Name: Inokulowanie komarów Anopheles gambiae koralikami w celu wywołania i zmierzenia odpowiedzi immunologicznej melanizacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj technikę inokulacji koralikami u Anopheles gambiae w celu stymulacji i pomiaru odpowiedzi melanizacyjnej w immunologii ekologicznej. Metoda umożliwia ilościową ocenę odpowiedzi immunologicznej komarów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania były możliwe dzięki finansowaniu z Uniwersytetu w Neuchâtel. Chcielibyśmy podziękować wszystkim uczniom, którzy pomogli w doskonaleniu tej techniki, a konkretnie naszemu koledze Kevinowi Thieventowi. Chcielibyśmy również podziękować członkom Thomas Lab za udostępnienie swojego laboratorium. Chcielibyśmy podziękować Janet Teeple za jej pomoc w hodowli komarów. Chcielibyśmy również podziękować Loyal Hall w laboratorium Pr. Toma Bakera za jego pomoc w przygotowaniu szklanych probówek mikrokapilarnych.

1. Roztwór soli fizjologicznej do wstrzykiwań i sekcji
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór soli, dodając NaCl, KCl i CaCl2 do wody destylowanej, aby uzyskać 1,3 mM NaCl, 0,5 mM KCl i 0,2 mM CaCl2 przy pH = 6,8.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 0,1% roztworu zieleni metylowej do 99 mililitrów roztworu soli fizjologicznej, aby zabarwić przezroczyste kulki. Jest to 0,001% zielony metylowy "roztwór do wstrzykiwań".</li>
	<li>Następnie dodać 5 ml 0,1% roztworu zieleni metylowej do 45 ml roztworu soli fizjologicznej. Ten 0,01% zielony metylowy "roztwór preparacyjny" jest 10 razy bardziej skoncentrowany w zieleni metylowej, aby ułatwić zabarwienie kulek i ich obserwację podczas sekcji. 
	UWAGA: W razie potrzeby wysterylizuj bufor z filtra.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kapilar
<ol>
	<li>Szklane rurki mikrokapilarne ciągnące na gorąco w celu uzyskania bardzo cienkiej końcówki nieco większej niż najmniejsze kulki (φ = 40 μm)42.</li>
	<li>Otwórz i wyreguluj każdą kapilarę, łamiąc końcówkę pęsetą lub odpiłowując końcówkę.</li>
</ol>
3. Hodowla komarów
<ol>
	<li>Tył A. gambiae w temperaturze 26 ± 1 °C, wilgotności względnej 70 ± 5% i cyklu światło: ciemność 12:12. Trzymaj dorosłe samice i zapewnij im dostęp do 10% roztworu cukru.</li>
</ol>
4. Zaznaczanie koralików za pomocą kapilary
<ol>
	<li>Wlać 0,009 g ujemnie naładowanych kulek (o średnicy 40-120 μm) na 5 cm szalkę Petriego i dodać 5 ml roztworu do wstrzykiwań 30 minut wcześniej. 
	UWAGA: Celem jest, aby barwnik zabarwił koraliki, aby ułatwić wybór koralików do wstrzyknięcia. Kulki należy sterylizować w autoklawie, jeśli nie znajdują się w sterylnym słoiku.</li>
	<li>Za pomocą kapilary zamontowanej w bańce pipety kapilarnej wizualnie wybrać najmniejszą kulkę w 0,1 μl roztworu soli fizjologicznej pod mikroskopem dwuokularowym. 
	UWAGA: W przypadku jednoczesnego zaszczepiania kilku kulek należy wybrać trzy kulki z całkowitej objętości 0,1 μl.</li>
</ol>
5. Postępowanie z komarami i szczepienie
<ol>
	<li>Za pomocą aspiratora do owadów umieść każdego komara w tubce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Schłodź krótko każdego komara, umieszczając rurkę w pokruszonym lodzie (2-5 min).</li>
	<li>Umieść komara na prawym boku pod mikroskopem lornetkowym.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym zaszczepij komara kapilarną, mocno przebijając lewą stronę naskórka klatki piersiowej, a następnie wstrzykując płyn i koralik. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić mięśni lotu, trzymając kapilarnę jak najbardziej prostopadle do komara.</li>
	<li>Usuń kapilarę.</li>
	<li>Używając lekkich jak piórko kleszczy entomologicznych, umieść każdą samicę indywidualnie w plastikowym kubku o pojemności 180 ml pokrytym moskitierą; daj im dostęp do 10% roztworu cukru. 
	UWAGA: Należy zachować ostrożność w przypadku roztworu cukru, ponieważ komar może utknąć na kroplach roztworu cukru.</li>
</ol>
6. Sekcja komarów i fotografia koralików
<ol>
	<li>Sprawdź, czy komary są żywe 24 godziny po szczepieniu. Jeśli tak, sprawdź ich stan i trzymaj tylko te komary, które są w stanie latać.</li>
	<li>Zamrozić te komary w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: W razie potrzeby można je przechowywać od kilku dni do miesięcy przed preparacją.</li>
	<li>Usuń skrzydła komarów za pomocą pęsety pod mikroskopem lornetkowym przy 32-krotnym powiększeniu. Przymocuj skrzydła do szkiełek za pomocą przezroczystej taśmy. Zapisz kod używany dla każdego komara z osobna.</li>
	<li>Umieść szkiełka w skanerze i zeskanuj je w rozdzielczości 1 200 dpi. 
