Name: Rozszerzenie naczyń krwionośnych izolowanych naczyń krwionośnych i izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej myszy o napiętej skórze (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Poznaj izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca i badania rozszerzania naczyń ex vivo u myszy o napiętej skórze. Ta metoda pozwala ocenić wpływ peptydu hamującego IRF5 na odpowiedzi naczyniowe i postęp choroby.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty NIH HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) i HL-102836 (KAP) oraz Cimphoni Life Sciences (część wynagrodzenia DW). Autorzy dziękują Meghann Sytsma za redakcję rękopisu.

<ol><li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF5%29+expression+in+human+ductal+carcinoma+correlates+with+disease+stage+and+contributes+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Loss of interferon regulatory factor 5 (IRF5) expression in human ductal carcinoma correlates with disease stage and contributes to metastasis.</a> Breast Cancer Res. 13 (6), 111(2011).</li>
<li>Dideberg, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+insertion-deletion+polymorphism+in+the+interferon+regulatory+Factor+5+%28IRF5%29+gene+confers+risk+of+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">An insertion-deletion polymorphism in the interferon regulatory Factor 5 (IRF5) gene confers risk of inflammatory bowel diseases.</a> Hum Mol Genet. 16 (24), 3008-3016 (2007).</li>
<li>Graham, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+haplotype+of+interferon+regulatory+factor+5+%28IRF5%29+regulates+splicing+and+expression+and+is+associated+with+increased+risk+of+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Genet%22%5BJournal%5D)">A common haplotype of interferon regulatory factor 5 (IRF5) regulates splicing and expression and is associated with increased risk of systemic lupus erythematosus.</a> Nat.Genet. 38 (5), 550-555 (2006).</li>
<li>Krausgruber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF5+promotes+inflammatory+macrophage+polarization+and+TH1-TH17+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">IRF5 promotes inflammatory macrophage polarization and TH1-TH17 responses.</a> Nat. Immunol. 12 (3), 231-238 (2011).</li>
<li>Eames, H. L., Corbin, A. L., Udalova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon+regulatory+factor+5+in+human+autoimmunity+and+murine+models+of+autoimmune+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Interferon regulatory factor 5 in human autoimmunity and murine models of autoimmune disease.</a> Transl Res. 167 (1), 167-182 (2016).</li>
<li>Mayes, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunochip+analysis+identifies+multiple+susceptibility+Loci+for+systemic+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Immunochip analysis identifies multiple susceptibility Loci for systemic sclerosis.</a> Am J Hum Genet. 94 (1), 47-61 (2014).</li>
<li>Dimitroulas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-and+Macrovascular+Treatment+Targets+in+Scleroderma+Heart+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Micro-and Macrovascular Treatment Targets in Scleroderma Heart Disease.</a> Curr Pharm Des. , (2013).</li>
<li>Botstein, G. R., LeRoy, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+heart+disease+in+systemic+sclerosis+%28scleroderma%29%3A+advances+in+clinical+and+pathologic+features%2C+pathogenesis%2C+and+new+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Primary heart disease in systemic sclerosis (scleroderma): advances in clinical and pathologic features, pathogenesis, and new therapeutic approaches.</a> Am Heart J. 102 (5), 913-919 (1981).</li>
<li>Oram, S., Stokes, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+in+scleroderma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+Heart+J%22%5BJournal%5D)">The heart in scleroderma.</a> Br Heart J. 23 (3), 243-259 (1961).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4F+decreases+IRF5+expression+and+activation+in+hearts+of+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">4F decreases IRF5 expression and activation in hearts of tight-skin mice.</a> PLoS One. 7 (12), 52046(2012).</li>
<li>Steen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+in+systemic+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.Rheumatol.Rep%22%5BJournal%5D)">The heart in systemic sclerosis.</a> Curr.Rheumatol.Rep. 6 (2), 137-140 (2004).</li>
<li>Deshpande, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RCSB+Protein+Data+Bank%3A+a+redesigned+query+system+and+relational+database+based+on+the+mmCIF+schema%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RCSB Protein Data Bank: a redesigned query system and relational database based on the mmCIF schema.</a> Nucleic Acids Res. 33, Database issue D233-D237 (2005).</li>
<li>Concepcion, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+biomolecular+interactions+using+biolayer+interferometry+for+kinetic+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Comb+Chem+High+Throughput+Screen%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization.</a> Comb Chem High Throughput Screen. 12 (8), 791-800 (2009).</li>
<li>Matthew, A. <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/drug-discovery/p97058-current-biosensor-technologies-in-drug-discovery-summer-06.html">Current biosensor technologies in drug discovery.</a> Drug Discovery. , 69(2006).</li>
