Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie komórek iPS z dorosłych ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu nieintegrujących wektorów episomalnych. Protokół ten może pomóc naukowcom zajmującym się komórkami macierzystymi, którzy chcą generować komórki iPS do monitorowania chorób, badań przesiewowych leków i regularnej medycyny radiowej. Nasz protokół przeprogramowania jest bardzo prosty, a jednocześnie bardzo wydajny.

Postępując zgodnie z tą procedurą, można łatwo opanować technikę przeprogramowywania komórek krwi. Jakość plazmy jest równie ważna dla udanego przeprogramowania. Zanieczyszczenia mogą zmniejszać wydajność przeprogramowywania, dlatego zalecamy stosowanie zestawów Endofree do oczyszczania plazmidów episomalnych.

Komórki iPS są bardziej kruche niż inne komórki. Przygotowanie komórek do przyjęcia więcej niż jednego genu podczas przechodzenia może wywołać masową śmierć komórki, w szczególności we wczesnych fazach przejścia. Aby rozpocząć tę procedurę, przygotuj wszystkie wymagane podłoża hodowlane zgodnie z dołączonym manuskryptem.

Następnie połącz 10 ml świeżej próbki PB i dziesięć ml buforu PBS w probówce o pojemności 50 ml i dobrze wymieszaj. Przed użyciem doprowadzić PBS do temperatury pokojowej lub 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 10 ml figolu na dno probówki.

Proces ten należy przeprowadzać powoli, aby upewnić się, że warstwa fikolu nie zmiesza się z PB. Odwirować mieszaninę przy 400 x g przez 30 minut z małym przyspieszaniem i zwalnianiem. Po odwirowaniu PB MNC znajdują się w białej warstwie znajdującej się między plazmą PB a filelem. Powoli odessać 10 ml osocza PB bez naruszania warstwy figlu buff.

Następnie ostrożnie zbierz białą warstwę do nowej probówki o pojemności 50 ml. Całkowita objętość pobranych komórek z białej warstwy powinna wynosić około trzech do sześciu ml. Następnie dodaj PBS, aby uzyskać całkowitą objętość do 30 ml i dobrze wymieszaj.

Następnie odwirować próbkę o masie 400 x g przez dziesięć minut. Po dziesięciu minutach usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 ml pożywki hodowlanej. Dobrze wymieszać i odwirować próbkę o stężeniu 400 x g przez pięć minut, aby usunąć większość płytek krwi.

Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w jednym do dwóch ml IMDM. Komórki mogą być wykorzystane do natychmiastowej hodowli lub zamrożone do późniejszego wykorzystania. W celu krioprezerwacji dodaj równą ilość podłoża do krioprezerwacji.

Podziel komórki na kriowiale i natychmiast przenieś je do zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza. W tej procedurze należy przygotować pięć ml pożywki IMDM w probówce o pojemności 15 ml. Szybko rozmrozić zamrożone PB MNC w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przed przeniesieniem ich do probówki z podłożem IMDM.

Odwirować próbkę o masie 400 x g przez pięć do dziesięciu minut. Następnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce erytroidalnej. Następnie policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru.

Następnie hodowlę PB MNC w kulturze nietkankowej potraktowano sześciodołkową płytkę dwoma ml pożywki na dołek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Jednego dnia trzeciego i piątego dodaj jeden ml świeżej pożywki erytroidalnej bezpośrednio do każdej studzienki bez zmiany pożywki. Szóstego dnia zbierz PB MNC do nukleofekcji.

Na dzień przed nukleofekcją należy wstępnie pokryć sześciodołkową płytkę potraktowaną 0,1% żelatyną w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut. Rozmrozić inaktywowane komórki zasilające MEF w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i natychmiast przenieść je do probówki o pojemności 15 ml zawierającej pięć ml pożywki MEF. Następnie odwirować je przy 400 x g przez pięć minut i usunąć supernatant.

Następnie usuń żelatynę z płytki sześciodołkowej i ponownie zawieś osad komórek w pożywce MEF. Następnie wysiewaj inaktywowane komórki MEF w dwóch ml pożywki MEF w każdym dołku wstępnie potraktowanej żelatyny na sześciodołkowej płytce i hoduj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla. W dniu nukleofekcji odessać pożywkę MEF i zastąpić ją jednym ml pożywki erytroidalnej.

