Dekstran zwiększa efektywność transdukcji lentiwirusowej mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opracowanie technologii umożliwiających skuteczną transdukcję genów w pierwotnych komórkach natural killer. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunoterapii, takie jak wpływ modyfikacji genetycznej na limfocyty efektorowe, na przykład komórki natural killer lub komórki NK. Główną zaletą tej techniki jest wydajna ekspresja interesującego genu w pierwotnych komórkach NK myszy lub człowieka.

Po przygotowaniu i miareczkowaniu wektorów lentiwirusowych zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeprowadzić oczyszczanie pierwotnych komórek NK myszy poprzez przepuszczenie zawiesiny pojedynczych komórek śledziony przez kolumny z wełny nylonowej w celu usunięcia populacji adherentnych, składających się z limfocytów B i makrofagów. Do hodowli populacji nieadherentnej zawierającej komórki NK należy użyć Interleukiny-2 w stężeniu 1 000 jednostek na mililitr w pełnej pożywce RPMI1640. W czwartym dniu hodowli należy wymienić pożywkę, stosując 20 mililitrów pełnej pożywki RPMI1640 oraz 1 000 jednostek na mililitr IL-2, aby usunąć nieadherentne limfocyty T i komórki NKT.

Siódmego dnia, przy użyciu markerów specyficznych dla komórek MK, należy sprawdzić czystość mysich komórek NK metodą cytometrii przepływowej, wykorzystując preparaty z populacją powyżej 95% CD3 ujemnych i NK1.1 dodatnich. Aby wyizolować mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMCs), należy ostrożnie nanieść 35 ml rozcieńczonych w połowie komórek na 15 ml gradientu gęstości w 50 ml probówce stożkowej. Następnie gradient należy wirować w rotorze z koszyczkami wahadłowymi przy 400 ×g i 20 °C przez 30 minut bez hamowania.

Po oczyszczeniu ludzkich pierwotnych komórek NK zgodnie z protokołem tekstowym, należy określić czystość komórek, dodając 2 µg/mL przeciwciał anty-CD3 oraz 2 µg/mL przeciwciał anty-CD56. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Komórki należy dwukrotnie przemyć PBS.

Następnie poddaj komórki analizie metodą cytometrii przepływowej. Populacja komórek NK będzie dodatnia w kierunku CD56 na powierzchni komórek i ujemna w kierunku CD3. Zawieś pierwotne komórki NK mysie lub ludzkie w dołkach płytki 24-dołkowej w stężeniu 0,5 × 10⁵ na mililitr medium z nadsączem lentiwirusa GFP, przy NLY wynoszących 5, 10 i 20.

Następnie w obecności polybrene, siarczanu protaminy lub dekstranu odwiruj płytki przy 1 000 ×g przez 60 minut. Następnie, bez odlewania supernatantu, inkubuj komórki przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C z zawartością 5,2% carbon dioxide.

Po przemyciu komórek 10 mililitrami PBS, należy użyć dwóch mililitrów pożywki RPMI1640 z dodatkiem IL-2 do resuspensji komórek. Dzień przedi zbieraniem komórek należy pokryć 96-dołkowe wysokobiałkowe absorbujące płytki polistyrenowe 2,5 mikrogramami na mililitr przeciwciał monoklonalnych anty-MKG2D i inkubować płytki w temperaturze pokojowej lub w lodówce przez noc.

Następnego dnia należy trzykrotnie przemyć każdą studzienkę, używając 100 µL PBS. Zebrać przetransdukowane komórki NK, najpierw delikatnie opukując płytki, a następnie dodać 100 µL komórek do każdej studzienki płytek 96-dołkowych. Od 16 do 18 godzin po aktywacji zebrać nadnadczyn za pomocą pipety wielokanałowej.

Następnie, wykorzystując rekombinowaną cytokinę z zestawu ELISA, należy wyznaczyć krzywą wzorcową i określić ilość cytokin, takich jak Interferon Gamma, w supernatancie. Aby przetestować żywotność komórek NK, cztery dni po transdukcji, należy dwukrotnie przemyć komórki 10 mililitrami zimnego PBS. Następnie należy zebrać komórki i użyć XM5 7-aminoactinomycin D w celu ich barwienia.

Należy wykorzystać cytometrię przepływową do oznaczenia odsetka komórek nekrotycznych wśród przekształconych komórek NK, a następnie przeanalizować dane zgodnie z protokołem tekstowym. Rysunek ten pokazuje, że ludzkie komórki NK inkubowane z rekombinowanym IL-2, a następnie transdukowane lentiwirusem GFP, osiągnęły wyższą wydajność transdukcji i zwiększony miano wirusa po dodaniu dekstranu do hodowli, w porównaniu z dodatkiem polybrene lub siarczanu protaminy. Jak widać tutaj, podobne wyniki zaobserwowano w przypadku mysich komórek NK, gdzie dekstran zwiększył wydajność wektorów lentiwirusowych w porównaniu z polybrene lub siarczanem protaminy.

W niniejszym eksperymencie zbadano potencjał cytotoksyczny przetransdukowanych pierwotnych komórek NK za pomocą testu uwalniania chromu (CR-release assay) przeciwko komórkom docelowym K562 i YAC-1. Transdukcja komórek NK za pomocą dekstranu nie wpływa negatywnie na potencjał zabijania przetransformowanych komórek NK w porównaniu z komórkami NK nieprzetransdukowanymi. W tym badaniu przetransdukowane ludzkie pierwotne komórki NK współhodowano z komórkami K562 przez 24 godziny, a następnie pobrano nadsączniki w celu oznaczenia poziomu interferonu gamma.

Wyniki wskazują, że dekstran nie wpływa na zdolność przetransdukowanych komórek NK do produkcji cytokin. Ponadto niezależna walidacja wykazała, że komórki NK traktowane dekstranem i aktywowane przeciwciałami monoklonalnymi anty-NKG2DA10 związanymi z płytką nadal były zdolne do produkcji cytokiny Interferon Gamma. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wirowaniu przetransdukowanych komórek.

Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak transfekcja, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące sposobów poprawy dostarczania genów. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie immunologii do eksploracji manipulacji genetycznych w komórkach NK. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak transdukować komórki NK.