<li>Doppelt-Azeroual, O., Moriaud, F., Adcock, S. A., Delfaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+MED-SuMo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">A review of MED-SuMo applications.</a> Infect Disord Drug Targets. 9 (3), 344-357 (2009).</li>
<li>Kim, S., Jang, J., Yu, J., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+mucosal+immunization+of+recombinant+adenovirus-based+vaccine+expressing+F1+protein+fragment+induces+protective+mucosal+immunity+against+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Single mucosal immunization of recombinant adenovirus-based vaccine expressing F1 protein fragment induces protective mucosal immunity against respiratory syncytial virus infection.</a> Vaccine. 28 (22), 3801-3808 (2010).</li>
<li>Frenzel, D., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+Titration+Series+with+Biolayer+Interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Kinetic Titration Series with Biolayer Interferometry.</a> PloS one. 9 (9), 106882(2014).</li>
<li>Ou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-4F%2C+an+apolipoprotein+A-1+mimetic%2C+dramatically+improves+vasodilation+in+hypercholesterolemia+and+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease.</a> Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal.Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Bauer, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+phosphorylation+and+protein-protein+interactions+revealed+by+loss+of+function+and+gain+of+function+mutants+of+multiple+serine+phosphorylation+sites+in+endothelial+nitric-oxide+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">Compensatory phosphorylation and protein-protein interactions revealed by loss of function and gain of function mutants of multiple serine phosphorylation sites in endothelial nitric-oxide synthase.</a> J.Biol.Chem. 278 (17), 14841-14849 (2003).</li>
<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+IRF5+Decoy+Peptide+Reduces+Myocardial+Inflammation+and+Fibrosis+and+Improves+Endothelial+Cell+Function+in+Tight-Skin+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An IRF5 Decoy Peptide Reduces Myocardial Inflammation and Fibrosis and Improves Endothelial Cell Function in Tight-Skin Mice.</a> PLoS One. 11 (4), 0151999(2016).</li>
<li>Hoogenboom, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+phage+display+technology+and+its+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Immunotechnology%22%5BJournal%5D)">Antibody phage display technology and its applications.</a> Immunotechnology. 4 (1), 1-20 (1998).</li>
<li>Roehm, N. W., Rodgers, G. H., Hatfield, S. M., Glasebrook, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+colorimetric+assay+for+cell+proliferation+and+viability+utilizing+the+tetrazolium+salt+XTT%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved colorimetric assay for cell proliferation and viability utilizing the tetrazolium salt XTT.</a> J Immunol Methods. 142 (2), 257-265 (1991).</li>
<li>Van Tonder, A., Joubert, A. M., Cromarty, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+the+3-%284%2C+5-dimethylthiazol-2-yl%29-2%2C+5-diphenyl-2H-tetrazolium+bromide+%28MTT%29+assay+when+compared+to+three+commonly+used+cell+enumeration+assays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Limitations of the 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) assay when compared to three commonly used cell enumeration assays.</a> BMC Res Notes. 8 (1), 1(2015).</li>
<li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-decellularized+matrix%3A+using+nature%27s+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nat Med. 14 (2), 213-221 (2008).</li>
<li>Ou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-4F%2C+an+apolipoprotein+A-1+mimetic%2C+dramatically+improves+vasodilation+in+hypercholesterolemia+and+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">L-4F, an apolipoprotein A-1 mimetic, dramatically improves vasodilation in hypercholesterolemia and sickle cell disease.</a> Circulation. 107 (18), 2337-2341 (2003).</li>
<li>Weihrauch, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+D-4F+on+vasodilation%2C+oxidative+stress%2C+angiostatin%2C+myocardial+inflammation%2C+and+angiogenic+potential+in+tight-skin+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of D-4F on vasodilation, oxidative stress, angiostatin, myocardial inflammation, and angiogenic potential in tight-skin mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 293 (3), 1432-1441 (2007).</li>
<li>Roy, S., P, P. IRF-5 - A New Link to Autoimmune Diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoy%2C+S+%22Autoimmune+Disorders+-+Pathogenetic+Aspects%22">Autoimmune Disorders - Pathogenetic Aspects</a>. Mavragani, C. , 35(2011).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Celem było zaprojektowanie inhibitora IRF5 w celu wyjaśnienia roli IRF5 w stanach zapalnych, zwłóknieniu i funkcji naczyniowej w sercach myszy Tsk/+. Wyniki wskazują, że IRF5D nie indukował proliferacji ani apoptozy. Ponadto zmniejszył się stan zapalny i poprawiła się funkcja naczyń krwionośnych. Dane te sugerują, że IRF5 odgrywa ważną mechanistyczną rolę w rozwoju stanu zapalnego i zwłóknienia w sercu myszy Tsk / + i że może służyć jako cel terapeutyczny.
Pierwszym krokiem było zaprojektowani...

