Rozszerzenie naczyń krwionośnych izolowanych naczyń krwionośnych i izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej myszy o napiętej skórze
24 marca 2017
Opisujemy izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca od myszy kontrolnych C57Bl/6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5. Opisujemy również badania rozszerzenia naczyń krwionośnych na izolowanych naczyniach od C57Bl / 6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5.
Ogólnym celem tych procedur izolacji macierzy zewnątrzkomórkowej i rozszerzenia naczyń krwionośnych ex vivo jest zbadanie leczenia peptydem hamującym IRF5 u gryzoni. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytanie, w jaki sposób zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej mogą zwiększać lub osłabiać postęp choroby. Główną zaletą badań nad rozszerzeniem naczyń krwionośnych jest to, że dają nam wgląd w procesy in vivo bez konieczności brania pod uwagę wszystkich składników sygnalizacyjnych.
Izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca można zastosować do innych narządów, takich jak kończyna tylna lub płuca. Po raz pierwszy wpadliśmy na ten pomysł, gdy zaczęliśmy skupiać się na duplikacji fibryliny u myszy o napiętej skórze i rozpoznaliśmy wpływ zmienionej macierzy zewnątrzkomórkowej i zachowania komórek. Po znieczuleniu myszy i przygotowaniu jej do zabiegu otwórz skórę za pomocą nożyczek.
Cięcie od klatki piersiowej do boku do kości szczęki z ostrożnością, aby nie naruszyć leżącej poniżej tkanki w kierunku przedniej części szczęki. Następnie wypreparuj tętnicę powięziową, usuwając otaczającą ją tkankę miękką. Robiąc to, należy uważać, aby nie uszkodzić tętnicy.
Zanurz odsłoniętą tkankę w buforze mopa, aby pozostały zdrowe. Gdy tętnica powięziowa zostanie w pełni odsłonięta, chwyć powięź proksymalnie do pierwszego rozwidlenia dystalnie do miejsca, w którym tętnica zostanie przecięta. Następnie odetnij go od tętnicy macierzystej i chwyć tętnicę powięziową kleszczami.
Odetnij dwie gałęzie wychodzące z powięzi, a następnie delikatnie podnieś naczynie, jednocześnie zrywając połączenia z otaczającą tkanką, aż do osiągnięcia rozwidlenia. Podczas rozwidlenia przetnij obie tętnice potomne, aby uwolnić naczynie i przenieś je do naczynia z buforem mopa, gdzie pozostanie nawodnione, dopóki nie będzie potrzebne. Aby zmierzyć rozszerzenie naczyń krwionośnych, najpierw przygotuj się do kaniulacji naczyń.
Załaduj szklane pipety o średnicy końcówki od 125 do 175 mikronów pełne bufora mopa. Napełnij również zbiorniki roztworu mopami. Teraz kaniuluj izolowane naczynia.
Przywiąż je do szklanych pipet za pomocą szwu optycznego. Należy pamiętać, aby w pipetach nie tworzyły się pęcherzyki powietrza. Następnie zamontuj komory naczyń na odwróconym mikroskopie z mocowaniem kamery wideo.
Przepuść wideo przez system pomiarowy suwmiarki wideo, aby dokonać pomiaru naczyń na ekranie. Teraz zwiększ ciśnienie w naczyniach w dwuetapowym procesie. Najpierw podnieś zbiorniki wypełnione mopami na wysokości nad naczyniem na 20 milimetrów słupa rtęci pod ciśnieniem.
Otwórz linkę z mopami do statku. Gdy ciśnienie w naczyniu rośnie, szukaj oznak przeciekania wokół wiązań i na całej długości naczynia. Jeśli nie zostaną znalezione żadne wycieki, podnieś zbiorniki, aby wytworzyć 60 milimetrów rtęci pod ciśnieniem.
Następnie ponownie sprawdź naczynia pod kątem wycieków. Gdy ciśnienie zostanie utrzymane bez wycieków, należy wyrównać naczynie przez 30 minut przy tym ciśnieniu. Po zrównoważeniu zmierz rozszerzenie naczyń krwionośnych w odpowiedzi na związek będący przedmiotem zainteresowania.
Najpierw zwęź naczynie o połowę do trzech czwartych, dodając U46619. Pozwól roztworowi kąpać naczynia przez sześć minut, aby się ustabilizował. Następnie stopniowo dodawać badany związek do roztworu do kąpieli, taki jak acetylocholina.
Co dwie minuty zwiększać stężenie roztworu badanego w kąpieli o 10, zaczynając od 000001 zębów trzonowych i przechodząc do 001 molowych. Zmiany w rozszerzeniu naczyń krwionośnych zrodziły pytania o sygnalizację. Ale my skupiamy się na sercu.
Aby ograniczyć wykorzystanie zwierząt, zdecydowaliśmy się wyizolować macierz zewnątrzkomórkową serca, aby skupić się na sygnalizacji inicjowanej z zewnątrz. Zacznij od pobrania serca od znieczulonej myszy. Przenieś go do zlewki wypełnionej 15 mililitrami hipertonicznego jednoprocentowego dodecylosiarczanu sodu.
