Name: Solidny model zapalenia płuc u immunokompetentnych gryzoni w celu oceny skuteczności przeciwbakteryjnej przeciwko S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj niechirurgiczną metodę infekcji oskrzelowej w celu wywołania zapalenia płuc u gryzoni immunokompetentnych. Ta technika umożliwia ocenę skuteczności terapii przeciwbakteryjnych w modelu ciężkiej pneumonii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JH pragnie podziękować mentorce, przyjaciółce i byłej menedżerce Valerie Berry za to, że jako pierwsza nauczyła nas tego modelu; oraz Gary'emu Woodnuttowi, który nauczył nas podstaw i zainspirował nasze zaangażowanie w dziedzinie antybakteryjnej PK/PD. Wszyscy autorzy pragną podziękować Davidowi Payne'owi za jego wsparcie i uznanie dla naszej nauki. Chcielibyśmy podziękować naszym byłym kolegom z mikrobiologii in vivo, którzy przyczynili się do powstania danych wygenerowanych przy użyciu tych metod, w szczególności Pete'owi DeMarshowi, Robowi Straubowi, Ronie Page i Nerissie Simon. Na koniec dziękujemy naszym kolegom z mikrobiologii in vitro za ich pomoc, a w szczególności za dostarczenie wszystkich wymaganych przez nas MIC-ów (Lynn McCloskey, Josh West i Sharon Min); oraz dla naszego zespołu mikrobiologii klinicznej, który służy fachowym doradztwem i wsparciem (Linda Miller, Nicole Scangarella-Oman i Deborah Butler).

