Name: In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 + FOXP3 + (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek T regulatorowych FOXP3+ z naiwnych komórek CD4+ in vitro przy użyciu TGF-β. Technika umożliwia powtarzalną generację i fenotypowanie iTreg dla badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nina Nagel jest wdzięczna za pomoc techniczną podczas kręcenia filmu i przygotowań do eksperymentu. Dziękujemy Evie-Marii Weiss za pomoc w opracowaniu wewnątrzkomórkowego protokołu barwienia FOXP3 oraz Elisabeth Suri-Payer i Ninie Oberle za ustanowienie protokołu izolacji nTreg. Matilda Eriksson i Peri Noori są cenione za zarządzanie laboratorium. 
Finansowanie: A.S. było wspierane przez Intraeuropejskie Stypendium Marie Curie w ramach 7 Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej, Fundację Dr. Ake Olssona oraz fundacje badawcze KI; A.S. i J.T. były wspierane przez grant CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease), J.T. był wspierany przez Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Fundacja Torstena Söderberga, 7PR STATegra, AFA Insurance i Rada Hrabstwa Sztokholm.

<ol><li>Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells%3A+history+and+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.Biol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells: history and perspective.</a> Methods Mol.Biol. 707, 3-17 (2011).</li>
<li>DeLeeuw, R. J., Kost, S. E., Kakal, J. A., Nelson, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prognostic+value+of+FoxP3%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes+in+cancer%3A+A+critical+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Can+Res%22%5BJournal%5D)">The prognostic value of FoxP3+ tumor-infiltrating lymphocytes in cancer: A critical review of the literature.</a> Clin Can Res. 18 (11), 3022-3029 (2012).</li>
<li>Liu, C., Workman, C. J., Vignali, D. A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Regulatory+T+Cells+in+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Targeting Regulatory T Cells in Tumors.</a> FEBS J. , (2016).</li>
<li>Trzonkowski, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First-in-man+clinical+results+of+the+treatment+of+patients+with+graft+versus+host+disease+with+human+ex+vivo+expanded+CD4%2BCD25%2BC%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">First-in-man clinical results of the treatment of patients with graft versus host disease with human ex vivo expanded CD4+CD25+C.</a> Clin. Immunol. 133, 22-26 (2009).</li>
<li>Brunstein, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+ex+vivo+expanded+T+regulatory+cells+in+adults+transplanted+with+umbilical+cord+blood%3A+safety+profile+and+detection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics.</a> Blood. 117, 1061-1070 (2011).</li>
<li>Di Ianni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tregs+prevent+GVHD+and+promote+immune+reconstitution+in+HLA-haploidentical+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation.</a> Blood. 117, 3921-3928 (2011).</li>
<li>Edinger, M., Hoffmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+in+stem+cell+transplantation%3A+strategies+and+first+clinical+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells in stem cell transplantation: strategies and first clinical experiences.</a> Curr. Opin. Immunol. 23, 679-684 (2011).</li>
<li>Bluestone, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes+immunotherapy+using+polyclonal+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells.</a> Science Transl Med. 7 (315), 189(2015).</li>
<li>Haribhai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+central+role+for+induced+regulatory+T+cells+in+tolerance+induction+in+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A central role for induced regulatory T cells in tolerance induction in experimental colitis.</a> J. Immunol. 182, 3461-3468 (2009).</li>
<li>Haribhai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+requisite+role+for+induced+regulatory+T+cells+in+tolerance+based+on+expanding+antigen+receptor+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen receptor diversity.</a> Immunity. 35, 109-122 (2011).</li>
<li>Abbas, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells%3A+recommendations+to+simplify+the+nomenclature%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells: recommendations to simplify the nomenclature.</a> Nat.Immunol. 14, 307-308 (2013).</li>
<li>Curotto de Lafaille, M. A., Lafaille, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+adaptive+foxp3%2B+regulatory+T+cells%3A+more+of+the+same+or+a+division+of+labor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Natural and adaptive foxp3+ regulatory T cells: more of the same or a division of labor.</a> Immunity. 30, 626-635 (2009).</li>
<li>Huehn, J., Polansky, J. K., Hamann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+control+of+FOXP3+expression%3A+the+key+to+a+stable+regulatory+T-cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic control of FOXP3 expression: the key to a stable regulatory T-cell lineage.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 83-89 (2009).</li>
<li>Schmitt, E. G., Williams, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+function+of+induced+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation and function of induced regulatory T cells.</a> Front Immunol. 4, 152(2013).</li>
