Name: Legionella pneumophila (Legionella pneumophila) Pęcherzyki błony zewnętrznej: izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego na makrofagach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Poznaj metodę izolacji pęcherzyków błony zewnętrznej Legionella pneumophila i analizę ich wpływu na makrofagi. Technika ta pozwala badać potencjał prozapalny OMV oraz ich rolę w interakcjach patogen-gospodarz.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Prof. Dr. Markusowi Schnare'owi za dostarczenie nam myszy TLR2-/- i TLR2/4-/- oraz Prof. Dr. Carsten Kirschning za myszy TRIF/MyD88-/-. Część tych prac została sfinansowana przez Bundesministerium für Bildung und Forschung (e:bio miRSys - FKZ 0316175B, e:Med CAPSYS - FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB/TR-84; http://www.sfb-tr84.de/) oraz Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (LOEWE Medical RNomics - FKZ 519/03/00.001-(0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), wszystkie dla BS.

1. Przygotowanie pożywki i płytek z agarem
<ol>
	<li>Przygotuj 1 L pożywki płynnej (YEB). Rozpuść 10 g ACES i 10 g ekstraktu drożdżowego w 900 mL wody destylowanej. Dostosuj pH do 6,9 za pomocą KOH (5 N). Dodaj 10 mL L-cysteiny (0,4 g w 10 mL wody destylowanej) oraz 10 mL Fe(NO3)3x9H2O (0,25 g w 10 mL wody destylowanej). Dopełnij objętość do 1 L wodą destylowaną i wysterylizuj roztwór poprzez filtrację (rozmiar porów: 0,22 µm). Przechowuj w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj płytki z buforowanym agarem z ekstraktem drożdżowym i węglem aktywnym (BCYE). Rozpuść 10 g ACES i 10 g ekstraktu drożdżowego w 900 mL wody destylowanej. Dostosuj pH do 6,9 za pomocą KOH (5 N). Dodaj 15 g agaru i 2,5 g węgla aktywnego. Dopełnij objętość do 1 L wodą destylowaną i wysterylizuj w autoklawie.
	<ol>
		<li>Do schłodzonego BCYE (około 50 °C) dodaj 10 mL L-cysteiny (0,4 g w 10 mL wody destylowanej) oraz 10 mL Fe(NO3)3x9H2O (0,25 g w 10 mL wody destylowanej; oba roztwory wysterylizowane przez filtrację przez pory 0,22-µm). Wlej pożywkę na płytki i przechowuj w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Hodowla L. pneumophila
<ol>
	<li>Wysiać szczep Corby L. pneumophila (typ dziki, WT) na płytki z agarem BCYE i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 dni. Zaszczepić 10 mL bulionu YEB przy OD600 wynoszącej 0,3 bakteriami L. pneumophila z płytki prekultury; inkubować bakterie w temperaturze 37 °C na inkubatorze obrotowym (150 rpm) przez 6 h.</li>
	<li>Zweryfikować czystość hodowli płynnej poprzez wysianie 100 µL zawiesiny na płytkę z agarem krwią. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać pozostałą hodowlę płynną do 90 mL świeżego medium YEB i inkubować na inkubatorze obrotowym (37 °C i 150 rpm) do osiągnięcia OD600 na poziomie 3,0-3,5, co zajmuje około 16-20 h.</li>
</ol>
3. Przygotowanie i kwantyfikacja OMV L. pneumophila
UWAGA: Wszystkie poniższe etapy wirowania należy przeprowadzać w warunkach sterylnych i w temperaturze 4 °C.
<ol>
	<li>Odwirować kulturę w cieczy przy 4,000 x g przez 20 min w celu osadzenia bakterii. Przenieść naddatek do nowych probówek do wirowania, usunąć osad bakteryjny i powtórzyć wirowanie (4,000 x g przez 20 min). Powtórzyć ten krok raz.</li>
	<li>Przefiltrować pozostały naddatek dwukrotnie przez filtr sterylny (rozmiar porów: 0.22 µm). Przenieść wolny od bakterii naddatek do probówek do ultrawirowania i ultrawirować przy 100,000 x g przez 3 h.</li>
	<li>Zlać naddatek i go usunąć. Resuspendować osad OMV w sterylnym roztworze soli fosforanowo-buforowanej (PBS) i ultrawirować (100,000 x g przez 3 h), aby usunąć zanieczyszczające białka i LPS.</li>
	<li>Usunąć naddatek i resuspendować osad OMV w 500 µL sterylnego PBS. Wysiać 20 µL na płytkę z agarem krwi oraz na płytkę z agarem BCYE, aby wykluczyć zanieczyszczenie przygotowanych pęcherzyków bakteriami. Inkubować płytkę z agarem krwi przez noc, a płytkę z agarem BCYE przez 3 dni (obie w temperaturze 37 °C).</li>
	<li>Oznaczyć ilość białka otrzymanego z preparatu OMV za pomocą testu z kwasem bicinchoninowym zgodnie z instrukcją producenta. 
	UWAGA: Stężenie w 100 mL kultury L. pneumophila wynosi zazwyczaj 1 µg/µL. Przygotowane i skwantyfikowane OMV przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4. Obróbka wstępna makrofagów
<ol>
	<li>Przygotuj komórki THP-1. 
	UWAGA: THP-1 jest monocytyczną linią komórkową pochodzącą od pacjenta z białaczką.