	UWAGA: Sprawdź, czy kod jest czytelny dla każdego komara z osobna.</li>
	<li>Na szklanym szkiełku mikroskopowym i w roztworze preparacyjnym użyj kleszczy, aby oddzielić klatkę piersiową od głowy i brzucha.</li>
	<li>Otwórz klatkę piersiową za pomocą kleszczy, aby pobrać koraliki. 
	UWAGA: Koraliki, które nie przemieszczają się do brzucha, nie stykają się ze sobą i większość z nich swobodnie unosi się w hemolimfie. Uważaj, aby nie złamać koralika kleszczami, ponieważ niemelanizowany koralik może być trudny do znalezienia. Odczekaj od 1 do 5 minut, aż koraliki nabiorą koloru.</li>
	<li>Przenieś koraliki w kropli roztworu preparacyjnego na szklane szkiełko mikroskopowe przed wykonaniem zdjęcia. 
	UWAGA: Nie ma potrzeby mycia koralików.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu wyposażonego w kamerę wykonaj cyfrowy obraz każdego koralika przy standardowym oświetleniu i 400-krotnym powiększeniu. 
	UWAGA: Nie zmieniaj oświetlenia między różnymi obrazami, aby umożliwić ich porównanie.</li>
</ol>
7. Analiza obrazu: Melanizacja koralików
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do analizy obrazu. Kliknij "plik", a następnie "otwórz", aby znaleźć obraz koralika.</li>
	<li>Kliknij "analizuj". Kliknij "ustaw pomiary". Zaznacz pole "średnia wartość szarości" w oknie "ustaw pomiary".</li>
	<li>Kliknij ikonę narzędzia do zaznaczania okręgu. Wybierz obwód ściegu; Pozostań wewnątrz koralika i unikaj otaczającej go świetlistej aureoli.</li>
	<li>Kliknij menu "analizuj". Kliknij "zmierz". Uzyskaj średnią wartość szarości i rozmiar pola przekroju poprzecznego ściegu.
	<ol>
		<li>Aby uzyskać wartość melanizacji każdego koralika, wykonaj następującą operację za pomocą kalkulatora lub oprogramowania kalkulatora: "256 - średnia wartość szarości". Miara melanizacji to wartość z zakresu od 0 do 256, gdzie 0 oznacza całkowicie biały obraz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dong, Y., Aguilar, R., Xi, Z., Warr, E., Mongin, E., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+gambiae+immune+responses+to+human+and+rodent+Plasmodium+parasite+species%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+pathog%22%5BJournal%5D)">Anopheles gambiae immune responses to human and rodent Plasmodium parasite species.</a> PLoS pathog. 2 (6), e52(2006).</li>
<li>Sadd, B. M., Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PERSPECTIVE%3A+Principles+of+ecological+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Evolutionary+Appl%22%5BJournal%5D)">PERSPECTIVE: Principles of ecological immunology.</a> Evolutionary Appl. 2 (1), 113-121 (2008).</li>
<li>Crompton, P. D., Moebius, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Immunity+in+Man+and+Mosquito%3A+Insights+into+Unsolved+Mysteries+of+a+Deadly+Infectious+Disease%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immuno%22%5BJournal%5D)">Malaria Immunity in Man and Mosquito: Insights into Unsolved Mysteries of a Deadly Infectious Disease*.</a> Annu Rev Immuno. 32 (1), 157-187 (2014).</li>
<li>Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EVOLUTIONARY+ECOLOGY+OF+INSECT+IMMUNE+DEFENSES%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">EVOLUTIONARY ECOLOGY OF INSECT IMMUNE DEFENSES.</a> Annu Rev Entomol. 50 (1), 529-551 (2005).</li>
<li>Hillyer, J. F., Schmidt, S. L., Christensen, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+phagocytosis+and+melanization+of+bacteria+and+Plasmodium+sporozoites+by+hemocytes+of+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22J+parasito%22%5BJournal%5D)">Rapid phagocytosis and melanization of bacteria and Plasmodium sporozoites by hemocytes of the mosquito Aedes aegypti.</a> J parasito. 89 (1), 62-69 (2003).</li>
<li>Carissimo, G., Pondeville, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+immunity+of+Anopheles+gambiae+is+highly+compartmentalized%2C+with+distinct+roles+for+RNA+interference+and+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Antiviral immunity of Anopheles gambiae is highly compartmentalized, with distinct roles for RNA interference and gut microbiota.</a> PNAS. 112 (2), E176-E185 (2015).</li>
<li>Christensen, B. M., Li, J., Chen, C. -C., Nappi, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanization+immune+responses+in+mosquito+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+parasito%22%5BJournal%5D)">Melanization immune responses in mosquito vectors.</a> Trends parasito. 21 (4), 192-199 (2005).</li>