<ol><li>Eagle, H., Fleischman, R., Levy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous%27+vs.+%27discontinuous%27+therapy+with+penicillin%3A+the+effect+of+the+interval+between+injections+on+therapeutic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Continuous' vs. 'discontinuous' therapy with penicillin: the effect of the interval between injections on therapeutic efficacy.</a> N Engl J Med. 248 (12), 481-488 (1953).</li>
<li>Eagle, H., Fleischman, R., Musselman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bactericidal+action+of+penicillin+in+vivo%3A+the+participation+of+the+host%2C+and+the+slow+recovery+of+the+surviving+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">The bactericidal action of penicillin in vivo: the participation of the host, and the slow recovery of the surviving organisms.</a> Ann Intern Med. 33 (3), 544-571 (1950).</li>
<li>Vogelman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+antimicrobial+pharmacokinetic+parameters+with+therapeutic+efficacy+in+an+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Correlation of antimicrobial pharmacokinetic parameters with therapeutic efficacy in an animal model.</a> J Infect Dis. 158 (4), 831-847 (1988).</li>
<li>Craig, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic%2Fpharmacodynamic+parameters%3A+rationale+for+antibacterial+dosing+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters: rationale for antibacterial dosing of mice and men.</a> Clin Infect Dis. 26 (1), 1-12 (1998).</li>
<li>Ambrose, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics-pharmacodynamics+of+antimicrobial+therapy%3A+it%27s+not+just+for+mice+anymore%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics-pharmacodynamics of antimicrobial therapy: it's not just for mice anymore.</a> Clin Infect Dis. 44 (1), 79-86 (2007).</li>
<li>Ambrose, P. G., Bhavnani, S. M., Owens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+pharmacodynamics+of+quinolones%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Dis+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Clinical pharmacodynamics of quinolones.</a> Infect Dis Clin North Am. 17 (3), 529-543 (2003).</li>
<li>Andes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+and+pharmacodynamic+properties+of+antimicrobials+in+the+therapy+of+respiratory+tract+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Inf+Dis%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of antimicrobials in the therapy of respiratory tract infections.</a> Curr Opin Inf Dis. 14 (2), 165-172 (2001).</li>
<li>Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Animal models of human pneumonia.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Antibiotics+in+laboratory+medicine%2C+5th+edition.+Chapter+15%3A+Evaluation+of+antimicrobials+in+experimental+animal+infections%22">Antibiotics in laboratory medicine, 5th edition. Chapter 15: Evaluation of antimicrobials in experimental animal infections</a>. Lorian, V. , Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia. (2005).</li>
<li>McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinetobacter+baumannii%3A+human+infections%2C+factors+contributing+to+pathogenesis+and+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models.</a> FEMS Microbiol Rev. 37 (2), 130-155 (2013).</li>
<li>Nuermberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+pneumococcal+pneumonia+and+their+applicability+to+the+study+of+tissue-directed+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Murine models of pneumococcal pneumonia and their applicability to the study of tissue-directed antimicrobials.</a> Pharmacotherapy. 25 (12 Pt 2), 134S-139S (2005).</li>
<li>Mehrad, B., Standiford, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+animal+models+in+the+study+of+inflammatory+mediators+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Use of animal models in the study of inflammatory mediators of pneumonia.</a> ILAR J. 40 (4), 167-174 (1999).</li>
<li>De Simone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+genetic+background+influences+the+response+to+the+opportunistic+Pseudomonas+aeruginosa+infection+altering+cell-mediated+immunity+and+bacterial+replication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Host genetic background influences the response to the opportunistic Pseudomonas aeruginosa infection altering cell-mediated immunity and bacterial replication.</a> PLoS ONE. 9 (9), (2014).</li>
<li>Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+non-surgical+method+of+intrabronchial+instillation+for+the+establishment+of+respiratory+infections+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">A simple non-surgical method of intrabronchial instillation for the establishment of respiratory infections in the rat.</a> Lab Anim. 25 (1), 46-49 (1991).</li>
<li>Berry, V., Ferreira-Cornwell, M. C., Singley, C., Woodnutt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+experimental+murine+infections+caused+by+H.+influenzae+and+H.+parainfluenzae%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Development of experimental murine infections caused by H. influenzae and H. parainfluenzae.</a> Clin Microbiol Infect. 7 (S1), 322(2001).</li>
<li>Miles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cyclohexyl-amides+as+potent+antibacterials+targeting+bacterial+type+IIA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel cyclohexyl-amides as potent antibacterials targeting bacterial type IIA topoisomerases.</a> Bioorg Med Chem Lett. 21 (24), 7483-7488 (2011).</li>
<li>Miles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+tricyclics+%28e.g.+GSK945237%29+as+potent+inhibitors+of+bacterial+type+IIA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel tricyclics (e.g. GSK945237) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases.</a> Bioorg Med Chem Lett. 26 (10), 2464-2469 (2016).</li>
<li>Hoover, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics%2Fpharmacodynamics+of+peptide+deformylase+inhibitor+GSK1322322+against+Streptococcus+pneumoniae%2C+Haemophilus+influenzae%2C+and+Staphylococcus+aureus+in+rodent+models+of+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics/pharmacodynamics of peptide deformylase inhibitor GSK1322322 against Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Staphylococcus aureus in rodent models of infection.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), 180-189 (2016).</li>
<li>Berry, V., Hoover, J., Singley, C., Woodnutt, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+bacteriological+efficacy+of+pharmacokinetically+enhanced+amoxicillin-clavulanate+against+Streptococcus+pneumoniae+with+elevated+amoxicillin+MICs+and+Haemophilus+influenzae%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Comparative bacteriological efficacy of pharmacokinetically enhanced amoxicillin-clavulanate against Streptococcus pneumoniae with elevated amoxicillin MICs and Haemophilus influenzae.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 908-915 (2005).</li>
<li>Czock, D., Markert, C., Hartman, B., Keller, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+antimicrobial+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 5 (5), 475-487 (2009).</li>
<li>Drusano, G. L., Fregeau, C., Liu, W., Brown, D. L., Louie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+burden+on+granulocyte+clearance+of+bacteria+in+a+mouse+thigh+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Impact of burden on granulocyte clearance of bacteria in a mouse thigh infection model.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54 (10), 4368-4372 (2010).</li>
<li>Miles, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+hydroxyl+tricyclics+%28e.g.+GSK966587%29+as+potent+inhibitors+of+bacterial+type+IIA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Novel hydroxyl tricyclics (e.g. GSK966587) as potent inhibitors of bacterial type IIA topoisomerases.</a> Bioorg Med Chem Lett. 23 (19), 5437-5441 (2013).</li>
<li>Hunt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pleuromutilin+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs+Future%22%5BJournal%5D)">Pleuromutilin antibiotics.</a> Drugs Future. 25 (11), 1163-1168 (2000).</li>
<li>Jin, Q., et al. Novel LpxC inhibitors with broad-spectrum gram-negative activity. Proceedings of the 44th National Organic Chemistry Symposium.. College Park, MD, , Abstract T-31 (2015).</li>
<li>Singley, C., Page, R., Hoover, J., Elefante, P., DeMarsh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+a+LRS+inhibitor+GSK2251052+against+Enterobacteriaceae+isolates+using+a+computer-controlled+infusion+system+to+recreate+human+PK+profiles+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Efficacy of a LRS inhibitor GSK2251052 against Enterobacteriaceae isolates using a computer-controlled infusion system to recreate human PK profiles in rats.</a> Clin Microbiol Infect. 17 (S4), S429-S430 (2011).</li>
<li>Berry, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+in+vivo+activity+of+gemifloxacin+in+a+rat+model+of+respiratory+tract+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Comparative in vivo activity of gemifloxacin in a rat model of respiratory tract infection.</a> J Antimicrob Chemother. 45 (S1), 79-85 (2000).</li>
<li>Tsuji, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-649266%2C+a+Novel+Siderophore+Cephalosporin%3A+Efficacy+against+Klebsiella+pneumoniae+producing+NDM-1+or+KPC+in+rat+lung+infection+model+with+recreated+humanized+exposure+profile+of+2+gram+dose+with+1+hour+and+3+hours+infusion%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Forum+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">S-649266, a Novel Siderophore Cephalosporin: Efficacy against Klebsiella pneumoniae producing NDM-1 or KPC in rat lung infection model with recreated humanized exposure profile of 2 gram dose with 1 hour and 3 hours infusion.</a> Open Forum Infect Dis. 1 (S1), S106-S107 (2014).</li>
<li>Tsuji, M., et al. Use of Iron Depleted Mueller Hinton Broth (IDMHB) for microdilution testing of S-649266, a novel siderophore cephalosporin. 26th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Amsterdam, Netherlands, , Abstract P0808 (2016).</li>
<li>Singley, C., Hoover, J., DeMarsh, P. J., Elefante, P., Zalacain, M. Efficacy of PDF Inhibitor GSK1322322 Against Abscess Infections Caused by MRSA Using a Computer-Controlled Infusion System to Recreate Human PK Profiles in Rats. Proceedings of the 60th Annual Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Boston, MA, , Abstract F1-2114 (2010).</li>
<li>Hoover, J., Mininger, C., Rittenhouse, S. GSK2251052, a novel LeuRS inhibitor, is effective against multi-drug resistant Pseudomonas aeruginosa in a mouse pneumonia model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract B-1308 (2012).</li>
<li>Hoover, J., Mininger, C., Novick, S., Rittenhouse, S. Efficacy of GSK2140944 against Streptococcus pneumoniae in a non-neutropenic mouse lung infection model. Proceedings of the 53rd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Denver, CO, , Abstract A-014 (2013).</li>
<li>Hoover, J. L., et al. Selection of a lung infection model to predict efficacy in community-acquired pneumonia (CAP) caused by S. pneumoniae (SP). Proceedings of the 47th Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, Illinois, , Abstract A-17 (2007).</li>
<li>Drusano, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saturability+of+granulocyte+kill+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+murine+model+of+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Saturability of granulocyte kill of Pseudomonas aeruginosa in a murine model of pneumonia.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (6), 2693-2695 (2011).</li>
<li>Peric, M., Browne, F. A., Jacobs, M. R., Applebaum, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+nine+oral+agents+against+gram-positive+and+gram-negative+bacteria+encountered+in+community-acquired+infections%3A+use+of+pharmacokinetic%2Fpharmacodynamic+breakpoints+in+the+comparative+assessment+of+beta-lactam+and+macrolide+antimicrobial+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Ther%22%5BJournal%5D)">Activity of nine oral agents against gram-positive and gram-negative bacteria encountered in community-acquired infections: use of pharmacokinetic/pharmacodynamic breakpoints in the comparative assessment of beta-lactam and macrolide antimicrobial agents.</a> Clin Ther. 25 (1), 169-177 (2003).</li>
<li>Calbo, E., Garau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+to+antimicrobial+therapy+of+community-acquired+respiratory+tract+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration%22%5BJournal%5D)">Application of pharmacokinetics and pharmacodynamics to antimicrobial therapy of community-acquired respiratory tract infections.</a> Respiration. 72 (6), 561-571 (2005).</li>
<li>Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2140944 against Staphylococcus aureus and Streptococcus pneumoniae in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 54th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Washington, DC, , Abstract A-680 (2014).</li>
<li>Bulik, C. C., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli in a murine-thigh infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1270 (2012).</li>
<li>Andes, D. R., et al. Evaluation of the pharmacokinetics-pharmacodynamics of GSK2251052 against gram-negative bacilli using data from a neutropenic murine-pneumonia infection model. Proceedings of the 52nd Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, CA, , Abstract A-1271 (2012).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są opłacanymi pracownikami GlaxoSmithKline Pharmaceuticals i posiadają akcje firmy.