Regulacja wzrostu i śmierci komórek odpowiedzi immunologicznych jest kluczowa dla roli rodziny czynników transkrypcyjnych regulujących interferon. Podkreśla się, że IRF5 ma kluczowe znaczenie dla regulacji odpowiedzi immunologicznej między typem 1, reakcją promującą stan zapalny, a odpowiedzią immunologiczną typu 2, odpowiedzią immunologiczną ukierunkowaną na naprawę tkanek. IRF5 jest kluczem w raku1, oraz autoimmunity2,3,4,5.
Mysz o napiętej skórze (Tsk/+) jest modelem zwłóknienia tkanek i twardziny spowodowanej mutacją duplikacyjną w genie fibryliny-1. Ta mutacja powoduje napięcie skóry i wzrost tkanki łącznej. U tych myszy rozwija się zapalenie mięśnia sercowego, zwłóknienie i wreszcie niewydolność serca5,6,7,8,9. Twardzina skóry jest autoimmunologiczną chorobą zwłóknieniową, która dotyka około 150 000 pacjentów w Stanach Zjednoczonych6. Cechami charakterystycznymi tej choroby są zwłóknienie narządów wewnętrznych, w tym serca7,8,9,10,11.
Charakter badania wymagał zaprojektowania peptydu hamującego. Wybrano podejście programowe zamiast tradycyjnego podejścia wykorzystującego wyświetlacz fagowy. Podejście oparte na oprogramowaniu jest łatwiejsze i mniej czasochłonne. Bank danych RCSB służy do identyfikowania odpowiednich miejsc wiązania12. Aby zbadać interakcję nowo zaprojektowanego peptydu z rekombinowanym białkiem i skupić się na parametrach wiązania, zastosowano technikę zwaną interferometrią biowarstw. Interferometria biowarstwowa to technika oparta na biosensorze, która określa powinowactwo, asocjację i dysocjację wiązania za pomocą biosensora i próbki wiążącej. Biosensor może być znakowany fluorescencyjnie, luminescencyjnie, radiometrycznie i kolorymetrycznie. Pomiar opiera się na dodawaniu lub uszczuplaniu masy, przypominającym asocjację i dysocjację13,14. Celem tego badania było zrozumienie roli IRF5 w zapaleniu i zwłóknieniu mięśnia sercowego. Celem było uzyskanie wglądu w rolę IRF5 w rozwoju zwłóknienia tkanek i twardziny.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Triton X 100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100- 100ml</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-mysie IgG znakowane Alexa 488&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Bardford odczynnik</td><td>Thermo Fisher</td><td>23200</td><td>Pierce&nbsp;</td></tr><tr><td>Biosensory</td><td>Forte-Bio</td><td>MR18-0009</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (H-250)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-15364</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże CellEvent Caspase-3/7 Thermo</td><td>Fisher/Life Technologies</td><td>C10427</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter AQueous One Solution Zestaw do oznaczania proliferacji komórek</td><td>Promega</td><td>G3580</td><td>Promega</td></tr><tr><td>DAPI (4&,6-diamidino-2-fenyloindol)</td><td>Thermo Fisher</td><td>D-1306</td><td>rozcieńczenie 1:1,000 w PBS</td></tr><tr><td>osło anty szczury Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-21208</td><td>1:1,000 rozcieńczenie w PBS</td></tr><tr><td>ECL plus</td><td>GE healthcare/Amersham</td><td>RPN2133</td><td>Po wielu próbach i błędach wróciliśmy do tego mikroskopu</td></tr><tr><td>Eclipse TE 200-U z oprogramowaniem do skanowania laserowego EZ C1</td><td>Koza Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anty królik Alexa 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11008</td><td>Rozcieńczenie 1:1,000 w PBS</td></tr><tr><td>HRP&nbsp; anty-kozie</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-516086</td><td>!:10,000 rozcieńczenie w TBS</td></tr><tr><td>HRP osło anty-myszy</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-2315</td><td>1:10,000 rozcieńczenie w TBS</td></tr><tr><td>ICAM-1</td> przeciwciało <td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-1511</td><td>1:200 rozcieńczenie w</td></tr><tr><td>PBS IRF5 przeciwciało (H56)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-98651</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Elx800</td><td>Marker</td> neutrofili Biotek <td></td><td></td></tr><tr><td>NIMP</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td>sc-133821</td><td>Rozcieńczenie 1:200 w PBS</td></tr><tr><td>Octet RED</td><td>Forte Bio</td><td></td><td>wiążące białko-białko</td></tr><tr><td>Projekt peptydu&nbsp; Oprogramowanie Medit SA</td><td>RCSB.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synteza rekombinowanego białka IRF5</td><td>TopGene Technologies</td><td></td><td>ekspresja białek, usługa syntezy</td></tr><tr><td>dodecylowo-fosforan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>436143</td><td>detergent</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Apteka</td><td></td><td>Harmonogram III substancja kontrolowana, wymagane wskazanie&nbsp;</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>MedVet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3,5X-45X Trójokularowy mikroskop stereoskopowy z zoomem preparacyjnym z lampami LED na gęsiej szyi</td><td>Am Scope</td><td>SKU: SM-1TSX-L6W</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny odsalające Zeba</td><td>Thermofisher</td><td>2161515</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Basal Media EBM Bullet kit</td><td>Zestaw Lonza</td><td>CC-3124</td><td>zawiera suplementy wzrostu</td></tr><tr><td>VIA-100K</td><td>&nbsp; Boeckeler Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 - 15% TGX żel</td><td>Bio-Rad</td><td>5671081</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MedSuMo</td><td>Medit, Palaiseau, Francja</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rozszerzenie naczyń krwionośnych izolowanych naczyń krwionośnych i izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej myszy o napiętej skórze

Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice

Czynnik regulacyjny interferonu 5 (IRF5) jest kluczowy dla komórek, aby określić, czy reagują w sposób prozapalny czy przeciwzapalny. Zdolność IRF5 do przełączania komórek z jednej ścieżki na drugą jest bardzo atrakcyjna jako cel terapeutyczny. Zaprojektowaliśmy peptyd wabik IRF5D z oprogramowaniem do modelowania molekularnego do projektowania małych cząsteczek i peptydów.
IRF5D hamował IRF5, zmniejszał zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej i poprawiał rozszerzenie naczyń krwionośnych śródbłonka u myszy o napiętej skórze (Tsk/+). Kd IRF5D dla rekombinowanego IRF5 wynosi 3,72 ± 0,74 x 10-6 M, jak określono w eksperymentach wiązania przy użyciu eksperymentów interferometrii biowarstw. Proliferacja i apoptoza komórek śródbłonka (EC) pozostały niezmienione przy rosnącym stężeniu IRF5D (od 0 do 100 μg/ml, 24 h). Myszy Tsk/+ leczono IRF5D (1 mg/kg/d podskórnie, 21 d). Ekspresje IRF5 i ICAM były zmniejszone po leczeniu IRF5D. Funkcja śródbłonka uległa poprawie, co oceniano na podstawie rozszerzenia naczyń krwionośnych tętnic twarzowych u myszy Tsk / + leczonych IRF5D w porównaniu z myszami Tsk / + bez leczenia IRF5D. Jako czynnik transkrypcyjny IRF5 przemieszcza się z cytozolu do jądra. Translokację oceniano za pomocą immunohistochemii na miocytach serca hodowanych na różnych matrycach zewnątrzkomórkowych serca. Leczenie IRF5D myszy Tsk/+ spowodowało zmniejszenie liczby jąder IRF5 dodatnich w porównaniu ze zwierzętami bez leczenia IRF5D (50 μg/ml, 24 h). Odkrycia te pokazują ważną rolę, jaką IRF5 odgrywa w zapaleniu i zwłóknieniu u myszy Tsk/+.

