Name: Pochodzenie kultur eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych od pośmiertnych dawców ludzkiego mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Poznaj technikę hodowli eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych od pośmiertnych dawców ludzkiego mózgu. Ta metoda pozwala uzyskać fibroblasty oponowe w ciągu 6-8 tygodni, umożliwiając badanie choroby Parkinsona.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Opracowanie tego protokołu zostało sfinansowane z prywatnych darowizn skierowanych do Programu Dawstwa Mózgu Instytutu Parkinsona.

Rejestracja dawcy mózgu zawiera dokumentację zarejestrowanego zamiaru oddania mózgu. Zgoda na autopsję w celu pobrania tkanek jest udzielana przez najbliższą krewną, zgodnie z prawem. Badania naukowe z wykorzystaniem pobranych próbek autopsyjnych są oceniane przez instytucjonalną komisję rewizyjną (IRB) w celu zapewnienia zgodności z przepisami ustawy o przenośności i odpowiedzialności w ubezpieczeniach zdrowotnych (HIPAA).
UWAGA: Próbki opon mózgowych są pobierane przez specjalistę mózgu lub neuropatologa podczas sekcji mózgu i są przechowywane w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml zawierających 25-30 ml pożywki wzrostowej opon mózgowych. Próbka jest przechowywana w temperaturze 4 °C do czasu przygotowania próbki. Przetwarzanie powinno być przeprowadzone tak szybko, jak to możliwe, ponieważ żywotność komórek zmniejsza się wraz z upływem czasu post mortem.
1. Przygotowanie przed rozpoczęciem sekcji opon mózgowo-rdzeniowych
UWAGA: Kroki 1.1 - 1.3 są do wykonania wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę wzrostową opon mózgowych, łącząc 375 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Dulbecco, 100 ml płodowej surowicy bydlęcej, 5 ml 10 ml 10 mM aminokwasów endogennych, 5 ml 200 ml L-alanylo-L-glutaminy, 5 ml 100 mM pirogronianu sodu, 5 ml 10 000 U/ml penicyliny/streptomycyny i 5 ml 250 μg/ml amfoterycyny B w 500 ml filtra. Przefiltruj i wymieszaj. Używaj nośnika przez okres do czterech tygodni.</li>
	<li>Przed rozpoczęciem preparacji umieść wszystkie materiały w komorze bezpieczeństwa biologicznego: 4x szalki Petriego, 2x płytki 6-dołkowe, 2x skalpele, 15-20 sterylizowanych 15-milimetrowych szkiełek nakrywkowych, sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS), pipety serologiczne, pipety aspiracyjne.</li>
	<li>Dodać 1 ml sterylnego, autoklawizowanego 0,1% roztworu żelatyny do każdego dołka na 6-dołkowej płytce. Odstaw talerz na 30-60 min. Przygotuj 2 płytki 6-dołkowe.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki opon mózgowo-rdzeniowych
UWAGA: Kroki 2.1 - 2.3 są do wykonania wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Dodać około 10 ml PBS do sterylnego 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej i umieścić w nim próbkę opon mózgowych. Za pomocą kleszczy delikatnie umyj opony mózgowe oponami mózgowymi PBS, aby usunąć krew.</li>
	<li>Przenieść opony mózgowe do nowego 10-centymetrowego naczynia do hodowli tkankowej zawierającego 10 ml świeżego PBS i kontynuować mycie. W razie potrzeby powtórz czynność, aby usunąć jak najwięcej krwi.</li>
	<li>Za pomocą dwóch skalpeli pokrój tkankę opon mózgowo-rdzeniowych na kawałek o wymiarach około 6 cm x 6 cm.</li>
	<li>Umieść pokrywkę na naczyniu hodowlanym i przenieś do mikroskopu preparacyjnego w poziomym okapie z przepływem laminarnym.</li>
</ol>
3. Sekcja tkanki opon mózgowych
UWAGA: Kroki 3.1 - 3.3 należy wykonać wewnątrz poziomego okapu z przepływem laminarnym za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
<ol>
	<li>Usuń naczynia krwionośne z obszaru na elemencie opon mózgowo-rdzeniowych (krok 2.3) wystarczająco dużych, aby utworzyć co najmniej 20-25 kawałków o wymiarach 3 mm x 3 mm. Przytrzymaj opony mózgowe na miejscu jednym skalpelem, a drugim delikatnie i płytko skrobanie, aby oddzielić naczynia.</li>
	<li>Wytnij małe kwadraty tkanki z przygotowanego regionu. Pokrój w procesie krokowym, najpierw robiąc większe kawałki, a następnie krojąc je na mniejsze części.</li>
	<li>Użyj jednego skalpela, aby przytrzymać tkankę na miejscu, a drugiego skalpela, aby przeciąć tkankę ruchem kołyszącym. Ze względu na konsystencję tkanki trudno jest dosunąć skalpele do siebie. Spowoduje to tylko rozerwę tkankę i spowoduje postrzępione krawędzie.</li>
	<li>Kontynuuj krojenie kawałków na pół, aż będzie około 20-25 kawałków 3 mm x 3 mm.</li>
</ol>
4. Przenoszenie wypreparowanych fragmentów opon mózgowych na płytki hodowli tkankowych
UWAGA: Krok 4 należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Odessać żelatynę z płytki 6-dołkowej (od kroku 1.3). Dodaj 1 ml pożywki wzrostowej opon mózgowych do każdej studzienki. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść 3-4 kawałki biopsji w każdej studzience.</li>
</ol>
5. Umieszczanie nakrywek na elementach opon mózgowych
UWAGA: Kroki 5.1 - 5.2 należy wykonać w poziomym okapie z przepływem laminarnym za pomocą mikroskopu preparacyjnego.