	<ol>
		<li>Dodaj 2x105 wysiać komórki THP-1 do płytek 24-dołkowych i zróżnicować je do fenotypu makrofagopodobnego poprzez dodanie 20 nM forbolu 12-mirystynianu 13-octanu (PMA). Inkubować przez 24 h w 37 °C.</li>
		<li>Wymień pożywkę na 500 µL do świeżej pożywki i inkubować przez kolejne 24 h; optymalna pożywka dla komórek THP-1 składa się z RPMI 1640 z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionej o 10% płodowej surowicy cielęcej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyizolować makrofagi pochodzące z szpiku kostnego myszy (mBMDM) zgodnie z opisem w publikacji 20.</li>
	<li>Inkubuj makrofagi pochodzące z linii THP-1 lub mBMDM z OMV.
	<ol>
		<li>Rozmrozić OMV przygotowane w kroku 3 i dodać je zgodnie z zawartością białka (0,1, 1 oraz 10 µg/mL) do makrofagów ludzkich lub mysich. Inkubować makrofagi z OMV w temperaturze 37 °C przez co najmniej 20 h. Nadpływ należy wykorzystać do testu ELISA lub przejść do kroku 5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Zakażenie makrofagów i ocena replikacji bakteryjnej za pomocą testu jednostek tworzących kolonie (CFU)
<ol>
	<li>Użyć L. pneumophila z kroku 2.1, poddanych wstępnej obróbce komórek THP-1 lub mBMDM z kroku 4.3, a także makrofagów bez wstępnej obróbki jako kontroli (2x105/24 studzienek). Nie wymieniać pożywki.</li>
	<li>Zainfekować komórki THP-1 szczepem L. pneumophila Corby WT, a mBMDM mutantem L. pneumophila Corby pozbawionym flagelliny (w obu przypadkach z mnożnością infekcji (MOI) wynoszącą 0,5; 1x105 L. pneumophila/24 studzienki) i inkubować odpowiednio przez 24 i 48 h. Przygotować oba warianty L. pneumophila Corby (WT lub mutant pozbawiony flagelliny) zgodnie z opisem w kroku 2.1.</li>
	<li>Zlizować komórki w pożywce poprzez dodanie saponiny (stężenie końcowe: 0,1%) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min.</li>
	<li>Resuspendować bakterie poprzez pipetowanie i przenieść zawiesinę do naczynia reakcyjnego. Przygotować rozcieńczenia seryjne pożywek zawierających L. pneumophila w sterylnym PBS.</li>
	<li>Wysiać 50 µL odpowiednich rozcieńczeń na płytki z agarem BCYE i inkubować przez 3 dni w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Policzyć wizualnie powstałe kolonie. Obliczyć CFU <img alt="Wzór na kwantyfikację bakterii, CFU/mL = liczba policzonych kolonii × czynnik rozcieńczenia, równanie." src="/files/ftp_upload/55146/55146eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Równanie 1">  Znormalizować wynik liczenia CFU względem zainfekowanych makrofagów bez wstępnej obróbki, które przyjmuje się za 100%.</li>
</ol>

<ol><li>Cambronne, E. D., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+and+delivery+of+effector+proteins+into+eukaryotic+cells+by+bacterial+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Recognition and delivery of effector proteins into eukaryotic cells by bacterial secretion systems.</a> Traffic. 7 (8), 929-939 (2006).</li>
<li>Ellis, T. N., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+and+immunomodulatory+roles+of+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74 (1), 81-94 (2010).</li>
<li>Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+gram-negative+cell+walls+and+their+derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles.</a> J Bacteriol. 181 (16), 4725-4733 (1999).</li>
<li>Kuehn, M. J., Kesty, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+and+the+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction.</a> Genes Dev. 19 (22), 2645-2655 (2005).</li>
<li>Chi, B., Qi, M., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+dentilisin+in+Treponema+denticola+epithelial+cell+layer+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of dentilisin in Treponema denticola epithelial cell layer penetration.</a> Res Microbiol. 154 (9), 637-643 (2003).</li>
<li>Kolling, G. L., Matthews, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Export+of+virulence+genes+and+Shiga+toxin+by+membrane+vesicles+of+Escherichia+coli+O157%3AH7%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli O157:H7.</a> Appl Environ Microbiol. 65 (5), 1843-1848 (1999).</li>
<li>Horstman, A. L., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterotoxigenic+Escherichia+coli+secretes+active+heat-labile+enterotoxin+via+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles.</a> J Biol Chem. 275 (17), 12489-12496 (2000).</li>
<li>Dorward, D. W., Schwan, T. G., Garon, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+capture+and+detection+of+Borrelia+burgdorferi+antigens+in+urine%2C+blood%2C+or+tissues+from+infected+ticks%2C+mice%2C+dogs%2C+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immune capture and detection of Borrelia burgdorferi antigens in urine, blood, or tissues from infected ticks, mice, dogs, and humans.</a> J Clin Microbiol. 29 (6), 1162-1170 (1991).</li>
<li>Mashburn, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+traffic+signals+and+facilitate+group+activities+in+a+prokaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote.</a> Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).</li>
<li>Kesty, N. C., Mason, K. M., Reedy, M., Miller, S. E., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterotoxigenic+Escherichia+coli+vesicles+target+toxin+delivery+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells.</a> EMBO J. 23 (23), 4538-4549 (2004).</li>
<li>Abu Kwaik, Y., Gao, L. Y., Stone, B. J., Venkataraman, C., Harb, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+protozoa+by+Legionella+pneumophila+and+its+role+in+bacterial+ecology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial ecology and pathogenesis.</a> Appl Environ Microbiol. 64, 3127-3133 (1998).</li>
<li>Winn, W. C., Myerowitz, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+the+Legionella+pneumonias.+A+review+of+74+cases+and+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of the Legionella pneumonias. A review of 74 cases and the literature.</a> Hum Pathol. 12 (5), 401-422 (1981).</li>
<li>Ge, J., Shao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+host+vesicular+trafficking+and+innate+immune+defence+by+Legionella+Dot%2FIcm+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Manipulation of host vesicular trafficking and innate immune defence by Legionella Dot/Icm effectors.</a> Cell Microbiol. 13 (12), 1870-1880 (2011).</li>
<li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 261-283 (2010).</li>
<li>Fernandez-Moreira, E., Helbig, J. H., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+shed+by+Legionella+pneumophila+inhibit+fusion+of+phagosomes+with+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles shed by Legionella pneumophila inhibit fusion of phagosomes with lysosomes.</a> Infect Immun. 74 (6), 3285-3295 (2006).</li>
<li>Galka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+characterization+of+the+whole+secretome+of+Legionella+pneumophila+and+functional+analysis+of+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Proteomic characterization of the whole secretome of Legionella pneumophila and functional analysis of outer membrane vesicles.</a> Infect Immun. 76 (5), 1825-1836 (2008).</li>
