Hodowla narządów i barwienie immunofluorescencyjne całego wierzchowca mysich przewodów Wolffa

Prezentujemy metodę izolacji i hodowli mysiego kanału Wolffa (WD). Demonstrujemy również szczegółową procedurę barwienia immunologicznego całej góry hodowanych/świeżo wyizolowanych WD z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami. Razem techniki te umożliwiają badanie rozwoju, zwijania i różnicowania WD.

Ogólnym celem tej hodowli narządowej i całej metody immunofluorescencji jest lepsza wizualizacja i zrozumienie procesu zwijania i rozwoju indukcji Wolffa. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii rozwoju dotyczące mechanizmów związanych z rozwojem kształtu, struktury i funkcji narządów. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że naśladuje ona systemy in vivo i dostarcza bardziej dokładnych informacji niż badania nad kulturami komórkowymi, w których brakuje czynników niszowych.

Przed południem 15 dnia po zapłodnieniu umieść ciężarną mysz w pozycji leżącej na chłonnej bibułce i spryskaj brzuszną stronę brzucha 70% etanolem. Za pomocą kleszczy podnieś dolną część skóry brzucha po brzusznej stronie zwierzęcia i użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać boczne nacięcie rozciągające się od otworu moczowo-płciowego do klatki piersiowej. Chwyć pęcherz moczowy kleszczami tuż nad szyjką macicy i wykonaj nacięcie w macicy.

Trzymając pęcherz moczowy, wykonaj nacięcie w szerokim więzadle macicy i połączeniu jajowodów macicy, aby odłączyć macicę od przyczepu przyzębnego. Umieść macicę w 50-mililitrowej probówce zawierającej lodowaty HBSS i delikatnie potrząśnij tkanką, aby usunąć nadmiar krwi. Przenieś opłukaną macicę na szalkę Petriego zawierającą świeży, lodowaty HBSS na lodzie i przetnij ścianę macicy, aby usunąć zarodki, umieszczając je na nowej szalce Petriego ze świeżym HBSS na lodzie podczas ich zbierania.

Umieść zarodek na bocznej stronie na nasączonym etanolem sterylnym kawałku bibuły w nowym naczyniu. I użyj sterylnego ostrza, aby wykonać ukośne nacięcie w poprzek dolnej części brzucha zwierzęcia. Przypnij zarodek do sterylnej podstawy z gąbki wzdłuż kręgosłupa i przenieś zarodek pod mikroskopem stereoskopowym do preparacji.

Ostrożnie przeciąć wzdłuż brzusznej linii środkowej i usunąć wątrobę i jelita. Układ moczowo-płciowy powinien być teraz widoczny. Wykonaj nacięcie w nasieniowodach, zamknij je w przyczepie cewki moczowej.

Następnie nacięcie polegało na przymocowaniu dolnej części przewodu Wolffa do gubernaculum w celu pobrania jąder i przewodów Wolffa. Umieszczanie tkanek na nowej szalce Petriego ze świeżym HBSS na lodzie podczas ich zbierania. Aby wyhodować zarodkowe grzbiety gonad, najpierw dodaj 300 mikrolitrów pożywki na studzienkę do 24-dołkowej płytki do hodowli komórek.

Następnie dodaj małą kroplę sterylnego HBSS do nowej szalki Petriego i umieść 0,8 mikrometra poliwęglanowej membrany do wytrawiania ścieżek na kropli tak, aby błyszcząca powierzchnia była skierowana w stronę HBSS. Zawsze umieszczaj membranę na wierzchu kropli HBSS, aby utrzymać nawodnienie tkanki szorstką stroną membrany skierowaną do góry. Za pomocą czystych kleszczy umieść dwa grzbiety narządów płciowych po szorstkiej stronie błony, tak aby tkanki się nie stykały.