<li>Pillai, V., Ortega, S. B., Wang, C. K., Karandikar, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regulatory+T-cells%3A+a+state+attained+by+all+activated+human+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.Immunol%22%5BJournal%5D)">Transient regulatory T-cells: a state attained by all activated human T-cells.</a> Clin.Immunol. 123, 18-29 (2007).</li>
<li>Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I. H., Huizinga, T. W., Toes, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+FOXP3+in+human+activated+nonregulatory+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells.</a> Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).</li>
<li>Josefowicz, S. Z., Rudensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+lineage+commitment+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell lineage commitment and maintenance.</a> Immunity. 30, 616-625 (2009).</li>
<li>Sun, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+intestine+lamina+propria+dendritic+cells+promote+de+novo+generation+of+Foxp3+T+reg+cells+via+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.Exp.Med%22%5BJournal%5D)">Small intestine lamina propria dendritic cells promote de novo generation of Foxp3 T reg cells via retinoic acid.</a> J.Exp.Med. 204, 1775-1785 (2007).</li>
<li>Coombes, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+specialized+population+of+mucosal+CD103%2B+DCs+induces+Foxp3%2B+regulatory+T+cells+via+a+TGF-beta+and+retinoic+acid-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">A functionally specialized population of mucosal CD103+ DCs induces Foxp3+ regulatory T cells via a TGF-beta and retinoic acid-dependent mechanism.</a> J. Exp. Med. 204, 1757-1764 (2007).</li>
<li>Kang, S. G., Lim, H. W., Andrisani, O. M., Broxmeyer, H. E., Kim, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+A+metabolites+induce+gut-homing+FoxP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Vitamin A metabolites induce gut-homing FoxP3+ regulatory T cells.</a> J. Immunol. 179, 3724-3733 (2007).</li>
<li>Mucida, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+can+directly+promote+TGF-beta-mediated+Foxp3%28%2B%29+Treg+cell+conversion+of+naive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid can directly promote TGF-beta-mediated Foxp3(+) Treg cell conversion of naive T cells.</a> Immunity. 30, 471-472 (2009).</li>
<li>Schmidt, A., Eriksson, M., Shang, M. -M., Weyd, H., Tegnér, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Analysis+of+Protocols+to+Induce+Human+CD4%2BFoxp3%2B+Regulatory+T+Cells+by+Combinations+of+IL-2%2C+TGF-beta%2C+Retinoic+Acid%2C+Rapamycin+and+Butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Comparative Analysis of Protocols to Induce Human CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells by Combinations of IL-2, TGF-beta, Retinoic Acid, Rapamycin and Butyrate.</a> PloS one. 11 (2), 0148474(2016).</li>
<li>Furusawa, Y., Obata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">regulatory T cells.</a> Nature. 504, 446-450 (2013).</li>
<li>Arpaia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolites+produced+by+commensal+bacteria+promote+peripheral+regulatory+T-cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T-cell generation.</a> Nature. 504, 451-455 (2013).</li>
<li>Battaglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+promotes+expansion+of+functional+CD4%2BCD25%2BFOXP3%2B+regulatory+T+cells+of+both+healthy+subjects+and+type+1+diabetic+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapamycin promotes expansion of functional CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells of both healthy subjects and type 1 diabetic patients.</a> J. Immunol. 177, 8338-8347 (2006).</li>
<li>Hippen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massive+ex+vivo+expansion+of+human+natural+regulatory+T+cells+%28T%28regs%29%29+with+minimal+loss+of+in+vivo+functional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity.</a> Sci. Transl. Med. 3, 41(2011).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+macrophages+induce+CD4%28%2B%29Foxp3%28%2B%29+regulatory+T+cells+via+binding+and+re-release+of+TGF-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+cell+biol%22%5BJournal%5D)">Human macrophages induce CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cells via binding and re-release of TGF-β.</a> Immunol cell biol. , (2016).</li>
<li>Baron, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+demethylation+in+the+human+FOXP3+locus+discriminates+regulatory+T+cells+from+activated+FOXP3%28%2B%29+conventional+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells.</a> Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).</li>
<li>Schmidt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+regulatory+T+cells+rapidly+suppress+T+cell+receptor-induced+Ca%282%2B%29%2C+NF-kappaB%2C+and+NFAT+signaling+in+conventional+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Human regulatory T cells rapidly suppress T cell receptor-induced Ca(2+), NF-kappaB, and NFAT signaling in conventional T cells.</a> Sci. Signal. 4, 90(2011).</li>