<li>Jager, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+tissue+explants+reveal+novel+interactions+during+Legionella+pneumophila+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Human lung tissue explants reveal novel interactions during Legionella pneumophila infections.</a> Infect Immun. 82 (1), 275-285 (2014).</li>
<li>Ellis, T. N., Leiman, S. A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+produced+outer+membrane+vesicles+from+Pseudomonas+aeruginosa+elicit+a+potent+innate+immune+response+via+combined+sensing+of+both+lipopolysaccharide+and+protein+components%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Naturally produced outer membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa elicit a potent innate immune response via combined sensing of both lipopolysaccharide and protein components.</a> Infect Immun. 78 (9), 3822-3831 (2010).</li>
<li>Jager, J., Keese, S., Roessle, M., Steinert, M., Schromm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+Legionella+pneumophila+outer+membrane+vesicles+with+eukaryotic+membrane+systems+is+a+mechanism+to+deliver+pathogen+factors+to+host+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fusion of Legionella pneumophila outer membrane vesicles with eukaryotic membrane systems is a mechanism to deliver pathogen factors to host cell membranes.</a> Cell Microbiol. , (2014).</li>
<li>Jung, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+pneumophila-Derived+Outer+Membrane+Vesicles+Promote+Bacterial+Replication+in+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Legionella pneumophila-Derived Outer Membrane Vesicles Promote Bacterial Replication in Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (4), (2016).</li>
<li>Jiang, Y., Kong, Q., Roland, K. L., Curtiss, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+of+Clostridium+perfringens+type+A+strains+induce+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles of Clostridium perfringens type A strains induce innate and adaptive immunity.</a> Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 431-443 (2014).</li>
<li>Whitmire, W. M., Garon, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+nonspecific+responses+of+murine+B+cells+to+membrane+blebs+of+Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Specific and nonspecific responses of murine B cells to membrane blebs of Borrelia burgdorferi.</a> Infect Immun. 61 (4), 1460-1467 (1993).</li>
<li>Ismail, S., Hampton, M. B., Keenan, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+outer+membrane+vesicles+modulate+proliferation+and+interleukin-8+production+by+gastric+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori outer membrane vesicles modulate proliferation and interleukin-8 production by gastric epithelial cells.</a> Infect Immun. 71 (10), 5670-5675 (2003).</li>
<li>Jager, J., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+outer+membrane+vesicles+shed+by+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of outer membrane vesicles shed by Legionella pneumophila.</a> Methods Mol Biol. 954, 225-230 (2013).</li>
<li>Park, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li>
<li>Casson, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+caspase-4+mediates+noncanonical+inflammasome+activation+against+gram-negative+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human caspase-4 mediates noncanonical inflammasome activation against gram-negative bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6688-6693 (2015).</li>
<li>Molofsky, A. B., Shetron-Rama, L. M., Swanson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Components+of+the+Legionella+pneumophila+flagellar+regulon+contribute+to+multiple+virulence+traits%2C+including+lysosome+avoidance+and+macrophage+death%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Components of the Legionella pneumophila flagellar regulon contribute to multiple virulence traits, including lysosome avoidance and macrophage death.</a> Infect Immun. 73 (9), 5720-5734 (2005).</li>
<li>Isaac, D. T., Laguna, R. K., Valtz, N., Isberg, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MavN+is+a+Legionella+pneumophila+vacuole-associated+protein+required+for+efficient+iron+acquisition+during+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MavN is a Legionella pneumophila vacuole-associated protein required for efficient iron acquisition during intracellular growth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (37), 5208-5217 (2015).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+cytosolic+RpsL+by+macrophages+induces+lysosomal+cell+death+and+termination+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Sensing cytosolic RpsL by macrophages induces lysosomal cell death and termination of bacterial infection.</a> PLoS Pathog. 11 (3), 1004704(2015).</li>
<li>Chutkan, H., Macdonald, I., Manning, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+preparations+of+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative preparations of bacterial outer membrane vesicles.</a> Methods Mol Biol. 966, 259-272 (2013).</li>
<li>Macdonald, I. A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+outer+membrane+vesicle+production+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Stress-induced outer membrane vesicle production by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 195 (13), 2971-2981 (2013).</li>
<li>Klimentova, J., Stulik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolation+and+purification+of+outer+membrane+vesicles+from+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Res%22%5BJournal%5D)">Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria.</a> Microbiol Res. 170, 1-9 (2015).</li>
<li>Novartis.com. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause">https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause</a> (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

OMV patogenów bakteryjnych i wpływ tych pęcherzyków błonowych na ich komórki docelowe są obecnie intensywnie badane. Na przykład OMV pochodzące z Clostridium perfringens indukują wydzielanie cytokin w makrofagach, limfocyty B mogą być aktywowane przez OMV z Borrelia burgdorferi, a pęcherzyki błonowe uwalniane przez Helicobacter pylori mogą działać na komórki nabłonka żołądka 21,22,23. L. pneumophila, patogen wewnątrzkomórkowy, który może wywołać ciężką postać atypowego zapalenia płuc, uwalnia również OMV, które są w stanie aktywować komórki nabłonka płuc i makrofagi16,19. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji OMV L. pneumophila na małą skalę z płynnej hodowli w celu zbadania potencjalnej roli OMV w zapaleniu płuc. Bardzo ważne jest, aby pracować w sterylnych warunkach i wykluczyć zanieczyszczenie innymi bakteriami, aby uzyskać czysty preparat OMV pochodzący z L. pneumophila. Izolacja OMV obejmuje etap filtracji przez pory 0,22 μm w celu zapobieżenia zanieczyszczeniu otrzymanej osadki OMV L. pneumophila, nawet jeśli zmniejsza to wydajność OMV, ponieważ największe OMV są tracone na tym etapie filtracji.
