Name: Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych bez integracji. Protokół umożliwia uzyskanie tysięcy kolonii iPSC z 1 mL krwi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Ministerstwo Nauki i Technologii Chin (2015CB964902, 2013CB966902 i 2012CB966601), Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (81500148, 81570164 i 81421002), grant GCAT Loma Linda University School of Medicine (2015) oraz Centrum Badań Telemedycyny i Zaawansowanych Technologii (W81XWH-08-1-0697).

Wszystkie próbki ludzkiego PB zostały pobrane od anonimowych dorosłych dawców bez dostępnych informacji identyfikacyjnych z Centrum Krwi w Tianjin za zgodą lokalnej komisji etyki badań.
1. Preparat plazmidu bez endo-free
<ol>
	<li>Użyj komercyjnego zestawu Plasmid Purification Maxi Kit, aby wyekstrahować wektory episomalne z E. coli zgodnie z protokołem producenta. W ostatnim kroku zastąp bufor TE sterylną wodą wolną od endotoksyn, aby rozpuścić osad DNA.</li>
	<li>Zmierz stężenie DNA za pomocą komercyjnego spektrofotometru UV/Vis. Stężenie jest zwykle większe niż 1 μg/μL, przy czym proporcje A260/A280 i A260/A230 są odpowiednio większe niż 1,8 i 2,0.</li>
</ol>
2. Pożywki hodowlane
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę erytroidalną: Pożywkę do eksplagowania hematopoetycznych komórek macierzystych uzupełnioną 100 ng/ml ludzkiego czynnika komórek macierzystych (SCF), 10 ng/ml interleukiny-3 (IL3), 2 U/ml erytropoetyny (EPO), 20 ng/ml insulinowego czynnika wzrostu-1 (IGF1), 1 μM deksametazonu i 0,2 mM 1-tioglicerolu. Filtr sterylizować za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Pożywka erytroidalna może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
	<li>Przygotuj pożywkę iPSC: pożywka DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) uzupełniona 1x L-glutaminą, 1x penicyliną/streptomycyną, 1x roztworem aminokwasów endogennych, 50 ng/ml czynnika wzrostu fibroblastów 2 (FGF2), 1x suplementem insuliny-transferyny-seleninu (ITS) i 50 mg/ml kwasu askorbinowego. Filtr sterylizować za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Pożywka iPSC może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.</li>
	<li>Przygotowanie pożywki MEF: Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco (DMEM; wysoki poziom glukozy) uzupełniony o 1x penicylinę/streptomycynę i 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS). Filtr sterylizować za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Pożywka MEF może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca lub świeżo dodać 1x L-glutaminę przed użyciem.</li>
	<li>Przygotowanie pożywki do kriokonserwacji iPSC (2x): Rozpuścić 5 g D-trehalozy w 30 ml sterylnej wody w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Doprowadzić temperaturę do 4 °C, a następnie dodać 10 ml FBS i 10 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). Filtr sterylizować za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy24.</li>
</ol>
3. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PB MNC)
<ol>
	<li>Połączyć 10 ml świeżej próbki PB i 10 ml PBS buforu w probówce o pojemności 50 ml i dobrze wymieszać. Przed użyciem doprowadzić PBS do temperatury RT lub 37 °C. 
	UWAGA: Z 1 ml PB można uzyskać około 1 - 3 x 106 MNC (świeżych lub kriokonserwowanych). Po 6 dniach hodowli spodziewaj się 0,5 - 1 x 106 całkowitych komórek z powodu śmierci dojrzałych komórek podczas hodowli. Z 10 ml świeżego PB można uzyskać około 1 x 107 komórek.</li>
	<li>Dodać 10 ml Ficoll na dno probówki za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml przymocowanej do długiej igły. Proces ten należy wykonywać powoli, aby upewnić się, że warstwa Ficoll nie miesza się z PB.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 30 minut przy niskiej prędkości przyspieszania i zwalniania. Po odwirowaniu PB MNC znajdują się w białej warstwie (kożuchowo) znajdującej się między plazmą PB a Ficollem.</li>
	<li>Powoli odsysać ~10 ml PB osocza bez naruszania warstwy kożuchowca. Ostrożnie zbierz białą warstwę za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml do nowej probówki o pojemności 50 ml. Całkowita objętość pobranych komórek z białej warstwy wyniesie od 3 do 6 ml.</li>
	<li>Dodaj PBS, aby uzyskać całkowitą objętość do 30 ml i dobrze wymieszaj pipetą o pojemności 10 ml. Wirować przy 400 x g przez 10 min.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 20 ml pożywki hodowlanej (tj. pożywce Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM) i dobrze wymieszać. Wirować przy 400 x g przez 10 minut, aby usunąć większość płytek krwi.</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 - 2 ml IMDM. Komórki mogą być wykorzystane do natychmiastowej hodowli lub zamrożone do późniejszego wykorzystania. W celu krioprezerwacji dodaj równą ilość podłoża do krioprezerwacji. Podwielokrotne komórki w kriowialach (0,5 - 1 ml na fiolkę) i natychmiast przenieść kriowiale do zamrażarki o temperaturze -80 °C. PB MNC mogą być przechowywane w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni lub przenoszone do zbiornika z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania. 
	UWAGA: Podczas rozmrażania zamrożonych komórek, chociaż nasze podłoże do krioprezerwacji może utrzymać żywotność komórek, liczba komórek może się zmniejszyć z powodu śmierci komórki podczas procesu rozmrażania. Zaleca się, aby w każdej fiolce zamrożono 1 - 10 x 107 komórek.</li>
</ol>
4. Ekspansja PB MNC w pożywce erytroidalnej
<ol>
	<li>Przygotuj 5 ml pożywki IMDM w probówce o pojemności 15 ml. Szybko rozmrozić zamrożone PB MNC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a następnie przenieść je do probówki z medium IMDM. 
	UWAGA: Czas przebywania w łaźni wodnej zależy od objętości komórek kriokonserwowanych i użytego kriowiołu. Zwykle zamrożona komórka rozmraża się w ciągu 1 minuty.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 5 - 10 min. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w podłożu erytroidalnym. Dodaj 10 μl roztworu błękitu trypanowego do 10 μl zawiesiny komórek i dobrze wymieszaj. Trypan Blue barwi martwe komórki w ciągu 1 - 3 minut. Policz komórki pod mikroskopem za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Hodowla PB MNC na 6-dołkowej płytce poddanej działaniu kultury nietkankowej (non-TC) z 2 ml pożywki na dołek, przy gęstości komórek ~5 x 106 komórek/ml, w temperaturze 37 °C w inkubatorze nawilżanym o stężeniu 5% CO2</li>.
	<li>Dodać 1 ml świeżej pożywki erytroidalnej bezpośrednio do każdej studzienki bez zmiany pożywki w D 3 i 5.</li>
	<li>W D 6 zbierz PB MNC do nukleofekcji.</li>
</ol>
5. PB MNC Nucleofekcja i przeprogramowanie
<ol>
	<li>Na dzień przed nukleofekcją należy wstępnie pokryć 6-dołkowe płytki poddane działaniu TC 0,1% żelatyny w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Rozmrozić inaktywowane komórki zasilające mysie fibroblasty embrionalne (MEF) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i natychmiast przenieść je do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml pożywki MEF.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g przez 5 minut i usunąć supernatant. Usuń żelatynę z płytki 6-dołkowej, ponownie zawieś osad komórkowy w pożywce MEF i przenieś go na wstępnie potraktowaną płytkę 6-dołkową z żelatyną. W każdym dołku wysiewaj 2 - 4 x 105 inaktywowanych komórek MEF zawieszonych w 2 ml pożywki MEF.</li>
	<li>Hodować komórki zasilające MEF w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5%CO2</li>.
	<li>W dniu nukleofekcji odessać pożywkę MEF i zastąpić ją 1 ml pożywką erytroidalną. Wstępnie zrównoważyć płytkę hodowlaną przez 10–30 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5%CO2</li>.
	<li>Dodaj 2 μg pEV-OCT4-2A-SOX2, 1 μg pEV-MYC, 1 μg pEV-KLF4 i 0,5 μg pEV-BCL-XL w sterylnej probówce Eppendorfa o pojemności 1,5 ml. Podgrzewać probówkę w temperaturze 50 °C przez 5 minut, aby zapobiec zanieczyszczeniu, i schłodzić do temperatury suchej. Dodać 57 μl buforu nukleofekcyjnego i 13 μl suplementu.</li>
	<li>Zebrać 2 x 106 hodowanych PB MNC do probówki o pojemności 5 ml, wirując przy 200 x g przez 7 minut. Usunąć supernatant i dodać mieszaninę plazmidu i buforu nukleofekcji do osadu komórkowego. Dobrze wymieszaj, przesuwając tubkę palcem. 
	UWAGA: Już 2 x 105 komórek może być używanych do nukleofekcji, ale należy również spodziewać się mniejszej wydajności przeprogramowywania.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę DNA i komórek do kuwety dostarczonej w zestawie i nakręć kuwetę. Wybierz program U-008 na urządzeniu nucleofekcyjnym. Włóż kuwetę do uchwytu i naciśnij OK, aby zastosować program U-008.</li>
	<li>Wyjmij kuwetę z uchwytu, dodaj 0,5 - 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża erytroidalnego do każdej kuwety i natychmiast przenieś komórki na wstępnie zrównoważoną płytkę MEF. Ze względu na wysoką wydajność przeprogramowywania i zmienność dawców, zdecydowanie zaleca się wysiewanie różnej liczby komórek w zakresie od 1 do 10 x 105 komórek na studzienkę.</li>