Aby uzyskać optymalny sukces w odtwarzaniu tego modelu infekcji, należy rozważyć następujące dodatkowe sugestie. Zjadliwość nowych izolatów można zwiększyć poprzez pasażowanie 2-3 razy in vivo przed zastosowaniem w badaniu. Zamrożone szczepy bakteryjne powinny być zawsze przygotowywane z pierwotnego źródła uzyskanego in vivo, z jak najmniejszą liczbą pasaży od oryginału, a ponowne zamrażanie lub ponowne użycie rozmrożonego wywaru jest odradzane. Wykorzystanie najnowszych izolatów klinicznych odzyskanych od pacjentów z zapaleniem płuc i/lub przygotowanie kultur w fazie logarytmicznej wzrostu może również pomóc w lepszym ustaleniu infekcji. Pięciokrotne rozcieńczenie do agaru (np. 2 ml zawiesiny soli dodanej do 8 ml agaru) może być użyte zamiast dziesięciokrotnego w celu zwiększenia inokulum bakteryjnego, a objętość inokulum można dostosować w zależności od wielkości zwierzęcia (np. 200 μl / zwierzę jest zwykle inokulowane u 250 g szczurów). Przed dodaniem zawiesiny bakteryjnej soli fizjologicznej do agaru (tj. na kroku 2.3), gęstość bakterii można przewidzieć lub oszacować za pomocą oględzin, wzorców MacFarlanda lub pomiarów gęstości optycznej. Pomocne jest zapoznanie się z charakterystyką wzrostu in vitro dla każdego izolatu przed przeprowadzeniem eksperymentów in vivo . Spójność w uprawie i obchodzeniu się z nimi umożliwia najdokładniejsze oszacowanie gęstości bakterii dla danego izolatu. Standardowe metody mikrobiologiczne, które różnią się od opisanych, takie jak alternatywne pożywki i homogenizatory tkankowe, mogą być stosowane odpowiednio do przygotowania inokulacji i liczenia bakterii z zakażonych tkanek.
Zdecydowanie zaleca się przygotowanie lub stopienie agaru dzień przed eksperymentem i przechowywanie go przez noc w oddzielnej łaźni wodnej ustawionej na 50 °C. Uprości to proces i pomoże zabezpieczyć agar przed zbyt wysoką temperaturą w momencie infekcji. Temperatura 41 - 42 °C zapewnia dobrą równowagę między utrzymaniem agaru w stanie ciekłym, bez bycia zbyt gorącym dla krótkotrwałego przetrwania bakterii. Jako możliwa alternatywa dla agaru odżywczego, agar szlachetny był z powodzeniem stosowany w niektórych eksperymentach. Jedna probówka inokulum agarowego jest zwykle wystarczająca na cały eksperyment (i jest zalecana), ale wiele probówek można przygotować do zakażenia dużej liczby zwierząt (np. więcej niż 60) lub gdy proces infekcji trwa dłużej niż 30 - 45 minut Jeśli wymaganych jest wiele probówek z inokulum, dodaj zawiesinę bakteryjną soli fizjologicznej do każdej probówki agaru, zgodnie z potrzebami. Zmniejsza to ryzyko, że długotrwała ekspozycja na podwyższoną temperaturę przed inokulacją wpłynie na przeżywalność i/lub kondycję bakterii. Należy zauważyć, że użycie wielu probówek z inokulum może również wymagać dodatkowych procedur randomizacji zwierząt. Jeśli to możliwe, należy zarazić wszystkie zwierzęta tym samym preparatem inokulum. Zaleca się dostosowanie wielkości eksperymentów do aktualnego poziomu zaawansowania w danej technice.
Wykwalifikowany naukowiec może zaintubować i zaszczepić zwierzę w czasie krótszym niż 30 sekund i zaszczepić do 5 - 6 zwierząt na partię (tj. za pomocą jednej strzykawki pełnej inokulum agarowego). Dla tych, którzy uczą się tej techniki, ważna jest szybkość, ponieważ agar zacznie krzepnąć; Jednak ważniejsze jest dokładne umieszczenie inokulum. Zacznij od 1 lub 2 zwierząt na partię i zwiększaj, gdy technika staje się bardziej znana. Zwierzęta kontynuują oddychanie podczas intubacji; Tak więc okno czasowe na zaszczepienie zależy od tego, jak szybko zwierzę wyzdrowieje po izofluranie, które powinno wynosić około 2 - 3 minut. Zwierzęta, które obudzą się podczas tego procesu, można ponownie znieczulić i spróbować po raz drugi, ale nie zaleca się tego wielokrotnie. Pomyślne zaszczepienie przy pierwszej próbie spodziewane jest u prawie 100% zwierząt po osiągnięciu biegłości. Zauważ, że łatwiej jest nauczyć się tej techniki najpierw na szczurach; Myszy są delikatniejsze, a mniejsze narzędzia są bardziej podatne na zablokowanie zestalonym agarem, jeśli nie są szybko manipulowane. Wstępne rozgrzanie strzykawek, rurki i soli fizjologicznej, a także utrzymywanie urządzenia do intubacji na ciepłej (nie gorącej) powierzchni, takiej jak poduszka grzewcza na niskim ustawieniu, może pomóc w zapobieganiu zestalaniu się agaru. Podczas nauki tej techniki pomocne jest również ćwiczenie prawidłowego umieszczania inokulum przy użyciu ciemnego barwnika (takiego jak skoncentrowany błękit metylenowy) zamiast zawiesiny bakteryjnej w agarze. Wykonaj procedurę zgodnie z opisem, ale poddaj zwierzę eutanazji natychmiast po zaszczepieniu barwnika (nie pozwalając zwierzęciu dojść do siebie między znieczuleniem a eutanazją). Przeanalizuj, aby określić, gdzie został umieszczony barwnik i odpowiednio dostosuj technikę.
Pierwszorzędowym punktem końcowym w tym modelu jest CFU z zakażonych płuc. Przeżywalność nie jest dobrym wskaźnikiem obciążenia bakteryjnego i nie jest zalecanym punktem końcowym. W badaniach skuteczności sugerowane N wynosi 5 - 6 zwierząt na grupę, ponieważ przewiduje się, że wykryje to różnice ≥1 log10 CFU między grupami o co najmniej 90% mocy. Zwierzęta mogą być zarażane w grupach, tak że koledzy z klatki pozostają razem lub można śledzić prawdziwy proces randomizacji. Należy zauważyć, że jeśli grupy są przypisane według klatki, grupy powinny być zakażone w losowej kolejności, przy czym grupa kontrolna wzrostu na końcu badania została zainfekowana jako ostatnia (w celu potwierdzenia, że czas wystawienia na działanie podwyższonej temperatury w łaźni wodnej nie miał wpływu na przeżycie/sprawność bakterii). Nie powinny być konieczne żadne metody cenzurowania danych i nie zaleca się ich stosowania, z wyjątkiem natychmiastowego usunięcia zwierzęcia, które zostało ewidentnie błędnie zaszczepione na początku badania (przed rozpoczęciem jakiegokolwiek leczenia). Zwierzęta, które zostały poddane eutanazji przed zakończeniem badania, powinny zostać poddane próbce, a wyniki powinny zostać włączone do zbioru danych, chyba że prospektywnie zidentyfikowano ważny powód wykluczenia (tj. zdarzenie niezwiązane z zakażeniem lub leczeniem). Przenoszenie leków może mieć wpływ na niektóre próbki i jest ważnym czynnikiem we wszystkich modelach zakażeń in vivo . Jeśli związek jest podawany często, blisko czasu eutanazji lub ma długi okres półtrwania, może być obecny w homogenacie tkankowym w wystarczająco wysokim stężeniu, aby kontynuować zabijanie bakterii ex vivo podczas procesu liczenia bakterii (rozcieńczanie i posiewanie próbek lub na płytkach agarowych podczas inkubacji przez noc). Aby temu zapobiec, przed homogenizacją do próbki można dodać węgiel aktywny i/lub dodatek, który rozkłada cząsteczkę czynną bez uszkadzania komórek bakteryjnych. Inne metody obejmują odwirowanie próbek w celu usunięcia większości związku aktywnego (który powinien pozostać w supernatancie) oraz zastosowanie różnych schematów rozcieńczania i powlekania w celu wystarczającego rozcieńczenia związku czynnego do stężenia niehamującego.
Jak pokazują przykłady przedstawione na rysunku 2, model ten skutecznie indukuje infekcje płuc u gryzoni z szeroką gamą organizmów, w tym takich, które nie rosną dobrze w innych modelach (np. H. influenzae). Infekcje te są spójne i powtarzalne, co zmniejsza prawdopodobieństwo, że eksperymenty będą musiały zostać powtórzone z powodu niepowodzenia modelu i/lub słabej wydajności z danym izolatem. Chociaż zwierzęta są immunokompetentne, nie są w stanie szybko rozwiązać infekcji, jeśli w ogóle. Pozwala to na zwiększenie elastyczności w długości badania, ponieważ wiele izolatów utrzymuje żywotną infekcję przez co najmniej 96 godzin bez konieczności wielokrotnego wstrzykiwania w celu utrzymania neutropenii. Potencjalne korzyści z badania skuteczności przeciwbakteryjnej u zwierząt immunokompetentnych zostały odnotowane wcześniej20, 21 i istnieją dowody na to, że w przypadku niektórych związków (np. oksazolidynonów) dane od gryzoni niebędących neutropenami mogą dokładniej przewidywać docelowe narażenie ludzi w porównaniu z tymi, którzy są neutropeniczni5. Wielofunkcyjna użyteczność modelu została przedstawiona na rysunkach 3 i 4 oraz w tabelach 1 i 2. Badania te są częścią dużego zbioru opublikowanych i niepublikowanych danych, które zostały wygenerowane za pomocą tego modelu w celu wsparcia wysiłków optymalizacyjnych16, 17, 22-24, w celu porównania i potwierdzenia proponowanych schematów dawkowania u ludzi19, 25-29 oraz w celu charakterystyki PK/PD18, 30-32. Chociaż model ten jest początkowo bardziej skomplikowany do przeprowadzenia w porównaniu z metodą inhalacji donosowej, istnieje wiele korzyści, jak opisano powyżej. Wraz z praktyką i rutynowym stosowaniem techniki powinny stać się proste do wykonania.
W niektórych badaniach można zauważyć, że obciążenie bakteryjne na początku badania było niższe niż zwykle docelowe w innych modelach infekcji płuc. Wynika to w dużej mierze z wymaganego rozcieńczenia do agaru i małej objętości prowokacyjnej, szczególnie u myszy. Należy jednak również zauważyć, że wzrost bakterii obserwowano we wszystkich przypadkach, nawet gdy początkowe obciążenie było stosunkowo niskie. Docelowe wyjściowe miano bakteryjne wynosi od 6 do 6,5 log10 CFU/płuca (6,8 do 7,3 log10 CFU/g tkanki u myszy na podstawie średniej masy płuc), co odpowiada gęstości oszacowanej u ludzi z ciężkim zapaleniem płuc33. Wyższe obciążenie wyjściowe można osiągnąć poprzez dalszą koncentrację inokulum bakteryjnego lub opóźnienie rozpoczęcia podawania związku, aby umożliwić dodatkowy wzrost bakterii; Jednak zbyt duże zwiększenie obciążenia prowokacyjnego może prowadzić do nienormalnie ciężkiej i ostrej choroby (tj. zgonu w czasie krótszym niż 24 godziny), która jest oporna na wszystkie leczenie przeciwbakteryjne niezależnie od wrażliwości. Chociaż inokulum jest początkowo umieszczane preferencyjnie w lewym płucu zwierzęcia, infekcja na ogół rozprzestrzenia się w obu płucach. Postępująca choroba płuc, rozprzestrzenianie się bakterii na inne narządy i ostateczna zachorowalność są często obserwowane w przypadku S. pneumoniae, K. pneumoniae i P. aeruginosa. Co ciekawe, zakażenia H. influenzae i A. baumannii są zwykle bardziej ograniczone i rzadko prowadzą do śmierci po podaniu przepisanej inokulacji bakteryjnej.
Wyniki skuteczności uzyskane za pomocą tego modelu dobrze korelowały z profilami wrażliwości in vitro, a także ze zdefiniowanymi celami PK/PD. Zmniejszenie obciążenia bakteryjnego jest rutynowo obserwowane w przypadku izolatów uznanych za podatne na badany czynnik, podczas gdy te uważane za oporne nie wykazują żadnych zmian ani wzrostu bakterii powyżej wartości wyjściowej16, 17, 19, 24-29. Badania na szczurach oceniające dwa chinolony i makrolid przy użyciu tego modelu32 wykazały, że docelowa wartość PK/PD wymagana do zmniejszenia liczby S. pneumoniae o 1 log10 w porównaniu z wartością wyjściową była skorelowana z wartością docelową określoną u myszy z neutropenami i, co ważniejsze, z celami klinicznymi dla bakteryjnego zapalenia płuc nabytego przez społeczność6, 7, 34, 35. Gepotydacyna, antybiotyk o nowym mechanizmie, została przetestowana przeciwko wielu S. pneumoniae i wymagała podobnego celu PK/PD dla zmniejszenia o 1 log10 w tym modelu infekcji płuc31, jak wymaganego dla zmniejszenia o 1 log10 w neutropenicznym modelu uda36, gdy uwzględniono penetrację płuc (dane w aktach). Podobnie, cele PK / PD określone u myszy dla GSK2251052 przeciwko P. aeruginosa były spójne dla zastoju, 1- i 2-log-10 redukcji CFU między tym modelem płuc30 a modelem neutropenicznego zakażenia uda, gdy rozważano penetrację płuc37, 38. Korelacja z modelem neutropenicznego zakażenia płuc przy użyciu inokulacji donosowej była słaba; Jednak w tym badaniu nie wywołało GSK2251052 więcej niż statyczną odpowiedź38. Może to być związane z wyższym poziomem inokulum bakteryjnego, które wynosiło 8 log10 CFU/mysz w porównaniu z 6 log10 CFU/mysz w neutropenicznych udach37 i intubacji dotchawiczej30. Gromadzenie takich danych ma kluczowe znaczenie dla analizy porównawczej, ponieważ umożliwia bezpośrednie porównanie z istniejącymi modelami i korelację z danymi klinicznymi w celu oceny zdolności predykcyjnych translacji. Szersze zastosowanie modelu intubacji dotchawiczej zakażenia płuc dostarczy dodatkowych danych do tego typu analiz.
Istnieje kilka ograniczeń tego immunokompetentnego modelu zapalenia płuc. Po pierwsze, nie nadaje się do oceny pojawienia się spontanicznej oporności, ponieważ wysoki poziom inokulum bakteryjnego zwykle wymagany do takich badań skutkuje zbyt ciężką infekcją. Po próbach osiągnięcia obciążenia bakteryjnego na poziomie 7 lub 8 log10 CFU na początku badania, zaobserwowano szybką zachorowalność (tj. zwierzęta umierające w czasie krótszym niż 24 godziny) pomimo dokładnego mycia inokulacji w celu usunięcia wcześniej istniejących toksyn (dane w aktach). Być może uda się przezwyciężyć ten problem za pomocą większych gryzoni. Szczury, zwłaszcza cięższe (> 250 g), wydają się lepiej tolerować wyższą dawkę szczepionki w porównaniu z myszami i mogą być odpowiednie do tego typu badań. Drugim ograniczeniem jest to, że stosowanie agaru jako wzmacniacza infekcji może wykluczać użycie modelu do oceny niektórych interakcji gospodarz-patogen. Uważa się, że agar zapewnia chroniony punkt ogniskowy do czasu pełnego ustabilizowania się infekcji w płucach. Możliwe jest dostarczenie inokulum w roztworze soli fizjologicznej, a nie w agarze w celu przezwyciężenia tego problemu; Należy jednak zauważyć, że spowoduje to zakażenie tylko niektórymi izolatami. Po trzecie, aby osiągnąć biegłość w tej technice, wymagana jest stroma krzywa uczenia się. Procedura może być delikatna, szczególnie u myszy. Łatwo jest omyłkowo umieścić metalową kaniulę w przełyku, a nadmierna siła może doprowadzić do przebicia przełyku lub tchawicy. Wymagane jest również ostrożne umieszczenie inokulum, w przeciwnym razie zwierzęta mogą albo nie wyzdrowieć, albo nie zostać odpowiednio zainfekowane. Jednak dzięki cierpliwości i wytrwałości można stać się bardzo biegłym i wykonać technikę szybko, płynnie i dokładnie.
Usuwając wymóg neutropenii, zwiększając odporność i odtwarzalność, umożliwiając badaczom badanie większej liczby patogenów i izolatów, poprawiając elastyczność projektu eksperymentalnego i zapewniając trudną infekcję do scharakteryzowania farmakodynamiki zapalenia płuc, ten immunokompetentny model infekcji płuc stanowi istotną wartość dodaną dla społeczności zajmującej się odkrywaniem antybiotyków. Zwiększone wykorzystanie tego modelu przez dodatkowych badaczy pomoże w zapewnieniu niezbędnej analizy porównawczej, aby zyskał on szerszą akceptację i nadal dostarczał informacji pomocniczych dla właściwej interpretacji.