<li>Ohkura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+stimulation-induced+epigenetic+changes+and+Foxp3+expression+are+independent+and+complementary+events+required+for+Treg+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor stimulation-induced epigenetic changes and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg cell development.</a> Immunity. 37, 785-799 (2012).</li>
<li>Hill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+enhances+Foxp3+induction+indirectly+by+relieving+inhibition+from+CD4%2BCD44hi+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid enhances Foxp3 induction indirectly by relieving inhibition from CD4+CD44hi Cells.</a> Immunity. 29, 758-770 (2008).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+Sulfide+Promotes+Tet1-+and+Tet2-Mediated+Foxp3+Demethylation+to+Drive+Regulatory+T+Cell+Differentiation+and+Maintain+Immune+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Hydrogen Sulfide Promotes Tet1- and Tet2-Mediated Foxp3 Demethylation to Drive Regulatory T Cell Differentiation and Maintain Immune Homeostasis.</a> Immunity. 43 (2), 251-263 (2015).</li>
<li>Yue, X., Trifari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Foxp3+stability+through+modulation+of+TET+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Control of Foxp3 stability through modulation of TET activity.</a> The Journal of experimental medicine. 213 (3), 377-397 (2016).</li>
<li>Sasidharan Nair, V., Song, M. H., Oh, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+C+Facilitates+Demethylation+of+the+Foxp3+Enhancer+in+a+Tet-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Vitamin C Facilitates Demethylation of the Foxp3 Enhancer in a Tet-Dependent Manner.</a> J Immunol. 196 (5), 2119-2131 (2016).</li>
<li>Geiger, T. L., Tauro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+and+nurture+in+Foxp3+%2B+regulatory+T+cell+development%2C+stability%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nature and nurture in Foxp3 + regulatory T cell development, stability, and function.</a> Hum Immunol. 73 (3), 232-239 (2012).</li>
<li>Gu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2-induced+CD4%2BFoxp3%2B+T+cells+attenuate+acute+graft-versus-host+disease+by+suppressing+expansion+and+killing+of+effector+CD8%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TGF-β-induced CD4+Foxp3+ T cells attenuate acute graft-versus-host disease by suppressing expansion and killing of effector CD8+ cells.</a> J Immunol. 193 (7), 3388-3397 (2014).</li>
<li>Brusko, T. M., Hulme, M. A., Myhr, C. B., Haller, M. J., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+In+Vitro+Suppressive+Capacity+of+Regulatory+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Invest%22%5BJournal%5D)">Assessing the In Vitro Suppressive Capacity of Regulatory T Cells.</a> Immunol Invest. 36 (5-6), 607-628 (2007).</li>
<li>McMurchy, A. N., Levings, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+assays+with+human+T+regulatory+cells%3A+a+technical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+immunol%22%5BJournal%5D)">Suppression assays with human T regulatory cells: a technical guide.</a> Eur J immunol. 42 (1), 27-34 (2012).</li>
<li>Mutis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+regulatory+T+cells+control+xenogeneic+graft-versus-host+disease+induced+by+autologous+T+cells+in+RAG2-%2F-gammac-%2F-+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+cancer+res%22%5BJournal%5D)">Human regulatory T cells control xenogeneic graft-versus-host disease induced by autologous T cells in RAG2-/-gammac-/- immunodeficient mice.</a> Clin cancer res. 12 (18), 5520-5525 (2006).</li>
<li>Tran, D. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+suppression+assay+for+functional+assessment+of+human+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol+biol%22%5BJournal%5D)">In vitro suppression assay for functional assessment of human regulatory T cells.</a> Meth mol biol. 979, 199-212 (2013).</li>
<li>Oberle, N., Eberhardt, N., Falk, C. S., Krammer, P. H., Suri-Payer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Suppression+of+Cytokine+Transcription+in+Human+CD4%2BCD25+T+Cells+by+CD4%2BFoxp3%2B+Regulatory+T+Cells%3A+Independence+of+IL-2+Consumption%2C+TGF-beta%2C+and+Various+Inhibitors+of+TCR+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid Suppression of Cytokine Transcription in Human CD4+CD25 T Cells by CD4+Foxp3+ Regulatory T Cells: Independence of IL-2 Consumption, TGF-beta, and Various Inhibitors of TCR Signaling.</a> J. Immunol. 179, 3578-3587 (2007).</li>
<li>Shevach, E. M., Thornton, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((tTregs%2C+pTregs%2C+and+iTregs%3A+similarities+and+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences.</a> Immunol. Rev. 259, 88-102 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany protokół umożliwia silną indukcję ludzkich iTreg CD4 + FOXP3 + z ludzkich naiwnych limfocytów T CD4 + . Obejmuje on nowy protokół, który opisaliśmy niedawno, wykorzystujący kombinację TGF-β, ATRA i rapamycyny, do indukcji iTreg o lepszej funkcji supresyjnej in vitro 22. W porównaniu z innymi opublikowanymi protokołami, kolejną zaletą jest indukcja różnych populacji iTreg równolegle za pomocą różnych protokołów, co umożliwia bezpośrednie porównanie efektów niektórych czynników induku...