<ol>
	<li>Przykryj kawałki 1-2 sterylnymi okrągłymi szkiełkami nakrywkowymi o średnicy 15 mm na studzienkę.</li>
	<li>Mocno dociśnij kleszczemi, aby upewnić się, że kawałki dotykają dna talerza. Pozwala to na przymocowanie kawałków tkanki do dna studni.</li>
	<li>Umieścić płytkę 6-dołkową w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
6. Utrzymanie hodowli komórkowej
UWAGA: Kroki 6.1 - 6.3 są do wykonania wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego. Z szalkami hodowlanymi należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ szkiełka nakrywkowe nie powinny się przesuwać i przemieszczać kawałków opon mózgowych.
<ol>
	<li>Po 2 dniach w hodowli dodaj dodatkowy 1 ml świeżej pożywki wzrostowej opon mózgowych do każdej studzienki.</li>
	<li>W dniu 7 ostrożnie odessać pożywkę i dodać 2 ml świeżej pożywki do każdej studzienki.</li>
	<li>Po 9 dniu kontynuuj zmianę pożywki wzrostowej co drugi dzień, aż kultura stanie się zlewna.</li>
</ol>
7. Przejście
UWAGA: Wszystkie kroki należy wykonać w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Gdy fibroblasty opon mózgowych wyemigrują z fragmentów tkanki oponowej i zaczną rosnąć w kierunku krawędzi naczynia hodowlanego, rozwiń fibroblasty opon mózgowych do większego naczynia hodowlanego.
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem pasażowania należy pokryć naczynie hodowlane 1% żelatyną przez 15-30 minut.</li>
	<li>Odessać pożywkę z naczynia 6-dołkowego i przepłukać komórki za pomocą 2 ml PBS.</li>
	<li>Dodać 1 ml trypsyny/EDTA do każdego dołka i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut. Na tym etapie nie jest konieczne usuwanie szkiełek nakrywkowych ani tkanki opony mózgowej.</li>
	<li>Gdy komórki zostaną zaokrąglone i zaczną się odłączać, dodaj 2 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Pipetuj komórki w górę i w dół, aby całkowicie rozbić wszystkie grudki i przenieś roztwór komórkowy do większej płytki hodowlanej.</li>
	<li>Użyj proporcji 1:3 do 1:4, aby połączyć komórki z trzech 6-dołkowych szalek w jedną naczynie hodowlaną T75.</li>
	<li>Gdy komórki fibroblastów opon mózgowych zbiegają się w kolbach hodowlanych T75, trypsynizują komórki i kriokonserwują w pożywce do kriokonserwacji w ilości 1x106 komórek / ml na fiolkę. Jedna kolba hodowlana T75 ze zlewającymi się fibroblastami opon mózgowych zawiera około 5-7 milionów komórek.</li>
</ol>
8. Charakterystyka fibroblastów opon mózgowych za pomocą barwienia immunologicznego
UWAGA: Przed rozpoczęciem procedury przygotuj 4% roztwór paraformaldehydu, 5% normalną surowicę kozią w PBS (bufor blokujący), 0,3% Triton X-100 w PBS (bufor permeabilizacyjny), pierwszorzędowe i drugorzędowe roztwory przeciwciał oraz 1 μg/ml Hoechst 33342 rozcieńczony w PBS z 10 mg/ml bulionu.
<ol>
	<li>Wysiew od 15 000 do 30 000 fibroblastów opon mózgowych w 8-dołkowym szkiełku pośrednim pokrytym 0,1% żelatyną.</li>
	<li>Po 24 godzinach od przyłączenia komórek utrwal je w 100 μl 4% paraformaldehydu na studzienkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj studzienki 3 razy za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek za pomocą 150 μl 0,3% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Umyj studzienki 3 razy za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu blokującego (PBS + 5% normalnej surowicy koziej) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odessać roztwór blokujący i dodać 150 μl pożądanych przeciwciał pierwszorzędowych rozcieńczonych w roztworze blokującym. Do podwójnego barwienia należy przygotować robocze rozcieńczenia pierwszorzędowych przeciwciał w oddzielnych probówkach wirówkowych na lodzie w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Przygotować rozcieńczenie anty-fibronektyny w stosunku 1:300 + rozcieńczenie anty-nestyny w roztworze blokującym w stosunku 1:200. Przygotować rozcieńczenie anty-SERPINH1 1:250 + rozcieńczenie anty-TUJ1 w stosunku 1:1,000 w roztworze blokującym. Przygotować rozcieńczenie anty-SERPINH1 1:250 + rozcieńczenie anty-SOX2 w roztworze blokującym 1:100</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Umyj studzienki 3 razy za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować robocze rozcieńczenie w stosunku 1:400 znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał drugorzędowych kozich anty-królików (zielony; Ex/Em2 495/519 nm) i kozioł anty-mysz (czerwony; Ex/Em2 590/617 nm) w roztworze blokującym i dodać 100 μl do każdego dołka. Inkubować przez 1 godzinę w ciemności, w temperaturze pokojowej. Następnie umyj studzienki raz za pomocą 1x PBS.</li>
	<li>Dodać 100 μl z 1 μg/ml Hoechst 33342 (niebieski; Ex/Em2 358/461 nm) do każdego dołka i inkubować w ciemności przez 3 minuty. Umyj studzienki 3 razy 1x PBS, pozostawiając końcowe płukanie 1x PBS w studzience i przykryj szkiełko folią aluminiową.</li>
	<li>Analizuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>