Ocena skuteczności potencjalnych kandydatów na leki w zwierzęcych modelach infekcji jest kluczowym elementem procesu odkrywania leków przeciwbakteryjnych. Badania skuteczności in vivo dostarczają ważnych danych do podejmowania decyzji w całym okresie prac odkrywczych, począwszy od wyjaśnienia zależności struktura-aktywność (SAR) i optymalizacji serii ołowiowych substancji chemicznych, poprzez określenie charakterystyki farmakokinetycznej i farmakodynamicznej (PK/PD) związków oraz wsparcie w doborze dawki do rozwoju klinicznego i zatwierdzenia przez organy regulacyjne. W tym celu w literaturze opisano liczne modele zakażeń zwierzęcych. Jednym z najczęstszych i najszerzej stosowanych modeli jest neutropeniczne zakażenie uda myszy, które zostało zapoczątkowane przez Eagle1, 2, a później rozszerzone przez Vogelmana i Craiga3, 4. Model ten okazał się nieoceniony w określaniu punktów granicznych podatności bakterii oraz w dostarczaniu celów farmakokinekicznych/farmakokinetycznych, które pomagają w dawkowaniu u ludzi. Istnieje wiele przykładów, w których zdolność predykcyjna tego modelu została udowodniona4-7. Jednak jedną z wad modelu infekcji uda jest brak bezpośredniego związku z infekcjami płuc. Obecnie kładzie się większy nacisk na dopasowanie miejsca infekcji w modelach zwierzęcych do miejsca infekcji u ludzi; W związku z tym, aby badać związki stosowane w leczeniu zapalenia płuc, idealnie jest wykorzystać model infekcji płuc u zwierząt.
Kilka metod wywoływania infekcji płuc u zwierząt laboratoryjnych zostało opisanych i wykorzystanych do badań skuteczności przeciwbakteryjnej, w tym inhalacja donosowa, aspiracja drogą ustno-gardłową, ekspozycja na aerozol i chirurgiczne inokulowanie dotchawicze8. W wielu przypadkach zwierzęta (zwłaszcza myszy) muszą najpierw zostać poddane działaniu neutropenii, aby uzyskać silną infekcję płuc. Pomimo tego poważnie obniżonego stanu odporności, liczba patogenów i szczepów bakteryjnych, które wywołują żywe infekcje u gryzoni, jest ograniczona. Na przykład skuteczne wykrycie Haemophilus influenzae lub Acinetobacter baumannii w modelachzapalenia płuc 9, 10 może być trudne, a nawet bardziej zjadliwe patogeny, takie jak Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i Klebsiella pneumoniae, mogą stanowić wyzwanie 11-13.
W 1991 roku Smith opisał model infekcji płuc u immunokompetentnych szczurów odsadzonych, u którego infekcja była ustalana przez wszczepienie bakterii bezpośrednio do płuc za pomocą prostej, niechirurgicznej metody intubacji dotchawiczej14. Jagoda i wsp. Później zmodyfikowano metodę infekowania myszy15. Stosując inokulum na bazie agaru, ta technika inokulacji wywołuje silne infekcje płuc zarówno u immunokompetentnych szczurów, jak i myszy z S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa i A. baumannii. Jest podatny na szeroki zakres izolatów, w tym te, które zawierają różne determinanty oporności i te, które nie wywołują żywej infekcji innymi drogami inokulacji. Pozwala również na określenie skuteczności u zwierząt immunokompetentnych, co jest bardziej istotne niż tradycyjny neutropeniczny model myszy dla populacji pacjentów, którzy nie mają poważnie obniżonej odporności. Spójność i niezawodność tego modelu w odniesieniu do wielu patogenów i izolatów sprawia, że doskonale nadaje się on do badań nad skutecznością przeciwbakteryjną.