Następnie wstępnie zrównoważyć płytkę hodowlaną przez 10-30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nawilżanym 5% dwutlenkiem węgla. Dodaj dwa mikrogramy PEV OCT4 do Sox2, jeden mikrogram PEV MYC, jeden mikrogram PEV KLF4 i 0,5 mikrograma PEV Bcl-XL do sterylnej probówki o pojemności 1,5 ml. Podgrzej probówkę w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby zapobiec zanieczyszczeniu, a następnie schłodzić ją do temperatury pokojowej.

Następnie dodaj 57 mikrolitrów buforu nukleofekcji i 13 mikrolitrów buforu suplementu do próbki. Zebrać dwa razy dziesięć do szóstych kultur PBMNC do probówki o pojemności pięciu ml przez odwirowanie przy 200 x g przez siedem minut. Następnie usuń supernatant i dodaj mieszaninę plazmidu i buforu nukleofekcji do osadu komórkowego.

Następnie dobrze wymieszaj, przesuwając tubkę palcem. Następnie przenieś DNA w zawiesinie komórek do kuwety dostarczonej przez zestaw i zakryj kuwetę. Wybierz program U-008 na urządzeniu nukleofekcyjnym.

Następnie włóż kuwetę do uchwytu i naciśnij OK. Następnie wyjmij kuwetę z uchwytu. Dodaj 0,5-1 ml wstępnie podgrzanej pożywki erytroidalnej do każdej kuwety i natychmiast przenieś komórki na wstępnie zrównoważoną płytkę MEF. W przypadku niektórych próbek można uzyskać tysiące kolonii z jednego miliona krwi.

Jeśli chcesz wybrać pojedynczą kolonię do dalszej hodowli, może być konieczne wysianie jednej dodatkowej studni z zaledwie 1 milionem komórek. Tuż przed umieszczeniem komory hipoksji w inkubatorze delikatnie obróć komorę kilka razy, aby uzyskać równomierny rozkład komórek w dołkach hodowlanych. Następnie przenieś płytkę do komory hipoksji.

Przepłukuj komorę zmieszanym gazem przez jedną do dwóch minut z szybkością 20 litrów na minutę. Następnie zamknij komorę i pohoduj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. W drugim dniu po nukleofekcji dodaj dwa ml pożywki iPSC bezpośrednio do każdej studzienki.

W czwartym dniu po nukleofekcji usunąć trzy ml pożywki i dodać dwa ml świeżej pożywki iPSC. Na tym etapie większość żywych komórek przyczepiła się do warstwy zasilającej. Po szóstym dniu po nukleofekcji zmieniaj pożywkę co dwa dni, pozostawiając 500 mikrolitrów zużytej pożywki i dodając dwa ml świeżej pożywki E8 uzupełnionej 0,25 milimolowym maślanem sodu do dni 14-18.

Pokazany tutaj jest schemat protokołu przeprogramowania komórek krwi obwodowej. To zdjęcie pokazuje AP stojącego w misce, a to pokazuje typową kolonię iPSC podobną do ESC w 14 dniu po nukleofekcji PB MNCs. Poniżej znajdują się reprezentatywne diagramy FACS iPSC w przejściu piątym wyrażające TRA-1-60 lub SSEA4.

Oto reprezentatywne obrazy konfokalne kolonii iPSC z ekspresją NANOG i OCT4. Przedstawione zdjęcia pokazują barwienie H&E terratomy, obejmującego wszystkie trzy listki zarodkowe. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować wolne od integracji komórki iPS z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej.

Po opanowaniu można wygenerować duże ilości komórek iPS w ciągu trzech tygodni, więc czas pracy będzie krótszy niż trzy godziny. Opracowaliśmy prosty, episomalny system wektorowy do skutecznego przeprogramowywania komórek krwi. Wierzymy, że ten przystępny cenowo system może być łatwo przyjęty, w szczególności w małych laboratoriach o ograniczonych zasobach.

Nie zapominaj, że praca z ludzką krwią i osoczem może być niebezpieczna i należy podjąć środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych podczas wykonywania tej procedury.