Name: Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek pluripotencjalnych w kardiomiocyty, komórki mięśni gładkich i śródbłonkowe. Technika ta umożliwia generowanie tkanki sercowej z komórek progenitorowych do naprawy mięśnia sercowego po urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty US Public Health Service dla NIH RO1s HL67828, HL95077, HL114120, oraz UO1 HL100407-project 4 (dla JZ), American Heart Association Scientist Development Grant (16SDG30410018) oraz Research Voucher Award z University of Alabama w Birmingham Center for Clinical and Translational Science (dla WZ).

Wszystkie procedury eksperymentalne są wykonywane zgodnie z wytycznymi dla zwierząt Uniwersytetu Alabama w Birmingham.
1. Rozróżnianie hiPSC na hiPSC-CM
<ol>
	<li>Pokrywy dołków 6-dołkowej płytki wstępnie schłodzoną galaretowatą mieszaniną białek o obniżonym współczynniku wzrostu w temperaturze 4 °C na noc. Przed użyciem odessać galaretowatą mieszaninę białek. Wysiewać hiPSC na wstępnie powlekane płytki i hodować komórki (1 x 105 komórek na studzienkę) w temperaturze 5% CO2 i 37 °C w podkładzie mTeSR1 z 10 μM inhibitorem ROCK.</li>
	<li>Odświeżaj pożywkę codziennie, aż komórki osiągną 90% zbieżności; następnie dodaj do pożywki mieszaninę galaretowatych białek o obniżonym współczynniku wzrostu (0,5 mg galaretowatej mieszaniny białek na 6-dołkową płytkę, 2 ml pożywki na dołek) i hoduj komórki przez 5% CO2 i 37 °C przez dwa kolejne dni.
	<ol>
		<li>Aby zastąpić pożywkę, delikatnie odessać pożywkę z szalki Petriego za pomocą podciśnienia, nie dotykając komórek, i dodać nową pożywkę za pomocą pipety transferowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zainicjować różnicowanie poprzez zastąpienie pożywki pożywką RPMI1640 uzupełnioną mieszaniną galaretowatych białek o obniżonym współczynniku wzrostu, B27 bez insuliny i 100 ng/ml aktywiny A; hodować komórki w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
	<li>Zastąp pożywkę pożywką RPMI1640 pożywką, która została uzupełniona witaminą B27 bez insuliny, 10 ng/ml białka morfogennego kości 4 (BMP-4) i 10 ng/ml podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF); hoduj komórki w temperaturze 5% CO2 i 37 °C przez 96 godzin.</li>
	<li>Zastąpić pożywkę pożywką RPMI1640 uzupełnioną witaminą B27 i kontynuować hodowlę komórek w temperaturze 5%CO2 i temperaturze 37 °C; odświeżać pożywkę co 3 dni.</li>
	<li>Obserwuj skupiska kurczących się komórek pod mikroskopem ~ 3 dni po zainicjowaniu różnicowania. Zbierz grona ~ 7 dni po pierwszych zaobserwowanych skurczach i umyj je w zrównoważonym roztworze soli Hanksa.
	<ol>
		<li>Rozdzielić zgrupowane komórki na płytce, inkubując je w buforze Hanksa zawierającym 100 j./ml kolagenazy IV przez 10 minut w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając; następnie dodać 0,25% trypsyny w kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) przez 5 minut.</li>
		<li>Zneutralizować roztwór enzymu 10% płodową surowicą bydlęcą w pożywce RPMI/B27, a następnie ponownie zawiesić komórki w pożywce RPMI/B27.</li>
		<li>Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Hodować komórki na 10-centymetrowych szalkach w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez co najmniej 3 godziny, co pozwoli komórkom niekardiomiocytów przylgnąć do powierzchni szalki hodowlanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórkową, która zawiera hiPSC-CM, i utrzymać komórki (około 1 x 106 komórek na 10 cm naczynie) poprzez hodowlę ich na galaretowatej powierzchni pokrytej mieszanką białek.</li>
</ol>
