Name: Regulacja tropizmu pikornawirusa w oparciu o mikroRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Odkryj metodę regulacji tropizmu pikornawirusa za pomocą mikroRNA poprzez wprowadzenie komplementarnych sekwencji do genomu wirusa. Technika ta wymaga minimalnej modyfikacji i zwiększa bezpieczeństwo badań wirusologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Al i Mary Agnes McQuinn, Fundacja Richarda M. Schulze oraz NIH Relief Grant z Mayo Clinic sfinansowali reprezentatywną pracę opisaną tutaj.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Projekt, skład i lokalizacja elementów odpowiedzi mikroRNA w genomie wirusa będzie dyktować skuteczność i swoistość celowania. Ich optymalizacja będzie wymagała prób i błędów. Jednak racjonalne projektowanie oparte na analizie strukturalnej RNA i wcześniejszych badaniach replikacji wirusa i sygnatur mikroRNA pomaga w realizacji tej techniki przy minimalnej optymalizacji 10,11,12,13,38.</su...

Opracowanie szeroko stosowanej, łatwej i efektywnej metody inżynierii wektora o ograniczonym tropizmie daje dużą szansę na zwiększenie bezpieczeństwa, zrozumienia biologicznego i użyteczności terapeutycznej wirusów. Istnieje kilka mechanizmów celowania w tropizm wirusowy, w tym techniki transdukcyjne, transkrypcyjne i translacyjne. Jednak metody te nie mają ogólnego zastosowania do wszystkich systemów wektorowych, mogą wymagać wadliwych szlaków sygnałowych w komórkach docelowych lub wymagać wprowadzenia dużych sekwencji kodujących do genomu wirusa. Dodatkowo metody te mogą skutkować atenuacją wirusa, co znacznie utrudnia jego działanie terapeutyczne i ogranicza wgląd w niezmodyfikowany układ.
MikroRNA to małe (22-25 nukleotydów), niekodujące RNA, które pośredniczą w wyciszaniu genów w komórkach eukariotycznych. MikroRNA działają poprzez wiązanie komplementarnych sekwencji docelowych (elementów odpowiedzi) w informacyjnych RNA (mRNA), co powoduje destabilizację transkryptu, degradację lub represję translacyjną. MikroRNA zwykle wiążą elementy odpowiedzi z częściową komplementarnością i powodują niewielkie modyfikacje ekspresji genów1,2,3,4,5. Bardziej znaczące zmiany w ekspresji genów można osiągnąć poprzez zwiększenie komplementarności elementu odpowiedzi6. Zidentyfikowano tysiące dojrzałych mikroRNA u różnych gatunków, a wiele z nich wykazuje zróżnicowane wzorce ekspresji w różnych typach komórek i tkanek7,8,9. Te sygnatury mikroRNA można wykorzystać do specyficznego dla komórki ograniczenia amplifikacji wirusa poprzez włączenie doskonale uzupełniających się elementów odpowiedzi do genomu wirusa10,11,12,13. Ogólnym celem tej techniki celowania w mikroRNA jest kontrolowanie tropizmu genomu wektora bez dodatkowego tłumienia.
Użyteczność tej metody do regulowania tropizmu wirusowego została pierwotnie zademonstrowana w wektorach lentiwirusowych w celu ograniczenia ekspresji transgenu w określonych tkankach14,15,16. Technika ta została następnie zastosowana do szerokiej gamy replikujących się i niereplikujących wektorów wirusowych w celu wzmocnienia terapii genowej, a także w celu poprawy profili bezpieczeństwa wielu wirusów onkolitycznych poprzez wyeliminowanie niepożądanych toksyczności w normalnych tkankach10,11,12,13,17. Został również wykorzystany do generowania bezpiecznych i skutecznych szczepionek z żywymi atenuami, a także do ulepszania procesów produkcji wirusów i szczepionek18,19,20,21. Ukierunkowanie wektora na mikroRNA może pozwolić na osłabienie u zaszczepionych gospodarzy lub systemów docelowych przy jednoczesnym utrzymaniu poziomów wzrostu typu dzikiego w systemach produkcyjnych. Celowanie w mikroRNA może być również wykorzystane do poprawy bezpieczeństwa biologicznego wirusów do celów badawczych poprzez ograniczenie transmisji u jednego gatunku (np. ludzi) przy jednoczesnym utrzymaniu transmisji u innych gospodarzy22. Wreszcie, celowanie mikroRNA może pozwolić na dogłębne analizy cykli życiowych wirusa i specyficznych ról typów komórek w patogenezie i odporności poprzez segregację wzrostu wirusa23,24,25,26.
Ta technika oferuje alternatywną metodę celowania, która jest łatwa do wdrożenia i może być stosowana dla wszystkich systemów antywirusowych. Ponadto stale powiększająca się kolekcja dojrzałych mikroRNA z różnymi wzorcami ekspresji w określonych typach komórek sprawia, że technika ta jest bardzo wszechstronna. Celowanie oparte na mikroRNA okazało się skuteczne w przypadku różnych systemów wirusowych bez uszczerbku dla funkcji systemu. Główne ograniczenia tej techniki obejmują optymalizację metodą prób i błędów, możliwość mutacji ucieczki oraz potencjalne efekty off-target na endogenne transkrypty. Jednak ograniczenia te można na ogół przezwyciężyć dzięki zoptymalizowanemu i racjonalnemu projektowaniu elementów odpowiedzi. Wirusy RNA o dodatnim zmyśle wydają się być szczególnie wrażliwe na celowanie w mikroRNA ze względu na pozytywną orientację ich genomu i dostępność transkryptów dla maszynerii mikroRNA podczas całkowicie cytoplazmatycznego cyklu replikacji. W tym miejscu opisujemy protokół generowania pikornawirusa ukierunkowanego na mikroRNA oraz metody eksperymentalne mające na celu weryfikację skuteczności i swoistości tego celowania in vitro.