	<li>Przenieść płytkę do komory hipoksji i przepłukać komorę mieszaniną gazów o składzie 92% N2, 5% CO2 i 3% O2 przez 1 - 2 minuty z prędkością 20 l/min. Po zamknięciu komory przeprowadzić hodowlę komórek w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>W D 2 po nukleofekcji dodać 2 ml pożywki iPSC bezpośrednio do każdej studzienki.</li>
	<li>W D 4 po nukleofekcji usuń 3 ml pożywki i dodaj 2 ml świeżej pożywki iPSC. W D 4 po nukleofekcji większość żywych komórek będzie przyczepiona do warstwy zasilającej.</li>
	<li>Po D 6 po nukleofekcji zmieniaj pożywkę co 2 dni, pozostawiając 500 μl zużytej pożywki i dodając 2 ml świeżej pożywki E8 uzupełnionej 0,25 mM maślanu sodu do D 14 - 18, 
	UWAGA: Dodatkowe komórki zasilające mogą być dodawane do dołków hodowlanych za każdym razem, gdy obserwuje się, że komórki zasilające zostały odłączone. Po rozmrożeniu MEF (patrz 5.1 i 5.2), ponownie zawiesić osad komórkowy w małej objętości pożywki E8 (tj. ~0,2 ml na jedno dołek płytki 6-dołkowej), a następnie dodać MEF do dołków hodowlanych. Można dodać około 2% FBS, aby zwiększyć przyczepienie komórek. Alternatywnie można również użyć pożywki kondycjonowanej MEF, ale jest to bardziej pracochłonne.</li>
</ol>
6. Rozbudowa iPSC
UWAGA: W większości przypadków duża liczba kolonii iPSC pojawia się na poziomie D 8 - 10 po nukleofekcji. Po D 14 duże kolonie iPSC są zwykle gotowe do zbioru.
<ol>
	<li>Przed pobraniem kolonii dodać 500 μl pożywki E8 uzupełnionej inhibitorem ROCK, Y27632 (10 μM), do jednego dołka podajnika lub 24-dołkowej płytki pokrytej Matrigelem. Użyj pipety o pojemności 10 lub 20 μl, aby zarysować i wybrać kolonie pod mikroskopem. Przenieś kawałki każdej kolonii do studzienek zawierających pożywkę hodowlaną. 
	UWAGA: Stężenie Matrigelu różni się w zależności od partii. Zazwyczaj używamy rozcieńczenia Matrigelu w stosunku 1:100.
	<ol>
		<li>Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, wybieraj kolonie, które są duże i dobrze oddzielone od innych. Hodowla iPSC w temperaturze 37 °C w inkubatorze z wilgotnością 5% CO2 . 
		UWAGA: Należy zauważyć, że populacja iPSC może być poliklonalna z powodu migracji komórek, gdy w każdym dołku płytki 6-dołkowej znajdują się dziesiątki lub setki kolonii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nie zmieniaj pożywki przez pierwsze 2 d. Inhibitor ROCK może sprzyjać przetrwaniu małych kolonii25.</li>
	<li>Począwszy od D 2 należy codziennie zmieniać pożywkę, usuwając zużyte podłoże i dodając 500 μl świeżej pożywki E8 do każdej studzienki.</li>
	<li>Około 1 tydzień później, gdy kolonie są wystarczająco duże, usunąć pożywkę i potraktować komórki 300 μl roztworu do oddzielania komórek (0,5 mM EDTA w PBS) w temperaturze 37 °C przez 1 - 3 minuty. Usunąć roztwór do odrywania komórek i dodać pożywkę E8 zawierającą inhibitor ROCK (10 μM) w celu zawieszenia iPSC. Nie należy rozbijać kolonii na pojedyncze komórki, co może prowadzić do nadmiernej śmierci komórek. Skupiska komórek składające się z 5 - 50 komórek są odpowiednie do przejścia iPSC.</li>
	<li>Przenieś 50 - 100% zawiesiny komórek do każdego dołka 12- lub 6-dołkowej płytki, która została wstępnie pokryta podajnikami lub Matrigelem.</li>
	<li>W przypadku długotrwałej hodowli na płytkach pokrytych Matrigelem (patrz uwaga w ppkt 6.1), pożywkę należy zmieniać codziennie. Gdy konfluencja komórek osiągnie 40 - 60%, potraktuj komórki 1 ml roztworu do oddzielania komórek (0,5 mM EDTA w PBS) w temperaturze 37 °C przez ~ 3 min. Kiedy kolonie zaczną się zwijać, usuń roztwór do odłączania komórek i dodaj pożywkę E8 zawierającą inhibitor ROCK (10 μM), aby zawiesić iPSC. Komórki pasażowe o współczynniku rozszczepienia 4 - 8. inhibitor ROCK powinien być dodawany podczas pasażowania komórek w celu zwiększenia przeżywalności, a usuwany 1 dzień później, aby zapobiec różnicowaniu.</li>
	<li>Aby zamrozić iPSC, należy traktować komórki roztworem do oddzielania komórek w temperaturze 37 °C przez 3 - 5 minut zgodnie z protokołem producenta. Gdy kolonie iPSC zaczną się zwijać, odessać bufor i dodać 0,5 - 1 ml pożywki E8.</li>
	<li>Dodaj równą objętość pożywki do kriokonserwacji do zawiesiny komórek i dobrze wymieszaj. Zamrożone iPSC można przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni lub w ciekłym azocie do długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
7. Wybór iPSC bez resztkowych plazmidów episomalnych
<ol>
	<li>Po pasażu 5 zbierz iPSC i wyekstrahuj genomowe DNA. 
	UWAGA: Zwykle po 5 pasażach hodowli resztkowe plazmidy episomalne są niewykrywalne. Tak więc prawie wszystkie kolonie iPSC w pasażach powyżej 5 (tj. w pasażu 10) nie mają szczątkowych plazmidów episomalnych.</li>
	<li>Użyć genomowego DNA z nietransfekowanych PB MNC jako kontroli negatywnej. Dodaj plazmid 1,6 pg pEV-OCT4-2A-SOX2 do 1 μg DNA kontroli negatywnej, aby naśladować komórki z jedną kopią plazmidu pEV na komórkę.</li>
	<li>Dodaj 9 μl wody klasy PCR, w tym 100 ng genomowego DNA i 1 μl specyficznych starterów (po 10 μM starterów do przodu i do tyłu) do 10 μl High-Fidelity PCR Master Mix. Normalizuj ilość DNA przez GAPDH. Użyj następujących starterów do PCR: EBNA1-F TTTAATACGATTGAGGGCGTCT, EBNA1-R GGTTTTGAAGGATGCGATTAAG, WPRE-F GGTTTAAACGCGTCGACAAT, WPRE-R GTTGCGTCAAACACAGT, GAPDH-F GAGTCCACTGGCCTTCTC, GAPDH-R GACTGTGGTCATGAGTCCTTC.</li>
	<li>Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 98 °C przez 60 s, następnie w temperaturze 98 °C przez 10 s, 60 °C przez 30 s i w temperaturze 72 °C przez 30 s. Po 30 cyklach; przedłużyć reakcję w temperaturze 72 °C na 5 minut.</li>
	<li>Załaduj 5 μl produktów PCR do każdej studzienki 1% żelu agarozowego. Uruchom żel na 20 - 30 minut przy napięciu 100 V. Wybierz klony iPSC z niewykrywalnymi pasmami dla EBNA1 i WPRE do dalszej hodowli i dalszej analizy.</li>
</ol>
8. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Zebrać iPSC, traktując je Accutazą w temperaturze 37 °C przez 3 - 5 minut w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki. Dodać 1 μl anty-TRA-1-60 sprzężonego z PE lub eFluor 570-sprzężonego z przeciwciałem anty-SSEA4 lub przeciwciała izotypowego do 100 μl zawiesiny komórkowej (1 - 5 x 105 komórek) w probówkach o pojemności 5 ml. Inkubować probówki w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej przez 20 minut.</li>
	<li>Po barwieniu przez 20 minut w temperaturze pokojowej dodać 2 ml PBS i wirować przy 400 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 300 μl PBS w celu analizy sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) przy użyciu analizatora komórek cytometrii przepływowej. Pytania z dnia 23,26</li> TGL
</ol>
9. Obrazowanie konfokalne
<ol>
	<li>Nasiona iPSC w szkiełkach komorowych pokrytych Matrigelem.</li>
	<li>Po 3 - 4 dniach hodowli usunąć pożywkę wzrostową i utrwalić 4% paraformaldehydem (PFA) w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umyć komórki dwukrotnie PBS. 
	Uwaga: PFA jest toksyczny i szkodliwy.</li>
	<li>Potraktuj komórki 0,1% Triton X-100 w PBS (PBS-T) w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Umyj komórki dwukrotnie PBS.</li>
	<li>Zablokować komórki buforem blokującym (5% surowicy koziej w PBS, V:V) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
	<li>Na etapie blokowania rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (100x) w buforze blokującym. 
	UWAGA: Informacje o przeciwciałach są wymienione w Tabeli materiałów/Wyposażenia.</li>
	<li>Inkubować komórki z rozcieńczonym przeciwciałem w temperaturze 4 °C O/N.</li>
	<li>Myć dwukrotnie PBS-T przez 15 minut, a następnie dwa razy PBS przez 15 minut.</li>
	<li>Inkubować komórki z rozcieńczonym przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem w RT przez 2 godziny.</li>
	<li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS-T przez 15 minut, a następnie dwukrotnie PBS przez 15 minut.</li>
	<li>Wybarwić jądro DAPI (1 μg/ml) w PBS w temperaturze RT przez 10 minut.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie PBS przez 15 minut.</li>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego. Pytania z dnia 23,27</li>
</ol>
10. Test potworniaka
Zbierz 1 x 106 iPSC roztworem do odłączania komórek (0,5 mM EDTA w PBS) i ponownie zawieś komórki w 200 μl rozcieńczonego (1:1) Matrigelu DMEM/F12.
<ol>
	<li>Podskórnie wstrzyknąć komórki do tylnego zadka myszy z niedoborem odporności NOD/SCID.</li>
	<li>Po 8 - 12 tygodniach od wstrzyknięcia iPSC należy wyciąć i naprawić potworniaki w 10% formalinie. 28</li>
	<li>Po mikrosekcji i barwieniu hematoksyliną i eozyną (H&E) przeanalizuj próbki. 29</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Trounson, A., McDonald, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Therapies+in+Clinical+Trials%3A+Progress+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges.</a> Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).</li>