2. Rozróżnianie hiPSC na hiPSC-EC
<ol>
	<li>Dysocjować populację hiPSC na pojedyncze komórki, inkubując je z czynnikiem chelatującym w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez 5 minut. Przenieść komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej świeżą pożywkę mTeSR1.</li>
	<li>Odwiruj komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut. Ponownie zawieś komórki w pożywce mTeSR1 uzupełnionej inhibitorem 10 μM ROCK. Określ gęstość komórek za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Dodać 250 μl 20 jednostek NIH / ml roztworu trombiny do jednego dołka 24-dołkowej płytki.</li>
	<li>Dodać 1 x 106 hiPSC do 250 μl 12,5 mg/ml roztworu fibrynogenu. I dodaj 250 μl roztworu fibrynogenu zawierającego komórki do studzienki obciążonej trombiną. Obserwuj, jak mieszanina krzepnie, tworząc rusztowanie fibrynowe zawierające hiPSC w ciągu minuty.</li>
	<li>Przenieść zestalone, zawierające komórki rusztowania do studzienek 6-dołkowej płytki za pomocą kleszczyków ze szkła nakrywkowego i zainicjować różnicowanie poprzez hodowlę rusztowań w 2 ml pożywki EBM2 uzupełnionej 2% B27 bez insuliny, aktywiny-A (50 ng/ml) i BMP-4 (25 ng/ml) przez 24 godziny w temperaturze 5% CO2 i 37 °C.
	<ol>
		<li>Wymień pożywkę, delikatnie odsysając starą pożywkę za pomocą próżni, nie dotykając komórek. Dodać nową pożywkę EBM2 uzupełnioną witaminą B27 bez insuliny, czynnikiem wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF, 50 ng / ml), erytropoetyną (EPO, 100 ng / ml) i transformującym czynnikiem wzrostu β1 (TGFβ1, 10 ng / ml) i hodować rusztowania w temperaturze 5% CO2 i 37 °C przez 48 godzin.</li>
		<li>Odświeżyć pożywkę i hodować rusztowania w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez kolejne 48 godzin; następnie uwolnić komórki z rusztowania, dodając 200 U kolagenazy IV (100 U/ml) do pożywki.</li>
		<li>Zakręć komórkami po ich zwolnieniu. Zastąp pożywkę 2 ml pożywki EGM2-MV uzupełnionej 2% witaminy B27, VEGF-A (50 ng/ml) i SB-431542 (10 μM); Odświeżaj podłoże co dwa dni.</li>
		<li>Około 10 dni później (tj. w ~ dniu 14 po rozpoczęciu różnicowania) należy dysocjować komórki za pomocą 100 U/ml kolagenazy IV, wyizolować hiPSC-EC z populacji zróżnicowanych komórek za pomocą analiz cytometrii przepływowej pod kątem ekspresji białek markerowych specyficznych dla EC (np. CD31, CD144)3.</li>
		<li>Rozwiń izolowane hiPSC-EC za pomocą ustalonego protokołu3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Rozróżnianie hiPSC na hiPSC-SMC
<ol>
	<li>Wysiewać hiPSC na płytki pokryte galaretowatą mieszanką białek i hodować komórki w pożywce mTeSR1 w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C, z dziennymi zmianami pożywki, aż do zlewu (~ 2 dni).</li>
	<li>Zainicjuj różnicowanie w komórki linii mezodermalnej, hodując komórki za pomocą CHIR99021 (5 μM) i BMP-4 (10 ng / ml) w pożywce RPMI1640 i 2% B27 plus insulina przez 3 dni.</li>
	<li>Do produkcji hiPSC-SMC o fenotypie głównie syntetycznym:
	<ol>
		<li>Hodowla komórek z VEGF-A (25 ng / ml), czynnikiem wzrostu fibroblastów β (FGFβ, 5 ng / ml) w pożywce RPMI1640 i 2% B27 minus insulina w stężeniu 5% CO2 i 37 °C przez 4 dni.</li>
		<li>Hodować komórki w VEGF-A (25 ng/ml), FGFβ (5 ng/ml) w pożywce RPMI1640 i 2% B27 plus insulina w temperaturze 5% CO2 i 37 °C przez 2 dni.</li>
		<li>Hodowla komórek w płytkopochodnym czynniku wzrostu β (PDGFβ, 10 ng/ml), TGFβ (3 ng/ml) w RPMI1640 i 2% B27 plus insulina w stężeniu 5% CO2 i 37 °C przez 4 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W celu wytworzenia hiPSC-SMC o fenotypie z przewagą kurczliwości:
	<ol>
		<li>Hoduj komórki przez 4 dni z VEGF-A (25 ng / ml) i FGFβ (5 ng / ml) w RPMI1640 i 2% B27 minus insulina.</li>
		<li>Hoduj komórki przez 7 dni z PDGFβ (5 ng / ml) i TGFβ (2,5 ng / ml) w RPMI1640 i 2% B27 plus insulina.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyść końcowe populacje hiPSC-SMC, hodując komórki w mleczanie (4 mM) zawierającym RPMI1640 pożywkę metaboliczną przez ~ 6 dni.</li>
</ol>
4. Tworzenie mikrosfer zawierających IGF
<ol>
	<li>Rozgrzej oliwę z oliwek do temperatury 45 °C w łaźni wodnej.</li>
	<li>Podgrzać 5 ml 10% roztworu żelatyny do temperatury 50 °C.</li>
	<li>Dodać żelatynę do oliwy z oliwek, wymieszać, a następnie szybko schłodzić do temperatury 5 °C, dodając lód do łaźni wodnej.</li>
	<li>Dwadzieścia pięć minut później dodaj schłodzony (4 °C) aceton do oliwy z oliwek, aby wywołać tworzenie się mikrosfery.</li>
	<li>Utrzymywać temperaturę 5 °C przez 1 godzinę, następnie zebrać mikrosfery, umyć je 5 razy wstępnie schłodzonym acetonem w celu usunięcia oliwy z oliwek i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawiesić mikrosfery w roztworze 70% etanolu i 0,25% aldehydu glutarowego przez noc w temperaturze 4 °C, aby wywołać sieciowanie, a następnie zneutralizować mieszaninę 100 mM glicyny.</li>
	<li>Załadować IGF do mikrosfer, mieszając mikrosfery 5 mg z 15 μl destylowanegoH2Ozawierającego 5 μg IGF i 0,1% albuminy surowicy bydlęcej przez 30 min.</li>
</ol>
5. Tworzenie łaty w miejscu urazu i wstrzykiwanie komórek
<ol>
	<li>Zawiesić CM pochodzące z hiPSC (2 miliony), SMC (1 milion) i EC (1 milion) razem w 1 ml minimum essential medium (MEM).</li>
	<li>Zawiesić 5 mg mikrosfer w 1 ml roztworu fibrynogenu (25 mg/ml).</li>
	<li>Napełnij jedną strzykawkę roztworem zawierającym komórkę, drugą strzykawkę roztworem fibrynogenu/mikrosfery, a trzecią strzykawkę 1 ml roztworu trombiny (80 jednostek NIH / ml, uzupełnionych 2 μl 400 mM CaCl2 i 200 mM kwasu ε-aminokapronowego).</li>
	<li>Chirurgicznie wywołać zawał mięśnia sercowego w sercu świni poprzez podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej, jak opisano wcześniej2. 
	UWAGA: W skrócie, samice świń rasy Yorkshire (~13 kg, wiek 45 dni) są uspokojone domięśniowym wstrzyknięciem telazolu/ksylazyny (4,4 mg/kg) i intubowane w znieczuleniu ogólnym izofluranem (0,5-5%). Wykonywana jest 4 torakotomia międzyżebrowa i odsłaniana jest lewa przednia zstępująca tętnica wieńcowa. Tętnica wieńcowa jest zamykana przez ligaturę na 60 minut, a następnie ligatura jest usuwana. W przypadku migotania komór wykonuje się natychmiastową defibrylację elektryczną.</li>
	<li>Umieść sterylny plastikowy pierścień (~2,5 cm) na nasierdziu zawału serca świń, a następnie jednocześnie wstrzyknij roztwory mikrosfery/fibrynogenu i trombiny do pierścienia.</li>
	<li>Poczekaj, aż mieszanina zastygnie (~30 sekund), a następnie włóż igłę strzykawki zawierającej komórkę przez zestaloną mieszaninę do zawału mięśnia sercowego i wstrzyknij komórki. Zamknij warstwy mięśni, tkankę podskórną i ścianę klatki piersiowej za pomocą szwu Monocryl 3-0 lub 2-0 w zależności od wielkości zwierzęcia. Buprenorfina 0,01-0,02 mg/kg we wstrzyknięciu domięśniowym co 8 godzin będzie stosowana w celu opanowania bólu przez pierwsze 3 dni po zabiegu.</li>
	<li>Oceń czynność serca za pomocą rezonansu magnetycznego serca (MRI) przed zabiegiem chirurgicznym, tydzień i cztery tygodnie po zabiegu chirurgicznym2,3,4. Po końcowych badaniach MRI należy złożyć zwierzę w ofierze i poddać jego serca analizie histologicznej i molekularnej2,3,4.</li>
</ol>