<table><tbody><tr><td>TSA II Tryptikaza Agar sojowy z 5% krwią owczą</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>4321261</td><td></td></tr><tr><td>Chocolate II Agar</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>4321267</td><td></td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion Modified</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>299070</td><td></td></tr><tr><td>BBL Tryptikaza Rosół sojowy z 20% glicerolem</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>297808</td><td>nośniki do przechowywania zamrożony bulion</td></tr><tr><td>Pętla inokulacyjna</td><td>Nunc</td><td>251586</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Chlorek sodu, USP</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>NDC 0338-0048-04</td><td></td></tr><tr><td>Difco Nutrient Agar</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>213000</td><td></td></tr><tr><td>30 ml wolnostojąca probówka wirówkowa z nakrętką</td><td>EverGreen Scientific</td><td>222-3530-G80</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polipropylenowa rurka stożkowa 30 x 115 mm</td><td>Falcon, marka Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>14 ml polipropylenowa rurka z okrągłym dnem 17 x 100 mm</td><td>Falcon, narzędzie przewodnika</td><td>352059 marki</td><td></td>Corning</tr><tr><td></td><td>Intek Services Ltd</td><td>GT01</td><td>wykonana na zamówienie metalowa kaniula dla szczurów</td></tr><tr><td>90' rurka Portex</td><td>SAI</td><td>POR-080-100</td><td>plastikowa kaniula dla szczurów</td></tr><tr><td>1 ml TB końcówka strzykawki</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Igła PrecisionGlide 25 G x 5/8</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Igła do karmienia zwierząt - prosta 20 x 3" 2-1/4</td><td>Popper and Sons, Inc</td><td>7903</td><td>służąca do tworzenia metalowej kaniuli dla myszy</td></tr><tr><td>Rurki polietylenowe Intramedic</td><td>marki Clay Adams - Becton Dickinson and Company</td><td>427401</td><td>plastikowa kaniula do myszy&nbsp;</td></tr><tr><td>75 TN 5.0 i mikro; Strzykawka L 26s/2"/2</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>Szklana strzykawka iniekcyjna HPLC</td></tr><tr><td>Rurka Pyrex, zakrętka do hodowli 25x150 z gumową wkładką</td><td>Corning</td><td>9825-25</td><td>do autoklawu/przechowywania kaniul metalowych</td></tr><tr><td>70% alkohol izopropylowy</td><td>Vi-Jon (Swan)</td><td>NDC 0869-0810-43</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran, USP</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NDC 66794-013-10</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher&nbsp;</td><td>Seward</td><td>Stomacher80</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 klasycznych torebek</td><td>Seward</td><td>BA6040</td><td></td></tr><tr><td>Płytka testowa, 96 dołków, okrągłe dno</td><td>Costar, Corning Inc</td><td>3795</td><td>opcjonalnie, do seryjnego rozcieńczania</td></tr><tr><td>Blood Omni Plates</td><td>Hardy</td><td>#A127</td><td>opcjonalnie, prostokątne płytki krwinkowe</td></tr></tbody></table>