Ponadto przetestowaliśmy reakcję makrofagów ludzkich i mysich na te izolowane pęcherzyki i komórki zakażone L. pneumophila , aby bardziej zbliżyć się do sytuacji w zapaleniu płuc Legionella , gdzie OMV są uwalniane do wnętrza LCV przez bakterie zewnątrzkomórkowe15. Zastosowane dawki OMV oszacowano na podstawie ilości wolnego OMV w zakażeniu in vitro ludzkimi makrofagami po 24 godzinach inkubacji (opisanej w piśmiennictwie 20). Do stymulacji innych komórek biorcy lub eksperymentów in vivo mogą być konieczne i muszą być ustalone inne dawki OMV. Analiza wpływu OMV L. pneumophila stanowi postęp w stosunku do protokołu opisanego przez Jagera i Steinerta24.
W tym przypadku zróżnicowane PMA komórki THP-1 służą jako model dla makrofagów pęcherzykowych ze względu na ograniczoną dostępność pierwotnego materiału ludzkiego. Dodatek PMA różnicuje monocytowe komórki THP-1 w komórki podobne do makrofagów25. Co więcej, są one dobrze znaną modelową linią komórkową do badań nad L. pneumophila 26. Oprócz tej ludzkiej linii komórek monocytowych stosuje się komórki mBMDM. mBMDM są powszechnie akceptowane w badaniach nad skutkami L. pneumophila 27,28,29. Możliwość wykorzystania nokautów genetycznych dla różnych TLR lub innych białek sprawia, że są one cennym narzędziem do badania efektów OMV. W celu zmniejszenia liczby myszy w eksperymencie, mBMDM są używane zamiast makrofagów pęcherzykowych ze względu na ograniczenia makrofagów. Kluczowe eksperymenty mogą wymagać makrofagów pęcherzykowych do walidacji.
Oprócz opisanego w niniejszym dokumencie protokołu ultrawirowania w celu oczyszczenia OMV, możliwe jest przeprowadzenie wirowania w gradiencie gęstości, które jest zawarte w protokole przez Chutkan i wsp.30. Może to poprawić czystość otrzymanego preparatu OMV i zmniejszyć ilość współoczyszczonych agregatów białkowych, flageliny i LPS. Czystość otrzymanego preparatu OMV może być analizowana za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej lub analizy śledzenia nanocząstek jako dodatkowy etap kontroli jakości. Może to zapewnić dodatkowy sposób oceny ilościowej, wykraczający poza przedstawioną tutaj procedurę pomiaru białka. Opcjonalnie stężenie LPS można analizować za pomocą testu lizatu amebocytów limulusa. Jeśli uzysk OMV jest niski, można przeprowadzić dodatkowy etap zatężania za pomocą filtrów odśrodkowych, czego w tym przypadku nie zrobiono. Jeśli wydajność była niższa niż oczekiwano, OMV były odrzucane.
W ramach trwających wysiłków mających na celu wyjaśnienie mechanizmów i funkcji biologicznych stojących za OMV można przetestować wpływ różnych warunków stresowych na produkcję OMV. Niedobór składników odżywczych, zmiany temperatury inkubacji lub narażenie na czynniki szkodliwe mogą mieć wpływ na wydzielanie OMV31. Możliwe warunki naprężeń zostały omówione w protokole przez Klimentovą i Stulika32. Co więcej, można wygenerować hiper- lub hipopęcherzykowe mutanty L. pneumophila . Różne preparaty OMV mogą być następnie analizowane w eksperymentach z infekcją makrofagami, eksplantatami ludzkiej tkanki płucnej (opisanymi w Piśmiennictwie 17), a nawet w modelach in vivo . Oprócz roli OMV we wrodzonej sygnalizacji immunologicznej, ich wpływ na komunikację bakteryjną można zbadać eksperymentalnie. Co więcej, wpływ różnych wrodzonych kaskad sygnalizacji immunologicznej może być analizowany za pomocą mysich komórek nokautujących lub generowania nokautów CRISPR/Cas9 w ludzkich liniach komórkowych. Te podstawowe badania nad OMV pomogą w opracowaniu nowych strategii szczepień, które już istnieją w przypadku zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych typu B przenoszonego przez Neisseria meningitides33.