<ol><li>Qiao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+and+proliferation+time+course+of+stem+cells+transplanted+in+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Death and proliferation time course of stem cells transplanted in the myocardium.</a> Mol Imaging Biol. 11 (6), 408-414 (2009).</li>
<li>Ye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+repair+in+a+porcine+model+of+acute+myocardial+infarction+with+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiovascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cardiac repair in a porcine model of acute myocardial infarction with human induced pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells.</a> Cell Stem Cell. 15 (6), 750-761 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Dutton, J. R., Su, L., Zhang, J., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+a+spatiotemporal+3D+environment+on+endothelial+cell+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of a spatiotemporal 3D environment on endothelial cell differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 35 (12), 3786-3793 (2014).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Induced-Pluripotent+Stem+Cells+into+Smooth-Muscle+Cells%3A+Two+Novel+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Induced-Pluripotent Stem Cells into Smooth-Muscle Cells: Two Novel Protocols.</a> PLoS One. 11 (1), e0147155(2016).</li>
<li>Rensen, S. S., Doevendans, P. A., van Eys, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+characteristics+of+vascular+smooth+muscle+cell+phenotypic+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Neth+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Regulation and characteristics of vascular smooth muscle cell phenotypic diversity.</a> Neth Heart J. 15 (3), 100-108 (2007).</li>
<li>Xu, C., Police, S., Hassanipour, M., Gold, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+bodies%3A+a+novel+culture+method+for+enrichment+of+cardiomyocytes+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Cardiac bodies: a novel culture method for enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells Dev. 15 (5), 631-639 (2006).</li>
<li>Anderson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+enrichment+of+cardiomyocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells.</a> Mol Ther. 15 (11), 2027-2036 (2007).</li>
<li>Huber, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+selection+of+cardiomyocytes+during+human+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Identification and selection of cardiomyocytes during human embryonic stem cell differentiation.</a> FASEB J. 21 (10), 2551-2563 (2007).</li>
<li>Kita-Matsuo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+and+protocols+for+creation+of+stable+hESC+lines+for+fluorescent+tracking+and+drug+resistance+selection+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors and protocols for creation of stable hESC lines for fluorescent tracking and drug resistance selection of cardiomyocytes.</a> PLoS One. 4 (4), e5046(2009).</li>
<li>Choi, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+and+endothelial+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells. 27 (3), 559-567 (2009).</li>
<li>Woll, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+promotes+hematoendothelial+cell+development+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling promotes hematoendothelial cell development from human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (1), 122-131 (2008).</li>
<li>Li, Z., Hu, S., Ghosh, Z., Han, Z., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+and+expression+profiling+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-+and+embryonic+stem+cell-derived+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Functional characterization and expression profiling of human induced pluripotent stem cell- and embryonic stem cell-derived endothelial cells.</a> Stem Cells Dev. 20 (10), 1701-1710 (2011).</li>
<li>Rufaihah, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+derived+from+human+iPSCS+increase+capillary+density+and+improve+perfusion+in+a+mouse+model+of+peripheral+arterial+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells derived from human iPSCS increase capillary density and improve perfusion in a mouse model of peripheral arterial disease.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (11), e72-e79 (2011).</li>
<li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li>
<li>Qu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+approaches+to+improve+cell+survival+in+myoblast+transfer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of approaches to improve cell survival in myoblast transfer therapy.</a> J Cell Biol. 142 (5), 1257-1267 (1998).</li>
<li>Tang, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracoronary+administration+of+cardiac+progenitor+cells+alleviates+left+ventricular+dysfunction+in+rats+with+a+30-day-old+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracoronary administration of cardiac progenitor cells alleviates left ventricular dysfunction in rats with a 30-day-old infarction.</a> Circulation. 121 (2), 293-305 (2010).</li>
<li>Zeng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+and+functional+consequences+of+bone+marrow-derived+multipotent+progenitor+cell+transplantation+in+hearts+with+postinfarction+left+ventricular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic and functional consequences of bone marrow-derived multipotent progenitor cell transplantation in hearts with postinfarction left ventricular remodeling.</a> Circulation. 115 (14), 1866-1875 (2007).</li>
<li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+myocardial+insulin-like+growth+factor+1+%28IGF-1%29+delivery+with+biotinylated+peptide+nanofibers+improves+cell+therapy+for+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Local myocardial insulin-like growth factor 1 (IGF-1) delivery with biotinylated peptide nanofibers improves cell therapy for myocardial infarction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (21), 8155-8160 (2006).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+insulin-like+growth+factor-1+in+mice+protects+from+myocyte+death+after+infarction%2C+attenuating+ventricular+dilation%2C+wall+stress%2C+and+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Overexpression of insulin-like growth factor-1 in mice protects from myocyte death after infarction, attenuating ventricular dilation, wall stress, and cardiac hypertrophy.</a> J Clin Invest. 100 (8), 1991-1999 (1997).</li>
<li>Wang, L., Ma, W., Markovich, R., Chen, J. W., Wang, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cardiomyocyte+apoptotic+signaling+by+insulin-like+growth+factor+I%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of cardiomyocyte apoptotic signaling by insulin-like growth factor I.</a> Circ Res. 83 (5), 516-522 (1998).</li>
<li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).</li>
</ol>