solidny model zapalenia płuc u immunokompetentnych gryzoni w celu oceny skuteczności przeciwbakteryjnej przeciwko s. pneumoniae, h. influenzae, k. pneumoniae, p. aeruginosa lub a. baumannii

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Skuteczność potencjalnych terapii przeciwbakteryjnych musi być wykazana na zwierzęcych modelach infekcji jako część procesu odkrywania i rozwoju, najlepiej w modelach, które naśladują zamierzone wskazania kliniczne. Opisano metodę wywoływania silnych zakażeń płuc u immunokompetentnych szczurów i myszy, która pozwala na ocenę leczenia w modelu poważnego zapalenia płuc wywołanego przez S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae lub A. baumannii. Zwierzęta są znieczulane, a inokulum na bazie agaru jest umieszczane głęboko w płucach poprzez niechirurgiczną intubację dotchawiczą. Powstała infekcja jest spójna, powtarzalna i stabilna przez co najmniej 48 godzin i do 96 godzin w przypadku większości izolatów. Badania z dostępnymi do obrotu lekami przeciwbakteryjnymi wykazały dobrą korelację między skutecznością in vivo a podatnością in vitro oraz zaobserwowano zgodność między celami farmakokinekicznymi/farmakodynamicznymi określonymi w tym modelu a klinicznie akceptowanymi celami. Chociaż nauka techniki wymaga początkowej inwestycji czasu, można ją wykonać szybko i efektywnie po osiągnięciu biegłości. Korzyści płynące z modelu obejmują wyeliminowanie wymogu neutropenicznego, zwiększenie odporności i odtwarzalności, możliwość badania większej liczby patogenów i izolatów, poprawę elastyczności w projektowaniu badań oraz ustalenie trudnej infekcji u immunokompetentnego gospodarza.

Opisano metodę wykrywania infekcji płuc u gryzoni immunokompetentnych. Przy wprawdzie metodę tę można szybko i łatwo przeprowadzić w celu wywołania stabilnego zakażenia wieloma izolatami S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae i A. baumannii.