<li>Hayes, M., Zavazava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+generate+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Strategies to generate induced pluripotent stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).</li>
<li>Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cellular reprogramming of human peripheral blood cells.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 11, 264-274 (2013).</li>
<li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nat Biotechnol. 33, 58-63 (2015).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31, 458-466 (2013).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).</li>
<li>Dorigo, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+helper-dependent+adenovirus-Epstein-Barr+virus+hybrid+system+for+the+stable+transformation+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of a novel helper-dependent adenovirus-Epstein-Barr virus hybrid system for the stable transformation of mammalian cells.</a> J Virol. 78, 6556-6566 (2004).</li>
<li>Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+postnatal+blood+mononuclear+cells+by+plasmid+vector+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression.</a> Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).</li>
<li>Harms, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+of+Cytokeratin+20-negative+Merkel+cell+carcinoma+reveals+ultraviolet-signature+mutations+and+recurrent+TP53+and+RB1+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing of Cytokeratin 20-negative Merkel cell carcinoma reveals ultraviolet-signature mutations and recurrent TP53 and RB1 inactivation.</a> Mod Pathol. 29, 240-248 (2016).</li>
<li>Abyzov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+copy+number+mosaicism+in+human+skin+revealed+by+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 492, 438-442 (2012).</li>
<li>Martincorena, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+evolution.+High+burden+and+pervasive+positive+selection+of+somatic+mutations+in+normal+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tumor evolution. High burden and pervasive positive selection of somatic mutations in normal human skin.</a> Science. 348, 880-886 (2015).</li>
<li>Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+iPS+Cells+from+Human+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+Using+Episomal+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors.</a> Methods Mol Biol. 1357, 57-69 (2016).</li>
<li>Seki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+terminally+differentiated+circulating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.</a> Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+T+cells+from+human+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of T cells from human peripheral blood.</a> Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).</li>
<li>Kishino, Y., Seki, T., Yuasa, S., Fujita, J., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+from+Human+Peripheral+T+Cells+Using+Sendai+Virus+in+Feeder-free+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+a+small+amount+of+human+peripheral+blood+using+a+combination+of+activated+T+cells+and+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus.</a> Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).</li>
<li>Gill, S., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Going+viral%3A+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies.</a> Immunological reviews. 263, 68-89 (2015).</li>
<li>Su, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+integration-free+ips+cells+from+human+adult+peripheral+blood+using+BCL-XL+together+with+Yamanaka+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors.</a> PLoS One. 8, e64496(2013).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p53-PUMA+axis+suppresses+iPSC+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The p53-PUMA axis suppresses iPSC generation.</a> Nat Commun. 4, 2174(2013).</li>
<li>Hardwick, J. M., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SnapShot%3A+BCL-2+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SnapShot: BCL-2 proteins.</a> Cell. 138, 404(2009).</li>
<li>Wen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Generation+of+Integration-free+iPSCs+from+Human+Adult+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+with+an+Optimal+Combination+of+Episomal+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors.</a> Stem Cell Reports. 6, 873-884 (2016).</li>
<li>Zhang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+ameliorates+the+cryopreservation+of+cord+blood+in+a+preclinical+system+and+increases+the+recovery+of+CFUs%2C+long-term+culture-initiating+cells%2C+and+nonobese+diabetic-SCID+repopulating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transfusion%22%5BJournal%5D)">Trehalose ameliorates the cryopreservation of cord blood in a preclinical system and increases the recovery of CFUs, long-term culture-initiating cells, and nonobese diabetic-SCID repopulating cells.</a> Transfusion. 43, 265-272 (2003).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Castiel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+associated+with+abnormal+mitosis+observed+by+confocal+imaging+in+live+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells.</a> J Vis Exp. , e50568(2013).</li>
<li>Peterson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratoma+generation+in+the+testis+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Teratoma generation in the testis capsule.</a> J Vis Exp. , e3177(2011).</li>
<li>Ritner, C., Bernstein, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+of+human+embryonic+stem+cells+by+teratoma+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Fate mapping of human embryonic stem cells by teratoma formation.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Wen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Generation+of+Integration-free+iPSCs+from+Human+Adult+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+with+an+Optimal+Combination+of+Episomal+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors.</a> Stem Cell Reports. , (2016).</li>
<li>Lo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Protein+Levels+in+Single+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantification of Protein Levels in Single Living Cells.</a> Cell Rep. 13, 2634-2644 (2015).</li>
<li>Liu, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+generating+integration-free+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Zhongguo+Shi+Yan+Xue+Ye+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">An improved method for generating integration-free human induced pluripotent stem cells.</a> Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22, 580-587 (2014).</li>
<li>Luni, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+cellular+reprogramming+with+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics.</a> Nat Methods. 13, 446-452 (2016).</li>
<li>Chou, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+method+to+establish+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+adult+blood+cells+under+feeder-free+and+xeno-free+culture+conditions%3A+a+clinically+compliant+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A facile method to establish human induced pluripotent stem cells from adult blood cells under feeder-free and xeno-free culture conditions: a clinically compliant approach.</a> Stem Cells Transl Med. 4, 320-332 (2015).</li>
<li>Nakagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+efficient+feeder-free+culture+system+for+the+derivation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells.</a> Sci Rep. 4, 3594(2014).</li>
<li>Howden, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Reprogramming+and+Gene+Correction+of+Patient+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Reprogramming and Gene Correction of Patient Fibroblasts.</a> Stem Cell Reports. 5, 1109-1118 (2015).</li>
<li>Meng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+reprogramming+of+human+fetal+and+adult+blood+CD34%2B+cells+into+mesenchymal+stem+cells+with+a+single+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient reprogramming of human fetal and adult blood CD34+ cells into mesenchymal stem cells with a single factor.</a> Cell research. 23, 658-672 (2013).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Conversion+of+Cord+Blood+CD34%2B+Cells+Into+Neural+Stem+Cells+by+OCT4%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Direct Conversion of Cord Blood CD34+ Cells Into Neural Stem Cells by OCT4.</a> Stem cells translational medicine. 4, 755-763 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konkurencyjnych ani sprzecznych interesów.

