Name: Dekstran zwiększa efektywność transdukcji lentiwirusowej mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Poznaj metodę transdukcji lentiwirusowej z użyciem dekstranu w pierwotnych komórkach NK myszy i człowieka. Technika zwiększa efektywność modyfikacji genetycznej przy zachowaniu cytotoksyczności komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Lucii Sammarco i jej stoisku z lemoniadą Lulu za inspirację, motywację i wsparcie. Prace te były częściowo wspierane przez NIH R01 AI102893 i NCI R01 CA179363 (SM); NHLBI-HL087951 (Szwajcarska Republika Ludowa); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W.); Fundacja Alex Lemonade Stand (S.M.); Program HRHM Funduszu MACC (S.M.; S.R.; M.S.T.); Fundacja Rodziny Mikołajów (S.M.); rodzina Gardetto (S.M.); Program Stypendialny Hyundai (M.S.T.); Hyundai Nadzieja na kołach (S.R.); Fundusz MACC (M.S.T. i S.M.); Instytut Badań nad Dziećmi, MCW (S.R.); oraz Nagroda im. Kathy Duffey Fogerty (M.J.R.).

Wszystkie protokoły dla zwierząt były zgodne z humanitarnym i etycznym traktowaniem zwierząt i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Centrum Badań Biomedycznych (BRC) Medical College of Wisconsin (MCW), Milwaukee, WI. Wykorzystanie ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB) Instytutu Badań Krwi Centrum Krwi Wisconsin, Milwaukee, WI.
1. Myszy, linie komórkowe i wektory
<ol>
	<li>Kup myszy C57BL/6 od komercyjnych dostawców. Utrzymuj kolonie myszy w warunkach wolnych od patogenów i używaj samic i samców myszy w wieku od 6 do 12 tygodni. Pozyskaj pozbawione elementów pozwalających na identyfikację PBMC pochodzące od ludzi ze źródeł zatwierdzonych przez IRB.</li>
	<li>Znieczulić zwierzęta mieszaniną 20-30% v/v izofluranu w glikolu propylenowym (1,2-propanodiol, klasa USP) w celu znieczulenia myszy. Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu, gdy myszy są pod narkozą.</li>
	<li>Aby poddać zwierzęta eutanazji, należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy po indukcji znieczulenia.
	<ol>
		<li>Powstrzymaj myszy, mocno chwytając jedną ręką podstawę ogona. Umieść solidny długopis typu kij lub kciuk i pierwszy palec drugiej ręki na karku, u podstawy czaszki.</li>
		<li>Aby spowodować zwichnięcie, popchnij rękę przytrzymującą głowę zwierzęcia do przodu i popchnij w dół, ciągnąc do tyłu ręką trzymającą podstawę ogona. Sprawdź skuteczność zwichnięcia poprzez wyczucie separacji tkanki szyjki macicy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trzymaj zwierzęta w komorze/klatce przez co najmniej 5 minut i usuwaj je tylko wtedy, gdy nie występuje aktywność oddechowa lub gdy brakuje wykrywalnego bicia serca.</li>
	<li>Zdobądź ogniwa K562 i YAC-1 od dostawców komercyjnych i utrzymuj je w RPMI1640 podłożu zawierającym 10% inaktywowanego termicznie FBS. Okresowo testuj te linie komórkowe, aby wykluczyć możliwość zanieczyszczenia mykoplazmą.</li>
</ol>
2. Przygotowanie i miareczkowanie wektorów lentiwirusowych
<ol>
	<li>Hodowla 5 × 106 komórek 293T przez noc w kolbie T75 cm2 zawierającej roztwór 20 ml pożywki RPMI1640 z 10% FBS, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 5% z 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu i 0,001% β-merkaptoetanolu. Umieścić kolbę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dodatkiem 5,2% CO2 .</li>
	<li>Zbierz komórki 293T za pomocą trypsyny (0,025%)/EDTA (1 mM) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dodać 5 ml trypsyny/EDTA do PBS i inkubować kolby przez 10 minut w inkubatorze o temperaturze 37 °C, aby umożliwić odłączenie komórek 293T od kolb T75 cm2.
