną techniką określania centralnego metabolizmu komórkowego dla różnych typów mikroorganizmów. Po hodowli komórek ze specyficznym znakowanym substratem, pomiar GC-MS może ujawnić funkcjonalne szlaki metaboliczne na podstawie unikalnych wzorów znakowania w aminokwasach proteinogennych.

Potwierdzanie i odkrywanie szlaków metabolicznych poprzez znakowanie 13C aminokwasów proteinogennych

Aktywna społeczność bakteryjna związana z jelitami Spodoptera littoralis, została określona przez sondowanie stabilnymi izotopami (SIP) sprzężone z pirosekwencjonowaniem. Korzystając z tej metodologii, identyfikacja metabolicznie aktywnych gatunków bakterii w społeczności została przeprowadzona z wysoką rozdzielczością i precyzją.

Identyfikacja metabolicznie aktywnych bakterii w jelicie ogólnego Spodoptera littoralis za pomocą sondowania stabilnych izotopów DNA przy użyciu 13C-glukozy

Ten protokół opisuje eksperymentalną procedurę ilościowego i kompleksowego badania metabolizmu wielu źródeł składników odżywczych. Ten przepływ pracy, oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi i procedury analitycznej, pozwala na określenie losu spożywanych składników odżywczych i pochodzenia metabolicznego cząsteczek syntetyzowanych przez mikroorganizmy.

Przebieg pracy oparty na połączeniu eksperymentów ze znacznikami izotopowymi w celu zbadania metabolizmu mikrobiologicznego wielu źródeł składników odżywczych

Podejście markerów troficznych kwasów tłuszczowych, tj. asymilacja kwasów tłuszczowych jako całej cząsteczki i transfer do tkanki konsumenckiej bez lub z niewielkimi modyfikacjami, jest utrudnione przez luki w wiedzy na temat metabolizmu kwasów tłuszczowych u małych bezkręgowców glebowych. Profilowanie izotopologiczne jest cennym narzędziem do rozplątywania oddziaływań troficznych.

Profilowanie izotopologu kwasów tłuszczowych 13C zapewnia wgląd w troficzny transfer węgla i metabolizm lipidów u konsumentów bezkręgowców

Tutaj prezentujemy solidny protokół do ilościowego oznaczania 40 związków biorących udział w centralnym metabolizmie węgla i energii w reakcjach syntezy białek bez komórek. Bezkomórkowa mieszanina syntezy jest derywatyzowana aniliną w celu skutecznego rozdzielania za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami, a następnie oznaczana ilościowo za pomocą spektrometrii mas przy użyciu izotopowo znakowanych wzorców wewnętrznych.

Bezwzględna kwantyfikacja metabolizmu syntezy białek bezkomórkowych za pomocą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami i spektrometrią mas

Ten protokół opisuje proces metabolicznego znakowania starzejących się i niedzielących się komórek za pomocą pulsacyjnego SILAC, nieukierunkowaną analizę spektrometrii mas i uproszczone obliczanie okresów półtrwania białek.

Pomiar szybkości obrotu białek w starzejących się i niedzielących się hodowanych komórkach z etykietowaniem metabolicznym i spektrometrią mas

Tutaj prezentujemy protokół do dokładnego i niezawodnego pomiaru metabolitów w rzadkich typach komórek. Udoskonalenia techniczne, w tym zmodyfikowany płyn osłonkowy do sortowania komórek i generowanie odpowiednich próbek ślepych, umożliwiają kompleksową ocenę ilościową metabolitów przy wkładzie zaledwie 5000 komórek na próbkę.

Ukierunkowana metabolomika rzadkich komórek pierwotnych

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący optyczną fototermiczną hybrydyzację in situ z fluorescencją podczerwieni (OPTIR-FISH), znaną również jako fototermiczna RYBA w średniej podczerwieni (MIP-FISH), do identyfikacji pojedynczych komórek i zrozumienia ich metabolizmu. Metodologia ta może być szeroko stosowana do różnych zastosowań, w tym do mapowania metabolizmu komórkowego z rozdzielczością pojedynczej komórki.

Optyczna fototermiczna hybrydyzacja in situ z fluorescencją w podczerwieni (OPTIR-FISH)

Protokół ten integruje niestandardowy system bioreaktora z hiperspolaryzowaną spektroskopią NMR ¹³C w celu pomiaru metabolizmu pirogronianu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, poprawiając odtwarzalność i dokładność kinetyczną w badaniach metabolicznych i badaniach przesiewowych leków.

Detekcja metaboliczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu hiperpolaryzowanego 13C NMR

Poznaj metodę pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów i spektrometrii mas. Technika ta umożliwia badanie różnic metabolicznych oraz współpracy między typami komórek.

Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów (Wideo) | JoVE Journal

Metoda pomiaru metabolizmu w posortowanych subpopulacjach złożonych zbiorowisk komórkowych za pomocą śledzenia stabilnych izotopów

Przeglądaj więcej filmów