Poprawa wydajności/czystości hiPSC-CM
Konwencjonalne protokoły różnicowania ludzkich komórek macierzystych w CM są często ograniczone przez niską wydajność i czystość; na przykład tylko 35-66% hESC-CM uzyskanych przez separację Percoll i tworzenie ciała serca wyrażało powolny łańcuch ciężki miozyny lub cTnT6. Czystość zróżnicowanych populacji hiPSC-CM można znacznie zwiększyć poprzez selekcję pod kątem ekspresji genu reporterowego, który został powiązany z promotorem białk...

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są jednymi z najbardziej obiecujących środków do regeneracyjnej terapii komórkowej, ponieważ mogą być różnicowane w potencjalnie nieograniczony zakres i ilość komórek, które nie są odrzucane przez układ odpornościowy pacjenta. Jednak ich zdolność do samoreplikacji i różnicowania może również prowadzić do powstawania nowotworów, w związku z czym hiPSC muszą być w pełni zróżnicowane w określone typy komórek, takie jak kardiomiocyty (CM), komórki śródbłonka (EC) i komórki mięśni gładkich (SMC), przed podaniem. Jedną z najprostszych i najczęstszych metod podawania komórek jest bezpośrednie wstrzyknięcie do mięśnia sercowego, ale liczba przeszczepionych komórek, które są wszczepiane przez natywną tkankę mięśnia sercowego, jest wyjątkowo niska. Wiele z tego wyczerpania można przypisać cytotoksycznemu środowisku niedokrwionej tkanki; jednakże, gdy mysie embrionalne komórki macierzyste (ESC) zostały wstrzyknięte bezpośrednio do mięśnia sercowego nieuszkodzonego serca, tylko ~40% z 5 milionów dostarczonych komórek zostało zachowanych przez 3-5 godzin1, co sugeruje, że znaczna część podanych komórek opuściła miejsce podawania, być może dlatego, że zostały wyciśnięte przez ścieżkę igły przez wysokie ciśnienie wytwarzane podczas skurczu mięśnia sercowego.
Tutaj prezentujemy nowatorskie i znacznie bardziej efektywne metody generowania kardiomiocytów pochodzących z hiPSC (hiPSC-CMs)2, komórek śródbłonka (hiPSC-ECs)3, oraz komórek mięśni gładkich (SMC)4. Warto zauważyć, że ten protokół hiPSC-SMC jest pierwszym, który naśladuje szeroki zakres cech morfologicznych i funkcjonalnych obserwowanych w somatycznych SMCs5, kierując komórki w kierunku głównie syntetycznego lub kurczliwego fenotypu SMC. Zapewniamy również metodę dostarczania komórek, która poprawia szybkość wszczepiania wstrzykiwanych komórek poprzez tworzenie plastra fibrynowego zawierającego cytokiny w miejscu wstrzyknięcia. Wydaje się, że plaster poprawia zarówno retencję komórek, uszczelniając ścieżkę igły, aby zapobiec wydostawaniu się komórek z mięśnia sercowego, jak i przeżycie komórek, uwalniając insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF) przez okres co najmniej trzech dni.