<ol><li>Decimo, I., Fumagalli, G., Berton, V., Krampera, M., Bifari, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges%3A+from+protective+membrane+to+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Meninges: from protective membrane to stem cell niche.</a> Am J Stem Cells. 1 (2), 92-105 (2012).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+stem%2Fprogenitor+cells+with+neuronal+differentiation+potential+reside+in+the+leptomeningeal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Novel stem/progenitor cells with neuronal differentiation potential reside in the leptomeningeal niche.</a> J Cell Mol Med. 13 (9B), 3195-3208 (2009).</li>
<li>Bifari, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meninges+harbor+cells+expressing+neural+precursor+markers+during+development+and+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Meninges harbor cells expressing neural precursor markers during development and adulthood.</a> Front Cell Neurosci. 9, 383(2015).</li>
<li>Decimo, I., Bifari, F., Krampera, M., Fumagalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+niches+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell niches in health and diseases.</a> Curr Pharm Des. 18 (13), 1755-1783 (2012).</li>
<li>Hayashi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+cells+induce+dopaminergic+neurons+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Meningeal cells induce dopaminergic neurons from embryonic stem cells.</a> Eur J Neurosci. 27 (2), 261-268 (2008).</li>
<li>Nakagomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leptomeningeal-derived+doublecortin-expressing+cells+in+poststroke+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Leptomeningeal-derived doublecortin-expressing cells in poststroke brain.</a> Stem Cells Dev. 21 (13), 2350-2354 (2012).</li>
<li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+autopsy+donor-derived+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from autopsy donor-derived somatic cells.</a> Neurosci Lett. 502 (3), 219-224 (2011).</li>
<li>Hjelm, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro-differentiated+neural+cell+cultures+progress+towards+donor-identical+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">In vitro-differentiated neural cell cultures progress towards donor-identical brain tissue.</a> Hum Mol Genet. 22 (17), 3534-3546 (2013).</li>
<li>Meske, V., Albert, F., Wehser, R., Ohm, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+autopsy-derived+fibroblasts+as+a+tool+to+study+systemic+alterations+in+human+neurodegenerative+disorders+such+as+Alzheimer%27s+disease--methodological+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neural+Transm+%28Vienna%29%22%5BJournal%5D)">Culture of autopsy-derived fibroblasts as a tool to study systemic alterations in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer's disease--methodological investigations.</a> J Neural Transm (Vienna). 106 (5-6), 537-548 (1999).</li>
<li>Bliss, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+postmortem+human+dura+mater+and+scalp+for+deriving+human+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Use of postmortem human dura mater and scalp for deriving human fibroblast cultures.</a> PLoS One. 7 (9), e45282(2012).</li>
<li>Sproul, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPSC+lines+from+archived+non-cryoprotected+biobanked+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Generation of iPSC lines from archived non-cryoprotected biobanked dura mater.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 4(2014).</li>
<li>Adler, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+clinical+diagnostic+accuracy+of+early+vs+advanced+Parkinson+disease%3A+clinicopathologic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Low clinical diagnostic accuracy of early vs advanced Parkinson disease: clinicopathologic study.</a> Neurology. 83 (5), 406-412 (2014).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Kilford, L., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+clinical+diagnosis+of+idiopathic+Parkinson%27s+disease%3A+a+clinico-pathological+study+of+100+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson's disease: a clinico-pathological study of 100 cases.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 55 (3), 181-184 (1992).</li>
<li>Hughes, A. J., Daniel, S. E., Lees, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+accuracy+of+clinical+diagnosis+of+Lewy+body+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Improved accuracy of clinical diagnosis of Lewy body Parkinson's disease.</a> Neurology. 57 (8), 1497-1499 (2001).</li>
<li>Langston, J. W., Schüle, B., Rees, L., Nichols, R. J., Barlow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisystem+Lewy+body+disease+and+the+other+parkinsonian+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Multisystem Lewy body disease and the other parkinsonian disorders.</a> Nature Genetics. 47 (12), 1378-1384 (2015).</li>
<li>Vangipuram, M., Ting, D., Kim, S., Diaz, R., Schüle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+punch+biopsy+explant+culture+for+derivation+of+primary+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Skin punch biopsy explant culture for derivation of primary human fibroblasts.</a> J Vis Exp. (77), e3779(2013).</li>
<li>Byers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNCA+triplication+Parkinson%27s+patient%27s+iPSC-derived+DA+neurons+accumulate+alpha-synuclein+and+are+susceptible+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SNCA triplication Parkinson's patient's iPSC-derived DA neurons accumulate alpha-synuclein and are susceptible to oxidative stress.</a> PLoS One. 6 (11), e26159(2011).</li>
<li>Sanders, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutations+cause+mitochondrial+DNA+damage+in+iPSC-derived+neural+cells+from+Parkinson%27s+disease+patients%3A+reversal+by+gene+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutations cause mitochondrial DNA damage in iPSC-derived neural cells from Parkinson's disease patients: reversal by gene correction.</a> Neurobiol Dis. 62, 381-386 (2014).</li>
<li>Beevers, J. E., Caffrey, T. M., Wade-Martins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+%28iPSC%29-derived+dopaminergic+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived dopaminergic models of Parkinson's disease.</a> Biochem Soc Trans. 41 (6), 1503-1508 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje prosty i solidny protokół uzyskiwania posiewu fibroblastów opon mózgowych z ludzkich pośmiertnych opon mózgowo-rdzeniowych pobranych w połączeniu z dawstwem mózgu. Istnieje bardzo niewiele opisów protokołów wyprowadzania kultur komórkowych z pośmiertnego materiału ludzkiego. Dwa badania opisują hodowle fibroblastów pochodzących ze skóry 7,8,9, jedno badanie opisuje próbki opony twardej10</s...