I użyj sterylnej chusteczki, aby usunąć nadmiar HBSS. Podczas przenoszenia grzbietów narządów płciowych na błonę, podnieś próbkę między dwoma ramionami kleszczy, uważając, aby usunąć nadmiar HBSS z błony po przeniesieniu, aby zapobiec torbielowatemu wzrostowi przewodów Wolffa. Następnie umieść membranę w jednym dołku 24-dołkowej płytki, aby wyhodować tkanki interfejsu pożywki usznej w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, z całkowitą wymianą podłoża codziennie przez trzy dni.

Do czwartego dnia hodowli rozwinięte przewody Wolffa przekształcą się w wysoce pofałdowane rurki. Aby utrwalić tkanki dla całej immunofluorescencji, przenieś błony z hodowanymi gonadami i przewodami Wolffa na nowe szalki Petriego zawierające lodowaty PBS. Membrany będą unosić się na PBS.

Użyj końcówki kleszczy, aby zatopić membrany. I przenieś wyhodowane tkanki gonadalne do 4% paraformaldehydu. Po utrwaleniu przepłukać próbki trzema 10-minutowymi płukaniami w PBS plus Triton X, delikatnie kołysząc w temperaturze pokojowej.

Następnie odwadniaj tkanki w serii stopniowanego etanolu przez 10 minut przy każdym zanurzeniu w czterech stopniach Celsjusza i 30 obrotach na minutę. Aby przełączać próbki między zanurzeniami, pozwól tkankom osiąść w ciągu ostatnich dwóch minut odwodnienia. Następnie usuń jak najwięcej alkoholu, nie dotykając tkanek, i dodaj kolejne wyższe stężenie etanolu.

Po ostatnim odwodnieniu należy ponownie nawodnić tkanki w odwrotnej serii etanolu, jak właśnie pokazano. Następnie umyj chusteczki w PBS plus Triton X cztery razy przez 20 minut w temperaturze pokojowej. I 30 obrotów na minutę dla każdego prania.

Zablokuj tkanki na godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą buforu do bibuły, a następnie wykonaj nocną inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 30 obrotów na minutę w głównym przeciwciałie będącym przedmiotem zainteresowania. Następnego dnia umyj chusteczki cztery razy w PBS plus beztłuszczowe mleko w proszku przez 30 minut w temperaturze pokojowej i 30 obrotów na minutę przy każdym praniu. Po ostatnim myciu oznacz tkanki odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez godzinę w temperaturze pokojowej, powoli kołysząc i chroniąc przed światłem.

Następnie umyj chusteczki trzy razy w PBS plus tylko animacja. I przeanalizuj próbki za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Podczas opracowywania kanał Wolffa ulega znaczącym zmianom, w których prosta i prosta rura przekształca się w bardzo złożony i zwinięty kanał.

Aby przeanalizować mechanizmy molekularne zaangażowane w morfogenezę przewodu Wolffa, pożywkę hodowlaną można uzupełnić o inhibitory i aktywatory, które działają na różne szlaki sygnałowe. Na przykład, ten przewód Wolffa pozostał rozwinięty po trzech dniach hodowli w obecności jednego do sygnalizującego specyficznego inhibitora. Ścieżka najwyraźniej zaangażowana w zwijanie.

Barwienie immunologiczne całego wierzchowca przewodów Wolffa ujawnia ekspresję cytokeratyny-8 oraz obecność komórek proliferujących PH3 dodatnich i tkanek hodowli trzydniowej, a także ekspresję beta kateniny w świeżo wyizolowanych całych tkankach po zapłodnieniu w 18,5 dniu po zapłodnieniu. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu około pięciu do 10 minut na zarodek, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Postępując zgodnie z tą procedurą, środki farmakologiczne lub hormony mogą być testowane na narządach hodowlanych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące bezpośredniego wpływu tych środków na określone tkanki gonad.

Podejmując tę procedurę, należy pamiętać, aby nie chwytać grzbietów narządów płciowych bezpośrednio kleszczami. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią rozwojową do zbadania mechanizmów związanych z wrodzonymi nieprawidłowościami i anomaliami w rozwoju układu rozrodczego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować gojowskie grzbiety i wykonywać immunofluorescenę w całości.

Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być niezwykle niebezpieczna, a podczas pracy z tym materiałem należy zawsze nosić środki ochrony osobistej.