<li>Collins, F., Sakai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+selection+of+a+Plasmodium-refractory+strain+of+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic selection of a Plasmodium-refractory strain of the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Science. 234 (4776), 607-610 (1986).</li>
<li>Warr, E., Lambrechts, L., Koella, J. C., Bourgouin, C., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+gambiae+immune+responses+to+Sephadex+beads%3A+Involvement+of+anti-Plasmodium+factors+in+regulating+melanization%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Molec%22%5BJournal%5D)">Anopheles gambiae immune responses to Sephadex beads: Involvement of anti-Plasmodium factors in regulating melanization.</a> Insect Biochem Molec. 36 (10), 769-778 (2006).</li>
<li>Fuchs, S., Behrends, V., Bundy, J. G., Crisanti, A., Nolan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylalanine+metabolism+regulates+reproduction+and+parasite+melanization+in+the+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Phenylalanine metabolism regulates reproduction and parasite melanization in the malaria mosquito.</a> PloS one. 9 (1), e84865(2014).</li>
<li>Cerenius, L., Söderhäll, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophenoloxidase-activating+system+in+invertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Immuno+Rev%22%5BJournal%5D)">The prophenoloxidase-activating system in invertebrates.</a> Immuno Rev. 198, 116-126 (2004).</li>
<li>Cerenius, L., Lee, B. L., Söderhäll, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proPO-system%3A+pros+and+cons+for+its+role+in+invertebrate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Immuno%22%5BJournal%5D)">The proPO-system: pros and cons for its role in invertebrate immunity.</a> Trend Immuno. 29 (6), 263-271 (2008).</li>
<li>Moret, Y., Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoret%2C+Y+%22Survival+for+immunity%3A+the+price+of+immune+system+activation+for+bumblebee+workers%22">Survival for immunity: the price of immune system activation for bumblebee workers</a>. , Science. New York, N.Y. 1166-1168 (2000).</li>
<li>Suwanchaichinda, C., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Larval+Nutrition%2C+Adult+Body+Size%2C+and+Adult+Temperature+on+the+Ability+of+Anopheles+gambiae%28Diptera%3A+Culicidae%29+to+Melanize+Sephadex+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Effects of Larval Nutrition, Adult Body Size, and Adult Temperature on the Ability of Anopheles gambiae(Diptera: Culicidae) to Melanize Sephadex Beads.</a> J Med Entomol. 35 (2), 157-161 (1998).</li>
<li>Chun, J., Riehle, M., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Mosquito+Age+and+Reproductive+Status+on+Melanization+of+Sephadex+Beads+in+Plasmodium-Refractory+and+-Susceptible+Strains+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effect of Mosquito Age and Reproductive Status on Melanization of Sephadex Beads in Plasmodium-Refractory and -Susceptible Strains of Anopheles gambiae.</a> J Invertebr Pathol. 66 (1), 11-17 (1995).</li>
<li>Schwartz, A., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanization+of+Plasmodium+falciparum+and+C-25+Sephadex+Beads+by+Field-Caught+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29+from+Southern+Tanzania%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Entomol%22%5BJournal%5D)">Melanization of Plasmodium falciparum and C-25 Sephadex Beads by Field-Caught Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) from Southern Tanzania.</a> J Med Entomol. 39 (1), 84-88 (2002).</li>
<li>Zahedi, M., Denham, D. A., Ham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+and+melanization+responses+of+Armigeres+subalbatus+against+inoculated+Sephadex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invertebr+Pathol%22%5BJournal%5D)">Encapsulation and melanization responses of Armigeres subalbatus against inoculated Sephadex beads.</a> J Invertebr Pathol. 59 (3), 258-263 (1992).</li>
<li>Laughton, A. M., Garcia, J. R., Altincicek, B., Strand, M. R., Gerardo, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+immune+responses+in+the+pea+aphid%2C+Acyrthosiphon+pisum%5BTitle%5D)+AND+%22J+insect+physiol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of immune responses in the pea aphid, Acyrthosiphon pisum.</a> J insect physiol. 57 (6), 830-839 (2011).</li>
<li>Barreaux, A. M. G., Barreaux, P., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overloading+the+immunity+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae+with+multiple+immune+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Vector%22%5BJournal%5D)">Overloading the immunity of the mosquito Anopheles gambiae with multiple immune challenges.</a> Parasite Vector. 9 (1), 210(2016).</li>