Opony mózgowe składają się z trzech błon, które chronią mózg: opony twardej, pajęczynówki i opony mózgowej. Niedawno uznano, że opony mózgowe odgrywają również ważną rolę w rozwoju mózgu i homeostazie mózgu1. Opony mózgowe pochodzą z komórek mezenchymalnych i wywodzących się z grzebienia nerwowego i co ciekawe, wykazano, że komórki progenitorowe znajdujące się w oponach mózgowych mogą dawać początek neuronom in vitro i po przeszczepieniu in vivo2,3,4. Kultury opon mózgowo-rdzeniowych są również z powodzeniem stosowane jako warstwy żywicielskie, ponieważ posiadają one aktywność indukującą pochodzącą z komórek zrębu do różnicowania embrionalnych komórek macierzystych w neurony dopaminergiczne5. Co więcej, opony mózgowe mają potencjał do bezpośredniego różnicowania się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty w warunkach niedokrwiennych6.

Dla tego protokołu, ludzkie pośmiertne próbki opon mózgowych są pobierane z pajęczynówki i pia mater, zbiorczo nazywanych leptomeningami, i są pozyskiwane jako część dawcy ludzkiego mózgu do celów badawczych. Sekcja mózgu jest wykonywana w ciągu 24 godzin od śmierci, a próbka opon mózgowo-rdzeniowych jest umieszczana w zimnym podłożu wzrostowym w celu dalszego przetwarzania w ciągu następnych 6-8 godzin, jak pokazano w tym protokole.
Ten protokół opisuje sekcję i przygotowanie próbek ludzkich opon mózgowych do opracowania pierwotnej hodowli komórek opon mózgowo-rdzeniowych pacjenta. Tkankę kroi się na 25-30 kawałków o wymiarach około 3 mm x 3 mm. Trzy kawałki umieszcza się w każdym 6-dołkowym dołku pokrytym żelatyną i przytrzymuje okrągłymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi. Rozwarstwienie opon mózgowych trwa około 25-35 minut. Głównym wyzwaniem związanym z tą kulturą jest bezpłodność, ponieważ pobieranie, transport i sekcja mózgu na ogół nie są wykonywane w sterylnych warunkach. Dlatego ważne jest, aby uzupełnić pożywkę hodowlaną koktajlem penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B oraz użyć szalek wielodołkowych do oddzielenia fragmentów tkanek hodowlanych.
Wzrost fibroblastów opon mózgowych następuje zwykle w ciągu pierwszego tygodnia. Pożywka jest zmieniana co dwa do trzech dni, aż komórki zlewają się, a komórki są enzymatycznie pasażowane. Fibroblasty opon mózgowo-rdzeniowych są kriokonserwowane w ilości 1 miliona komórek na ml / fiolkę w pożywce do kriokonserwacji. Dzięki temu protokołowi w ciągu 6-8 tygodni można uzyskać 20-30 milionów fibroblastów opon mózgowych w celu kriokonserwacji. Dalsze zastosowania tych fibroblastów opon mózgowych są podstawowymi hodowlami do badań nad chorobami, bezpośrednim różnicowaniem neuronów lub wyprowadzaniem indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z opon mózgowo-rdzeniowych w celu zrozumienia mechanizmów choroby i opracowania leków.

<table><tbody><tr><td>Szalki Petriego Corning</td><td>Fisher Scientific</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 6-dołkowa płytka</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-83 15CIR-1D</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele, ostrze sterylne, nr 15</td><td>Miltex</td><td>4-415</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki precyzyjne</td> zakrzywione <td>Fisher Scientific</td><td>16-100-122</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-230490</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca Corning 500 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>430770</td><td>Połącz składniki mediów i filtr.</td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórek nunc z nasadkami filtrującymi, T175 cm2&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>178883</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Growth Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30081.02</td><td></td></tr><tr><td>Hyclon FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Suplement GlutaMAX (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu (100 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B (żółty roztwór/250 i mikro; g/ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP264520</td><td></td></tr><tr><td>Bambanker Freeze 120 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9582225</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Fibronectin Staining</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zjeżdżalnie studzienne 8-studzienne&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>1256518</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehydu&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>100% glicerol&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>9455</td><td></td></tr><tr><td>100% normalna surowica kozia&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>101098-382</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-fibronektyny [F1]</td> <td>Abcam</td><td>ab32419</td><td>1:300 rozcieńczenie w roztworze blokującym</td></tr><tr><td>Anti-SERPINH1</td><td>Sigma</td><td>S5950-200ul</td><td>1:250 rozcieńczenie w roztworze blokującym</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>Millipore</td><td>MAB4343</td><td>1:100 w roztworze blokującym</td></tr><tr><td>Anti-Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td>1:200 rozcieńczenie w roztworze blokującym</td></tr><tr><td>Anti-TUJ1</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>rozcieńczenie 1:1,000 w roztworze blokującym</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 antykrólik</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11029</td><td>rozcieńczenie 1:400 w roztworze blokującym; (kanał zielony; Ex/Em2 495/519 nm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 przeciw myszom</td><td>Thermo Fisher</td><td>A21424</td><td>rozcieńczenie 1:400 w roztworze blokującym; (kanał czerwony; Ex/Em2 590/617 nm)&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 bejca</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td>rozcieńczyć do końcowego stężenia 1,0 &mu; g/ml; (kanał niebieski; Ex/Em2 358/461 nm)</td></tr><tr><td colspan="4">Dostawcy są sugestiami, można również korzystać z podobnych produktów od alternatywnych dostawców.</td></tr></tbody></table>

pochodzenie kultur eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych od pośmiertnych dawców ludzkiego mózgu