<table><tbody><tr><td>Kodowanie RE Oligonukleotydy</td><td>IDT</td><td>PAGE-Oczyszczona sekwencja ultramerowa</td><td>zaprojektowana przez badacza</td></tr><tr><td>Oligonukleotydy kodujące unikalne miejsce restrykcyjne</td><td>Sekwencja IDT</td><td>25nM</td><td>zaprojektowana przez badacza</td></tr><tr><td>Rozwiń zestaw High Fidelity PCR</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 11732641001</td><td>Wiele innych dostępnych zestawów do PCR polimerazy o wysokiej wierności</td></tr><tr><td>System ligazy DNA T4</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw MEGAscript</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw MEGAclear</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>0,5 m EDTA</td><td>ThermoFisher Scientific AM9260G</td><td></td><td>bez RNaz</td></tr><tr><td>5 M octan NH4</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N/A</td><td>jest dostarczany w zestawie MEGAclear</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9938</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji TransIT-2020</td><td>Mirus</td><td>MIR 5404</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji TransIT-mRNA</td><td>Mirus</td><td>MIR 2225</td><td></td></tr><tr><td>0,2 i mu; m Filtr strzykawkowy</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>2 ml Probówki z nakrętką</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td></td></tr><tr><td>Skrobaki do komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-241</td><td></td></tr><tr><td>MikroRNA naśladuje</td><td>Dharmacon</td><td>Zróżnicowany</td><td></td></tr><tr><td>test proliferacji komórek MTT</td><td>ATCC</td><td>30-1010K</td><td></td></tr><tr><td>Skuteczność subklonowania DH5&alpha; Competent Cells</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18265017</td><td></td></tr><tr><td>pBlueScript II Wektory</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zmienne (np. 212205)</td><td>Istnieją różne plazmidy z promotorami T7 lub T3 i zmiennymi miejscami klonowania, aby umożliwić klonowanie i transkrypcję RNA.</td></tr></tbody></table>