Trzymaj roztwór, delikatnie mieszając na talerzu mieszającym w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnego dnia zmień roztwór na 15 mililitrów 5-procentowego trytona X100 przez 30 minut, a następnie 15 mililitrów PBS przez 15 minut. Następnie zatrzaskowo zamroź ECM i ciekły azot w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej.
Po zamrożeniu przenieś tkankę do wstępnie schłodzonego moździerza i tłuczka i zmiel ją na proszek. Zawiesić proszek w PBS z dodatkiem antybiotyku w stężeniu 1:100 w lepkim roztworze. Sonikować zawiesinę przez 30 do 60 sekund w łaźni lodowej przy wysokim ustawieniu sonikacji.
Białko ECM jest teraz izolowane i musi pozostać zimne. Przed użyciem białka zmierz jego stężenie za pomocą testu Bradforda. Peptyd IRF5D jest peptydem hamującym, który znacznie różni się od normalnego IRF5.
IRF5D ma tylko 17 aminokwasów i wiąże się z miejscem fosforylacji IRF5. Zapobiega to fosforylacji i homodimeryzacji, zakłócając w ten sposób powstawanie stanu aktywnego IRF5. Heterozygotyczne myszy o napiętej skórze leczono IRF5D podskórnie przez trzy tygodnie.
Liczba neutrofili i CD64 zmniejszyła się, jak określono za pomocą immunohistochemii w średniej liczbie barwionych komórek w polu widzenia. Leczenie IRF5D poprawiło wywołane acetylocholiną rozszerzenie naczyń krwionośnych tętnic powięziowych u heterozygotycznych myszy o napiętej skórze leczonych IRF5D w porównaniu z myszami leczonymi buforem fosforanowym. W hodowanych miocytach pochodzących z tkanki serca myszy transgenicznych było więcej komórek IRF5 dodatnich w hodowlach myszy heterozygotycznych o napiętej skórze niż u myszy kontrolnych.
Traktowanie którejkolwiek z kultur IRF5D spowodowało zmniejszenie jąder IRF5 dodatnich. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zdeceluaryzować serce. Po opanowaniu technikę tę można przenieść na wiele narządów i pomóc odpowiedzieć na różne pytania I pamiętaj, że ważne jest, aby nie przetrawić matrycy.
Powinieneś również dobrze zrozumieć, jak wypreparować i zawiesić tętnicę powięziową. Po opanowaniu ta technika powinna zająć około 60 minut i może być stosowana na prawie każdym łożysku naczyniowym. Ważne jest, aby pamiętać, jak kruchy jest śródbłonek, należy postępować ostrożnie podczas sekcji.
Nierzadko zdarza się, że masz zdrowe mięśnie gładkie i uszkodzony śródbłonek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule opisano izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca z różnych modeli mysich oraz przeprowadzone następnie badania nad wazodylatacją. Głównym celem jest zrozumienie wpływu leczenia peptydem hamującym IRF5 na progresję choroby.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia układu sercowo-naczyniowego
- Badania nad macierzą zewnątrzkomórkową
Wstęp
- Izolacja macierzy pozakomórkowej jest kluczowa dla badania jej roli w chorobach.
- IRF5 jest zaangażowany w progresję niektórych chorób.
- Myszy z fenotypem tight-skin wykazują zmienione właściwości macierzy pozakomórkowej.
- Badania nad wazodylatacją dostarczają informacji o funkcji naczyniowej.
Cel badania
- Wyizolowanie macierzy zewnątrzkomórkowej serca do dalszych analiz.
- Ocena wpływu peptydu inhibującego IRF5 na odpowiedzi naczyniowe.
- Zrozumienie, w jaki sposób zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej wpływają na progresję choroby.
Zastosowane metody
- Izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej serca z modeli mysich.
- Badania wazodylatacji ex vivo na izolowanych naczyniach.
- Porównanie odpowiedzi między myszami kontrolnymi a leczonymi.
- Przygotowanie chirurgiczne myszy do izolacji macierzy.
Główne wyniki
- Pomyślna izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej serca z różnych szczepów myszy.
- Reakcje wazodylatacyjne różniły się między myszami kontrolnymi a myszami traktowanymi peptydem IRF5.
- Zdobycie wiedzy na temat roli macierzy zewnątrzkomórkowej w funkcji naczyniowej.
- Potencjalne zastosowania metody izolacji w odniesieniu do innych organów.
Wnioski
- Badanie podkreśla znaczenie macierzy zewnątrzkomórkowej dla zdrowia układu sercowo-naczyniowego.
- Leczenie z użyciem peptydu hamującego IRF5 wykazuje potencjał w modyfikowaniu odpowiedzi naczyniowych.