Pobieranie próbek krwi od zdrowych dawców lub pacjentów jest wygodne i nieinwazyjne, co czyni je atrakcyjnym źródłem komórek do badań podstawowych i klinicznej terapii komórkowej. W tym miejscu opisaliśmy protokół wysoce wydajnego generowania bezintegracyjnych iPSC z próbek krwi obwodowej. To powtarzalne i przystępne cenowo podejście powinno przynieść korzyści w dziedzinie iPSC.
Informowaliśmy, że istnieją dwa krytyczne czynniki odpowiedzialne za wysoce wydajne przeprogramowanie PB30</sup...

Po wymuszonej ekspresji kilku czynników transkrypcyjnych (tj. OCT4, SOX2, MYC i KLF4), komórki somatyczne mogą zostać przeprogramowane na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC), które są bardzo obiecujące dla zastosowań w medycynie regeneracyjnej i terapii zastępczej1-3. Do tej pory opracowano różne metody mające na celu zwiększenie wskaźnika sukcesu przeprogramowania4-7. Przeprogramowanie wywołane wektorami wirusowymi jest szeroko stosowane do wydajnego generowania iPSC, ponieważ integracja wirusowa prowadzi do stabilnej ekspresji czynników przeprogramowujących na wysokim poziomie. Jednak trwała integracja DNA wektora z genomem komórki może wywołać mutagenezę insercyjną5. Ponadto niewystarczająca inaktywacja czynników przeprogramowujących może zaburzać różnicowanie iPSC8. W związku z tym konieczne jest stosowanie iPSC bez integracji czynników przeprogramowujących, zwłaszcza w zastosowaniach terapii komórkowej.
Wektory episomalne (EV) są szeroko stosowane w generowaniu bezintegracyjnych iPSC. Najczęściej stosowanym EV jest plazmid zawierający dwa elementy, pochodzenie replikacji wirusa (oriP) i antygen jądrowy EB 1 (EBNA1), z wirusa Epsteina-Barr (EB)9. Element oriP wspomaga replikację plazmidu w komórkach ssaków, podczas gdy element EBNA1 wiąże plazmidowe DNA zawierające oriP z chromosomalnym DNA, co pozwala na partycjonowanie episomu podczas podziału komórki gospodarza. W porównaniu z innymi podejściami bez integracji, w tym transfekcją wirusa Sendai (SV) i RNA, EV mają wiele zalet5,6,10. Jako plazmidowe DNA, EV mogą być łatwo produkowane i modyfikowane we własnym zakresie, co czyni je niezwykle przystępnymi cenowo. Ponadto przeprogramowanie za pomocą EV jest procesem mniej pracochłonnym, ponieważ pojedyncza transfekcja za pomocą EV jest wystarczająca do wygenerowania iPSC, podczas gdy kilka transfekcji RNA jest niezbędnych do pomyślnego przeprogramowania.
Fibroblasty skórne były wykorzystywane w wielu badaniach nad przeprogramowaniem. Jednak biopsja skóry jest nie tylko inwazyjnym i bolesnym procesem, ale także czasochłonnym dla rozprężania komórek do ilości wystarczającej do przeprogramowania. Bardziej niepokojące jest to, że komórki skóry dorosłych dawców były często narażone na długotrwałe promieniowanie UV, które może prowadzić do mutacji związanych z nowotworami, ograniczając w ten sposób zastosowania iPSC pochodzących z fibroblastów skóry11,12. Ostatnio doniesiono, że normalne ludzkie komórki skóry gromadzą mutacje somatyczne, a wiele genów nowotworowych, w tym większość kluczowych czynników powodujących raka płaskonabłonkowego skóry, podlega silnej selekcji pozytywnej13.
W przeciwieństwie do fibroblastów skóry, komórki krwi obwodowej (PB) są preferowanym źródłem komórek do przeprogramowania, ponieważ: 1) komórki krwi można łatwo uzyskać w procesie minimalnie inwazyjnym, 2) komórki krwi obwodowej są potomstwem hematopoetycznych komórek macierzystych znajdujących się w szpiku kostnym, a więc chronionych przed szkodliwym promieniowaniem. Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PB MNC) można pobrać w ciągu godziny z warstwy kożucha po prostym wirowaniu gradientowym przy użyciu Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). Otrzymane PB MNC składają się z limfocytów, monocytów i kilku hematopoetycznych komórek progenitorowych (HPC) 14. Chociaż ludzkie limfocyty T są jednym z głównych typów komórek w PB, dojrzałe limfocyty T zawierają rearanżacje genów receptora komórek T (TCR) i nie mają nienaruszonego genomu, co ogranicza ich potencjał do zastosowań15,16. Jednak odmładzanie limfocytów T poprzez wytwarzanie iPSC może mieć potencjalne zastosowania w terapii limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) 17-19. Dla porównania, HPC mają nienaruszony genom i można je łatwo przeprogramować. Chociaż tylko 0,01 - 0,1% komórek w krążeniu obwodowym to HPC, komórki te mogą być namnażane ex vivo w środowisku erytroidalnym, które sprzyja proliferacji erytroidalnych komórek progenitorowych14.
W naszym poprzednim badaniu, użyliśmy czynnika BCL-XL oprócz czynników Yamanaka (OCT4, SOX2, MYC i KLF4), co spowodowało 10-krotny wzrost efektywności przeprogramowania PB20. BCL-XL, znany również jako BCL2L1, jest silnym inhibitorem śmierci komórki poprzez hamowanie aktywacji kaspaz21,22. Ale BCL-XL może również odgrywać ważną rolę w utrzymaniu pluripotencji21,22. Ostatnio jeszcze bardziej zoptymalizowaliśmy nasz system przeprogramowania pojazdów elektrycznych, oddzielnie wyrażając MYC i KLF4 za pomocą dwóch wektorów, co prowadzi do około 100-krotnego wzrostu wydajności przeprogramowania23. Stosując tę metodę, wydajność przeprogramowania, określona przez liczbę kolonii podzieloną przez początkową liczbę komórek podczas transfekcji, wynosi 0,2 - 0,5% od zdrowych dawców. Poniżej opisano szczegółową procedurę eksperymentalną generowania bezcałkujących iPSC z PB.