	<ol>
		<li>Zbierz oderwane komórki i umyj je dwukrotnie w PBS, aby usunąć wszelkie ślady trypsyny i EDTA. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj liczbę komórek do miliona komórek na ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transfekcja komórek 293T18 za pomocą 3,95 μg psPAX2, 1,32 μg pMD2G i 5,26 μg pLEP-GFP-Puro (wygenerowanych wewnętrznie w BRI przez klonowanie promotora EF1alpha z pWPI zamiast promotora CMV w pLenti CMV-GFP-Puro)19.
	<ol>
		<li>Przygotuj 1 ml 150 mM NaCl plus 63 μl 0,6 mg/ml polietylenininu (PEI; 25 000 kD, liniowo). Dobrze wymieszaj, a następnie dodaj plazmidy i wymieszaj. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodać do komórek.</li>
		<li>16 godzin po transfekcji zastąp pożywkę do transfekcji świeżą pożywką plus 4,5 mM maślanu sodu. Zebrać supernatant zawierający wirusa 48 godzin po transfekcji i zagęścić przez nocne odwirowanie w ilości 5 000 × g. Zobacz tabelę materiałów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ miana wirusa za pomocą komórek 293T, wykonując seryjne rozcieńczenia i oznaczając metodą cytometrii przepływowej 72 godziny po transdukcji20. Wykorzystanie ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP) jako miary do ilościowego określenia miana wirusa.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie i ekspansja mysich pierwotnych komórek NK
<ol>
	<li>Oczyść mysie pierwotne komórki NK21. Krótko mówiąc, przepuść jednokomórkowe zawiesiny śledziony przez kolumny z wełny nylonowej, aby zubożyć przylegające populacje składające się z komórek B i makrofagów.</li>
	<li>Posiewaj nieprzylegające populacje eluowane z kolumny z wełny nylonowej, która zawiera mysie komórki NK z 1,000 U / ml interleukiny (IL)-2 w RPMI1640 pożywce z 10% FBS, 100 U / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 5% z 7,5% roztworu wodorowęglanu sodu i 0,001% β-merkaptoetanolu (RPMI1640 kompletne podłoże).</li>
	<li>Zmienić pożywkę z kolb w 4 dniu tej hodowli, aby usunąć nieprzylegające limfocyty T i NKT; komórki, które pozostają przyklejone do kolb, są w dużej mierze komórkami NK. Dodać 20 ml świeżej RPMI1640 kompletnej pożywki i 1000 U/ml IL-2, aby uzupełnić kolby.</li>
	<li>Sprawdź czystość mysich hodowli komórek NK w dniu 7 za pomocą cytometrii przepływowej z markerami specyficznymi dla komórek NK20 przy użyciu preparatów z ponad 95% populacji CD3-NK1.1+.</li>
</ol>
4. Oczyszczanie i ekspansja ludzkich pierwotnych komórek NK
<ol>
	<li>Wyizoluj PBMC według gradientu gęstości z kożuchów zdrowych ochotników. Na krótko, ostrożnie ułóż 35 ml na wpół rozcieńczonych (HBSS) komórek na 15 ml gradientu gęstości w 50-mililitrowej probówce kanonicznej. Wirować przy 400 × g przez 30 minut w temperaturze 20 °C w obracającym się wirniku kubełkowym bez hamulca.</li>
	<li>Użyj komercyjnych zestawów selekcji ujemnej opartych na przeciwciałach do oczyszczania ludzkich pierwotnych komórek NK zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Po wyizolowaniu należy oznaczyć czystość preparatów komórek NK za pomocą analiz immunofluorescencyjnych. Preparaty z komórek NK barwić przeciwciałami anty-CD3 2 μg/ml i 2 μg/ml anty-CD56 w temperaturze 4 °C przez 20 min. Umyj komórki dwukrotnie populacjami komórek PBS NK oznaczonymi przez brak CD3 i obecność CD56 na powierzchni komórki.</li>