CD4+CD25+FOXP3+ regulatorowe limfocyty T (Treg) tłumią inne komórki odpornościowe i są krytycznymi mediatorami tolerancji obwodowej, zapobiegając autoimmunizacji i nadmiernemu zapaleniu1. Znaczenie limfocytów Treg ilustruje zespół sprzężony z chromosomem X choroby człowieka immunodysregulacji, poliendokrynopatii, enteropatii sprzężonej z chromosomem X (IPEX), w którym utrata limfocytów Treg z powodu mutacji w "głównym" skrzynce widłowej P3 czynnika transkrypcyjnego Treg (FOXP3) prowadzi do ciężkiej ogólnoustrojowej choroby autoimmunologicznej, śmiertelnej we wczesnym wieku. Jednak limfocyty Treg działają jak miecz obosieczny w układzie odpornościowym, ponieważ mogą również hamować odporność przeciwnowotworową w niektórych ustawieniach2. Terapeutyczna manipulacja liczbą i funkcją limfocytów Treg jest zatem przedmiotem licznych badań klinicznych. W przypadku nowotworów wyczerpanie limfocytów Treg może być pożądane, a pewne sukcesy metod klinicznych zachęcają do dalszych badań3. W chorobach autoimmunologicznych i zapalnych, oprócz terapeutycznych efektów Treg w kilku mysich modelach choroby, niedawne pierwsze badania na ludziach dotyczące adoptywnego transferu Treg w celu zapobiegania chorobie przeszczep przeciwko gospodarzowi (GvHD)4-7 i oceny bezpieczeństwa w leczeniu cukrzycy typu 18 wykazały bardzo obiecujące wyniki.
Naturalnie występujące Tregi (nTregs) składają się z tTreg pochodzących z grasicy i pTregów indukowanych obwodowo, z niezbędnymi podstawowymi funkcjami w utrzymaniu zdrowia 9-11. Jednak liczba nTreg jest ograniczona, co zachęca do komplementarnego podejścia polegającego na indukowaniu Treg (iTreg) in vitro z naiwnych prekursorów limfocytów T12. Nadal stabilność iTreg, prawdopodobnie z powodu braku demetylacji w tak zwanym regionie demetylowanym specyficznym dla Treg (TSDR) w locus13 genu FOXP3, pozostaje problemem, a kilka badań wskazuje, że Treg indukowane in vivo są bardziej stabilne14.
Do tej pory, FOXP3 pozostaje najlepszym markerem białkowym dla Treg, ale nie jest to absolutnie specyficzne, ponieważ ludzkie konwencjonalne limfocyty T CD4+CD25- przejściowo wyrażają pośrednie poziomy FOXP3 po aktywacji15,16. Chociaż poczyniono znaczne postępy w wyjaśnianiu regulacji ekspresji FOXP3, wiele pozostaje do odkrycia w zakresie indukcji, stabilności i funkcji FOXP3, szczególnie w komórkach ludzkich. Pomimo różnic w stosunku do nTreg, indukowane in vitro limfocyty T FOXP3 + CD4 + mogą być wykorzystywane jako system modelowy do badania mechanizmów molekularnych indukcji FOXP3 oraz jako punkt wyjścia do opracowania w przyszłości protokołów, które pozwalają na generowanie iTreg, które są bardziej podobne do Treg generowanych in vivo, co może mieć zastosowanie w strategiach transferu adoptywnego w przyszłości.
Nie ma 'złotego standardu' protokołu do indukowania ludzkich iTreg, a obecne protokoły zostały opracowane na podstawie naśladowania warunków indukujących Treg in vivo: sygnalizacja interleukiny 2 (IL-2) i transformującego czynnika wzrostu β (TGF-β) są kluczowe dla indukcji FOXP3 in vivo17, a kwas all-trans retinowy (ATRA) — który jest produkowany in vivo przez komórki dendrytyczne związane z jelitami — jest często stosowany w celu zwiększenia indukcji FOXP3 in vitro 18-21. Opracowaliśmy dodatkowe protokoły indukowania limfocytów Treg u ludzi przy użyciu maślanu22, krótkołańcuchowego kwasu tłuszczowego pochodzącego z mikrobioty jelitowej, który, jak wykazano niedawno, zwiększa indukcję mysiego Treg23,24. Niedawno ustaliliśmy również nowy protokół generowania iTreg o doskonałej funkcji supresyjnej in vitro przy użyciu kombinacji TGF-β, ATRA i rapamycyny22, przy czym ta ostatnia jest klinicznie zatwierdzonym celem inhibitora rapamycyny (mTOR) u ssaków, o którym wiadomo, że sprzyja utrzymaniu FOXP3 podczas ekspansji ludzkiego Treg25,26.
Ta metoda opisuje powtarzalne generowanie in vitro ludzkich iTreg CD4+FOXP3+ przy użyciu zestawu różnych warunków, a następnie ich fenotypowanie za pomocą cytometrii przepływowej i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR) w celu ujawnienia specyficznych dla protokołu wzorców ekspresji FOXP3 i innych cząsteczek sygnatury Treg, takich jak CD25, CTLA-4, EOS, a także represjonowanie ekspresji IFN-γ i SATB1 22. Wygenerowane populacje komórek można wykorzystać do testów funkcjonalnych dotyczących aktywności supresyjnej lub do badań molekularnych, zarówno dotyczących ogólnych regulatorów FOXP3, jak i do badania efektów specyficznych dla niektórych związków, takich jak maślan lub rapamycyna. Pogłębienie wiedzy na temat mechanizmów molekularnych kierujących różnicowaniem limfocytów Treg jest bardzo istotne dla przyszłych podejść terapeutycznych w chorobach autoimmunologicznych lub nowotworach, które mają być ukierunkowane na cząsteczki zaangażowane w wytwarzanie i funkcję limfocytów Treg.