<table><tbody><tr><td>Protocol Section 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel o obniżonym współczynniku wzrostu</td><td>Corning</td><td>lifescience 356231</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Technologie</td><td>komórek macierzystych</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27, bez surowicy</td><td>Fisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R& D</td><td>338-AC-010</td><td></td></tr><tr><td>BMP-4</td><td>R& D</td><td>314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>232-FA-025</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza IV</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0217889</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Zrównoważony roztwór soli (dekstroza, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 bezwodny)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14175079</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>10438018</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 6-dołkowa</td><td>Corning Lifescience</td><td>356721</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Corning</td><td>Lifescience</td><td>354732</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator komórek</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Protocol Sekcja 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Fisher Scientific</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8630-5g</td><td></td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7009-1KU</td><td></td></tr><tr><td>EMB2 średni</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>VEGF</td><td>ProSpec-Tany</td><td>CYT-241</td><td></td></tr><tr><td>EPO</td><td>Life Technologies</td><td>PHC9431</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&#946;</td><td>Peprotech</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>EGM2-MV medium</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>Selleckchem</td><td>S1067</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Bioscience</td><td>BDB555445</td><td></td></tr><tr><td>CD144</td><td>BD Bioscience</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówka wirówkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorff</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Protocol, sekcja 3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>720542</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-&#946;</td><td>Prospec</td><td>CYT-501-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Protocol Sekcja 4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oliwa z oliwek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1514</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>Aldehyd glutarowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>IGF</td><td>R& D</td><td>291-G1-01M</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Fisher Scientific</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10Q</td><td></td></tr><tr><td>Protokół Sekcja 5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>&#949;-kwas aminokapronowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0420000</td><td></td></tr><tr><td>MEM podłoże</td><td>Fisher Scientific</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482748</td><td></td></tr><tr><td>Respirator anestezjologiczny</td><td>Datex-Ohmeda</td><td>47810</td><td></td></tr><tr><td>Respirator anestezjologiczny</td><td>Ohio Medical</td><td>V5A</td><td></td></tr><tr><td>Defibrylator</td><td>Physiol Control</td><td>LIFEPAK 15</td><td></td></tr><tr><td>1,5 T MRI</td><td>General</td><td>Electric Signa Horizon LX</td><td></td></tr><tr><td>7 T</td><td>MRI Siemens</td><td>10018532</td><td></td></tr><tr><td>Gadolinowy środek kontrastowy (Magnevist)</td><td>Berlex</td><td>50419-188-02</td><td></td></tr><tr><td>2-0 szew jedwabny</td><td>Ethilon</td><td>685H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 szew jedwabny</td><td>Ethilon</td><td>622H</td><td></td></tr><tr><td>3-0 szew monofilamentowy</td><td>Ethilon</td><td>627H</td><td></td></tr></tbody></table>

pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Pluripotent Stem Cell Derived Cardiac Cells for Myocardial Repair

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) muszą być w pełni zróżnicowane na określone typy komórek przed podaniem, ale konwencjonalne protokoły różnicowania hiPSC na kardiomiocyty (hiPSC-CMs), komórki śródbłonka (hiPSC-ECs) i komórki mięśni gładkich (SMC) są często ograniczone przez niską wydajność, czystość i/lub słabą stabilność fenotypową. W tym miejscu przedstawiamy nowatorskie protokoły generowania hiPSC-CM, -EC i -SMC, które są znacznie bardziej wydajne niż konwencjonalne metody, a także metodę łączenia wstrzykiwania komórek z plastrem zawierającym cytokiny utworzonym w miejscu podania. Plaster poprawia zarówno retencję wstrzykniętych komórek, uszczelniając ścieżkę igły, aby zapobiec wyciśnięciu komórek z mięśnia sercowego, jak i przeżycie komórek, uwalniając insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF) przez dłuższy czas. W świńskim modelu uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego, szybkość wszczepienia była ponad dwukrotnie większa, gdy komórkom podawano plaster zawierający cytokiny w porównaniu z komórkami bez plastra, a leczenie zarówno komórkami, jak i łatą, ale nie samymi komórkami, wiązało się ze znaczną poprawą funkcji serca i wielkości zawału.

Charakterystyka zróżnicowanych hiPSC-CM, -EC i -SMC
Zdolność różnicowania hiPSC została oceniona2,3,4. Analizy cytometrii przepływowej ekspresji troponiny T serca (cTnT) sugerują, że czystość końcowej populacji hiPSC-CM może przekraczać 90% (Rysunek 1A, 1B, panel B1). Prawie wszystkie komórki wykazywały ek...