	<li>Inkubować preparaty komórkowe z przeciwciałami przez 20 minut w temperaturze 4 °C, przemyć PBS i przeanalizować w cytometrze przepływowym. Do testów transdukcji genów należy używać preparatów z komórek NK o czystości ponad 85%20.</li>
</ol>
5. Transdukcja mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK za pomocą lentiwirusa
<ol>
	<li>Zawiesić mysie lub ludzkie pierwotne komórki NK na 24-dołkowej płytce w 0,5 × 105/ml pożywki w obecności supernatantu lentiwirusa GFP przy 5, 10 i 20 wielokrotności infekcji (MOI) oraz w obecności Pb (8 μg/ml), PS (8 μg/ml) lub dekstranu (8 μg/ml).</li>
	<li>Odwirować płytki o masie 1 000 × g przez 60 minut.</li>
	<li>Bez dekantacji supernatantu należy hodować komórki przez noc (16-18 godzin) w inkubatorze o temperaturze 37 °C z dodatkiem 5,2% CO2 . </li>
	<li>Przemyć 10 ml PBS i ponownie zawiesić w 2 ml kompletnej pożywki RPMI1640 hodowlanej w obecności IL-2 (300 j./ml).</li>
	<li>Przetestuj pierwotną cytotoksyczność komórek NK u ludzi i myszy odpowiednio wobec K562 i YAC-1, wykonując 51testów uwalniania chromu (Cr) w różnych proporcjach efektora do komórki docelowej22.
	<ol>
		<li>Krótko mówiąc, podaj milionowi komórek docelowych 50 μCi znakowanego radioaktywnie chromianu sodu 51Cr. Podczas 4-godzinnego czasu inkubacji pobierają 51Cr do białek komórkowych. Pod koniec inkubacji umyj komórki, aby usunąć wszelkie niewłączone etykiety.</li>
		<li>Oblicz specyficzną lizę komórek nowotworowych przez ilość bezwzględnego, spontanicznego i eksperymentalnego uwolnienia 51Cr z komórek docelowych. 
		UWAGA: Obliczenie procentu lizy swoistej z eksperymentów z pentapikatami przeprowadzono przy użyciu następującego równania: % lizy swoistej = ((51Cr średnie uwalnianie eksperymentalne - 51Cr średnie uwalnianie spontaniczne) / (51Cr średnie maksymalne uwalnianie - 51Cr średnie uwalnianie spontaniczne)) х 100, gdzie "51Cr średnie spontaniczne uwalnianie" to 51Cr uwalniane z komórek docelowych przy braku komórek NK i "51Cr średnie maksymalne uwalnianie" oznacza 51Cr uwalniane z komórek docelowych po lizie przez 2 N kwas solny (HCl).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbierz transdukowane komórki NK w 7 dniu, delikatnie stukając w kolby.
	<ol>
		<li>Aktywuj pobrane komórki za pomocą miareczkowanych stężeń mAb anty-NKG2D (A10) związanych z płytkami, pokrywając 96-dołkowe, wysoce absorbujące białka płytki polistyrenowe stężeniami 2,5 μg/ml mAb anty-NKG2D przez noc.</li>
		<li>Przemyć każdą studzienkę 100 μl PBS trzy razy przed dodaniem pierwotnych komórek NK.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać supernatanty hodowli za pomocą pipety wielokanałowej między 16 a 18 godzinami po aktywacji, aby określić ilościowo cytokiny, takie jak IFN-γ. Wygeneruj krzywe standardowe przy użyciu rekombinowanych cytokin dostarczonych z zestawami do testów immunoenzymatycznych (ELISA).</li>
	<li>Przetestuj żywotność komórek NK za pomocą barwienia aneksyny-V/7-amino-aktynomycyny D (7-AAD)23 i określ procent komórek martwiczych wśród przekształconych komórek NK za pomocą cytometru przepływowego.
	<ol>
		<li>Aby przeprowadzić ten test, należy zebrać mysie i ludzkie komórki NK cztery dni po transdukcji, przemyć dwa razy 10 ml zimnego PBS w ilości 500 × g przez 5 minut każdy i inkubować z zestawem Annexin-V (PE)/7-AAD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj odpowiedniego oprogramowania do cytometrii przepływowej do analizy danych. Wybierz populację żywych komórek i przeanalizuj ekspresję GFP (kanał FITC) jako miarę transdukcji wirusa24.</li>
</ol>