Wyniki przedstawione na Rysunku 1 pokazują sposób projektowania peptydu. Rysunek 1, góra po lewej, przedstawia region w IRF5 (między 2 żółtymi strzałkami, aminokwasy (aa) 425-436), który jest fosforylowany przez szereg kinaz. Rysunek 1, góra po prawej, pokazuje żółtą owalną obszar, w którym wiąże się ufosforylowana domena IRF5. Strukturę dimeryczną 3DSH obrócono, aby zaobserwować szczelinę lub dolinę po lewej stronie Helisy 2 (aa303-312)....

Opisujemy izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca od myszy kontrolnych C57Bl/6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5. Opisujemy również badania rozszerzenia naczyń krwionośnych na izolowanych naczyniach od C57Bl / 6J, myszy o napiętej skórze i myszy o napiętej skórze leczonych peptydem hamującym IRF5.

Rozszerzenie naczyń krwionośnych izolowanych naczyń krwionośnych i izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej myszy o napiętej skórze

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5's ...

Ogólnym celem niniejszych procedur izolacji macierzy zewnątrzkomórkowej oraz badania rozszerzania naczyń ex vivo jest analiza wpływu leczenia peptydem hamującym IRF5 u gryzoni. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytanie, w jaki sposób zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej mogą przyspieszać lub hamować postęp choroby. Główną zaletą badań nad rozszerzaniem naczyń jest uzyskanie wglądu w procesy in vivo bez konieczności uwzględniania wszystkich komponentów sygnalizacyjnych.Izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca można zastosować również do innych organów, takich jak kończyna tylna lub płuca. Pomysł ten pojawił się, gdy zaczęliśmy skupiać się na duplikacji fibrilliny 1 u myszy z ciasną skórą i dostrzegliśmy wpływ zmienionej macierzy zewnątrzkomórkowej oraz zachowania komórek. Po znieczuleniu myszy i przygotowaniu jej do zabiegu, otwórz skórę za pomocą nożyczek.Wykonaj nacięcie od klatki piersiowej w stronę bocznej części żuchwy, uważając, aby nie uszkodzić tkanek podległych w przedniej części żuchwy. Następnie wypreparuj tętnicę fascialis, usuwając otaczającą ją tkankę miękką. Podczas tej czynności należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić tętnicy.Obmywaj odsłoniętą tkankę buforem MOPS, aby zachować jej żywotność. Po pełnym odsłonięciu tętnicy fascialis, uchwyć ją proksymalnie względem pierwszej bifurkacji dystalnie od miejsca planowanego przecięcia tętnicy. Następnie oddziel ją od tętnicy macierzystej i utrzymaj tętnicę fascialis za pomocą pincety.Odetnij dwie gałęzie odchodzące od fascialis, a następnie ostrożnie unieś naczynie, przecinając połączenia z otaczającymi tkankami, aż do osiągnięcia miejsca rozwidlenia. W miejscu rozwidlenia przetnij obie tętnice potomne, aby uwolnić naczynie, i przenieś je do naczynia z buforem MOPS, gdzie pozostanie ono nawodnione do momentu użycia. Aby zmierzyć rozszerzenie naczyń, w pierwszej kolejności przygotuj się do kaniulacji naczyń.Napełnij pipety szklane o średnicy końcowej od 125 do 175 mikronów buforem MOPS. Wypełnij również zbiorniki na roztwór buforem MOPS. Następnie przeprowadź kaniulację wyizolowanych naczyń.Przywiąż je do szklanych pipet za pomocą nici chirurgicznej okulistycznej. Należy dopilnować, aby w pipetach nie powstały pęcherzyki powietrza. Następnie zamocuj komory naczyń na mikroskopie odwróconym z dołączoną kamerą wideo.Przesuń wideo przez system pomiarowy wideo-suwmiarki, aby dokonać pomiaru naczyń na ekranie. Następnie napisz naczynia, stosując proces dwuetapowy. W pierwszej kolejności podnieś zbiorniki wypełnione mopsami na wysokość odpowiadającą ciśnieniu 20 mmHg.Otwórz linię z mopami do naczynia. W miarę wzrostu ciśnienia w naczyniu sprawdź, czy nie występują wycieki w okolicach opasek oraz wzdłuż naczynia. Jeśli nie stwierdzono wycieków, podnieś zbiorniki, aby wytworzyć ciśnienie równe 60 mmHg.Następnie ponownie sprawdź naczynia pod kątem nieszczelności. Po utrzymaniu