<table><tbody><tr><td>Kwas all-trans retinowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50MG&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki klon Foxp3-APC 236A/E7</td><td>eBioscience</td><td>17-4777-42</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzkie mikrogranulki CD25</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-983</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzkie CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td></td></tr> przeciwciało <tr><td>anty-ludzkie CD28, LEAF Purified&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>302914</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-ludzkie CD3, LEAF Purified&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>317315</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki CD45RA, FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-247</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki klon CD45RO PE UCHL1</td><td>BD Biosciences</td><td>555493</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki klon CD4-PerCP SK3; mIgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>345770</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki CD8-eFluor 450 (klon OKT8), mIgG2a</td><td>eBioscience</td><td>48-0086-42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki CTLA-4 (CD152), klon BNI3, mIgG2ak, fioletowy brylantowy 421</td><td>BD Biosciences</td><td>562743</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki klon IFN-g FITC 4S. Klasa B3; mIgG1k</td><td>eBioscience</td><td>11-7319-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór zawierający Brefeldin A: GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555029</td><td></td></tr><tr><td>zestaw do syntezy cDNA: SuperScript VILO (odwrotna transkryptaza) Zestaw do syntezy cDNA</td><td>Invitrogen</td><td>11754-250</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże do wirowania gęstości: Ficoll-Paque</td><td>GE healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 99,7%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-5X5ML</td><td></td></tr><tr><td>FBS, inaktywowany termicznie</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Utrwalany barwnik żywotności, eFluor 780&nbsp; &nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>65-0865-14 lub 65-0865-18&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw barwiących Foxp3</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Uwaga: zawiera paraformaldehyd. Można go również kupić w zestawie łączonym z przeciwciałami; 77-5774-40 Zestaw do barwienia anty-ludzkiego Foxp3 Klon APC: 236A/E7 Zestaw</td></tr><tr><td>GlutaMAX (200 mM L-alanylo-L-glutamina)</td> <td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji ludzkich naiwnych limfocytów T CD4 II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy ludzkiej 50 g/L</td><td>Baxter</td><td>1501057</td><td></td></tr><tr><td>Jonomycyna ze Streptomyces conglobatus >98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9657-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS-columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>mysz IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1</td><td>eBioscience</td><td>17-4714-42</td><td></td></tr><tr><td>mysz IgG1 K Isotype Control FITC 50 &#956; g</td><td>eBioscience</td><td>11-4714-81&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>kontrola izotypu myszy IgG2a, fiolet brylantowy 421, klon MOPC-173</td><td>BD Biosciences</td><td>563464</td><td></td></tr><tr><td>pipeta Pasteura plastikowa, pakowana pojedynczo</td><td>Sarstedt</td><td>86.1172.001&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMA Phorbol 12-mirystynian 13-octan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585-1MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rapamycyna</td><td>EMD (Merck)</td><td>553210-100UG</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-2, CF</td><td>R& D</td><td>202-IL-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TGF-beta 1, CF</td><td>RnD</td><td>240-B-010/CF</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA: RNAqueous-Micro Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Średni&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>72400-054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887-250MG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do hodowli limfocytów T: pożywka X-Vivo 15, z gentamycyną + fenolem</td> Test ekspresji genów <td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr>, <tr><td>FOXP3 (najlepsze pokrycie)&nbsp;</td><td>Identyfikator testu Applied Biosystems</td><td>4331182: Hs01085834_m1</td><td>Uwaga: zawiera paraformaldehyd</td></tr><tr><td>Test ekspresji genów TaqMan, RPL13A (najlepsze pokrycie)</td><td>Identyfikator testu 4351370 Biosystems Applied Biosystems</td><td>: Hs04194366_g1&nbsp; &nbsp;</td><td>Uwaga: zawiera paraformaldehyd</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369514</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro różnicowanie ludzkich limfocytów t regulatorowych indukowanych cd4 + foxp3 + (itreg) od naiwnych limfocytów t cd4 + przy użyciu protokołu zawierającego tgf-β