<ol><li>Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functions of natural killer cells.</a> Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).</li>
<li>Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+despite+immunosurveillance%3A+immunoselection+and+immunosubversion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).</li>
<li>Arina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+liaisons+of+natural+killer+lymphocytes+in+immunology+and+immunotherapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer.</a> Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).</li>
<li>Manilay, J. O., Sykes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+cells+and+their+role+in+graft+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Natural killer cells and their role in graft rejection.</a> Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).</li>
<li>Raulet, D. H., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-tolerance+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Self-tolerance of natural killer cells.</a> Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).</li>
<li>Chouaib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+outcome+of+leukemia+by+natural+killer+cell-based+immunotherapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies.</a> Front Immunol. 5, 95(2014).</li>
<li>Dulphy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underground+Adaptation+to+a+Hostile+Environment%3A+Acute+Myeloid+Leukemia+vs.+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells.</a> Front Immunol. 7, 94(2016).</li>
<li>Tran, J., Kung, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+mediate+stable+and+efficient+gene+delivery+into+primary+murine+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells.</a> Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).</li>
<li>Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+human+natural+killer+cell+line%2C+NKL%2C+using+the+Amaxa+nucleofection+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system.</a> J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).</li>
<li>Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+efficient+gene+transfer+into+natural+killer+cells+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection.</a> J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).</li>
<li>Becknell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+infection+of+human+natural+killer+cells+with+an+EBV%2Fretroviral+hybrid+vector%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector.</a> J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).</li>
<li>Jiang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syk+regulation+of+phosphoinositide+3-kinase-dependent+NK+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function.</a> J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).</li>
<li>Burshtyn, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+residues+amino-terminal+of+cytoplasmic+tyrosines+contribute+to+the+SHP-1-mediated+inhibitory+function+of+killer+cell+Ig-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors.</a> J. Immunol. 162, 897-902 (1999).</li>
<li>Schroers, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+human+T+lymphocytes+and+natural+killer+cells+by+Ad5%2FF35+chimeric+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors.</a> Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).</li>
<li>Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modification+of+primary+natural+killer+cells+overcomes+inhibitory+signals+and+induces+specific+killing+of+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells.</a> Blood. 106, 376-383 (2005).</li>
<li>Denning, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+transductional+efficiency+of+lentiviral+vectors%3A+effect+of+sera+and+polycations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations.</a> Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).</li>
<li>Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+gene+transduction+and+expansion+of+human+T+lymphocytes+for+clinical+immunogene+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer.</a> Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).</li>
<li>Campeau, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+viral+system+for+expression+and+depletion+of+proteins+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+ONE%22%5BJournal%5D)">A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells.</a> PLoS. ONE. 4, e6529(2009).</li>
<li>Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+protocol+for+lentiviral+vector+mass+production%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New protocol for lentiviral vector mass production.</a> Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).</li>
<li>Rajasekaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+by+Fyn-ADAP+via+the+Carma1-Bcl-10-MAP3K7+signalosome+exclusively+regulates+inflammatory+cytokine+production+in+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells.</a> Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).</li>
<li>Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKG2D+receptor-mediated+NK+cell+function+is+regulated+by+inhibitory+Ly49+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors.</a> Blood. 105, 233-240 (2005).</li>
<li>Awasthi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1b+facilitates+NK+cell+functions+via+IQGAP1-mediated+signalosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes.</a> J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).</li>
<li>Rajasekaran, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+Growth+Factor-%7Bbeta%7D-activated+Kinase+1+Regulates+Natural+Killer+Cell-mediated+Cytotoxicity+and+Cytokine+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production.</a> J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).</li>
<li>Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+for+the+delivery+of+DNA+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).</li>
<li>Sutlu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+intracellular+antiviral+defense+mechanisms+augments+lentiviral+transduction+of+human+natural+killer+cells%3A+implications+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).</li>
<li>Cornetta, K., Anderson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine+sulfate+as+an+effective+alternative+to+polybrene+in+retroviral-mediated+gene-transfer%3A+implications+for+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy.</a> J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).</li>
<li>Toyoshima, K., Vogt, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+and+inhibition+of+avian+sarcoma+viruses+by+polycations+and+polyanions%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions.</a> Virology. 38, 414-426 (1969).</li>
<li>Jensen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bi-specific+CD3+x+NCAM+antibody%3A+a+model+to+preactivate+T+cells+prior+to+tumour+cell+lysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).</li>
</ol>