<table><tbody><tr><td>Pożywka do ekspansji hematopoetycznych komórek macierzystych</td><td>Sigma</td><td>S0192</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Czynnik ludzkich komórek macierzystych (SCF)</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 lub -80 stopni; C</td></tr><tr><td>Interleukina-3 (IL-3)</td><td>Peprotech</td><td>AF-200-03</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 lub -80 stopni; C</td></tr><tr><td>Erytropoetyna (EPO)</td><td>Peprotech</td><td>100-64</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 lub -80 stopni; C</td></tr><tr><td>Insulinowy czynnik wzrostu-1 (IGF-1)</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 lub -80 stopni; C</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 lub -80 stopni; C</td></tr><tr><td>1-tioglicerol (MTG)</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 lub -80 stopni; C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 medium</td><td>Gibco</td><td>112660-012</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>L-glutamina (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna (100x)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Roztwór aminokwasów endogennych (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu fibroblastów 2 (FGF2)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 lub -80 stopni; C</td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen (ITS, 100x)</td><td>Gibco</td><td>41400-045</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>49752</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>DMEM (high glucos) medium</td><td>Thermo</td><td>SH30243.01B</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & st.; C</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyclon</td><td>SV30087.01</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare, SIGMA</td><td>17-5442-02</td><td>Sklep w RT</td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Sigma</td><td>T9531</td><td>Sklep pod adresem 4 &deg; C</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Przechowywać w RT, chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Endofree Plasmid Maxi Kit (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>21056-023</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Zestaw do nukleofekcji komórek ludzkich CD34 +</td><td>Lonza</td><td>VPA-1003</td><td>Przechowywać w temperaturze RT, bufor nukleofekcyjny i suplement należy przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Maślan sodu</td><td>Sigma</td><td>B5887</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 lub -80 stopni; Inhibitor C</td></tr><tr><td>ROCK - Y27632</td><td>STEMGENT</td><td>04-0012-10</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Essential 8 podłoże podstawowe (E8)</td><td>Gibco</td><td>A15169-01</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, suplement powinien być przechowywany w temperaturze -20 lub -80 &deg; C</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td>354277</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 lub -80 stopni; C</td></tr><tr><td>2x EasyTaq PCR SuperMix (+ barwnik)</td><td>TransGen Biotech</td><td>AS111</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Roztwór do odwarstwiania komórek</td><td>STEMGENT</td><td>01-0006</td><td>Przechowywać w temperaturze -20 stopni; C, Accutase jako roztwór do odrywania komórek w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-1MG</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 lub -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Anti-Nanog AF488</td><td>BD</td><td>560791</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C, przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do immunofluorescencji, rozcieńczyć 1/100 w przypadku stosowania</td></tr><tr><td>Anty-OCT4</td><td>abcam</td><td>ab19857</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, przeciwciało pierwszorzędowe stosowane do immunofluorescencji, rozcieńczyć 1/100 w przypadku stosowania</td></tr><tr><td>AF488 osła anty-mysie IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C, przeciwciało drugorzędowe stosowane do immunofluorescencji,&nbsp; rozcieńczyć 1/500 w przypadku stosowania</td></tr><tr><td>PE przeciwciało anty-ludzkie TRA-1-60-R</td><td>Biolegend</td><td>330610</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni C, przeciwciało stosowane w cytometrii</td></tr><tr><td>przepływowej eFluor 570-sprzężony anty-SSEA4</td><td>eBioscience</td><td>41-8843</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C, przeciwciało stosowane do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Przeciwciało izotypowe</td><td>eBioscience</td><td>11-4011</td><td>Przechowywać w 4 & stopni; C, przeciwciało używane do cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>Zestaw do wykrywania fosfatazy alkalicznej</td><td>SiDanSai</td><td>1102-100</td><td>Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji genomowego DNA</td><td>TIANGEN</td><td>DP304-02</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Analizator komórek do cytometrii przepływowej</td><td>BD</td><td>LSRII</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem (SDC)</td><td>PerkinElmer</td><td>UltraVIEW VOX</td><td>do obrazowania konfokalnego</td></tr><tr><td>Urządzenie do nukleofekcji</td><td>Lonza</td><td>Nucleofector 2b</td><td>do nukleokcji PB MNC</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS-4010</td><td>GE</td><td></td><td>do masowego wykonywania zdjęć barwienia AP</td></tr></tbody></table>

generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) są bardzo obiecujące dla modelowania chorób i terapii regeneracyjnych. Wcześniej informowaliśmy o zastosowaniu wektorów episomalnych (EV) do generowania wolnych od integracji iPSC z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PB MNC). Stosowane wektory episomalne to plazmidy DNA połączone z elementami oriP i EBNA1 wirusa Epsteina-Barr (EB), które pozwalają na replikację i długotrwałe zatrzymywanie plazmidów w komórkach ssaków, odpowiednio. Dzięki dalszej optymalizacji można uzyskać tysiące kolonii iPSC z 1 ml krwi obwodowej. Dwa kluczowe czynniki osiągnięcia wysokiej wydajności przeprogramowania to: 1) zastosowanie peptydu "samorozszczepienia" 2A do połączenia OCT4 i SOX2, osiągając w ten sposób równomolową ekspresję tych dwóch czynników; 2) użycie dwóch wektorów do indywidualnej ekspresji MYC i KLF4. W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół generowania bezintegracyjnych iPSC z próbek krwi obwodowej u dorosłych. Wygenerowane iPSC są wolne od integracji, ponieważ resztkowe plazmidy episomalne są niewykrywalne po pięciu pasażach. Chociaż wydajność przeprogramowania jest porównywalna z wektorami wirusa Sendai (SV), plazmidy EV są znacznie bardziej ekonomiczne niż dostępne na rynku wektory SV. Ten przystępny cenowo system przeprogramowania pojazdów elektrycznych ma potencjał do zastosowań klinicznych w medycynie regeneracyjnej i zapewnia podejście do bezpośredniego przeprogramowania PB MNC na wolne od integracji mezenchymalne komórki macierzyste, nerwowe komórki macierzyste itp.