<li>Lazzaro, B. P., Rolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Danger%2C+Microbes%2C+and+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Danger, Microbes, and Homeostasis.</a> Science. 332 (6025), 43-44 (2011).</li>
<li>Arrighi, R. B. G., Faye, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+GPI+toxin%3A+a+common+foe+for+man+and+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+trop%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum GPI toxin: a common foe for man and mosquito.</a> Acta trop. 114 (3), 162-165 (2010).</li>
<li>Michel, K., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+immunity+against+Plasmodium%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Molec%22%5BJournal%5D)">Mosquito immunity against Plasmodium.</a> Insect Biochem Molec. 35 (7), 677-689 (2005).</li>
<li>Osta, M. A., Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%3A+comparative+and+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in the malaria vector Anopheles gambiae: comparative and functional genomics.</a> J Exp Biol. 207 (15), 2551-2563 (2004).</li>
<li>Christophides, G. K., Vlachou, D., Kafatos, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+and+functional+genomics+of+the+innate+immune+system+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Comparative and functional genomics of the innate immune system in the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Immunol Rev. 198 (1), 127-148 (2004).</li>
<li>Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+RNAi+is+the+major+innate+immune+pathway+controlling+arbovirus+infection+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Future+microbiol%22%5BJournal%5D)">Mosquito RNAi is the major innate immune pathway controlling arbovirus infection and transmission.</a> Future microbiol. 6 (3), 265-277 (2011).</li>
<li>Fragkoudis, R., Attarzadeh-Yazdi, G., Nash, A. A., Fazakerley, J. K., Kohl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+dissecting+mosquito+innate+immune+responses+to+arbovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Advances in dissecting mosquito innate immune responses to arbovirus infection.</a> J Gen Virol. , (2009).</li>
<li>Schwartz, A., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cost+of+immunity+in+the+yellow+fever+mosquito%2C+Aedes+aegypti+depends+on+immune+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+evol+biol%22%5BJournal%5D)">The cost of immunity in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti depends on immune activation.</a> J evol biol. 17 (4), 834-840 (2004).</li>
<li>Lambrechts, L., Vulule, J. M., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+correlation+between+melanization+and+antibaterial+immune+responses+in+a+natural+population+of+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Genetic correlation between melanization and antibaterial immune responses in a natural population of the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Evolution. 58 (10), 2377(2004).</li>
<li>Boete, C., Paul, R. E. L., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+and+indirect+immunosuppression+by+a+malaria+parasite+in+its+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22P+Roy+Soc+B-Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Direct and indirect immunosuppression by a malaria parasite in its mosquito vector.</a> P Roy Soc B-Biol Sci. 271 (1548), 1611-1615 (2004).</li>
<li>Sacks, D., Sher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evasion+of+innate+immunity+by+parasitic+protozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+immunol%22%5BJournal%5D)">Evasion of innate immunity by parasitic protozoa.</a> Nat immunol. 3 (11), 1041-1047 (2002).</li>
<li>Zambrano-Villa, S., Rosales-Borjas, D., Carrero, J. C., Ortiz-Ortiz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+protozoan+parasites+evade+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Parasito%22%5BJournal%5D)">How protozoan parasites evade the immune response.</a> Trend Parasito. 18 (6), 272-278 (2002).</li>
<li>Damian, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+immune+evasion+and+exploitation%3A+reflections+and+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Parasite immune evasion and exploitation: reflections and projections.</a> Parasitology. 115, S169-S175 (1997).</li>