Autorzy twierdzą, że nie ma finansowego konfliktu interesów.

Badanie to pokazuje, że zastosowanie dekstranu jako kationowego środka polimerowego zwiększa skuteczność transdukcji lentiwirusowej zarówno mysich, jak i ludzkich pierwotnych komórek NK. Ponadto inne czynniki kationowe, takie jak Pb lub PS, nie mają zauważalnego wpływu na dostarczanie wektorów wirusowych do ludzkich pierwotnych komórek NK. Wcześniej wykazano, że Pb może zwiększać transdukcję genów w ludzkich limfocytach T17. Wyniki te sugerują jednak, że ani Pb, ani PS nie mają podobnej wydajności...

Komórki NK (Natural killer) są główną populacją limfocytarną wrodzonego układu odpornościowego1. Komórki NK funkcjonują jako pierwszoliniowi obrońcy odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciwko nowotworom i infekcjom2,3,4. Komórki NK odgrywają również kluczową rolę w rozwoju tolerancji poprzez wydzielanie silnych cytokin i chemokin5. Ze względu na ich silną zdolność do celowania i eliminowania komórek nowotworowych, prowadzonych jest wiele badań klinicznych mających na celu ocenę ludzkich komórek NK pochodzących od dawcy jako adoptywnej immunoterapii raka6,7. W przeciwieństwie do limfocytów T, biologia rozwojowa komórek NK nie została jeszcze dobrze scharakteryzowana8. Ten brak wiedzy jest częściowo spowodowany brakiem skutecznych technik, które dostarczałyby geny będące przedmiotem zainteresowania do mysich lub ludzkich pierwotnych komórek NK. Z tych powodów większość badań nad komórkami NK przeprowadzono w liniach komórkowych, a nie w komórkach pierwotnych. W związku z tym kluczowe znaczenie ma potrzeba niezawodnego i wydajnego protokołu transdukcji pierwotnych komórek NK z genami będącymi przedmiotem zainteresowania.
Ogólnym celem tego badania było sformułowanie spójnej i niezawodnej metody, za pomocą której pierwotne ludzkie lub mysie komórki NK mogłyby być transdukowane za pomocą lenti- lub retrowirusów.
Wcześniejsze badania, które próbowały rozwiązać ten problem, zostały przeprowadzone, głównie przy użyciu przejściowej transformacji pierwotnych komórek NK. Obejmuje to transfekcję plazmidu9,10, wirus Epsteina-Barr (EBV)/retrowirusowy wektor hybrydowy11, wektory krowianki12,13 i chimeryczne wektory adenowirusowe Ad5/F3514. Pomimo skromnej skuteczności tych technik, przejściowy charakter transdukcji sprawia, że nie nadają się one do długoterminowego wykorzystania genetycznie zmodyfikowanych komórek NK. W kilku ostatnich badaniach wykorzystano wektory retrowirusowe do transdukcji komórek NK, co wymagało wielu cykli infekcji w celu osiągnięcia akceptowalnego poziomu ekspresji genów11,15. W przeciwieństwie do wektorów retrowirusowych, wektory lentiwirusowe mogą wykorzystywać maszynerię importu jądra komórkowego gospodarza do translokacji kompleksu wstępnej integracji wirusa do jądra. Jest to główny czynnik ograniczający replikację wirusa w komórkach niedzielących się, do których należą pierwotne komórki NK.
Interakcje między różnymi receptorami na powierzchni komórki a cząsteczkami wirusa umożliwiają jego wychwyt do komórki. Początkowe zaangażowanie między białkami otoczki wirusa a pokrewnymi receptorami gospodarza może być ograniczone ze względu na potencjalne ujemne ładunki istniejące między tymi dwoma. Uzasadnieniem wielu technik transdukcji jest to, że dodanie polimerów kationowych, takich jak polibren (Pb), siarczan protaminy (PS) lub dekstran, może nadać dodatni ładunek receptorom na powierzchni komórki, a tym samym zwiększyć wiązanie białek otoczki wirusa. Zwiększy to wydajność fuzji i wychwyt cząstek wirusa przez komórki16. Chociaż doniesiono, że Pb lub PS mogą poprawić transfer genów w limfocytach T17, ich zastosowanie nie miało żadnego wpływu na wydajność transdukcji pierwotnych komórek NK. Ponadto nie przeprowadzono analizy porównawczej między tymi odczynnikami przy użyciu pierwotnych komórek NK. W tym badaniu porównano wydajność transdukcji trzech polimerów kationowych. Wyniki pokazują, że spośród tych trzech polimerów kationowych tylko dekstran znacząco zwiększa wydajną transdukcję wirusa zarówno do mysich, jak i ludzkich pierwotnych komórek NK.