regulacja tropizmu pikornawirusa w oparciu o mikrorna

MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism

Specyficzne dla komórek ograniczenie replikacji wirusa bez jednoczesnego tłumienia może przynieść korzyści w rozwoju szczepionek, terapii genowej, wirusoterapii onkolitycznej i zrozumieniu biologicznych właściwości wirusów. Istnieje kilka mechanizmów regulujących tropizm wirusowy, jednak są one zwykle specyficzne dla klasy wirusa, a wiele z nich powoduje atenuację wirusa. Ponadto wiele wirusów, w tym pikornawirusy, wykazuje ograniczenia rozmiaru, które nie pozwalają na włączenie dużych ilości obcego materiału genetycznego wymaganego do niektórych metod celowania. MikroRNA to krótkie, niekodujące RNA, które regulują ekspresję genów w komórkach eukariotycznych poprzez wiązanie komplementarnych sekwencji docelowych w informacyjnych RNA, zapobiegając ich translacji lub przyspieszając ich degradację. Różne komórki wykazują różne sygnatury mikroRNA, a wiele mikroRNA służy jako biomarkery. Te zróżnicowane wzorce ekspresji można wykorzystać do ograniczenia ekspresji genów w komórkach, które wyrażają określone mikroRNA, przy jednoczesnym utrzymaniu ekspresji w komórkach, które tego nie robią. Jeśli chodzi o regulację tropizmu wirusowego, sekwencje komplementarne do określonych mikroRNA są włączane do genomu wirusa, na ogół w regionach niekodujących 3', kierując je do zniszczenia w obecności pokrewnych mikroRNA, zapobiegając w ten sposób ekspresji i / lub replikacji genów wirusa. Celowanie w mikroRNA to technika, która teoretycznie może być zastosowana do wszystkich wektorów wirusowych bez zmiany siły działania wirusa w przypadku braku odpowiednich mikroRNA. W tym miejscu opisujemy metody eksperymentalne związane z generowaniem pikornawirusa ukierunkowanego na mikroRNA oraz oceną skuteczności i swoistości tego celowania in vitro. Protokół ten jest przeznaczony dla szybko replikującego się wirusa z litycznym cyklem replikacji, jednak modyfikacja analizowanych punktów czasowych i zastosowanych określonych odczytów miareczkowania wirusa pomoże w dostosowaniu tego protokołu do wielu różnych wirusów.

Tabela 1 przedstawia wyniki typowe dla testu miareczkowania picornawirusa i opisuje sposób obliczania 50% zakaźnej dawki dla hodowli tkankowych. Schematyczna reprezentacja ogólnej koncepcji regulacji tropizmu wirusowego opartej na mikroRNA, opisanej w niniejszym manuskrypcie, przedstawiona jest na Rysunku 1. Orientacja mikroRNA względem elementu odpowiedzi podczas interakcji wewnątrzkomórkowych, właściwe projektowanie oligonukleotydów elementu odpowiedzi ...

Opisujemy tutaj metodę regulacji tropizmu picornawirusa poprzez włączenie sekwencji komplementarnych do określonych mikroRNA do genomu wirusa. Protokół ten można dostosować do wszystkich różnych klas wirusów, wprowadzając modyfikacje w zależności od długości i charakteru ich cyklu życia.

Regulacja tropizmu pikornawirusa w oparciu o mikroRNA

Cell-specific restriction of viral replication without concomitant attenuation can benefit vaccine development, gene therapy, oncolytic virotherapy, and ...

Ogólnym celem następujących eksperymentów jest ocena wydajności i specyficzności regulacji tropizmu pikornawirusów w oparciu o mikroRNA in vitro. Cel ten zostaje osiągnięty poprzez przygotowanie pikornawirusów, których genom koduje elementy odpowiedzi na mikroRNA. W drugim kroku wirusy te służą do zakażenia komórek, które wykazują lub nie wykazują ekspresji odpowiadających im mikroRNA.Następnie należy ocenić kinetykę replikacji wirusa, propagację oraz toksyczność, aby określić wydajność i swoistość celowania. Metoda ta może być wykorzystana w wirusologii w celu poprawy bezpieczeństwa, produkcji i użyteczności wirusów lub w celu ułatwienia badań koncentrujących się na zrozumieniu procesów biologicznych związanych z infekcją wirusową. Głównymi zaletami tej techniki są minimalne wymagania dotyczące inżynierii genomu wirusowego oraz wysoka wszechstronność, wynikająca z zidentyfikowania znacznej liczby sygnatur komórkowych mikroRNA.Aby rozpocząć tę procedurę, wysiej komórki permisywne na płytkę 96-dołkową z pełną pożywką wzrostową. Do rzędu pierwszego i dwunastego dodaj pożywkę bezsurowiczą bez wirusa w celu przygotowania kontroli niezakażonych. Następnie inkubuj komórki w temperaturze

microrna-based-regulation-of-picornavirus-tropism

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Regulacja tropizmu wirusów typu picorna opierająca się na microRNA

Biblioteka Target ID jest opartą na plazmidach, genomową kolekcją klonowanego cDNA, służącą do identyfikacji celów miRNA. W niniejszym materiale prezentujemy sposób jej użycia i zastosowania.

Przesiew genomowy w celu identyfikacji celów miRNA z wykorzystaniem biblioteki MISSION Target ID

MikroRNA (miRNA) są istotnymi regulatorami ekspresji genów i wykazano, że odgrywają one rolę w licznych procesach biologicznych. Aby lepiej zrozumieć interakcje miRNA-UTR, stworzyliśmy obejmującą cały genom kolekcję reporterów lucyferazy 3' UTR, połączonych z nowym genem lucyferazy i odczynnikiem analitycznym, systemem LightSwitch.