<li>Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+immune+evasion%3A+a+momentous+molecular+war%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+ecol+evol%22%5BJournal%5D)">Parasite immune evasion: a momentous molecular war.</a> Trend ecol evol. 23 (6), 318-326 (2008).</li>
<li>Schmid-Hempel, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+defence%2C+parasite+evasion+strategies+and+their+relevance+for+%26%2334%3Bmacroscopic+phenomena%26%2334%3B+such+as+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22P+Roy+Soc+B-Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Immune defence, parasite evasion strategies and their relevance for &#34;macroscopic phenomena&#34; such as virulence.</a> P Roy Soc B-Biol Sci. 364 (1513), 85-98 (2009).</li>
<li>Stearns, S. C., Koella, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+phenotypic+plasticity+in+life+history+traits-+predictions+of+reaction+norms+for+age+and+size+at+maturity%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">The evolution of phenotypic plasticity in life history traits- predictions of reaction norms for age and size at maturity.</a> Evolution. 40 (5), 893-913 (1986).</li>
<li>Stearns, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life-history+tactics%3A+a+review+of+the+ideas%5BTitle%5D)+AND+%22Q+rev+biol%22%5BJournal%5D)">Life-history tactics: a review of the ideas.</a> Q rev biol. 51 (1), 3-47 (1976).</li>
<li>Valtonen, T. M., Kleino, A., Ramet, M., Rantala, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+Reveals+Maintenance+Cost+of+Humoral+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Starvation Reveals Maintenance Cost of Humoral Immunity.</a> Evol Biol. 37 (1), 49-57 (2010).</li>
<li>Sheldon, B. C., Verhulst, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecological+immunology%3A+costly+parasite+defences+and+trade-offs+in+evolutionary+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Ecol+Evo%22%5BJournal%5D)">Ecological immunology: costly parasite defences and trade-offs in evolutionary ecology.</a> Trend Ecol Evo. 11 (8), 317-321 (1996).</li>
<li>Graham, A. L., Allen, J. E., Read, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+causes+and+consequences+of+immunopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Ecol+Evol+S%22%5BJournal%5D)">Evolutionary causes and consequences of immunopathology.</a> Annu Rev Ecol Evol S. 36, 373-397 (2005).</li>
<li>Best, A., Long, G., White, A., Boots, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+implications+of+immunopathology+for+parasite+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22P+Roy+Soc+B-Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The implications of immunopathology for parasite evolution.</a> P Roy Soc B-Biol Sci. 279 (1741), 3234-3240 (2012).</li>
<li>Cator, L. J., George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((34%3BManipulation%26%2334%3B+without+the+parasite%3A+altered+feeding+behaviour+of+mosquitoes+is+not+dependent+on+infection+with+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22P+Roy+Soc+B-Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">34;Manipulation&#34; without the parasite: altered feeding behaviour of mosquitoes is not dependent on infection with malaria parasites.</a> P Roy Soc B-Biol Sci. 280 (1763), 20130711(2013).</li>
<li>Voordouw, M. J., Lambrechts, L., Koella, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+maternal+effects+after+stimulation+of+the+melanization+response+in+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Oikos%22%5BJournal%5D)">No maternal effects after stimulation of the melanization response in the yellow fever mosquito Aedes aegypti.</a> Oikos. 117 (8), 1269-1279 (2008).</li>
<li>Paskewitz, S., Riehle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Plasmodium+refractory+and+susceptible+strains+of+Anopheles+gambiae+to+inoculated+Sephadex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+comp+immunol%22%5BJournal%5D)">Response of Plasmodium refractory and susceptible strains of Anopheles gambiae to inoculated Sephadex beads.</a> Dev comp immunol. 18 (5), 369-375 (1994).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Ta technika iniekcji jest przydatna do stymulowania i badania reakcji melanizacji u komarów. Na przykład tutaj badaliśmy wpływ obciążenia bodźcami immunologicznymi.
Krytycznym krokiem w tej procedurze jest prawidłowe zaszczepienie komara. Wszelkie nadmierne uszkodzenia mięśni lotu lub samego komara mogą uniemożliwić komarowi żerowanie lub zabić go przed rozbiorem. Drugim kluczowym krokiem jest utrzymanie komarów na lodzie wystarczająco długo, aby je znokautować bez zabijania. Mały pojemnik uła...