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Mimo że poczyniono znaczne postępy w klinicznej charakterystyce choroby Parkinsona, kilka badań donosi, że diagnoza choroby Parkinsona nie jest patologicznie potwierdzona nawet u 25% klinicznie zdiagnozowanych przypadków choroby Parkinsona. Dlatego tkanki pobrane od klinicznie zdiagnozowanych pacjentów z idiopatyczną chorobą Parkinsona mogą mieć wysoki wskaźnik błędnej diagnozy; stąd badania in vitro z takich tkanek w celu zbadania choroby Parkinsona jako modelu przedklinicznego mogą okazać się daremne.
Zbierając pośmiertne ludzkie opony mózgowe z potwierdzonym neuropatologicznym rozpoznaniem choroby Parkinsona i charakteryzujące się utratą komórek nigrostriatalnych i wewnątrzkomórkowymi inkluzjami białkowymi zwanymi ciałami Lewy'ego, można być pewnym, że klinicznie obserwowany parkinsonizm nie jest spowodowany innym procesem chorobowym (np. nowotworem, miażdżycą).
Ten protokół przedstawia sekcję i przygotowanie pośmiertnych ludzkich opon mózgowo-rdzeniowych do uzyskania kultury fibroblastów opon mózgowych. Ta procedura jest solidna i ma wysoki wskaźnik sukcesu. Wyzwaniem związanym z hodowlą jest bezpłodność, ponieważ pobieranie mózgu na ogół nie odbywa się w sterylnych warunkach. Dlatego ważne jest, aby uzupełnić pożywkę hodowlaną koktajlem penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B.
Pochodzenie fibroblastów opon mózgowych z potwierdzonych autopsją przypadków choroby Parkinsona stanowi podstawę do modelowania in vitro choroby Parkinsona. Fibroblasty opon mózgowych pojawiają się 3-9 dni po przygotowaniu próbki, a około 20-30 milionów komórek można poddać kriokonserwacji w ciągu 6-8 tygodni. Hodowla fibroblastów opon mózgowych jest jednorodna, a komórki wyrażają fibronektynę, powszechnie stosowany marker do identyfikacji opon mózgowych.

Po pomyślnym przeprowadzeniu protokołu przetwarzania oponopajęczynicy, wzrost fibroblastów oponowych jest po raz pierwszy obserwowany od trzech do dziewięciu dni po sekcji, choć może to zależeć od długości okresu pośmiertnego dla mózgu. Rysunek 1 przedstawia hodowle fibroblastów oponowych od czterech różnych dawców. Rysunek 1A pokazuje fragment oponopajęczynicy przytrzymany szkiełkiem nakrywkowym (ciemna linia ukośna) oraz wzrost fibroblastów wokół tkanki...

Protokół hodowli eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego jest technicznie solidnym i prostym sposobem na uzyskanie fibronektynowo-dodatnich fibroblastów opon mózgowych w ciągu 6-8 tygodni i kriokonserwację około 20-30 milionów komórek.

Pochodzenie kultur eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych od pośmiertnych dawców ludzkiego mózgu

