Solidny model zapalenia płuc u immunokompetentnych gryzoni w celu oceny skuteczności przeciwbakteryjnej przeciwko S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii

Ogólnym celem tej niechirurgicznej procedury zakażenia śródoskrzelowego jest ustalenie silnego bakteryjnego zapalenia płuc u gryzoni immunokompetentnych. Metoda ta stanowi wartość dodaną dla odkrywania i opracowywania środków przeciwbakteryjnych, umożliwiając ocenę skuteczności potencjalnych metod leczenia w immunokompetentnym modelu ciężkiego zapalenia płuc. Główną zaletą tej techniki jest to, że ustanawia ona solidną i powtarzalną infekcję płuc za pomocą wielu izolatów, w tym tych, które zwykle wymagają neutropenii zwierząt lub izolatów, które nie wywołują żywej infekcji innymi metodami.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej procedurze, będą miały trudności. Właściwa intubacja to ślepa procedura, która wymaga nauczenia się prawidłowego czucia do intubacji tchawicy zamiast przełyku. Właściwa intubacja jest inna dla każdego naukowca.

Dokładny kąt nachylenia kaniuli może nie być taki sam dla wszystkich. Kluczem jest wyczucie grzbietów tchawicy. Technikę tę zademonstruje Cindy Mininger, naukowiec z naszego laboratorium.

Na początek przygotuj zawiesiny bakteryjne soli fizjologicznej z nocnych kultur bulionowych, jak wskazano w protokole tekstowym, lub z płytek agarowych, jak pokazano tutaj. Zbierz nocny wzrost z płytek agarowych, używając sterylnej pętli do zeskrobywania kolonii z powierzchni. Przenieś zebrany materiał do pięciu mililitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aż do uzyskania mętnej, nieprzezroczystej zawiesiny i delikatnie wiruj kulturę, aż będzie jednorodna.

Następnie rozcieńczyć seryjnie i z każdego rozcieńczenia nanieść na płytkę podwielokrotność zgodnie z protokołem tekstowym. Po przygotowaniu agaru i zgromadzeniu narzędzi niezbędnych do procesu infekcji, zgodnie z protokołem tekstowym, podwielokrotność dziewięciu mililitrów agaru do sterylnej probówki, a następnie umieszczenie probówki w łaźni wodnej, aż agar zrównoważy się do około 42 stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr wcześniej przygotowanej zawiesiny bakteryjnej soli fizjologicznej do probówki agarowej.

Następnie odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać i wrzucić ją z powrotem do wody. Umieść czystą, jednorazową matę na powierzchni roboczej w pobliżu łaźni wodnej. Aby przygotować powierzchnię roboczą i urządzenie do intubacji, najpierw wysterylizuj metalową kaniulę i rurkę polietylenową zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie przenieś je w szklanej rurce do przechowywania na powierzchnię roboczą.

Następnie zdejmij nasadkę z rurki do przechowywania i wsuń koniec uchwytu kaniuli do otwartego końca tuby. Za pomocą sterylnych kleszczy wyjmij jeden odcinek rurki polietylenowej ze zlewki i włóż ją przez wnętrze sterylnej metalowej kaniuli, upewniając się, że porusza się swobodnie. Umieść znak prowadzący w określonym miejscu za pomocą nieusuwalnego pisaka.

Następnie załóż sterylną jednorazową igłę o rozmiarze 25 na wolnym końcu rurki polietylenowej, wsuwając igłę na kilka milimetrów do rurki. Następnie użyj sterylnego soli fizjologicznej, aby napełnić świeżą jednorazową strzykawkę o pojemności jednego mililitra. Przymocować strzykawkę do igły umieszczonej na rurki polietylenowej i przepłukać całą objętość soli fizjologicznej przez rurkę.

Wyrzuć zużytą strzykawkę do pojemnika na ostre przedmioty. Następnie napełnij nową sterylną jednorazową strzykawkę o pojemności jednego mililitra inokulum na bazie agaru z łaźni wodnej. Ponownie zamocuj igłę i rurkę o rozmiarze 25 i przepłucz agar przez rurkę, naciskając tłok tylko do momentu, gdy rurka zostanie całkowicie wypełniona agarem.

Po znieczuleniu szczura zgodnie z protokołem tekstowym należy ułożyć zwierzę w pozycji leżącej na jednorazowej macie z głową skierowaną w prawo i ogonem skierowanym w lewo. Następnie włóż wolny koniec metalowej kaniuli do pyska zwierzęcia. Obróć kaniulę tak, aby wolny koniec był ustawiony pod kątem do góry i delikatnie wsuń ją do tchawicy, ostrożnie omijając struktury krtani lekkim ruchem skręcającym.

Potwierdź wprowadzenie do tchawicy, a nie do przełyku, delikatnie przesuwając kaniulę lekko do przodu i do tyłu kilka razy, jednocześnie dotykając pierścieni tchawicy lewym palcem wskazującym. Aby zapewnić intubację do tchawicy, a nie do przełyku, przesuń lekko kaniulę do przodu i do tyłu i wyczuj grzbiety. Jeśli kaniula gładko przesuwa się w dół gardła, a wypukłości nie są wyczuwalne, wyjmij urządzenie i spróbuj ponownie.