In Vitro Differentiation of Human CD4+FOXP3+ Induced Regulatory T Cells (iTregs) from Na&#239;ve CD4+ T Cells Using a TGF-&#946;-containing Protocol

Limfocyty T regulatorowe (Treg) są integralną częścią tolerancji obwodowej, tłumiąc reakcje immunologiczne przeciwko własnym strukturom i zapobiegając w ten sposób chorobom autoimmunologicznym. Podejścia kliniczne mające na celu adoptywny transfer limfocytów Treg lub ich zubożenie w leczeniu raka są w toku, przynosząc obiecujące pierwsze wyniki. 
Ponieważ liczba naturalnie występujących Treg (nTreg) jest bardzo ograniczona, badanie pewnych cech Treg za pomocą indukowanych in vitro Treg (iTregs) może być korzystne. Do tej pory najlepszym, choć nie do końca specyficznym markerem białkowym do wyznaczania limfocytów Treg, jest czynnik transkrypcyjny FOXP3. Pomimo znaczenia limfocytów Treg, w tym nieredundantnych ról limfocytów Treg indukowanych obwodowo, protokoły generowania limfocytów Treg są obecnie kontrowersyjne, szczególnie w przypadku komórek ludzkich. Protokół ten opisuje zatem różnicowanie in vitro ludzkich iTreg CD4 + FOXP3 + od ludzkich naiwnych limfocytów T przy użyciu szeregu czynników indukujących Treg (TGF-β plus tylko IL-2 lub ich kombinacji z kwasem retinowym, rapamycyną lub maślanem) równolegle. Opisano również fenotypowanie tych komórek za pomocą cytometrii przepływowej i qRT-PCR. 
Te protokoły skutkują powtarzalną ekspresją FOXP3 i innych genów sygnatury Treg oraz umożliwiają badanie ogólnych mechanizmów regulacyjnych FOXP3, jak również efektów specyficznych dla protokołu, aby określić wpływ pewnych czynników. iTregi mogą być wykorzystywane do badania różnych aspektów fenotypowych, jak również molekularnych mechanizmów indukcji Treg. Szczegółowe badania molekularne ułatwiają stosunkowo duże liczby komórek, które można uzyskać. 
Ograniczeniem dla stosowania iTreg jest względna niestabilność ekspresji FOXP3 w tych komórkach w porównaniu do nTreg. iTregi generowane przez te protokoły mogą być również wykorzystywane do testów funkcjonalnych, takich jak badanie ich funkcji supresyjnej, w których iTregi indukowane przez TGF-β plus kwas retinowy i rapamycyna wykazują wyższą aktywność tłumiącą. Jednak zdolność tłumienia iTreg może różnić się od nTreg, a zastosowanie odpowiednich kontroli ma kluczowe znaczenie.