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Nazywam się Birgitt Schule i jestem dyrektorem Programu Dawstwa Mózgu w Instytucie Parkinsona i Centrum Klinicznym. W tym filmie opisujemy technikę hodowli komórek eksplantatów i czas trwania pierwotnego fibroblastu z opon mózgowych pośmiertnego ludzkiego mózgu od pacjentów z chorobą Parkinsona. Te fibroblasty mogą być wykorzystywane do różnych zastosowań, w tym do testów komórkowych.Jest to ważne, ponieważ możemy badać linie komórkowe z potwierdzonych autopsją przypadków sporadycznej choroby Parkinsona z patologią ciał Lewy'ego. Zacznij od umieszczenia wszystkich wymaganych materiałów w kapturze do hodowli tkankowych. Wszystkie przedmioty wchodzące do okapu należy spryskać 70% etanolem i wytrzeć.Pierwszym krokiem jest przeniesienie opon mózgowych z rurki do naczynia tnącego. Zacznij od wlania około 10 mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do sterylnego 10-centymetrowego naczynia do krojenia. Tutaj możesz zobaczyć opony mózgowe.Za pomocą sterylnych kleszczy ostrożnie przenieś opony mózgowe do naczynia do krojenia. Wykonaj ten krok powoli, aby zapobiec rozdarciu. Następnym krokiem jest umycie opon mózgowych w PBS, aby usunąć jak najwięcej krwi.Jeśli twoja próbka jest zbyt krwawa, możesz rozważyć przeniesienie jej do innego naczynia do krojenia. Dodaj kolejne 10 mililitrów PBS do świeżego 10-centymetrowego naczynia. Powtórz to płukanie, aby kontynuować usuwanie krwi z opon mózgowych.Na koniec przenieś opony mózgowe do świeżego 10-centymetrowego naczynia zawierającego PBS. Po zakończeniu przykryj naczynie i przenieś je do mikroskopu preparacyjnego w okapie z przepływem laminarnym. Następnym krokiem jest kontynuowanie dzielenia opon mózgowych na mniejsze kawałki.Za pomocą dwóch sterylnych skalpeli delikatnie oddziel naczynia krwionośne od opon mózgowych płytkim ruchem skrobania. Przygotuj obszar wystarczająco duży, aby wyciąć około 18 kawałków o wymiarach 3 na 3 milimetry, jak pokazano na tym obrazku. Następnie weź skalpel i ruchem kołyszącym pokrój przygotowany obszar na kawałki o wymiarach 3 na 3 milimetry.Łatwiej jest to zrobić w procesie krokowym, najpierw przecinając opony mózgowe na większe kawałki, a następnie krojąc te kawałki na mniejsze części. Przykryj naczynie do krojenia i przenieś je z powrotem do kaptura do hodowli tkankowych. Następnie przygotuj się do przeniesienia opon mózgowych na sześciodołkową płytkę do hodowli tkankowej, która została pokryta 1 mililitrem 0,1% żelatyny przez 30 do 60 minut.Dodaj jeden mililitr pożywki oponowej do każdej studzienki. Następnie za pomocą sterylnych kleszczy przenieś trzy do czterech kawałków opon mózgowych na środek każdej studzienki. Komórki wyhodowane na tej płytce będą pasażem zerowym.W następnym kroku wykorzystuje się szkiełka nakrywkowe, aby upewnić się, że kawałki opon mózgowych są nieruchome i pozostają w kontakcie z naczyniem hodowlanym. Umieść sterylne 15-milimetrowe