Solidny model zapalenia płuc u immunokompetentnych gryzoni w celu oceny skuteczności przeciwbakteryjnej przeciwko S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Ogólnym celem tej niechirurgicznej procedury zakażenia śródoskrzelowego jest ustalenie silnego bakteryjnego zapalenia płuc u gryzoni immunokompetentnych. Metoda ta stanowi wartość dodaną dla odkrywania i opracowywania środków przeciwbakteryjnych, umożliwiając ocenę skuteczności potencjalnych metod leczenia w immunokompetentnym modelu ciężkiego zapalenia płuc. Główną zaletą tej techniki jest to, że ustanawia ona solidną i powtarzalną infekcję płuc za pomocą wielu izolatów, w tym tych, które zwykle wymagają neutropenii zwierząt lub izolatów, które nie wywołują żywej infekcji innymi metodami.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej procedurze, będą miały trudności. Właściwa intubacja to ślepa procedura, która wymaga nauczenia się prawidłowego czucia do intubacji tchawicy zamiast przełyku. Właściwa intubacja jest inna dla każdego naukowca.Dokładny kąt nachylenia kaniuli może nie być taki sam dla wszystkich. Kluczem jest wyczucie grzbietów tchawicy. Technikę tę zademonstruje Cindy Mininger, naukowiec z naszego laboratorium.Na początek przygotuj zawiesiny bakteryjne soli fizjologicznej z nocnych kultur bulionowych, jak wskazano w protokole tekstowym, lub z płytek agarowych, jak pokazano tutaj. Zbierz nocny wzrost z płytek agarowych, używając sterylnej pętli do zeskrobywania kolonii z powierzchni. Przenieś zebrany materiał do pięciu mililitrów sterylnego roztworu soli fizjologicznej, aż do uzyskania mętnej, nieprzezroczystej zawiesiny i delikatnie wiruj kulturę, aż będzie jednorodna.Następnie rozcieńczyć seryjnie i z każdego rozcieńczenia nanieść na płytkę podwielokrotność zgodnie z protokołem tekstowym. Po przygotowaniu agaru i zgromadzeniu narzędzi niezbędnych do procesu infekcji, zgodnie z protokołem tekstowym, podwielokrotność dziewięciu mililitrów agaru do sterylnej probówki, a następnie umieszczenie probówki w łaźni wodnej, aż agar zrównoważy się do około 42 stopni Celsjusza. Dodaj jeden mililitr wcześniej przygotowanej zawiesiny bakteryjnej soli fizjologicznej do probówki agarowej.Następnie odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać i wrzucić ją z powrotem do wody. Umieść czystą, jednorazową matę na powierzchni roboczej w pobliżu łaźni wodnej. Aby przygotować powierzchnię roboczą i urządzenie do intubacji, najpierw wysterylizuj metalową kaniulę i rurkę polietylenową zgodnie z protokołem tekstowym, a następnie przenieś je w szklanej rurce do przechowywania na powierzchnię roboczą.Następnie zdejmij nasadkę z rurki do przechowywania i wsuń koniec uchwytu kaniuli do otwartego końca tuby. Za pomocą sterylnych kleszczy wyjmij jeden odcinek rurki polietylenowej ze zlewki i włóż ją przez wnętrze sterylnej metalowej kaniuli, upewniając się, że porusza się swobodnie. Umieść znak prowadzący w określonym miejscu za pomocą nieusuwalnego pisaka.Następnie załóż sterylną jednorazową igłę o rozmiarze 25 na wolnym końcu rurki polietylenowej, wsuwając igłę na kilka milimetrów do rurki. Następnie użyj sterylnego soli fizjologicznej, aby napełnić świeżą jednorazową strzykawkę o pojemności jednego mililitra. Przymocować strzykawkę do igły umieszczonej na rurki polietylenowej i przepłukać całą objętość soli fizjologicznej przez rurkę.Wyrzuć zużytą strzykawkę do pojemnika na ostre przedmioty. Następnie napełnij nową sterylną jednorazową strzykawkę o pojemności jednego mililitra inokulum na bazie agaru z łaźni wodnej. Ponownie zamocuj igłę i rurkę o rozmiarze 25 i przepłucz agar przez rurkę, naciskając tłok tylko do momentu, gdy rurka zostanie całkowicie wypełniona agarem.Po znieczuleniu szczura zgodnie z protokołem tekstowym należy ułożyć zwierzę w pozycji leżącej na jednorazowej macie z głową skierowaną w prawo i ogonem skierowanym w lewo. Następnie włóż wolny koniec metalowej kaniuli do pyska zwierzęcia. Obróć kaniulę tak, aby wolny koniec był ustawiony pod kątem do góry i delikatnie wsuń ją do tchawicy, ostrożnie omijając struktury krtani lekkim ruchem skręcającym.Potwierdź wprowadzenie do tchawicy, a nie do przełyku, delikatnie przesuwając kaniulę lekko do przodu i do tyłu kilka razy, jednocześnie dotykając pierścieni tchawicy lewym palcem wskazującym. Aby zapewnić intubację do tchawicy, a nie do przełyku, przesuń lekko kaniulę do przodu i do tyłu i wyczuj grzbiety. Jeśli kaniula gładko przesuwa się w dół gardła, a wypukłości nie są wyczuwalne, wyjmij urządzenie i spróbuj ponownie.Gdy kaniula dotrze do rozwidlenia, w którym tchawica rozdziela się na lewe i prawe oskrzela, wykonaj lekki ruch skręcający w kierunku lewej strony zwierzęcia, aby upewnić się, że kaniula została wprowadzona do lewego oskrzela. Częstym błędem jest nieumieszczanie szczepionki wystarczająco głęboko w płucach, co może blokować drogi oddechowe i utrudniać oddychanie. Gdy kaniula zostanie obrócona pod odpowiednim kątem, powinna łatwo wsunąć się w lewe oskrzela i płynnie przesuwać się na odpowiednią głębokość.Przesuń metalową kaniulę do połowy, aż koniec znajdzie się w połowie do trzech czwartych w dół lewego płuca, używając wcześniej umieszczonego znacznika prowadzącego, aby potwierdzić, że osiągnięto odpowiednią głębokość. Po założeniu metalowej kaniuli przesuń rurkę polietylenową o kilka milimetrów, korzystając z wcześniej umieszczonego znaku prowadzącego na rurce, aby upewnić się, że jest ona wysunięta tylko na tyle daleko, aby wyjść z końca metalowej kaniuli i nie przebić płuca. Po założeniu obu kaniul użyj dołączonej strzykawki, aby wkroplić 100 mikrolitrów zawiesiny agarowej głęboko do dużego płata lewego płuca.Pobrać kilka milimetrów rurki i delikatnie wyjąć nienaruszone urządzenie do intubacji. Umieść go z powrotem w szklanej tubie do przechowywania i przenieś zwierzę do nowej klatki, aby wyzdrowiało. Przygotuj powierzchnię roboczą i kaniulę, jak właśnie pokazano dla szczurów, używając sprzętu o odpowiedniej wielkości dla myszy.Użyj sterylnej jednorazowej strzykawki o pojemności 1 mililitra i sterylnej igły o rozmiarze 25, aby napełnić szklaną strzykawkę do mikroiniekcji sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Następnie przepłucz sól fizjologiczną przez ponownie zmontowane urządzenie. Następnie użyj nowej sterylnej jednorazowej strzykawki o pojemności jednego mililitra i sterylnej igły o rozmiarze 25, aby napełnić strzykawkę do mikroiniekcji inokulum agarowym.Następnie ponownie zmontuj urządzenie i przepłucz agar przez rurkę, aż rurka zostanie całkowicie wypełniona agarem. Po znieczuleniu myszy zgodnie z protokołem tekstowym, ustaw zwierzę w tej samej orientacji, jak pokazano dla szczura, i użyj stałego, ale delikatnego nacisku, aby zaintubować tchawicę w podobny sposób, jak w przypadku szczura. Unikaj używania siły, ponieważ technika jest bardziej delikatna u myszy.Upewnij się, że kaniula została włożona do tchawicy, wyczuwając pierścienie tchawicy. Lekko obrócić i wsunąć kaniulę do lewego oskrzela, wprowadzając ją głęboko do płuca za pomocą wcześniej umieszczonych znaków prowadzących. Po założeniu metalowej kaniuli przesuń rurkę polietylenową o kilka milimetrów i wlej 20 mikrolitrów zawiesiny agarowej.Pokazany tutaj jest reprezentatywny przykład kolonii rosnących na płytce agarowej po seryjnym rozcieńczeniu i trzykrotnym posiewie próbki homogenatu płucnego. Jak wykazano na tym wykresie w przypadku S. pneumoniae, wzrost obciążenia bakteryjnego kilkoma jednostkami o podstawie dziesięciu jtk powyżej wyjściowej kontroli jest zwykle obserwowany w zakażonych płucach w przypadku większości izolatów bakteryjnych, nawet po 96 godzinach od zakażenia, a zmienność między zwierzętami jest niska. W tym eksperymencie dwa związki oceniano pod kątem wrażliwych lub opornych na chinolony izolatów S.pneumoniae, aby zilustrować, że ten model infekcji płuc może być wykorzystany podczas optymalizacji serii ołowiu chemicznego w celu wspierania zależności aktywności struktury.Każdy symbol reprezentuje CFU wyznaczone na podstawie płuc jednego szczura. Poniżej przedstawiono modele E max stworzone na podstawie danych dotyczących skuteczności w zakresie dawek u myszy immunokompetentnych zakażonych w płucach izolatami S.pneumoniae lub H.influenzae w celu określenia celów farmakokinetycznych i farmakodynamicznych dla nowego inhibitora deformylazy polipeptydowej. Kręgi reprezentują średnie obciążenie bakteryjne od czterech do pięciu myszy na grupę leczoną różnymi dawkami związku.Otwarte okręgi reprezentują wolny obszar pod krzywą, a wypełnione okręgi reprezentują obszar pod krzywą stężenia w czasie powyżej minimalnego stężenia hamującego. Po opanowaniu, technika ta może być wykonana w około 30 sekund na zwierzę, przy czym na strzykawkę z inokulum agarowym szczepi się do pięciu lub sześciu zwierząt. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać tę niechirurgiczną metodę infekcji śródoskrzelowej i być w stanie wykorzystać ją do ustalenia infekcji płuc za pomocą wielu różnych izolatów bakteryjnych.Instrument energetyczny