<table><tbody><tr><td>Dekstran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90-64-91-9</td><td></td></tr><tr><td>polibren (Pb)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>siarczan protaminy (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p3369</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>ATALANTA</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>Corning</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>B-merkaptoetanol</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>pirogronian sodu</td><td>Corning</td><td>MT25000CI</td><td></td></tr><tr><td>Interferon gamma (IFN-&gamma; )</td><td>eBioscience</td><td>14-7311-85</td><td></td></tr><tr><td>Propidium lodding roztwór barwiący</td><td>BD</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofektamina 3000</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>PHOENIX</td><td>NDC 57319-559-05</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do negatywnej selekcji komórek NK</td><td>Komórka macierzysta</td><td>19855</td><td></td></tr><tr><td>Yac-1</td><td>ATCC</td><td>TIB-160</td><td></td></tr><tr><td>K562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Myszy</td><td>Jakson</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Komórki 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Kolby T75</td><td>Cornnig</td><td>430641U</td><td></td></tr> oparte na <tr><td>przeciwciałach Zestawy do negatywnej selekcji</td><td>Komórki macierzyste</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>51Testy uwalniania chromu (Cr)</td><td>Perkin Elmer's</td><td>NEZ030</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy ELISA</td><td>Ebioscience</td><td>00-4201-56</td><td></td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Sigma</td><td>5887-5G</td><td></td></tr><tr><td>Liniowe polinauki</td><td>polietylenowe</td><td>23966-2</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Nauki przyrodnicze</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr></tbody></table>

dekstran zwiększa efektywność transdukcji lentiwirusowej mysich i ludzkich pierwotnych komórek nk

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

Skuteczna transdukcja określonych genów do komórek NK była dużym wyzwaniem. Udane transdukcje mają kluczowe znaczenie dla określenia roli genu będącego przedmiotem zainteresowania w rozwoju, różnicowaniu i funkcjonowaniu komórek NK. Ostatnie postępy związane z chimerycznymi receptorami antygenowymi (CAR) w immunoterapii nowotworów podkreślają potrzebę opracowania skutecznej metody dostarczania genów egzogennych do limfocytów efektorowych. Skuteczność transdukcji genów za pośrednictwem lentiwirusa do pierwotnych ludzkich lub mysich komórek NK pozostaje znacznie niska, co jest głównym czynnikiem ograniczającym. Ostatnie postępy w stosowaniu polimerów kationowych, takich jak polibren, wskazują na poprawę skuteczności transdukcji genów w limfocytach T. Jednak produkty te nie poprawiły wydajności transdukcji komórek NK. Praca ta pokazuje, że dekstran, rozgałęziony polisacharyd glukanu, znacznie poprawia wydajność transdukcji pierwotnych komórek NK u ludzi i myszy. Ta wysoce powtarzalna metodologia transdukcji zapewnia kompetentne narzędzie do transdukcji ludzkich pierwotnych komórek NK, co może znacznie poprawić kliniczne zastosowania dostarczania genów, a tym samym immunoterapię nowotworów opartą na komórkach NK.