okrągłe szkiełko nakrywkowe na kawałkach opon mózgowych. W razie potrzeby przełóż kawałki opon mózgowych za pomocą szkiełka nakrywkowego.Następnie za pomocą kleszków mocno dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby upewnić się, że kawałki dotykają płytki. Ten obraz przedstawia kawałki opon mózgowych utrzymywane na miejscu za pomocą szkiełka nakrywkowego. Umieść pokrywę na płytce sześciodołkowej i ostrożnie przenieś płytkę do inkubatora ustawionego na 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po dwóch dniach w hodowli dodaj dodatkowy mililitr świeżej pożywki oponowej do każdej studzienki. Po siedmiu dniach zassać pożywkę. Następnie napełnij każdą studzienkę 2 mililitrami świeżego podłoża.Po siódmym dniu kontynuuj uzupełnianie studzienek 2 mililitrami świeżej pożywki co drugi dzień. To zdjęcie pokazuje początkowy dzień fragmentów opon mózgowych i hodowli pod odwróconym mikroskopem. Po około sześciu do dziewięciu dniach można zaobserwować przyczepienie komórkowe w pierwszym wyrostku.Między 15 a 19 dniem liczba komórek wzrasta, a wzrost staje się gęstszy. Fibroblasty opon mózgowych charakteryzują się ekspresją fibronektyny. Obrazy te pokazują hodowane komórki opon mózgowych, które zostały wybarwione i są dodatnie dla fibronektyny.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać hodowle eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych od pośmiertnych dawców ludzkiego mózgu. Technika ta zapewnia prosty i niezawodny sposób na uzyskanie fibroblastów opon mózgowych w ciągu trzech do sześciu tygodni i pozwala na przechowywanie od 15 do 20 milionów komórek przy niskiej liczbie pasażów.

derivation-leptomeninges-explant-cultures-from-postmortem-human-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ten artykuł opisuje metody uzyskiwania wzbogaconych populacji mysich komórek prekursorowych oligodendrocytów (OPC) w hodowli podstawowej, które różnicują się w celu wytworzenia dojrzałych oligodendrocytów (OL). Ponadto w raporcie opisano techniki wytwarzania mysich kokultur mielinizacyjnych poprzez wysiewanie mysich OPC na łożu neurytowym neuronów zwojowych korzenia grzbietowego myszy (DRGN).

Wyprowadzanie wzbogaconych kultur oligodendrocytów i kokultur mielinizujących oligodendrocyty/neurony z postporodowych tkanek myszy

Niniejszy protokół opisuje metodę otrzymywania prekursorów ograniczeń glejowych (Glial Restricted Precursors) z płodowych rdzeni kręgowych oraz ich utrzymywanie in vitro w celu transplantacji lub badania linii oligodendrocytów.

Wyizolowanie prekursorów ograniczonych do linii glejowej (GRP) od myszy w 13. dniu embrionalnym (E13)

Ten film demonstruje technikę przygotowywania swobodnie pływających kultur warstwowych z mózgu dorosłego człowieka. Cienkie plasterki są generowane z części mózgu za pomocą wibratomu. Wycinki te są następnie zawieszane w pożywce hodowlanej uzupełnionej czynnikami wzrostu w celu utrzymania żywotności tkanek.