- Dalsze badania są niezbędne w celu zgłębienia implikacji dla leczenia chorób.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda umożliwia mechanistyczne obniżenie ryzyka uznania IRF5 za cel terapeutyczny poprzez powiązanie przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej z dysfunkcją naczyniową w przebiegu włóknienia zapalnego. Test rozszerzania naczyń ex vivo dostarcza ilościowych, powtarzalnych wyników dotyczących funkcji śródbłonka, niezależnie od czynników zakłócających o charakterze systemowym, co wspiera walidację celu w modelach przedklinicznych. Izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej istotnej dla przebiegu choroby ułatwia przesiew fenotypowy oraz wyjaśnienie szlaków sygnałowych w procesie odkrywania leków przeciw włóknieniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezę terapeutyczną, według której hamowanie IRF5 zmniejsza sygnalizację prozapalną oraz odkładanie macierzy zewnątrzkomórkowej u myszy z modelem twardej skóry (tight-skin mice).
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez pomiar translokacji jądrowej IRF5 oraz ekspresji ICAM w kardiomiocytach.
- Wartość predykcyjna: Wspiera selekcję projektów w portfolio, wykazując poprawę rozszerzenia naczyń śródbłonkowych jako funkcjonalny biomarker zaangażowania celu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Izolowana macierz pozakomórkowa serca zapewnia standaryzowany, istotny z punktu widzenia choroby system do oceny wpływu związków na zachowanie i sygnalizację komórkową.
- Wynik ilościowy: Pomiary wazodylatacji ex vivo z wykorzystaniem krzywych zależności odpowiedzi od dawki acetylocholiny umożliwiają precyzyjną ocenę funkcji śródbłonka w izolowanych tętnicach twarzowych.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Protokół izolacji ECM można przenieść na łożyska naczyniowe kończyn tylnych, płuc lub inne, aby wesprzeć walidację celów terapeutycznych w różnych narządach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście choroby: Wykorzystuje model myszy z twardą skórą, który wykazuje włóknienie i dysfunkcję naczyniową analogiczną do ludzkiej twardziny.
- Ciągłość translacyjna: Łączy inhibicję IRF5 ze zmniejszeniem zmian w macierzy zewnątrzkomórkowej i poprawą rozszerzania naczyń, co wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego w procesie translacji klinicznej.
- Użyteczność modelu przedklinicznego: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez wykazanie zapośredniczonej przez cel poprawy funkcji naczyniowej po przewlekłym podawaniu podskórnym.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po przedkliniczną ocenę skuteczności – umożliwiając iteracyjne projektowanie związków modulujących IRF5 w oparciu o fenotypy naczyniowe i macierzy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez izolację macierzy pozakomórkowej w celu badania sygnalizacji zewnątrz-do-wewnątrz, która napędza aktywację IRF5 i odpowiedzi prozapalne.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy tkanki naczyniowe z powtarzalnymi odpowiedziami wazodylatacyjnymi w celu oceny mocy i selektywności związków.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary zmiennych zależnych (zmiany średnicy naczyń) oraz wyniki statystyczne (EC50, % wazodylatacji) do porównania efektów leczenia między grupami.
- Badania translacyjne: Łączy zaangażowanie celu molekularnego (redukcja jądrowa IRF5) z wynikami na poziomie tkankowym (remodelowanie ECM) i poprawą funkcjonalną (wazodylatacja) w systemie istotnym dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy możliwość ponownego wykorzystania metody do badania oddziaływań między macierzą pozakomórkową a naczyniami w wielu systemach organowych i modelach chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez odizolowanie funkcji naczyniowej od zmiennych systemowych, co zwiększa pewność co do relacji między celem a chorobą.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury wazodylatacji i izolacji ECM, zwiększając powtarzalność w różnych laboratoriach i umożliwiając współpracę międzyfunkcyjną.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez powiązanie inhibicji celu z funkcjonalnymi efektami naczyniowymi, co redukuje biologiczne ryzyko na późnych etapach programów badania włóknienia.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapii skierowanych przeciwko IRF5 z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wykazaną poprawę funkcji śródbłonka i homeostazy macierzy.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrodysekcji naczyniowej, myografii ciśnieniowej oraz biochemii macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Zależna od specjalistycznej aparatury, w tym systemów wideo-mierników, mikroskopów odwróconych oraz zbiorników ciśnieniowych do badań wazodylatacji.
- Wymaga standaryzacji postępowania z tkanką, składu buforu (MOPS) oraz protokołów skurczu (prekonstrykcja U46619) w celu zapewnienia porównywalności danych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody izolacji ECM do tkanek pozasercowych, w tym optymalizacji odczynników do decelularyzacji (SDS, Triton X-100) oraz czasu ich działania.
- Ograniczenie praktyczne: kruchość izolowanego endotelium wymaga niezwykle precyzyjnej techniki, aby uniknąć uszkodzeń mechanicznych podczas kaniulacji i utrymaskiwania ciśnienia w naczyniu.