Owady polegają na odpowiedziach immunologicznych, aby chronić się przed pasożytami i patogenami 1-3, które przenikają przez ich naskórek lub nabłonek jelita środkowego4. U komarów reakcje te są skuteczne przeciwko bakteriom5, wirusom6, nicieniom filarialnym7 i pasożytom malarii1,8,9. U komarów kluczową odpowiedzią immunologiczną jest zamknięcie obcych cząstek w melaninie10-12. Ta enkapsulacja może wystąpić w jelicie środkowym lub w układzie krążenia hemolimfy10-12. Ta reakcja melanizacji jest wynikiem kaskady pro-fenooksydazy10-12 i może prowadzić do śmierci pasożytów lub do ich fagocytozy. U dorosłych komarów, u których liczba komórek hemocytów jest ograniczona, melanizacja jest reakcją humoralną, podobnie jak przeciwko pasożytom Plasmodium lub nicieniom filarialnym 7. U niektórych innych owadów to bezpośrednio komórki hemocytów gromadzą się wokół pasożyta, aby go melanizować7. Poza tym melanina jest również niezbędna w kilku innych procesach fizjologicznych, takich jak produkcja jaj i gojenie się ran naskórka7.
Stymulacja odpowiedzi immunologicznej jest używana jako narzędzie do badania odporności owadów w kilku systemach modelowych rolnictwa i zdrowia publicznego13-18. Jest stosowany u komarów Anopheles gambiae, głównego wektora malarii w Afryce, do badania interakcji gospodarz-pasożyt 14-16,19. Techniki te opierają się na zdolności owadów do wykrywania pasożytów za pomocą ich receptorów rozpoznawania wzorców (PRR)2. Komary mogą również wykrywać inne cząsteczki zakłócające ich biologię, takie jak wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), lub wykrywać własne uszkodzone komórki w wyniku uwalniania kolagenu i kwasów nukleinowych. Komórki odpornościowe komarów, takie jak hemocyty, są używane do wykrywania20-23. Głównymi szlakami sygnalizacji immunologicznej są Imd, Toll, JAK/STAT24 i interferencja kwasu rybonukleinowego (RNAi)25,26. Zarówno szlaki Toll, jak i Imd wpływają na odpowiedź melanizacji i oddziałują z kaskadą pro-fenolooksydazy 10-12.
Standardowym narzędziem używanym do stymulowania reakcji melanizacji jest zaszczepienie komara małym koralikiem do hemolimfy klatki piersiowej. Stopień enkapsulacji melaniny można następnie zmierzyć19 po pobraniu koralika przez rozwarstwienie komara. W większości badań wstrzyknięto tylko jeden koralik nakomara15,16,27, ale możliwe jest wstrzyknięcie większej liczby koralików w celu zbadania granic odpowiedzi melanizacji19. Kulki te są wstrzykiwane za pomocą roztworu do wstrzykiwań (surowicy fizjologicznej) w celu ograniczenia zaburzeń fizjologii komara i wysuszenia komara15,16,27. Do tego roztworu dodaje się barwnik, aby ułatwić wybór koralików. To samo dotyczy roztworu preparacyjnego używanego do pobierania koralika15,16,27.
Zaletą zaszczepiania owadów bodźcami niepatogennymi jest możliwość skupienia się na bezpośrednim wpływie na odpowiedź immunologiczną. Nie ma żadnych komplikacji spowodowanych patogennością pasożytów28, immunosupresją 29-31 lub unikaniem odporności31-34. Poza tym można również badać wpływ stymulacji na inne cechy historii życia, takie jak długowieczność czy płodność. Tak więc badacze zajmujący się ekologią ewolucyjną mogą potrzebować takich narzędzi2,35,36. Na przykład trzmiele z obniżoną odpornością mają skróconą długość życia w warunkach głodu. Podobne negatywne skutki stymulacji i rozmieszczenia układu immunologicznego zaobserwowano w różnych modelach bezkręgowców, często skutkując krótszą długością życia lub mniejszym sukcesem reprodukcyjnym13,27,37. Takie badania mogą być prowadzone w różnych środowiskach2,4,38. Stymulowanie odporności jest również interesujące dla osób zajmujących się bezpośrednio immunopatologią39,40.
Ten protokół opiera się na inokulacji koralików z komarami, aby stymulować reakcję melanizacji i bezpośrednio mierzyć ilość melaniny. Umożliwia to ilościowe i jakościowe badanie odpowiedzi melanizacji w różnych warunkach eksperymentalnych. Takie narzędzie można rozszerzyć o stymulację innych odpowiedzi immunologicznych, takich jak odpowiedź przeciwbakteryjna na bakterie zabijane termicznie41. Może być również prowadzony w wielu ekologicznych warunkach.