Przygotowanie swobodnie unoszących się kultur warstwowych z dorosłego ludzkiego mózgu

Ten film demonstruje technikę tworzenia trójwymiarowej hodowli komórek glejowych. Komórki glejowe pochodzące z mózgu szczura są zamknięte w fotosieciowalnej matrycy polimerowej zawierającej składniki macierzy zewnątrzkomórkowej. Po inkubacji w pożywce wzrostowej komórki glejowe namnażają się w macierzy nośnej, tworząc trójwymiarową kulturę.

Stworzenie trójwymiarowej hodowli komórek glejowych pochodzących z mózgu szczura

Płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) kąpie komórki progenitorowe neuroepitelialu i kory mózgowej podczas wczesnego rozwoju mózgu w zarodku.  W tym miejscu opisujemy metodę opracowaną w celu izolacji komorowego płynu mózgowo-rdzeniowego z zarodków gryzoni w różnym wieku w celu zbadania jego funkcji biologicznej.  Ponadto demonstrujemy naszą technikę rozwarstwiania i hodowli eksplantatów kory mózgowej, która pozwala na wzrost eksplantatów przy minimalnych ilościach pożywki hodowlanej lub płynu...

Izolacja płynu mózgowo-rdzeniowego z zarodków gryzoni do stosowania z wypreparowanymi eksplantatami kory mózgowej

Ten protokół opisuje metodę śledzenia indywidualnych trajektorii starzenia się mózgu poprzez program dawstwa mózgu i właściwą charakterystykę mózgów. Dawcy mózgu biorą udział w długoterminowym badaniu podłużnym, w tym w seryjnych ocenach wielowymiarowych. Protokół zawiera szczegółowy opis przetwarzania przez mózg i dokładną metodologię diagnostyczną.

Protokół Abbiategrasso Brain Bank do gromadzenia, przetwarzania i charakteryzowania starzejących się mózgów

Opisujemy iniekcję domostkową, która wykorzystuje igłę zgiętą na końcu, która może być stabilizowana do czaszki, eliminując w ten sposób ryzyko uszkodzenia leżącego pod spodem miąższu. Podejście to może być wykorzystane do genetycznego mapowania losów i manipulacji komórkami opon mózgowo-rdzeniowych oraz do śledzenia ruchów płynu mózgowo-rdzeniowego.

Indukcja modyfikacji komórek opon mózgowo-rdzeniowych poprzez wstrzyknięcie domostkowe

Ten artykuł przedstawia dwa zoptymalizowane protokoły badania rezydentnych i obwodowo pochodzących komórek odpornościowych w ośrodkowym układzie nerwowym, w tym mózgu, rdzeniu kręgowym i oponach mózgowych. Każdy z tych protokołów pomaga ustalić funkcję i skład komórek zajmujących te przedziały w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych.

Izolowanie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i związanych z nimi opon mózgowych w celu dalszej analizy komórek odpornościowych

Ten protokół prezentuje unikalny sposób generowania kultur komórkowych ośrodkowego układu nerwowego z embrionalnych mózgów myszy w 17. dniu do badań neuro(immunologicznych). Model ten można analizować przy użyciu różnych technik eksperymentalnych, w tym RT-qPCR, mikroskopii, ELISA i cytometrii przepływowej.

Ustanowienie mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych z embrionalnych mózgów myszy w celu zbadania infekcji i odporności wrodzonej

Komórki śródbłonka limfatycznego (LLEC), niedawno zidentyfikowany typ komórek wewnątrzczaszkowych, mają słabo poznane funkcje. W badaniu przedstawiono powtarzalny protokół zbierania LLEC od myszy i tworzenia kultur pierwotnych in vitro. Protokół ten ma na celu umożliwienie naukowcom zagłębienia się w funkcje komórkowe i potencjalne implikacje kliniczne LLEC.

Zbiór i pierwotna hodowla komórek śródbłonka limfatycznego opon mózgowo-rdzeniowych

Ten artykuł opisuje protokół namnażania komórek nowotworowych krążących w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF-CTC) pobranych od pacjentów z chorobą oponowo-rdzeniową związaną z czerniakiem (M-LMD) w celu opracowania modeli przedklinicznych do badania M-LMD.

Ex vivo Hodowla krążących komórek nowotworowych w płynie mózgowo-rdzeniowym od pacjentów z czerniakiem w celu zbadania choroby opon mózgowo-rdzeniowych związanej z czerniakiem

Poznaj technikę hodowli eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych od pośmiertnych dawców ludzkiego mózgu. Ta metoda pozwala uzyskać fibroblasty oponowe w ciągu 6-8 tygodni, umożliwiając badanie choroby Parkinsona.

Pochodzenie kultur eksplantatów opon mózgowo-rdzeniowych od pośmiertnych dawców ludzkiego mózgu

Przeglądaj więcej filmów