Dekstran indukuje wydajny transfer genów wektora lentiwirusowego w pierwotnych komórkach NK człowieka i myszy
Ludzkie komórki NK zostały wyizolowane i oczyszczone z PBMC (z czystością powyżej 85%) i inkubowane przez noc z rIL-2 300 U/mL. Te pierwotne komórki NK poddano następnie transdukcji lentiwirusem GFP przy różnych wielokrotnościach infekcji (MOI; 3, 10 i 20 IU na komórkę) w płytkach 24-dołkowych w obecności 8 µg/mL Pb, PS lub...

Celem tego badania było sformułowanie technologii, które pozwalają na skuteczną transdukcję genów w pierwotnych komórkach NK (natural killer). Transdukcja lentiwirusowa ludzkich lub mysich pierwotnych komórek NK za pośrednictwem dekstranu skutkuje wyższą wydajnością ekspresji genów. Ta metoda transdukcji genów znacznie poprawi manipulację genetyczną komórkami NK.

Dekstran zwiększa efektywność transdukcji lentiwirusowej mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest opracowanie technologii umożliwiających skuteczną transdukcję genów w pierwotnych komórkach natural killer. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie immunoterapii, takie jak wpływ modyfikacji genetycznej na limfocyty efektorowe, na przykład komórki natural killer lub komórki NK. Główną zaletą tej techniki jest wydajna ekspresja interesującego genu w pierwotnych komórkach NK myszy lub człowieka.Po przygotowaniu i miareczkowaniu wektorów lentiwirusowych zgodnie z protokołem tekstowym, należy przeprowadzić oczyszczanie pierwotnych komórek NK myszy poprzez przepuszczenie zawiesiny pojedynczych komórek śledziony przez kolumny z wełny nylonowej w celu usunięcia populacji adherentnych, składających się z limfocytów B i makrofagów. Do hodowli populacji nieadherentnej zawierającej komórki NK należy użyć Interleukiny-2 w stężeniu 1 000 jednostek na mililitr w pełnej pożywce RPMI1640. W czwartym dniu hodowli należy wymienić pożywkę, stosując 20 mililitrów pełnej pożywki RPMI1640 oraz 1 000 jednostek na mililitr IL-2, aby usunąć nieadherentne limfocyty T i komórki NKT.Siódmego dnia, przy użyciu markerów specyficznych dla komóre

dextran-enhances-lentiviral-transduction-efficiency-murine-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przedstawiamy nasz zoptymalizowany protokół wysokoprzepustowej nukleofekcji jako wydajny sposób transfekcji pierwotnych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów za pomocą plazmidowego DNA lub siRNA, bez wywoływania dojrzewania komórek. Dostarczamy ponadto dowodów na skuteczne wyciszenie siRNA docelowego genu RIG-I zarówno na poziomie mRNA, jak i białka.

Zoptymalizowany protokół wydajnej transfekcji komórek dendrytycznych bez dojrzewania komórek

Opisano protokół ex vivo służący do generowania dojrzałych ludzkich erytrocytów z hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych. Dodatkowo opisano wydajną metodę dostarczania lentiwirusowego w celu wyciszenia czynnika transkrypcyjnego TAL1 w pierwotnych komórkach erytroidalnych. Wydajność dostarczania genów za pomocą lentiwirusów została zademonstrowana z wykorzystaniem wirusów ekspresyjących GFP.

