Name: Rozszerzenie naczyń krwionośnych izolowanych naczyń krwionośnych i izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej myszy o napiętej skórze (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca i badania rozszerzania naczyń ex vivo u myszy o napiętej skórze. Ta metoda pozwala ocenić wpływ peptydu hamującego IRF5 na odpowiedzi naczyniowe i postęp choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) i HL-102836 (KAP) oraz Cimphoni Life Sciences (część wynagrodzenia DW). Autorzy dziękują Meghann Sytsma za redakcję rękopisu.

<ol><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF5%29+expression+in+human+ductal+carcinoma+correlates+with+disease+stage+and+contributes+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).</li>
<li>Dideberg, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insertion-deletion+polymorphism+in+the+interferon+regulatory+Factor+5+%28IRF5%29+gene+confers+risk+of+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases.</a> Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).</li>
<li>Graham, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+haplotype+of+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF5%29+regulates+splicing+and+expression+and+is+associated+with+increased+risk+of+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Genet%22%5BJournal%5D)">A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus.</a> Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).</li>
<li>Krausgruber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF5+promotes+inflammatory+macrophage+polarization+and+TH1-TH17+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses.</a> Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).</li>
<li>Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+5+in+human+autoimmunity+and+murine+models+of+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease.</a> Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).</li>
<li>Mayes, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochip+analysis+identifies+multiple+susceptibility+Loci+for+systemic+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis.</a> Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).</li>
<li>Dimitroulas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-and+Macrovascular+Treatment+Targets+in+Scleroderma+Heart+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease.</a> Curr Pharm Des. , (2013).</li>
<li>Botstein, G. R., LeRoy, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+heart+disease+in+systemic+sclerosis+%28scleroderma%29%3A+advances+in+clinical+and+pathologic+features%2C+pathogenesis%2C+and+new+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches.</a> Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).</li>
<li>Oram, S., Stokes, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+in+scleroderma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Heart+J%22%5BJournal%5D)">The heart in scleroderma.</a> Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4F+decreases+IRF5+expression+and+activation+in+hearts+of+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice.</a> PLoS One. 7 (12), 52046(2012).</li>
<li>Steen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+in+systemic+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Rheumatol.Rep%22%5BJournal%5D)">The heart in systemic sclerosis.</a> Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).</li>
<li>Deshpande, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RCSB+Protein+Data+Bank%3A+a+redesigned+query+system+and+relational+database+based+on+the+mmCIF+schema%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema.</a> Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).</li>
<li>Concepcion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+biomolecular+interactions+using+biolayer+interferometry+for+kinetic+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Comb+Chem+High+Throughput+Screen%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization.</a> Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).</li>
<li>Matthew, A. <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/drug-discovery/p97058-current-biosensor-technologies-in-drug-discovery-summer-06.html">Current biosensor technologies in drug discovery.</a> Drug Discovery. , 69(2006).</li>
<li>Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+MED-SuMo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">A review of MED-SuMo applications.</a> Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).</li>
<li>Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mucosal+immunization+of+recombinant+adenovirus-based+vaccine+expressing+F1+protein+fragment+induces+protective+mucosal+immunity+against+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection.</a> Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).</li>
<li>Frenzel, D., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Titration+Series+with+Biolayer+Interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry.</a> PloS one. 9 (9), 106882(2014).</li>
<li>Ou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-4F%2C+an+apolipoprotein+A-1+mimetic%2C+dramatically+improves+vasodilation+in+hypercholesterolemia+and+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease.</a> Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Bauer, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+phosphorylation+and+protein-protein+interactions+revealed+by+loss+of+function+and+gain+of+function+mutants+of+multiple+serine+phosphorylation+sites+in+endothelial+nitric-oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase.</a> J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).</li>
<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+IRF5+Decoy+Peptide+Reduces+Myocardial+Inflammation+and+Fibrosis+and+Improves+Endothelial+Cell+Function+in+Tight-Skin+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).</li>
<li>Hoogenboom, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+phage+display+technology+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotechnology%22%5BJournal%5D)">Antibody phage display technology and its applications.</a> Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).</li>
<li>Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+colorimetric+assay+for+cell+proliferation+and+viability+utilizing+the+tetrazolium+salt+XTT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT.</a> J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).</li>
<li>Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+3-%284%2C+5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C+5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+%28MTT%29+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Res Notes. 8 (1), 1(2015).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Ou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-4F%2C+an+apolipoprotein+A-1+mimetic%2C+dramatically+improves+vasodilation+in+hypercholesterolemia+and+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease.</a> Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).</li>
<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+D-4F+on+vasodilation%2C+oxidative+stress%2C+angiostatin%2C+myocardial+inflammation%2C+and+angiogenic+potential+in+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).</li>
<li>Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoy%2C+S+%22Autoimmune+Disorders+-+Pathogenetic+Aspects%22">Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects</a>. Mavragani, C. , 35(2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Celem było zaprojektowanie inhibitora IRF5 w celu wyjaśnienia roli IRF5 w stanach zapalnych, zwłóknieniu i funkcji naczyniowej w sercach myszy Tsk/+. Wyniki wskazują, że IRF5D nie indukował proliferacji ani apoptozy. Ponadto zmniejszył się stan zapalny i poprawiła się funkcja naczyń krwionośnych. Dane te sugerują, że IRF5 odgrywa ważną mechanistyczną rolę w rozwoju stanu zapalnego i zwłóknienia w sercu myszy Tsk / + i że może służyć jako cel terapeutyczny.
Pierwszym krokiem było zaprojektowani...