Stosując ten protokół, możemy uzyskać setki kolonii z 1 x 105 nukleofektowanych PB MNCs (Rycina 1A i 1B). Wydajność przeprogramowania wynosi około 0,2 - 0,5%, a kolonie wykazują ekspresję markerów pluripotencji (Rycina 1C i 1D). iPSC wygenerowane zgodnie z opisanym protokołem są wolne od integracji i mają zdolność do tworzenia potworniaków składających się z 3 listków zarodkowych (Rycina 1E i<s...

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie komórek iPS z mononuklearnych komórek krwi obwodowej dorosłego człowieka przy użyciu nieintegrujących wektorów episomalnych. Niniejszy protokół może pomóc naukowcom z dziedziny komórek macierzystych, którzy chcą generować komórki iPS do monitorowania chorób, przesiewania leków oraz rutynowej radiomedycyny. Nasz protokół reprogramowania jest bardzo prosty, a zarazem wysoce wydajny.Postępując zgodnie z tą procedurą, można z łatwością opanować technikę przeprogramowania komórek krwi. Jakość osocza jest równie istotna dla powodzenia procesu przeprogramowania. Zanieczyszczenia mogą obniżyć wydajność przeprogramowania, dlatego zalecamy stosowanie zestawów Endofree do oczyszczania plazmidów episomalnych.Komórki iPS są bardziej delikatne niż inne komórki. Przygotowanie komórek do więcej niż jednego pasażu w trakcie pasażowania genów może wywołać masową śmierć komórek, szczególnie w przypadku wczesnych pasaży. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wszystkie wymagane pożywki hodowlane zgodnie z towarzyszącym manuskryptem.Następnie połącz 10 mL świeżej próbki PB oraz dziesięć mL buforu PBS w probówce o pojemności 50 mL i dokładnie wymieszaj. Przed użyciem doprowadź PBS do temperatury pokojowej lub 37 °C. Następnie dodaj 10 mL ficollu na dno probówki.Proces ten należy przeprowadzać powoli, aby zapobiec zmieszaniu warstwy ficollu z krwią obwodową (PB). Odwiruj mieszaninę przy 400 x g przez 30 minut, stosując niskie przyspieszenie i zwolnienie. Po wirowaniu monocyty i limfocyty (MNCs) z PB znajdują się w białej warstwie położonej pomiędzy osoczem PB a ficollen. Powoli odessij 10 mL osocza PB, nie naruszając buforowej warstwy ficollu.Następnie ostrożnie przenieś białą warstwę do nowej probówki o pojemności 50 mL. Całkowita objętość komórek zebranych z białej warstwy powinna wynosić od trzech do sześciu mL. Po tym kroku dodaj PBS, aby zwiększyć całkowitą objętość do 30 mL, i dokładnie wymieszaj.Następnie odwiruj próbkę przy 400 x g przez dziesięć minut. Po dziesięciu minutach usuń nadkład i resuspenduj osad komórkowy w 20 mL pożywki hodowlanej. Wymieszaj dokładnie i odwiruj próbkę przy 400 x g przez pięć minut, aby usunąć większość płytek krwi.Następnie usunąć nadsącz i zawiesić osad komórkowy w 1–2 mL IMDM. Komórki można wykorzystać do natychmiastowej hodowli lub zamrozić do późniejszego użycia. W przypadku kriokonserwacji dodać równą ilość medium do kriokonserwacji.Rozdzielić komórki do krioampułek i natychmiast przenieść je do zamrażarki w temperaturze -80 °C. W tej procedurze przygotować 5 mL pożywki IMDM w probówce o pojemności 15 mL. Szybko rozmrozić zamrożone PB MNCs w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przed ich przeniesieniem do probówki z pożywką IMDM.Wiruj próbkę z prędkością 400 x g przez pięć do dziesięciu minut. Następnie usuń nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w medium erytroidalnym. Po tym policz komórki pod mikroskopem, używając hemocytometru.Następnie hoduj PB MNC w sześciodołkowej płytce, która nie była poddawana obróbce do hodowli tkanek, w 2 mL pożywki na dołek, w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% Carbon Dioxide i zwiększoną wilgotnością. W dniu trzecim i piątym dodaj 1 mL świeżej pożywki erytroidalnej bezpośrednio do każdego dołka bez wymiany pożywki. W dniu szóstym zbierz PB MNC do nukleofekcji.Na dzień przed nukleofekcją pokryj płytkę 6-dołkową do hodowli tkankowej 0,1% żelatyną w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Rozmroź inaktywowane komórki karmące MEF w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i natychmiast przenieś je do probówki 15 mL zawierającej 5 mL pożywki MEF. Następnie odwiruj je przy 400 ×g przez pięć minut i usuń nadsącz.Następnie usuń żelatynę z płytki sześciodołkowej i resuspenduj osad komórkowy w pożywce MEF. Po tym czasie wysiej inaktywowane komórki MEF w 2 mL pożywki MEF do każdego dołka płytki sześciodołkowej uprzednio przygotowanej żelatyną i inkubuj je w temperaturze 37 °C w humidyfikowanym inkubatorze z 5% carbon dioxide. W dniu nukleofekcji odessij pożywkę MEF i zastąp ją 1 mL pożywki erytroidalnej.Następnie przeprowadzić wstępną inkubację płytki hodowlanej przez 10-30 minut w temperaturze 37°C w wilgotnej inkubatorze z 5% carbon dioxide. Do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mL dodać dwie mikrogramy PEV OCT4 do Sox2, jeden mikrogram PEV MYC, jeden mikrogram PEV KLF4 oraz 0,5 mikrograma PEV Bcl-XL. Podgrzewać probówkę w temperaturze 50°C przez pięć minut w celu zapobiegania kontaminacji, a następnie schłodzić ją do temperatury pokojowej.Następnie do próbki dodać 57 µL buforu do nukleofekcji oraz 13 µL buforu uzupełniającego. Zebrać 2 × 10⁶ hodowlanych komórek PBMNC do probówki o pojemności 5 mL poprzez wirowanie przy 200 x g przez siedem minut. Po tym czasie usunąć nadsącz i dodać mieszaninę plazmidu z buforem do nukleofekcji do osadu komórkowego.Następnie wymieszaj zawartość, lekko opukując probówkę palcem. Potem przenieś zawiesinę komórek z DNA do kuwety dołączonej do zestawu i zamknij kuwetę. Na urządzeniu do nukleofekcji wybierz program U-008.Następnie włóż kuwetę do uchwytu i naciśnij OK. Po tym czasie wyjmij kuwetę z uchwytu. Do każdej kuwety dodaj 0,5-1 mL podgrzanego wcześniej medium erytroidalnego i niezwłocznie przenieś komórki na wcześniej wyrównaną temperaturą płytkę z MEF. W przypadku niektórych próbek z jednego ml krwi można uzyskać tysiące kolonii.Jeśli chcą Państwo wybrać pojedynczą kolonię do dalszej hodowli, może być konieczne zasianie jednego dodatkowego dołka zawierającego tylko 1 million cells. Bezpośrednio przed umieszczeniem komory hipoksji w inkubatorze, należy delikatnie kilkakrotnie potrząsnąć komorą, aby uzyskać równomierny rozkład komórek w dołkach hodowlanych. Następnie należy przenieść płytkę do komory hipoksji.Prze płucz komorę mieszanką gazów przez jedną lub dwie minuty przy przepływie 20 Liters per minute. Następnie zamknij szczelnie komorę i inkubuj próbkę w temperaturze 37 degrees Celsius. Drugiego dnia po nukleofekcji dodaj 2 mL medium dla iPSC bezpośrednio do każdej studni.W czwartym dniu po nukleofekcji usunąć 3 mL pożywki i dodać 2 mL świeżej pożywki dla iPSC. Na tym etapie większość żywych komórek przytwierdziła się do warstwy feederowej. Po szóstym dniu od nukleofekcji wymieniać pożywkę co dwa dni, pozostawiając 500 µL zużytej pożywki i dodając 2 mL świeżej pożywki E8 uzupełnionej o 0,25 mM maślanu sodu, aż do 14-18 dnia.Przedstawiono tutaj schemat protokołu przeprogramowania komórek krwi obwodowej. Ten obraz przedstawia AP w szalce, a ten pokazuje typową kolonię iPSC przypominającą ESC w 14. dniu po nukleofekcji PB MNCs. Tutaj znajdują się reprezentatywne diagramy FACS dla iPSC w piątym pasażu wykazujących ekspresję TRA-1-60 lub SSEA4.Oto reprezentatywne obrazy konfokalne kolonii iPSC wykazujących ekspresję NANOG i OCT4. Przedstawione obrazy ukazują barwienie H&E teratoma, obejmujące wszystkie trzy listki zarodkowe. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak generować wolne od integracji komórki iPS z ludzkich mononuklearnych komórek krwi obwodowej.Po opanowaniu metody można w ciągu trzech tygodni wygenerować duże ilości komórek iPS, przy czym czas pracy własnej wyniesie mniej niż trzy godziny. Opracowaliśmy prosty system wektorów episomalnych do wydajnego przeprogramowania komórek krwi. Wierzymy, że ten przystępny cenowo system może zostać łatwo wdrożony, szczególnie w małych laboratoriach o ograniczonych zasobach.Należy pamiętać, że praca z ludzką krwią i osoczem może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i fartuchów laboratoryjnych.