Lentiwirusowy wyciszanie genów podczas erytropoezy ex vivo ludzkich hematopoetycznych komórek macierzystych

Lentiwirusy są cennym narzędziem badawczym w analizie funkcji genów; jednak badacze mogą chcieć uniknąć produkcji pantropowych lentiwirusów kodujących znane lub podejrzewane onkogeny. Jako alternatywę przedstawiamy bezpieczniejszy protokół wykorzystania ektropowych lentiwirusów w komórkach ludzkich zmodyfikowanych w celu ekspresji ektropowego receptora mSlc7a1.

Transdukcja komórek ludzkich ekotropowym lentiwirusem w kompleksie z polimerem w celu zwiększenia bezpieczeństwa biologicznego

Ten film demonstruje test na transdukcję wirusa za pośrednictwem kationowego polimeru w komórkach NK (natural killer). Komórki są inkubowane z transgenicznymi wektorami lentiwirusa kodującymi białko fluorescencyjne. Dodanie polimeru kationowego umożliwia wirusowi przyłączenie się do komórek i zintegrowanie swojego RNA z genomem gospodarza, powodując ekspresję białka fluorescencyjnego. Fluorescencję określa się ilościowo w celu oceny indukcji wywołanej przez polimer.

Wzmacnianie transdukcji wirusa w komórkach NK za pomocą polimeru kationowego

Tutaj używamy transdukcji retrowirusowej i transfekcji konkategomerycznej, aby stworzyć linię komórkową, która może wyrażać składniki wektora lentiwirusowego (LV) przy braku tetracykliny. Ten LV koduje GFP i jest pseudotypowany glikoproteiną SVGmu, która jest specyficzna dla receptora na komórkach dendrytycznych.

Linia komórkowa regulowana tetracykliną wytwarza wektory lentiwirusowe o wysokim mianie, które są specyficznie ukierunkowane na komórki dendrytyczne

W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół ekspresji białek fuzyjnych fluorescencyjnych w komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Metoda opiera się na transdukcji komórek progenitorowych szpiku kostnego za pomocą konstruktów retrowirusowych, a następnie różnicowaniu do makrofagów i komórek dendrytycznych in vitro.

Ekspresja fluorescencyjnych białek fuzyjnych w mysich komórkach dendrytycznych i makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Opisujemy szybki i solidny protokół wzbogacania niezmiennych komórek T natural killer (iNKT) ze śledziony myszy i rozszerzania ich in vitro do odpowiedniej liczby dla badań in vitro i in vivo.

Oczyszczanie i namnażanie mysich niezmiennych limfocytów T NK do badań in vitro i in vivo

Ten protokół opisuje izolację podwójnie ujemnych tymocytów z grasicy myszy, a następnie transdukcję retrowirusową i kohodowlę w systemie kohodowli linii komórek zrębu szpiku kostnego z ekspresją delta 4 (OP9-DL4) w celu dalszej analizy funkcjonalnej.

Współhodowla i transdukcja mysich tymocytów na komórkach zrębowych z ekspresją 4 podobną do delta w celu badania onkogenów w białaczce z komórek T

Obecny protokół pokazuje, jak odróżnić komórki CD3−/CD45+CD56+ o łagodnej cytotoksyczności od ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale (hEPSC) zarówno w warunkach hodowli 3D, jak i 2D. Pozwala to na rutynową walidację fenotypową bez niszczenia złożonego mikrośrodowiska.

Generowanie komórek NK z ludzkich komórek macierzystych o rozszerzonym potencjale

Pokazujemy krok po kroku protokół badania funkcji genów w makrofagach rezydujących w tkance otrzewnej in vivo, przy użyciu wektorów lentiwirusowych.

Preparat wektora lentiwirusowego do skutecznej modulacji genów i mikroRNA makrofagów rezydujących w tkankach jamy otrzewnej in vivo u myszy

Poznaj metodę transdukcji lentiwirusowej z użyciem dekstranu w pierwotnych komórkach NK myszy i człowieka. Technika zwiększa efektywność modyfikacji genetycznej przy zachowaniu cytotoksyczności komórek.

Dekstran zwiększa efektywność transdukcji lentiwirusowej mysich i ludzkich pierwotnych komórek NK

Przeglądaj więcej filmów