Prezentujemy trzy nowatorskie i bardziej efektywne protokoły różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich oraz metodę dostarczania, która poprawia wszczepianie przeszczepionych komórek poprzez połączenie iniekcji komórek z dostarczaniem cytokin za pośrednictwem łatki.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) must be fully differentiated into specific cell types before administration, but conventional protocols for ...

Ogólnym celem niniejszego filmu jest przedstawienie techniki różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty oraz zademonstrowanie wykorzystania tych komórek do badania regeneracji mięśnia sercowego po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące inżynierii tkanki serca z wykorzystaniem pochodzących z ludzkich komórek iPS komórek serca w celu naprawy mięśnia sercowego. Główną zaletą tej procedury jest to, że pozwala ona naukowcom na pozyskanie oczyszczonych kardiomiocytów, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka oraz wytworzenie tkanki serca z tych komórek progenitorowych.Ling Gao jest pracownikiem postdoktorskim w laboratorium dr Zhanga na UAB, a Greg Walcott jest kardiologiem w szpitalu UAB. Trina jest specjalistą MRI w szpitalu UAB. Aby zindukować różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty, należy najpierw pokryć dołki płytki sześciodołkowej mieszaniną białka żelatynowego o zredukowanej zawartości czynników wzrostu, schłodzoną do 4 °C.Następnie schłodź płytkę przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnego dnia odessij żelatynową mieszanin

pluripotent-stem-cell-derived-cardiac-cells-for-myocardial-repair

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego w mysich modelach chorób sercowo-naczyniowych, takich jak nadciśnienie czy zawał mięśnia sercowego, jest szeroko stosowane do testowania potencjału terapeutycznego różnych typów komórek w badaniach regeneracyjnych. Dlatego szczegółowy opis i przejrzysta wizualizacja tego zabiegu chirurgicznego pomogą określić ograniczenia i zalety analiz terapeutycznych komórek sercowo-naczyniowych u małych gryzoni.

Dostarczanie komórek do mięśnia sercowego: obserwacje w mysich sercach

W tym protokole zostanie zilustrowane pochodzenie komórek progenitorowych serca zarówno z mysich, jak i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Główną strategią w tym protokole jest wzbogacenie komórek progenitorowych serca za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnych reporterów zmodyfikowanych w embrionalnych liniach komórek macierzystych.

Wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Tutaj prezentujemy solidną metodę przeprogramowania pierwotnych fibroblastów embrionalnych w funkcjonalne kardiomiocyty poprzez nadekspresję GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 i miR-133 (GHMT2m) wraz z hamowaniem sygnalizacji TGF-β. Nasz protokół generuje bicie kardiomiocytów już po 7 dniach od transdukcji z wydajnością do 60%.

Tłumienie sygnalizacji pro-fibrotycznej nasila przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy w indukowane kardiomiocyty za pośrednictwem czynników

Ten protokół opisuje technikę różnicowania śródbłonka dla komórek progenitorowych serca. W szczególności koncentruje się na tym, jak stężenie surowicy i gęstość wysiewu komórek wpływają na potencjał różnicowania śródbłonka.

Indukcja różnicowania śródbłonka w komórkach progenitorowych serca w warunkach niskiej surowicy

Tutaj podajemy szczegółowy opis eksperymentalnego zestawu do analizy oceny integralności DNA w komórkach macierzystych przed przeszczepem komórki.

Ocena integralności DNA komórek macierzystych w terapii komórek serca

Obecny protokół generuje siatkowe tkanki serca zawierające komórki sercowo-naczyniowe pochodzące z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, aby umożliwić badanie terapii implantacji komórek w chorobach serca.

Przygotowanie zmodyfikowanych tkanek serca w kształcie siatki pochodzących z ludzkich komórek iPS do naprawy mięśnia sercowego in vivo

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Dostarczanie komórek pod kontrolą ultradźwięków w miejscu zawału mięśnia sercowego u myszy jest bezpiecznym, skutecznym i wygodnym sposobem przeszczepu komórek.

Indukowana ultradźwiękami indukowana pluripotencjalna implantacja kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych u myszy z zawałem mięśnia sercowego

Poznaj metodę różnicowania ludzkich komórek pluripotencjalnych w kardiomiocyty, komórki mięśni gładkich i śródbłonkowe. Technika ta umożliwia generowanie tkanki sercowej z komórek progenitorowych do naprawy mięśnia sercowego po urazie niedokrwienno-reperfuzyjnym.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Przeglądaj więcej filmów