Regulacja wzrostu i śmierci komórek odpowiedzi immunologicznych jest kluczowa dla roli rodziny czynników transkrypcyjnych regulujących interferon. Podkreśla się, że IRF5 ma kluczowe znaczenie dla regulacji odpowiedzi immunologicznej między typem 1, reakcją promującą stan zapalny, a odpowiedzią immunologiczną typu 2, odpowiedzią immunologiczną ukierunkowaną na naprawę tkanek. IRF5 jest kluczem w raku1, oraz autoimmunity2,3,4,5.
Mysz o napiętej skórze (Tsk/+) jest modelem zwłóknienia tkanek i twardziny spowodowanej mutacją duplikacyjną w genie fibryliny-1. Ta mutacja powoduje napięcie skóry i wzrost tkanki łącznej. U tych myszy rozwija się zapalenie mięśnia sercowego, zwłóknienie i wreszcie niewydolność serca5,6,7,8,9. Twardzina skóry jest autoimmunologiczną chorobą zwłóknieniową, która dotyka około 150 000 pacjentów w Stanach Zjednoczonych6. Cechami charakterystycznymi tej choroby są zwłóknienie narządów wewnętrznych, w tym serca7,8,9,10,11.
Charakter badania wymagał zaprojektowania peptydu hamującego. Wybrano podejście programowe zamiast tradycyjnego podejścia wykorzystującego wyświetlacz fagowy. Podejście oparte na oprogramowaniu jest łatwiejsze i mniej czasochłonne. Bank danych RCSB służy do identyfikowania odpowiednich miejsc wiązania12. Aby zbadać interakcję nowo zaprojektowanego peptydu z rekombinowanym białkiem i skupić się na parametrach wiązania, zastosowano technikę zwaną interferometrią biowarstw. Interferometria biowarstwowa to technika oparta na biosensorze, która określa powinowactwo, asocjację i dysocjację wiązania za pomocą biosensora i próbki wiążącej. Biosensor może być znakowany fluorescencyjnie, luminescencyjnie, radiometrycznie i kolorymetrycznie. Pomiar opiera się na dodawaniu lub uszczuplaniu masy, przypominającym asocjację i dysocjację13,14. Celem tego badania było zrozumienie roli IRF5 w zapaleniu i zwłóknieniu mięśnia sercowego. Celem było uzyskanie wglądu w rolę IRF5 w rozwoju zwłóknienia tkanek i twardziny.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Triton X 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100ml</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-mysie IgG znakowane Alexa 488&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Bardford odczynnik</td><td>Thermo Fisher</td><td>23200</td><td>Pierce&nbsp;</td></tr><tr><td>Biosensory</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże CellEvent Caspase-3/7 Thermo</td><td>Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Zestaw do oznaczania proliferacji komórek</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&,6-diamidino-2-fenyloindol)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-1306</td><td>rozcieńczenie 1:1,000 w PBS</td></tr><tr><td>osło anty szczury Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21208</td><td>1:1,000 rozcieńczenie w PBS</td></tr><tr><td>ECL plus</td><td>GE healthcare/Amersham</td><td>RPN2133</td><td>Po wielu próbach i błędach wróciliśmy do tego mikroskopu</td></tr><tr><td>Eclipse TE 200-U z oprogramowaniem do skanowania laserowego EZ C1</td><td>Koza Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty królik Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000 w PBS</td></tr><tr><td>HRP&nbsp; anty-kozie</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td>!:10,000 rozcieńczenie w TBS</td></tr><tr><td>HRP osło anty-myszy</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>1:10,000 rozcieńczenie w TBS</td></tr><tr><td>ICAM-1</td> przeciwciało <td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>1:200 rozcieńczenie w</td></tr><tr><td>PBS IRF5 przeciwciało (H56)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Elx800</td><td>Marker</td> neutrofili Biotek <td></td><td></td></tr><tr><td>NIMP</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-133821</td><td>Rozcieńczenie 1:200 w PBS</td></tr><tr><td>Octet RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>wiążące białko-białko</td></tr><tr><td>Projekt peptydu&nbsp; Oprogramowanie Medit SA</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synteza rekombinowanego białka IRF5</td><td>TopGene Technologies</td><td></td><td>ekspresja białek, usługa syntezy</td></tr><tr><td>dodecylowo-fosforan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td>detergent</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Apteka</td><td></td><td>Harmonogram III substancja kontrolowana, wymagane wskazanie&nbsp;</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5X-45X Trójokularowy mikroskop stereoskopowy z zoomem preparacyjnym z lampami LED na gęsiej szyi</td><td>Am Scope</td><td>SKU: SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny odsalające Zeba</td><td>Thermofisher</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Basal Media EBM Bullet kit</td><td>Zestaw Lonza</td><td>CC-3124</td><td>zawiera suplementy wzrostu</td></tr><tr><td>VIA-100K</td><td>&nbsp; Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15% TGX żel</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MedSuMo</td><td>Medit, Palaiseau, Francja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rozszerzenie naczyń krwionośnych izolowanych naczyń krwionośnych i izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej myszy o napiętej skórze