ciśnienia bez wycieków, inkubuj naczynie w celu wyrównania parametrów przez 30 minut przy tym ciśnieniu. Po wyrównaniu parametrów zmierz wazodylatację w odpowiedzi na badany związek.W pierwszej kolejności zwęź naczynie o jedną drugą do trzech czwartych, dodając U46619. Pozostaw naczynia w roztworze przez sześć minut w celu stabilizacji. Następnie stopniowo dodawaj do roztworu kąpieli związek testowy, taki jak acetylocholina.Co dwie minuty zwiększaj stężenie roztworu testowego w kąpieli o 10, zaczynając od 000001 molar i przechodząc do 001 molar. Zmiany w rozszerzeniu naczyń krwionośnych wzbudziły pytania dotyczące sygnalizacji. Jednak naszym głównym celem jest serce.Aby ograniczyć liczbę wykorzystywanych zwierząt, zdecydowaliśmy się wyizolować macierz pozakomórkową serca, aby skupić się na sygnalizacji inicjowanej z zewnątrz. Rozpocznij od pobrania serca od znieczulonej myszy. Przenieś je do zlewki zawierającej 15 mililitrów hipertonicznego jednego procentowego dodecylosiarczanu sodu.Mieszać łagodnie roztwór na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnego dnia wymienić roztwór na 15 milliliters 5% Triton X100 na 30 minut, a następnie na 15 milliliters PBS na 15 minut. Następnie gwałtownie zamrozić ECM w ciekłym azocie w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 milliliter.Po zamrożeniu przenieść tkankę do schłodzonego wcześniej moździerza z tłuczkiem i rozetrzeć ją na proszek. Zawiesić proszek w PBS z dodatkiem antybiotyku w stężeniu 1:100 w roztworze o wysokiej lepkości. Sonicować zawiesinę przez 30 do 60 sekund w kąpieli lodowej przy wysokim ustawieniu sonikacji.Białko ECM zostało wyizolowane i musi pozostać w niskiej temperaturze. Przed użyciem białka należy zmierzyć jego stężenie za pomocą testu Bradforda. Peptyd IRF5D jest peptydem hamującym, który znacznie różni się od prawidłowego białka IRF5.IRF5D składa się tylko z 17 aminokwasów i wiąże się z miejscem fosforylacji IRF5. Zapobiega to fosforylacji i homodimeryzacji, zakłócając tym samym tworzenie aktywnego stanu IRF5. Myszy heterozygوطyczne z objawem tight skin były leczone podskórnie IRF5D przez trzy tygodnie.Liczba neutrofili oraz CD64 uległa zmniejszeniu, co określono za pomocą immunohistochemii na podstawie średniej liczby komórek barwionych w polu widzenia. Leczenie IRF5D poprawiło indukowane acetylocholiną rozszerzenie naczyń krwionośnych tętnic twarzowych u heterozygicznych myszy z ciasną skórą leczonych IRF5D w porównaniu z myszami leczonymi buforem fosforanowym. W hodowlach miocytów pochodzących z tkanki serca myszy transgenicznych w kulturach z heterozygicznych myszy z ciasną skórą stwierdzono więcej komórek IRF5-dodatnich niż w myszach kontrolnych.Potraktowanie obu kultur IRF5D doprowadziło do zmniejszenia liczby jąder dodatnich pod kątem IRF5. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić decelularyzację serca. Po opanowaniu ta technika może zostać przeniesiona na wiele organów i pomóc w udzieleniu odpowiedzi na szereg pytań. Należy pamiętać, że ważne jest, aby nie doprowadzić do nadmiernego trawienia macierzy.Należy również posiadać biegłość w preparowaniu i zawieszaniu tętnicy fascialis. Po opanowaniu, technika ta powinna zająć około 60 minut i może być stosowana w niemal każdym łożysku naczyniowym. Należy pamiętać o delikatności śródbłonka i zachować ostrożność podczas preparowania.Często zdarza się występowanie zdrowych mięśni gładkich przy jednoczesnym uszkodzeniu śródbłonka.

vasodilation-isolated-vessels-isolation-extracellular-matrix-tight

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Prezentujemy preparat do wizualizacji i manipulowania sygnalizacją wapniową w natywnym, nienaruszonym śródbłonku mikronaczyniowym. Śródbłonek świeżo wyizolowany z tętnic oporowych myszy zaopatrujących mięśnie szkieletowe zachowują morfologię in vivo i dynamiczną sygnalizację w sąsiednich komórkach i między nimi. Rurki śródbłonka można przygotować z mikronaczyń innych tkanek i narządów.