<table><tbody><tr><td>Szklane rurki mikrokapilarne GB120TF-10</td><td>science-products.com</td><td>GB120TF-10</td><td>http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html</td></tr><tr><td>Microcaps Żarówka do pipet kapilarnych</td><td>Drumond</td><td>1-000-9000</td><td></td></tr><tr><td>naładowana ujemnie Koraliki Sephadex CM C-25</td><td>Sigma-Aldrich, Steinheim, Niemcy</td><td>C25120 SIGMA</td><td>potrzebuje niewielu, aby rozpocząć</td></tr><tr><td>Zieleń</td> <td>metylowaSigma-Aldrich</td><td>323829 ALDRICH</td><td>potrzebują niewielu, aby uruchomić</td></tr><tr><td>oprogramowanie ImageJ</td><td>opensource</td><td></td><td>w wersji 1.47f7 lub nowszej</td></tr></tbody></table>

inokulowanie komarów anopheles gambiae koralikami w celu wywołania i zmierzenia odpowiedzi immunologicznej melanizacji

Inoculating Anopheles gambiae Mosquitoes with Beads to Induce and Measure the Melanization Immune Response

Stymulacja odpowiedzi immunologicznych jest powszechnym narzędziem w badaniach na bezkręgowcach w celu zbadania skuteczności i mechanizmów odporności. Stymulacja ta opiera się na wstrzyknięciu niepatogennych cząstek do owadów, ponieważ cząsteczki zostaną wykryte przez układ odpornościowy i wywołają produkcję efektorów immunologicznych. Skupiamy się tutaj na stymulacji reakcji melanizacji u komara Anopheles gambiae. Reakcja melanizacji powoduje zamknięcie obcych cząstek i pasożytów ciemną warstwą melaniny. Aby stymulować tę reakcję, komary są zaszczepiane kulkami w jamie piersiowej za pomocą szklanych rurek mikrokapilarnych. Następnie, po 24 godzinach, komary są preparowane w celu odzyskania koralików. Stopień melanizacji koralika mierzy się za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Koraliki nie mają chorobotwórczego działania pasożytów ani ich zdolności do unikania lub tłumienia odpowiedzi immunologicznej. Zastrzyki te są sposobem pomiaru skuteczności immunologicznej i wpływu stymulacji immunologicznej na inne cechy historii życia, takie jak płodność lub długowieczność. Nie jest to dokładnie to samo, co bezpośrednie badanie interakcji gospodarz-pasożyt, ale jest to interesujące narzędzie do badania odporności i jej ekologii ewolucyjnej.

Komary nie melanizowały koralików w ten sam sposób, ponieważ niektóre z nich były pokryte melaniną w mniejszym stopniu niż inne (Rysunek 1). Rzeczywiście, niektóre koraliki pozostały niebieskie z powodu braku melanizacji, podczas gdy inne były całkowicie ciemne (Rysunek 1). Wartość melanizacji została znormalizowana poprzez interpolację liniową do wartości od 0 (co odpowiadało niebieskiemu i niemelanizowanemu koralikowi) do 100 (odpowiadającej ciemnemu i ...

Poprzez inokulację koralikami, opisana technika umożliwia stymulację reakcji melanizacji komarów w układzie krążenia hemolimfy. Ilość melaniny pokrywającej koraliki można zmierzyć po rozbiorze jako miarę odpowiedzi immunologicznej.

Inokulowanie komarów Anopheles gambiae koralikami w celu wywołania i zmierzenia odpowiedzi immunologicznej melanizacji

The stimulation of immune responses is a common tool in invertebrate studies to examine the efficacy and the mechanisms of immunity. This stimulation is ...

Ogólnym celem tej techniki inokulacji jest stymulacja odpowiedzi immunologicznej komara i zmierzenie reakcji melanizacji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania z zakresu immunologii ekologicznej, w tym genetyczne podstawy kosztu odpowiedzi człowieka i wpływu czynników środowiskowych. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w odpowiedź na szczepienia, może być również stosowana do innych systemów, takich jak odpowiedź przeciwwirusowa lub przeciwbakteryjna w innych systemach bezkręgowców.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą zmagać się z uszkodzeniami spowodowanymi przez owady, które może spowodować wstrzyknięcie. Dodaj jeden mililitr 0,1% roztworu zieleni metylowej do 99 mililitrów roztworu soli fizjologicznej, aby zabarwić przezroczyste kulki. Jest to 0,001% roztwór do wstrzykiwań zieleni metylowej.Następnie dodaj pięć mililitrów 0,1% roztworu zieleni metylowej do 45 mililitrów roztworu soli fizjologicznej. Ten 0,01% roztwór do rozwarstwiania zieleni metylowej jest 10 razy bardziej skoncentrowany w zieleni metylowej, aby ułatwić zabarwienie kulek i ich obserwację podczas sekcji. Autoklawuj roztwory w temperaturze 110 stopni Celsjusza