Rycina 1 przedstawia schemat układu eksperymentalnego. Rycina 2 przedstawia reprezentatywne barwienie kontrolne czystości dla magnetycznie wyizolowanych naiwnych limfocytów T CD4+ oraz nTregs.
Rysunek 3A przedstawia strategię bramkowania w cytometrii przepływowej, a rysunek 3B ukazuje reprezentatywne barwienia cytometryczne FOXP3 i CD25 w 6. dniu hodo...

Ten protokół opisuje powtarzalne wytwarzanie i fenotypowanie ludzkich indukowanych regulatorowych limfocytów T (iTreg) z naiwnych limfocytów T CD4+ in vitro. Różne protokoły indukcji FOXP3 pozwalają na badanie określonych fenotypów iTreg uzyskanych za pomocą odpowiednich protokołów.

In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 + FOXP3 + (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β

Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest indukcja ludzkich limfocytów T regulatorowych FOXP3-dodatnich z naiwnych limfocytów T CD4 in vitro oraz analiza ich fenotypu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii limfocytów T, takie jak: w jaki sposób zachodzi różnicowanie regulatorowych limfocytów T na poziomie molekularnym? Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona powtarzalne generowanie i fenotypowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych FOXP3-dodatnich.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat różnicowania regulatorowych limfocytów T, można ją również zmodyfikować w celu zbadania innych podzbiorów limfocytów T CD4 i innych komórek odpornościowych będących przedmiotem zainteresowania. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki PBMC i magnetycznej izolacji bitów są łatwe do zrozumienia, gdy są pokazane, a nie opisane. Aby wyizolować limfocyty T krwi obwodowej, zacznij od dodania 15 mililitrów pożywki o gradiencie gęstości w temperaturze pokojowej do pięciu 50-mililitrowych probówek na płaszcz buffy i zwiększ ostateczną objętość płaszcza buffy do 180 mililitrów za pomocą PBS w temperaturze pokojowej.

in-vitro-differentiation-human-cd4-foxp3-induced-regulatory-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Limfocyty T regulatorowe CD4+ są silnymi modulatorami immunologicznymi i pełnią ważne funkcje w homeostazie immunologicznej. Niedobór tych komórek we krwi obwodowej sprawia, że badania funkcjonalne są trudne, szczególnie w kontekście zakażenia HIV-1. Opisujemy tutaj metodę izolowania i namnażania funkcjonalnych limfocytów Treg CD4 + z krwi obwodowej od osób zakażonych wirusem HIV-1.

Nowe narzędzia do ekspansji limfocytów T regulatorowych od osób zakażonych wirusem HIV-1

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Mysie embrionalne komórki macierzyste mogą być różnicowane do limfocytów T in vitro za pomocą systemu kohodowli OP9-DL1. Powodzenie tej procedury wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na konserwację odczynnika/ogniwa oraz kluczowych kroków wrażliwych na technikę. W tym miejscu omawiamy te krytyczne parametry i przedstawiamy szczegółowy protokół, aby zachęcić do przyjęcia tej technologii.

Wyprowadzanie limfocytów T in vitro z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Ten protokół zapewnia in vitro strategię współhodowli do badania wpływu komórek T regulatorowych na proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych.

In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek T regulatorowych FOXP3+ z naiwnych komórek CD4+ in vitro przy użyciu TGF-β. Technika umożliwia powtarzalną generację i fenotypowanie iTreg dla badań immunologicznych.

In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 + FOXP3 + (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β (Wideo) | JoVE Journal

In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 ⁺ FOXP3 ⁺ (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 ⁺ przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β

Przeglądaj więcej filmów