Izolacja śródbłonka mikronaczyniowego z tętnic oporowych myszy

Macierz zewnątrzkomórkowa ulega znacznej przebudowie podczas gojenia się ran, stanów zapalnych i nowotworzenia. Przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii immunofluorescencyjnej przyżyciowej do wizualizacji dynamiki fibrylarnych, a także siatkowych składników matrycy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

Przedstawione okno mysiej komory grzbietowego fałdu skórnego wizualizuje strefę ostrego, uporczywego niedokrwienia płata mięśniowo-skórnego. Przyżyciowa mikroskopia epifluorescencyjna pozwala na bezpośrednią i powtarzalną ocenę mikrokrążenia i ilościowe określenie hemodynamiki. Wyniki morfologiczne i hemodynamiczne można dodatkowo skorelować z analizami histologicznymi i molekularnymi.

Niedokrwienne uszkodzenie tkanki w grzbietowej komorze fałdu skórnego myszy: model płata skóry do badania ostrego uporczywego niedokrwienia

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie technik izolacji i hodowli mysich pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z krążenia wieńcowego. Po wyizolowaniu VSMC można je stosować w wielu standardowych technikach hodowli.

Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Protokoły badania embrionalnej i okołoporodowej mysiej aorty za pomocą analizy klonalnej in vivo i mapowania losu, eksplantatów aorty i izolowanych komórek mięśni gładkich są szczegółowo opisane tutaj. Te różnorodne podejścia ułatwiają badanie morfogenezy aorty zarodkowej i okołoporodowej w prawidłowym rozwoju oraz patogenezy choroby.

Wykorzystanie metod in vivo oraz eksplantatów tkanek i komórek do badania morfogenezy i patogenezy aorty embrionalnej i okołoporodowej

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru przecieku naczyniowego wywołanego śródskórnym podawaniem środków zwiększających przepuszczalność do skóry myszy. Technika ta może być wykorzystana do określenia zdolności cząsteczek do promowania lub hamowania przecieku naczyniowego lub do badania mechanizmów molekularnych regulujących przepuszczalność naczyń.

Ocena czynników indukujących nadprzepuszczalność naczyń krwionośnych w skórze za pomocą testu Milesa

Ten manuskrypt opisuje prosty protokół izolacji tętniczek od siatkówki szczura, który może być wykorzystany w badaniach elektrofizjologicznych, obrazowania wapnia i miografii ciśnieniowej.

Izolacja tętniczek siatkówki do badań fizjologii komórek ex vivo

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Celem tego protokołu jest opisanie generacji i analizy objętościowej unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry przy użyciu dostępnych i prostych technik dla długoterminowej hodowli. W miarę możliwości opisano uzasadnienie kroków, aby umożliwić badaczom dostosowanie ich do ich potrzeb badawczych.

Generacja samoorganizujących się unaczynionych odpowiedników ludzkiej skóry

Intensywne przygotowanie nienaruszonych "rurek" śródbłonka mózgu myszy z tętniczek miąższowych mózgu jest zilustrowane do badania regulacji przepływu krwi w mózgu. Ponadto pokazujemy eksperymentalne mocne strony tego modelu badania śródbłonka do obrazowania fluorescencyjnego i pomiaru elektrofizjologii kluczowych szlaków sygnalizacji komórkowej, w tym zmian wewnątrzkomórkowych [Ca2+] i potencjału błonowego.

Izolacja i analiza funkcjonalna śródbłonka tętniczego miąższu mózgu myszy

Poznaj izolację macierzy zewnątrzkomórkowej serca i badania rozszerzania naczyń ex vivo u myszy o napiętej skórze. Ta metoda pozwala ocenić wpływ peptydu hamującego IRF5 na odpowiedzi naczyniowe i postęp choroby.

Rozszerzenie naczyń krwionośnych izolowanych naczyń krwionośnych i izolacja macierzy zewnątrzkomórkowej myszy o napiętej skórze

Przeglądaj więcej filmów