Wychodząc od protokołu izolacji i charakterystyki OMV, można go zastosować do innych bakterii Gram-ujemnych i innych komórek gospodarza; Wystarczy go dostosować do wzrostu bakterii w płynnej kulturze. Protokół opublikowany przez Chutkan i wsp. zawiera szczegółowe informacje na temat wytwarzania OMV z Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa30. Hodowla nie powinna osiągać późnej fazy stacjonarnej, aby uniknąć wzrostu liczby bakterii poddanych lizie oraz zanieczyszczania białek i błon. Dodatkowo, dawka OMV stosowana do stymulacji komórek gospodarza musi być określona w zależności od ilości OMV obecnych podczas infekcji in vivo , przy jednoczesnym zapewnieniu niskiego wskaźnika cytotoksyczności. W ten sposób można było zbadać patologiczną rolę OMV, ich wpływ na komunikację międzygatunkową oraz interakcje gospodarz-patogen.
Aby dalej badać rolę OMV L. pneumophila w zapaleniu płuc, potrzebne są standaryzowane preparaty OMV o wystarczającej wydajności i porównywalnych eksperymentach z infekcjami. Protokół ten pomoże ustandaryzować procedury izolacji i rozszerzyć badania OMV na inne bakterie Gram-ujemne i inne komórki gospodarza. Ponadto w badaniach wykorzystana zostanie szczegółowa wiedza z zakresu badań in vitro , która może zostać wykorzystana do rozszerzenia eksperymentów na warunki in vivo . W przyszłości protokół ten może zostać rozszerzony o izolację OMV z pierwotnego materiału biologicznego, takiego jak surowica lub płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, aby uzyskać wgląd w skład OMV uwalnianych w warunkach fizjologicznych. Pomoże to w określeniu kluczowych parametrów składu OMV i zrozumieniu właściwości OMV generowanych in vitro.

Bakterie mogą wydzielać czynniki wirulencji za pomocą różnych mechanizmów1. Oprócz dobrze znanych systemów wydzielniczych, bakterie Gram-ujemne mogą wymieniać informacje i dostarczać czynniki wirulencji za pośrednictwem pęcherzyków błony zewnętrznej (OMV), które są małymi, sferoidalnymi pęcherzykami o średnicy 10-300 nm i dwuwarstwowej strukturze błony. Są wydzielane w różnych środowiskach wzrostu (kultura płynna, kultura stała i biofilmy) i we wszystkich fazach wzrostu2,3. OMV są ważnym środkiem transportu (np. dla białek, adhezyn, toksyn i enzymów, a także dla LPS, który znajduje się na powierzchni OMV)4. Ładunek wewnątrzświetlny jest chroniony przed degradacją proteolityczną, dzięki czemu jest w stanie działać na duże odległości, a pęcherzyki można znaleźć w płynach ustrojowych i odległych narządach5,6,7,8. Mogą być nie tylko rozpoznawane i wychwytywane przez komórki eukariotyczne9,10, ale ponadto są w stanie ułatwić wiązanie bakterii i ich inwazję do komórek gospodarza4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) jest bakterią Gram-ujemną, która może uwalniać OMV. W ludzkim płucu infekuje przede wszystkim makrofagi pęcherzykowe pęcherzyków płucnych, mimo że jego naturalnym gospodarzem są ameby słodkowodne11. Zakażenie L. pneumophila może powodować chorobę legionistów, ciężką postać zapalenia płuc12. Blokuje fuzję fagosomu i lizosomu w komórce gospodarza. Rekrutuje również organelle gospodarza, w wyniku czego tworzona jest nisza replikacyjna, wakuola zawierająca Legionellę (LCV)13,14. Degradacja lizosomów jest hamowana nie tylko przez translokację białek efektorowych przez system wydzielania typu IV, ale także przez uwalnianie OMVs15.
Oczyszczanie OMV z kultur bakteryjnych jest wymagane do analizy ich wpływu na komórki biorców. Wcześniejsze badania koncentrowały się na zawartości białka w OMV L. pneumophila oraz na wpływie pęcherzyków na komórki nabłonka pęcherzyków płucnych16, ale późniejsze badania z wykorzystaniem przeszczepów ludzkiej tkanki płucnej wykazały, że OMV L. pneumophila są wychwytywane przez makrofagi pęcherzykowe 17.
Ponieważ OMV prezentują wzorce molekularne związane z patogenami (PAMPs) i inne antygeny bakteryjne, mogą mieć wpływ na infekcję komórek eukariotycznych i modulować odpowiedź immunologiczną gospodarza18. L. pneumophila OMV szybko łączą się z błonami komórkowymi gospodarza, a ponadto aktywują błoniaste TLR219. Ponieważ wiadomo, że OMV L. pneumophila stymulują makrofagi i komórki nabłonkowe w sposób prozapalny16,17, przeanalizowaliśmy wpływ OMV na proces infekcji u makrofagów ludzkich i mysich.
Tutaj opisujemy protokół hodowli L. pneumophila w płynnej hodowli, aby wyizolować wydzielane OMV przez różnicowe ultrawirowanie i ocenić wpływ pęcherzyków na eukariotyczne komórki gospodarza, bezpośrednio lub po infekcji.