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Czynnik regulacyjny interferonu 5 (IRF5) jest kluczowy dla komórek, aby określić, czy reagują w sposób prozapalny czy przeciwzapalny. Zdolność IRF5 do przełączania komórek z jednej ścieżki na drugą jest bardzo atrakcyjna jako cel terapeutyczny. Zaprojektowaliśmy peptyd wabik IRF5D z oprogramowaniem do modelowania molekularnego do projektowania małych cząsteczek i peptydów.
IRF5D hamował IRF5, zmniejszał zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej i poprawiał rozszerzenie naczyń krwionośnych śródbłonka u myszy o napiętej skórze (Tsk/+). Kd IRF5D dla rekombinowanego IRF5 wynosi 3,72 ± 0,74 x 10-6 M, jak określono w eksperymentach wiązania przy użyciu eksperymentów interferometrii biowarstw. Proliferacja i apoptoza komórek śródbłonka (EC) pozostały niezmienione przy rosnącym stężeniu IRF5D (od 0 do 100 μg/ml, 24 h). Myszy Tsk/+ leczono IRF5D (1 mg/kg/d podskórnie, 21 d). Ekspresje IRF5 i ICAM były zmniejszone po leczeniu IRF5D. Funkcja śródbłonka uległa poprawie, co oceniano na podstawie rozszerzenia naczyń krwionośnych tętnic twarzowych u myszy Tsk / + leczonych IRF5D w porównaniu z myszami Tsk / + bez leczenia IRF5D. Jako czynnik transkrypcyjny IRF5 przemieszcza się z cytozolu do jądra. Translokację oceniano za pomocą immunohistochemii na miocytach serca hodowanych na różnych matrycach zewnątrzkomórkowych serca. Leczenie IRF5D myszy Tsk/+ spowodowało zmniejszenie liczby jąder IRF5 dodatnich w porównaniu ze zwierzętami bez leczenia IRF5D (50 μg/ml, 24 h). Odkrycia te pokazują ważną rolę, jaką IRF5 odgrywa w zapaleniu i zwłóknieniu u myszy Tsk/+.

Wyniki przedstawione w Rysunek 1 pokazanie, jak zaprojektować peptyd. Rycina 1, w górnym lewym rogu, przedstawia region (między 2 żółtymi strzałkami, aminokwasy (aa) 425-436) w IRF5, który jest fosforylowany przez szereg kinaz. Rycina 1, w prawym górnym rogu, przedstawia żółty owal w miejscu wiązania domeny fosforylowanej IRF5. Strukturę dimeryczną 3DSH obrócono, aby zaobserwować szczelinę lub wgłębienie po lewej stronie helisy 2 (aa303-3...

Opisujemy izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca od myszy kontrolnych C57Bl/6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5. Opisujemy również badania rozszerzenia naczyń krwionośnych na izolowanych naczyniach od C57Bl / 6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5.