Gdy kaniula dotrze do rozwidlenia, w którym tchawica rozdziela się na lewe i prawe oskrzela, wykonaj lekki ruch skręcający w kierunku lewej strony zwierzęcia, aby upewnić się, że kaniula została wprowadzona do lewego oskrzela. Częstym błędem jest nieumieszczanie szczepionki wystarczająco głęboko w płucach, co może blokować drogi oddechowe i utrudniać oddychanie. Gdy kaniula zostanie obrócona pod odpowiednim kątem, powinna łatwo wsunąć się w lewe oskrzela i płynnie przesuwać się na odpowiednią głębokość.

Przesuń metalową kaniulę do połowy, aż koniec znajdzie się w połowie do trzech czwartych w dół lewego płuca, używając wcześniej umieszczonego znacznika prowadzącego, aby potwierdzić, że osiągnięto odpowiednią głębokość. Po założeniu metalowej kaniuli przesuń rurkę polietylenową o kilka milimetrów, korzystając z wcześniej umieszczonego znaku prowadzącego na rurce, aby upewnić się, że jest ona wysunięta tylko na tyle daleko, aby wyjść z końca metalowej kaniuli i nie przebić płuca. Po założeniu obu kaniul użyj dołączonej strzykawki, aby wkroplić 100 mikrolitrów zawiesiny agarowej głęboko do dużego płata lewego płuca.

Pobrać kilka milimetrów rurki i delikatnie wyjąć nienaruszone urządzenie do intubacji. Umieść go z powrotem w szklanej tubie do przechowywania i przenieś zwierzę do nowej klatki, aby wyzdrowiało. Przygotuj powierzchnię roboczą i kaniulę, jak właśnie pokazano dla szczurów, używając sprzętu o odpowiedniej wielkości dla myszy.

Użyj sterylnej jednorazowej strzykawki o pojemności 1 mililitra i sterylnej igły o rozmiarze 25, aby napełnić szklaną strzykawkę do mikroiniekcji sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Następnie przepłucz sól fizjologiczną przez ponownie zmontowane urządzenie. Następnie użyj nowej sterylnej jednorazowej strzykawki o pojemności jednego mililitra i sterylnej igły o rozmiarze 25, aby napełnić strzykawkę do mikroiniekcji inokulum agarowym.

Następnie ponownie zmontuj urządzenie i przepłucz agar przez rurkę, aż rurka zostanie całkowicie wypełniona agarem. Po znieczuleniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, ustaw zwierzę w tej samej orientacji, jak pokazano dla szczura, i użyj stałego, ale delikatnego nacisku, aby zaintubować tchawicę w podobny sposób, jak w przypadku szczura. Unikaj używania siły, ponieważ technika jest bardziej delikatna u myszy.

Upewnij się, że kaniula została włożona do tchawicy, wyczuwając pierścienie tchawicy. Lekko obrócić i wsunąć kaniulę do lewego oskrzela, wprowadzając ją głęboko do płuca za pomocą wcześniej umieszczonych znaków prowadzących. Po założeniu metalowej kaniuli przesuń rurkę polietylenową o kilka milimetrów i wlej 20 mikrolitrów zawiesiny agarowej.

Pokazany tutaj jest reprezentatywny przykład kolonii rosnących na płytce agarowej po seryjnym rozcieńczeniu i trzykrotnym posiewie próbki homogenatu płucnego. Jak wykazano na tym wykresie w przypadku S. pneumoniae, wzrost obciążenia bakteryjnego kilkoma jednostkami o podstawie dziesięciu jtk powyżej wyjściowej kontroli jest zwykle obserwowany w zakażonych płucach w przypadku większości izolatów bakteryjnych, nawet po 96 godzinach od zakażenia, a zmienność między zwierzętami jest niska. W tym eksperymencie dwa związki oceniano pod kątem wrażliwych lub opornych na chinolony izolatów S.pneumoniae, aby zilustrować, że ten model infekcji płuc może być wykorzystany podczas optymalizacji serii ołowiu chemicznego w celu wspierania zależności aktywności struktury.

Każdy symbol reprezentuje CFU wyznaczone na podstawie płuc jednego szczura. Poniżej przedstawiono modele E max stworzone na podstawie danych dotyczących skuteczności w zakresie dawek u myszy immunokompetentnych zakażonych w płucach izolatami S.pneumoniae lub H.influenzae w celu określenia celów farmakokinetycznych i farmakodynamicznych dla nowego inhibitora deformylazy polipeptydowej. Kręgi reprezentują średnie obciążenie bakteryjne od czterech do pięciu myszy na grupę leczoną różnymi dawkami związku.

Otwarte okręgi reprezentują wolny obszar pod krzywą, a wypełnione okręgi reprezentują obszar pod krzywą stężenia w czasie powyżej minimalnego stężenia hamującego. Po opanowaniu, technika ta może być wykonana w około 30 sekund na zwierzę, przy czym na strzykawkę z inokulum agarowym szczepi się do pięciu lub sześciu zwierząt. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać tę niechirurgiczną metodę infekcji śródoskrzelowej i być w stanie wykorzystać ją do ustalenia infekcji płuc za pomocą wielu różnych izolatów bakteryjnych.

Instrument energetyczny