a-robust-pneumonia-model-immunocompetent-rodents-to-evaluate

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Lenhard, A. i in. Model myszy przedstawiający przejście Streptococcus pneumoniae z kolonizatora do patogena po współinfekcji wirusowej powtarza chorobę zaostrzoną przez wiek. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje model współinfekcji myszy, w którym wirus grypy wywołuje przejście Streptococcus pneumoniae z kolonizatora do patogenu. Opisuje etapy związane z kolonizacją bakteryjną, infekcją wirusową i postępem choroby.

Model myszy do badania patogennej przejścia paciorkowca pneumoniae po współinfekcji wirusowej

Ten film pokazuje proces powstawania infekcji płuc u immunokompetentnego modelu gryzoni poprzez intubację i instalację zawiesin bakteryjnych w płatach płuc. Model ten umożliwia badania skuteczności przeciwbakteryjnej u zwierząt immunokompetentnych.

Wkraplanie dooskrzelowe Streptococcus pneumoniae w immunokompetentnych modelach gryzoni

Śledzenie w czasie rzeczywistym wpływu czynników wirulencji pneumokoków w modelu ostrego mysiego zapalenia płuc z wykorzystaniem bakterii bioluminescencyjnych

Opracowaliśmy model uszkodzenia płuc myszy poprzez wstrzyknięcie do tchawicy bakterii Pseudomonas aeruginosa. Model ten naśladuje uszkodzenie płuc podczas zapalenia płuc i ma znaczenie kliniczne.

Pseudomonas aeruginosa Model indukowanego uszkodzenia płuc

W literaturze opisano kilka metod modelowania bakteryjnego zapalenia płuc u myszy. W niniejszym artykule opisano nieinwazyjną, niedrogą i szybką metodę wywoływania zapalenia płuc poprzez aspirację (tj. wdychanie) inokulum bakteryjnego pipetowanego do jamy ustnej i gardła. Szczegółowo opisano również dalsze metody oceny wrodzonej odpowiedzi immunologicznej płuc.

Nieinwazyjna i technicznie nieintensywna metoda indukcji i fenotypowania eksperymentalnego bakteryjnego zapalenia płuc u myszy

Zakaźne zapalenie płuc jest jedną z najczęstszych infekcji u ludzi. Odpowiedni model in vivo ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia patogenezy choroby i testowania skuteczności nowych terapii. Dzięki temu mysiemu modelowi aspiracyjnego zapalenia płuc w jamie ustnej i gardle można zbadać patogenezę i nowe metody leczenia tych śmiertelnych infekcji.

Mysi model aspiracji jamy ustnej i gardła bakteryjnego zapalenia płuc związanego z respiratorem i nabytego w szpitalu

Tutaj prezentujemy metody poprawy badań nad wtórnym bakteryjnym zapaleniem płuc poprzez zapewnienie nieinwazyjnej drogi wkraplania do dolnych dróg oddechowych, po której następuje odzyskiwanie patogenów i analiza transkryptów. Zabiegi te są powtarzalne i mogą być wykonywane bez specjalistycznego sprzętu, takiego jak kaniule, druty doprowadzające czy światłowodowe.

Precyzyjny system dostarczania i odzyskiwania patogenów dla mysich modeli wtórnego bakteryjnego zapalenia płuc

Ten manuskrypt opisuje stworzenie zakaźnego modelu zapalenia płuc u myszy i odpowiednią charakterystykę leczenia urazów wraz z metodami hodowli bakterii i wkraplania dotchawiczego. Opisano również nowatorskie podejście wykorzystujące wysokowymiarową cytometrię przepływową do oceny krajobrazu immunologicznego.

Eksperymentalny model do oceny ustąpienia zapalenia płuc

Ten artykuł opisuje nowy model myszy do przejścia pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora w patogen chorobotwórczy podczas infekcji wirusowej. Model ten można łatwo zaadaptować do badania interakcji wielodrobnoustrojowych i gospodarz-patogen w różnych fazach progresji choroby i u różnych gospodarzy.

Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem

Myszy są ogólnie odporne na infekcje Mycobacterium abscessus, co komplikuje odkrycie i opracowanie bardzo potrzebnych antybiotyków przeciwko infekcjom płuc. W tym miejscu opisujemy metodę przygotowania inokulum i zakażenia dotchawiczego, która, jak wykazano, zapewnia trwałą infekcję u myszy immunokompetentnych.

Przygotowanie Mycobacterium abscessus osadzonego w paciorkach agarowych w celu śródtchawiczego inokulacji myszy immunokompetentnych

Tu przedstawiamy protokół do ustanowienia modelu immunosupresji z powodu wstrzyknięcia Klebsiella pneumoniae do nosa u myszy i zweryfikowaliśmy model za pomocą różnych wskaźników.

Ustanowienie modelu immunosupresji wywołanej przez sepsy u myszy poprzez wewnątrznosowe wprowadzanie bakterii

Poznaj niechirurgiczną metodę infekcji oskrzelowej w celu wywołania zapalenia płuc u gryzoni immunokompetentnych. Ta technika umożliwia ocenę skuteczności terapii przeciwbakteryjnych w modelu ciężkiej pneumonii.

Solidny model zapalenia płuc u immunokompetentnych gryzoni w celu oceny skuteczności przeciwbakteryjnej przeciwko S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii (Wideo) | JoVE Journal

Solidny model zapalenia płuc u immunokompetentnych gryzoni w celu oceny skuteczności przeciwbakteryjnej przeciwko S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa lub A. baumannii

Przeglądaj więcej filmów