<table><tbody><tr><td>10 cm szalka</td><td>Petriego Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Niemcy)</td><td>82.1473</td><td></td></tr><tr><td>70 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter Incorporation (Kalifornia, USA)</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>ACES</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>9138.2</td><td></td></tr><tr><td>węgiel aktywny</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>X865.2</td><td></td></tr><tr><td>agar-agar, Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>5210.2</td><td></td></tr><tr><td>Agar Columbia z 5% krwią owczą</td><td>Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Niemcy)</td><td>254005</td><td></td></tr><tr><td>kuwety</td><td>Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Niemcy)</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (człowiek)</td><td>BD OptEIA&handel;; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Niemcy)</td><td>IL-8: 555244 IL-6: 550799</td><td></td></tr><tr><td>ELISA (mysi)</td><td>DuoSet, R& D (Minneapolis, USA)</td><td>CXCL1: DY453-05</td><td></td></tr><tr><td>Fe(NO3)3x9H2O</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>5632.1</td><td></td></tr><tr><td>Surowica cielęca płodu (FCS)</td><td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Niemcy)</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator CO2 Heracell 240i</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)</td><td>40830469</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)</td><td>75004515</td><td></td></tr><tr><td>Pętla inokulacyjna&nbsp;</td><td>Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Niemcy)</td><td>86.1567.010</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>6751.1</td><td></td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby</td><td>---</td><td>---</td> <td>uprzejmie dostarczone przez prof. dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Niemcy)</td></tr><tr><td>L. pneumophila Corby &Delta; flaA</td><td>---</td><td>---</td> <td>uprzejmie dostarczone przez Prof. Dr Klausa Heunera (RKI, Berlin, Niemcy)</td></tr><tr><td>L-cystein</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)</td>mBMDM------dzięki uprzejmości prof. dr Markusa Schnare'a (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Niemcy) i prof. dr Carstena Kirschninga (Uniwersytet Duisburg Essen, Essen, Niemcy)<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom GmbH (Berlin, Niemcy)</td><td>L 1825</td><td></td></tr><tr><td>12-mirystynian 13-octan forbolu</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Niemcy)</td><td>P8139-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka obrotowa (MaxQ 6000)</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)</td><td>SHKE6000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 high glucose</td><td>Life Technologies GmbH (Darmstadt, Niemcy)</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>saponin</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>9622.1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrospec 10</td><td>Biochrom Ltd (Cambridge, Anglia)</td><td>80-2116-30</td><td></td></tr><tr><td>sterylny filtr (wielkość porów: 0,22 i mikro; m)</td><td>Corning Incorporated (Nowy Jork, USA)</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Niemcy)</td><td>88081201-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Discovery 100 SE</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ekstrakt drożdżowy</td><td>Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Niemcy)</td><td>2363.2</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Brunszwik, Niemcy)</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

legionella pneumophila (legionella pneumophila) pęcherzyki błony zewnętrznej: izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego na makrofagach

Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages

Bakterie są w stanie wydzielać różne cząsteczki za pośrednictwem różnych systemów wydzielniczych. Oprócz wydzielania cząsteczek do przestrzeni zewnątrzkomórkowej lub bezpośrednio do innej komórki, bakterie Gram-ujemne mogą również tworzyć pęcherzyki błony zewnętrznej (OMV). Te pęcherzyki błonowe mogą dostarczać swój ładunek na duże odległości, a ładunek jest chroniony przed degradacją przez proteazy i nukleazy. 
Legionella pneumophila (L. pneumophila) to wewnątrzkomórkowy, Gram-ujemny patogen, który powoduje ciężką postać zapalenia płuc. U ludzi infekuje makrofagi pęcherzykowe pęcherzyków płucnych, gdzie blokuje degradację lizosomalną i tworzy wyspecjalizowaną wakuolę replikacyjną. Ponadto L. pneumophila wytwarza OMV w różnych warunkach wzrostu. Aby zrozumieć rolę OMV w procesie infekcji ludzkich makrofagów, opracowaliśmy protokół oczyszczania pęcherzyków błony bakteryjnej z płynnej hodowli. Metoda opiera się na różnicowym ultrawirowaniu. Wzbogacone OMV zostały następnie przeanalizowane pod kątem zawartości białka i lipopolisacharydów (LPS), a następnie wykorzystano je do leczenia ludzkiej linii komórek monocytowych lub makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego myszy. Odpowiedzi prozapalne tych komórek analizowano za pomocą testu immunoenzymatycznego. Ponadto przeanalizowano zmiany w późniejszej infekcji. W tym celu badano bakteryjną replikację L. pneumophila w makrofagach za pomocą testów jednostek tworzących kolonie. 
Tutaj opisujemy szczegółowy protokół oczyszczania OMV L. pneumophila z płynnej hodowli za pomocą ultrawirowania oraz dalszej analizy ich potencjału prozapalnego na makrofagach.

Układ eksperymentalny służący do przygotowania OMV z L. pneumophila oraz analizy ich wpływu na odpowiedź prozapalną makrofagów po infekcji przedstawiono na Rysunku 1. Potencjał prozapalny przygotowanych OMV można analizować na komórkach THP-1 zróżnicowanych za pomocą PMA, co pokazano na Rysunku 2. Komórki THP-1 reagują zależnym od czasu i dawki wzrostem sekrecji IL-8 i IL-6. Dodatkowo wpływ różnych receptorów TLR na rozpoznawanie OMV z L. pneumophila można analizować, wykorzystując mBMDM z różnych tło genetycznych, co przedstawiono w badaniu ELISA dla CXCL1 na Rysunku 3. mBMDM z myszy WT wydzielały CXCL1 po stymulacji OMV, podczas gdy mBMDM TLR2/4-/- wydzielały go w znacznie mniejszej ilości. Aby zbadać wpływ OMV z L. pneumophila na replikację bakteryjną w makrofagach THP-1, komórki inkubowano wstępnie z OMV, a następnie dodatkowo zainfekowano L. pneumophila (Rysunek 4 A). Wstępna stymulacja makrofagów pochodzących z linii THP-1 początkowo zmniejsza replikację bakteryjną po 24 h od infekcji, ale prowadzi do dwukrotnego wzrostu liczby CFU w późniejszym punkcie czasowym (48 h p.i.). Wpływ sygnalizacji receptorów Toll-podobnych (TLR) na rozpoznawanie OMV po infekcji makrofagów można ocenić za pomocą mBMDM, jak przedstawiono na Rysunku 4 B. Replikacja bakteryjna zwiększa się dziesięciokrotnie w mBMDM od zwierząt WT po wstępnej inkubacji z OMV, podczas gdy komórki TLR2-/- i TRIF/MyD88-/- nie wykazują takiego wzrostu replikacji L. pneumophila.