Rozszerzenie naczyń krwionośnych izolowanych naczyń krwionośnych i izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej myszy o napiętej skórze

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Ogólnym celem niniejszych procedur izolacji macierzy zewnątrzkomórkowej oraz badania rozszerzania naczyń ex vivo jest analiza wpływu leczenia peptydem hamującym IRF5 u gryzoni. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej mogą przyspieszać lub hamować postęp choroby. Główną zaletą badań nad rozszerzaniem naczyń jest uzyskanie wglądu w procesy in vivo bez konieczności uwzględniania wszystkich komponentów sygnalizacyjnych.Izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca można zastosować również do innych organów, takich jak kończyna tylna lub płuca. Pomysł ten pojawił się, gdy zaczęliśmy skupiać się na duplikacji fibrilliny 1 u myszy z ciasną skórą i dostrzegliśmy wpływ zmienionej macierzy zewnątrzkomórkowej oraz zachowania komórek. Po znieczuleniu myszy i przygotowaniu jej do zabiegu, otwórz skórę za pomocą nożyczek.Wykonaj nacięcie od klatki piersiowej w stronę bocznej części żuchwy, uważając, aby nie uszkodzić tkanek podległych w przedniej części żuchwy. Następnie wypreparuj tętnicę fascialis, usuwając otaczającą ją tkankę miękką. Podczas tej czynności należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić tętnicy.Obmywaj odsłoniętą tkankę bufo

vasodilation-isolated-vessels-isolation-extracellular-matrix-tight

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prezentujemy preparat do wizualizacji i manipulowania sygnalizacją wapniową w natywnym, nienaruszonym śródbłonku mikronaczyniowym. Śródbłonek świeżo wyizolowany z tętnic oporowych myszy zaopatrujących mięśnie szkieletowe zachowują morfologię in vivo i dynamiczną sygnalizację w sąsiednich komórkach i między nimi. Rurki śródbłonka można przygotować z mikronaczyń innych tkanek i narządów.

Izolacja śródbłonka mikronaczyniowego z tętnic oporowych myszy

Macierz zewnątrzkomórkowa ulega znacznej przebudowie podczas gojenia się ran, stanów zapalnych i nowotworzenia. Przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii immunofluorescencyjnej przyżyciowej do wizualizacji dynamiki fibrylarnych, a także siatkowych składników matrycy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Przedstawione okno mysiej komory grzbietowego fałdu skórnego wizualizuje strefę ostrego, uporczywego niedokrwienia płata mięśniowo-skórnego. Przyżyciowa mikroskopia epifluorescencyjna pozwala na bezpośrednią i powtarzalną ocenę mikrokrążenia i ilościowe określenie hemodynamiki. Wyniki morfologiczne i hemodynamiczne można dodatkowo skorelować z analizami histologicznymi i molekularnymi.

Niedokrwienne uszkodzenie tkanki w grzbietowej komorze fałdu skórnego myszy: model płata skóry do badania ostrego uporczywego niedokrwienia

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie technik izolacji i hodowli mysich pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z krążenia wieńcowego. Po wyizolowaniu VSMC można je stosować w wielu standardowych technikach hodowli.

Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Protokoły badania embrionalnej i okołoporodowej mysiej aorty za pomocą analizy klonalnej in vivo i mapowania losu, eksplantatów aorty i izolowanych komórek mięśni gładkich są szczegółowo opisane tutaj. Te różnorodne podejścia ułatwiają badanie morfogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej w prawidłowym rozwoju oraz patogenezy choroby.

Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej

Tutaj prezentujemy protokół izolacji całych, nienaruszonych gruczołów sutkowych myszy w celu zbadania ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i morfologii przewodowej. Gruczoły brzuszne myszy #4 wyekstrahowano od 8-10 tygodniowych samic myszy nieródek, utrwalono w neutralnej buforowanej formalinie, pocięto i wybarwiono przy użyciu immunohistochemii białek ECM.

Izolacja nienaruszonych, całych gruczołów sutkowych myszy w celu analizy ekspresji macierzy zewnątrzkomórkowej i morfologii gruczołów

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru przecieku naczyniowego wywołanego śródskórnym podawaniem środków zwiększających przepuszczalność do skóry myszy. Technika ta może być wykorzystana do określenia zdolności cząsteczek do promowania lub hamowania przecieku naczyniowego lub do badania mechanizmów molekularnych regulujących przepuszczalność naczyń.

Ocena czynników indukujących nadprzepuszczalność naczyń krwionośnych w skórze za pomocą testu Milesa

Ten manuskrypt opisuje prosty protokół izolacji tętniczek od siatkówki szczura, który może być wykorzystany w badaniach elektrofizjologicznych, obrazowania wapnia i miografii ciśnieniowej.

Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Poznaj izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca i badania rozszerzania naczyń ex vivo u myszy o napiętej skórze. Ta metoda pozwala ocenić wpływ peptydu hamującego IRF5 na odpowiedzi naczyniowe i postęp choroby.

Rozszerzenie naczyń krwionośnych izolowanych naczyń krwionośnych i izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej myszy o napiętej skórze

Przeglądaj więcej filmów