generation-integration-free-induced-pluripotent-stem-cells-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Tutaj opisujemy protokół generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu strategii przeprogramowania opartej na episomach i inhibitorów deacetylazy histonowej.

Wydajne wytwarzanie komórek iPS z krwi przy użyciu episomów i inhibitorów HDAC

Opracowano metodę bezpośredniego pozyskiwania ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych wzbogaconych o komórki krwi obwodowej.

Bezpośrednia indukcja ludzkich nerwowych komórek macierzystych z krwiotwórczych komórek progenitorowych krwi obwodowej

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Ten manuskrypt przedstawia krok po kroku procedurę pozyskiwania i utrzymywania ludzkich keratynocytów z wyrwanych włosów oraz późniejszej generacji wolnych od integracji ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) za pomocą wektorów epizodycznych.

Generowanie bezintegracyjnych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu keratynocytów pochodzących z włosów

Ten protokół opisuje, jak generować indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) z ludzkich obwodowych limfocytów T w warunkach wolnych od karmy, używając kombinacji wektorów matrigelu i wirusa Sendai zawierających czynniki przeprogramowujące.

Wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich obwodowych limfocytów T przy użyciu wirusa Sendai w warunkach wolnych od żywiciela

Proponujemy protokół przeprogramowania komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Poprzez posiew transdukowanych komórek krwi na płytkach pokrytych matrycą za pomocą wirowania, iPSC są z powodzeniem indukowane z komórek pływających. Technika ta sugeruje prosty i skuteczny protokół przeprogramowania komórek, takich jak PBMC i CBMC.

Indukowane pluripotencjalne wytwarzanie komórek macierzystych z komórek krwi za pomocą wirusa Sendai i wirowania

Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Poznaj metodę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych bez integracji. Protokół umożliwia uzyskanie tysięcy kolonii iPSC z 1 mL krwi.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Przeglądaj więcej filmów