Identyfikacja celów ludzkich mikroRNA za pomocą systemu testowego LightSwitch Luciferase z wykorzystaniem konstruktów reporterowych 3'UTR oraz mimiku mikroRNA w komórkach adherentnych

Norowirusy są główną przyczyną gastroenteritis, jednak techniki molekularne służące do ich charakterystyki są wciąż stosunkowo nowe. W niniejszej pracy przedstawiamy dwa różne podejścia genetyki odwrotnej w celu efektywnego odzyskiwania norowirusa mysiego (MNV), jedynego przedstawiciela tego rodzaju, który może być propagowany w hodowlach komórkowych.

Odzyskiwanie zakaźnego norowirusa mysiego za pomocą genetyki odwrotnej

Źródło: Ruiz, A. J. and Russell, S. J. MicroRNA-based Regulation of Picornavirus Tropism. J. Vis. Exp. (2017)W niniejszym filmie zaprezentowano wykorzystanie syntetycznych mimików microRNA do selektywnego hamowania replikacji wirusowej w hodowlach komórek nabłonkopodobnych. Przedstawiono w nim, w jaki sposób wyciszanie genomu kierowane przez microRNA może blokować rozprzestrzenianie się wirusa oraz potwierdzać specyficzność celowania poprzez analizę zakaźności w kolejnych etapach.

Ocena hamowania rozprzestrzeniania się wirusa poprzez wyciszanie genomu za pomocą mimetyków microRNA

Tutaj proponujemy strategię badania wpływu interesującego czynnika transkrypcyjnego na transkryptom mikroRNA, korzystając z publicznie dostępnych danych, zasobów obliczeniowych i danych o wysokiej przepustowości z macierzy mikroRNA po transfekcji komórek z małą spinką do włosów (sh)RNA ukierunkowaną na interesujący czynnik transkrypcyjny.

Opisywanie zależnej od czynnika transkrypcyjnego regulacji transkryptomu mikroRNA

Informujemy o użyciu sztucznej strategii ekspresji małego RNA w celu opracowania niewadliwego systemu dostarczania rekombinowanego densowirusa Aedes aegypti (AaeDV) in vivo. Opisano szczegółową procedurę budowy, pakowania i analizy ilościowej wektorów rAaeDV, a także infekcji larwalnej.

Zastosowanie rekombinowanego densowirusa komarów jako wektora dostarczania genów do analizy funkcjonalnej genów w larwach komarów

Dwuniciowe RNA wytwarzane podczas replikacji wirusa RNA mogą być rozpoznawane przez receptory rozpoznające wzorce, aby wywołać wrodzoną odpowiedź immunologiczną. W przypadku wirusów RNA o ujemnym znaczeniu interakcja między niskim poziomem dsRNA a PRR pozostaje niejasna. Opracowaliśmy metodę mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dsRNA i PRR arenawirusa w poszczególnych komórkach.

Obrazowanie konfokalne dwuniciowego RNA i receptorów rozpoznawania wzorców w zakażeniu wirusem RNA o ujemnym znaczeniu

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla systemu wyciszania mikroRNA (VbMS) opartego na wirusie ziemniaka X (PVX), aby funkcjonalnie scharakteryzować endogenne mikroRNA (miRNA) u ziemniaka. Docelowe cząsteczki mimiczne (TM) interesującego nas miRNA są integrowane z wektorem PVX i przejściowo ulegają ekspresji w ziemniakach w celu wyciszenia docelowego miRNA lub rodziny miRNA.

Wyciszanie mikroRNA na bazie wirusa ziemniaka (VbMS) w ziemniakach.

Opracowaliśmy test reporterowy biogenezy mikroRNA do wykorzystania w komórkach in vitro z czterema plazmidami: jeden z miRNA intronicznym, jeden z celem, jeden do nadekspresji białka regulatorowego i jeden dla lucyferazy Renilla. MiRNA zostało przetworzone i mogło kontrolować ekspresję lucyferazy poprzez wiązanie się z sekwencją docelową.

Test reporterowy do analizy dojrzewania intronowego mikroRNA w komórkach ssaków

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Odkryj metodę regulacji tropizmu pikornawirusa za pomocą mikroRNA poprzez wprowadzenie komplementarnych sekwencji do genomu wirusa. Technika ta wymaga minimalnej modyfikacji i zwiększa bezpieczeństwo badań wirusologicznych.

Regulacja tropizmu pikornawirusa w oparciu o mikroRNA

Przeglądaj więcej filmów