inoculating-anopheles-gambiae-mosquitoes-with-beads-to-induce-measure

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Komary z gatunku Anopheles stephensi są wektorami malarii zamieszkującymi Indie oraz cały obszar Azji. Niniejszy film demonstruje technikę wykonywania mikroiniekcji u tego gatunku z wykorzystaniem transgenów, które nadadzą komarowi odporność na malarię. Większość metodologii przedstawionej w tym filmie ma zastosowanie w technikach mikroiniekcji u innych gatunków komarów.

Iniekcja embrionów An. stephensi w celu wytworzenia komarów odpornych na malarię

W tym filmie pokazujemy dostarczanie konstruktu napędu genowego do zarodka komara Anopheles gambiae za pomocą techniki mikroiniekcji zarodka. Procedura ta pozwala na integrację dostarczonego konstruktu DNA, poprzez rekombinację homologiczną, z komórkami linii rozrodczej w celu wytworzenia przekształconej populacji komarów.

Mikroiniekcja zarodka komara: technika dostarczania egzogennego DNA do żółtka zarodka Anopheles Gambiae w celu wytworzenia mutacji linii zarodkowej

Ten film demonstruje test do immunizacji modelu myszy żywymi, atenuowanymi sporozoitami. Osłabione promieniowaniem sporozoity Plasmodium są wstrzykiwane do grzbietowej strony ucha myszy. Po wstrzyknięciach w wielu miejscach na obu uszach mysz może dojść do siebie.

Immunizacja śródskórna żywymi atenuowanymi sporozoitami w modelu mysim

Współinfekcja człowieka jest trudna do odtworzenia in vitro. Jednak ludzkie pasożyty malarii mogą być łatwo hodowane in vitro, podobnie jak świeżo wyizolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej naturalnie zakażone wirusem HIV. Stanowi to doskonały model do badania wczesnych odpowiedzi immunologicznych na pasożyty malarii w kontekście współzakażenia wirusem HIV.

Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Opisujemy tutaj protokół izolacji komórek szpikowych ze skóry myszy i drenowania węzłów chłonnych po śródskórnym wstrzyknięciu sporozoitów Plasmodium. Cytometria przepływowa pobranych komórek zapewnia wiarygodny test charakteryzujący reakcję zapalną skóry i węzłów chłonnych drenujących na pasożyta.

Izolacja komórek szpikowych ze skóry myszy i drenaż węzłów chłonnych po szczepieniu śródskórnym żywymi atenuowanymi sporozoitami zarodźca

Opisujemy mysi model eksperymentalnej malarii mózgowej i pokazujemy, jak można śledzić stan zapalny i patologię mikrokrążenia in vivo za pomocą rezonansu magnetycznego.

In vivo (in vivo) Śledzenie rozwoju obrzęku i patologii mikrokrążenia w modelu eksperymentalnej malarii mózgowej z wykorzystaniem rezonansu magnetycznego

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Techniki mikroiniekcji są niezbędne do wprowadzenia egzogennych genów do genomów komarów. Protokół ten wyjaśnia metodę stosowaną przez laboratorium Jamesa do mikrowstrzykiwania konstruktów DNA do embrionów Anopheles gambiae w celu wygenerowania przekształconych komarów.

Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Standardowy test karmienia membranowego (SMFA) jest uważany za złoty standard oceny i identyfikacji potencjalnych związków przeciwmalarycznych. Ten sztuczny system karmienia jest używany do zakażania komarów w celu dalszej oceny wpływu takich związków na intensywność i częstość występowania pasożyta Plasmodium falciparum.

Standardowy test karmienia membranowego do wykrywania zakażenia Plasmodium falciparum u wektorów komarów Anopheles

Poznaj technikę inokulacji koralikami u Anopheles gambiae w celu stymulacji i pomiaru odpowiedzi melanizacyjnej w immunologii ekologicznej. Metoda umożliwia ilościową ocenę odpowiedzi immunologicznej komarów.

Inokulowanie komarów Anopheles gambiae koralikami w celu wywołania i zmierzenia odpowiedzi immunologicznej melanizacji

Przeglądaj więcej filmów