<img alt="Proces hodowli Legionella, schemat wirowania, oznaczanie ilości białka, etapy testu infekcyjnego." src="/files/ftp_upload/55146/55146fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Procedura eksperymentalna. (A) L. pneumophila Corby WT z płytek agarowych BCYE 10-cm służą do zaszczepienia małej kultury ciekłej (10 mL), która po 6 h jest przenoszona do 90 mL świeżej pożywki YEB. Mała objętość jest również wysiewana na płytkę z agarem krwi w celu sprawdzenia czystości. Bakterie są inkubowane w 37 °C aż do wczesnej fazy stacjonarnej (OD600 = 3.0-3.5). (B) Kultura ciekła jest wirowana i filtrowana sterylnie w celu usunięcia bakterii. Pozbawiony Legionella nadsącz jest następnie poddawany ultrawirowaniu w celu uzyskania osadu OMV, który jest resusp endowany w PBS i ponownie ultrawirowany. Wyizolowane pęcherzyki są resusp endowalne, sprawdzane pod kątem czystości oraz poddawane ilościowemu oznaczaniu zawartości białka. Pasek skali reprezentuje 2.5 cm. (C) Makrofagi ludzkie lub mysie są stymulowane oznaczonymi ilościowo OMV. Nadsącz z hodowli komórkowej można wykorzystać do testu ELISA lub makrofagi można zainfekować L. pneumophila w celu określenia replikacji bakteryjnej za pomocą testu CFU na płytkach agarowych BCYE 10-cm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig1large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Wykresy wzrostu stężenia IL-8 i IL-6 w czasie przy różnych stężeniach OMV, wyniki." src="/files/ftp_upload/55146/55146fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Aktywacja prozapalna komórek THP-1 przez OMV L. pneumophila. (A) W tym doświadczeniu monocytowa linia komórkowa THP-1 została wykorzystana jako model makrofagów pęcherzykowych. Komórki THP-1 zróżnicowane za pomocą PMA poddano działaniu zwiększających się dawek OMV L. pneumophila (0,01-25 µg/mL) odpowiednio przez 24 i 48 h. Bezkomórkowy nadsącz wykorzystano do analizy IL-8 metodą ELISA. Przedstawiono wartości średnie z trzech niezależnych eksperymentów ± SEM. Komórki THP-1 zareagowały na dawkę OMV L. pneumophila tak niską jak 0,01 µg/mL znaczną sekrecją IL-8, która była zależna od czasu i dawki. (B) Do stymulacji zróżnicowanych za pomocą PMA komórek THP-1 wykorzystano OMV L. pneumophila (0,1-10 µg/mL). Nadsącz zebrano po 24 i 48 h inkubacji, a ilość uwolnionej IL-6 zmierzono w nadsączu za pomocą metody ELISA. Przedstawiono wartości średnie z trzech niezależnych eksperymentów ± SEM. Komórki THP-1 wydzielały znaczące ilości IL-6, nawet przy najniższej dawce OMV (0,1 µg/mL). Sekrecja IL-6 wzrastała wraz ze zwiększaniem dawek OMV oraz wydłużeniem czasu inkubacji. Statystyka: test Manna-Whitneya; *p < 0,05 oraz **p < 0,01 w porównaniu do odpowiadającej wartości 0 µg/mL OMV. Przedrukowano za zgodą z referencji 20. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres ekspresji CXCL1 w makrofagach mysich, WT vs knockout TLR2/4, zależność od dawki OMV, 24/48h." src="/files/ftp_upload/55146/55146fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Prozapalna aktywacja makrofagów zależy od TLR2/4. mBMDM z myszy WT i TLR2/4-/- inkubowano z OMV L. pneumophila (0,1 lub 1 µg/mL). Sekrecję CXCL1 analizowano metodą ELISA odpowiednio po 24 i 48 h. Przedstawiono wartości średnie ± SEM z trzech niezależnych eksperymentów. mBMDM z myszy WT odpowiedziały zależną od dawki sekrecją CXCL1 po inkubacji z OMV L. pneumophila. mBMDM TLR2/4-/- wydzielały znacząco mniej CXCL1 w porównaniu do mBMDM WT, a sekrecja ta nie zwiększała się w sposób zależny od dawki. Statystyka: test Mann-Whitney; *p &lt; 0,05 w porównaniu do odpowiedniej grupy kontrolnej 0 µg/mL OMV; #p &lt; 0,05 w porównaniu do analogicznie traktowanej próbki WT. Przedruk za zgodą z Odniesienia 20. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres replikacji L. pneumophila; CFU w funkcji czasu/makrofagów, analizowane wstępne przetwarzanie OMV/LPS-IFN." src="/files/ftp_upload/55146/55146fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Preinkubacja z OMV L. pneumophila zwiększa replikację bakteryjną w makrofagach. (A) Zróżnicowane komórki THP-1 poddano preinkubacji z OMV (0,1, 1 lub 10 µg/mL) lub LPS/IFN-γ (po 200 ng/mL każdego z nich) lub pozostawiono bez obróbki jako kontrolę. Po preinkubacji (20 h) komórki THP-1 zainfekowano szczepem L. pneumophila Corby WT (MOI 0,5) odpowiednio przez 2, 24 i 48 h. Komórki THP-1 lizowano poprzez dodanie saponiny, a bakterie wysiano na płytki z agarem BCYE. Wartości CFU obliczono względem 0 µg/mL OMV po każdym punkcie czasowym. Słupki reprezentują średnie wartości ± SEM z trzech niezależnych eksperymentów, z których każdy wykonano w duplikatach technicznych. Nie stwierdzono różnic w pobieraniu bakterii (2 h po infekcji (p.i.)) w porównaniu do komórek niepoddanych wstępnemu przetwarzaniu. Zmiany w replikacji bakteryjnej określono odpowiednio po 24 i 48 h. Komórki THP-1 wstępnie traktowane LPS/IFN-γ wykazały redukcję ładunku bakteryjnego 24 h p.i. Zaobserwowano to również w sposób zależny od dawki dla komórek wstępnie traktowanych OMV L. pneumophila. W późniejszym punkcie czasowym (48 h p.i.) komórki THP-1 wstępnie traktowane OMV wykazały dwukrotny wzrost replikacji L. pneumophila, podczas gdy makrofagi wstępnie traktowane LPS/IFN-γ wykazały dalszą redukcję ładunku bakteryjnego. Statystyka: test Mann-Whitneya; *p &lt; 0,05 i **p &lt; 0,01 w porównaniu do odpowiadającej grupy 0 µg/mL OMV. (B) mBMDM od myszy o różnych podłożach genetycznych (WT, TLR2-/- oraz TRIF/MyD88-/-) poddano preinkubacji z 0,1 µg/mL OMV L. pneumophila przez 20 h, a następnie zainfekowano mutantem L. pneumophila Corby pozbawionym flagelliny (MOI 0,5) przez 48 h. mBMDM lizowano poprzez dodanie saponiny, a Legionella została wysiana na płytki z agarem BCYE. Wartości CFU obliczono względem 0 µg/mL OMV, co zaznaczono linią ciągłą. Słupki reprezentują średnie wartości ± SEM z trzech niezależnych eksperymentów, z których każdy wykonano w duplikatach. mBMDM od myszy WT wykazały wzrost replikacji L. pneumophila po wstępnym traktowaniu OMV. Makrofagi TLR2-/- wykazały znacząco zredukowaną replikację Legionella, co było porównywalne z mBMDM TRIF/MyD88-/-. Statystyka: test Mann-Whitneya; p &lt; 0,05 w porównaniu do próbki WT. Przedrukowano za zgodą z odnośnika 20. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55146/55146fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Tutaj opisujemy oczyszczanie pęcherzyków błony zewnętrznej (OMV) Legionella pneumophila (L. pneumophila) z płynnych kultur. Te oczyszczone pęcherzyki są następnie wykorzystywane do leczenia makrofagów w celu analizy ich potencjału prozapalnego.

Legionella pneumophila (Legionella pneumophila) Pęcherzyki błony zewnętrznej: izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego na makrofagach

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or ...

Ogólnym celem niniejszego badania jest standaryzowana puryfikacja pęcherzyków błony zewnętrznej (OMVs) z Legionella pneumophila oraz analiza ich wpływu na replikację bakteryjną w makrofagach ludzkich i mysich. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad pęcherzykami błony zewnętrznej. Przykładowo, standaryzowana procedura przygotowania OMV może wspomóc badanie ich wpływu na interakcje między gospodarzem a patogenem.Główną zaletą tej techniki jest zapewnienie zstandaryzowanego protokołu do badania wpływu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (OMV) *Legionella pneumophila* na makrofagi ludzkie lub mysie, co pozwoli na lepsze zrozumienie patogenności *Legionella pneumophila*. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy rozważaliśmy potencjał prozapalny OMV oraz wpływ, jaki mogą one wywierać na przebieg infekcji, ponieważ *Legionella* uwalnia OMV zarówno wewnątrz komórki gospodarza, jak i poza nią. Procedura zostanie zademonstrowana przez Kerstin Hoffmann, technika z mojego laboratorium, oraz Analinę Young, badaczkę postdoc.W pierwszej kolejności, pracując w warunkach sterylnych, należy wysiać szczep core B L.pneumophila na płytki z agarem BCYE i inkubować w temperaturze 37 °C przez trzy dni. Wykorzystując L.pneumophila z płytki z prekulturą, należy zaszczepić 10 ml pożywki YEB do osiągnięcia OD600 wynoszącej 0,3, a następnie inkubować bakterie w temperaturze 37 °C na wytrząsarce rotacyjnej przez sześć godzin. Czystość hodowli płynnej należy zweryfikować poprzez wysianie 100 µL zawiesiny na płytkę z agarem krwi.Inkubuj płytkę z agarem krwi przez noc w temperaturze 37 °C. Pozostałą kulturę w cieczy dodaj do 90 ml świeżego medium YEB i inkubuj kulturę na wytrząsarce orbitalnej, aż osiągnie wartość OD600 od 3,0 do 3,5. Odwiruj kulturę w cieczy przy 4 000 g przez 20 minut, aby uzyskać osad bakteryjny.Następnie przenieś supernatant do nowych probówek do wirowania. Odrzuć osad bakteryjny i ponownie odwiruj próbki przed powtórzeniem etapu wirowania jeszcze raz. Następnie dwukrotnie wysterylizuj pozostały supernatant za pomocą filtracji.Następnie przenieś supernatant pozbawiony bakterii do probówek do ultrawirowania i wiruj próbki przy 100 000 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez trzy godziny. Odlej supernatant i go usuń. Następnie użyj sterylnego PBS, aby resuspender osady OMV i połączyć je w jedną pulę.Powtórz etap ultracentryfugacji, aby usunąć zanieczyszczające białka oraz wolne LPS. Następnie odlej nadsącz i osusz probówkę do ultracentryfugi za pomocą sterylnego patyczka bawełnianego. Resuspenduj osad OMV w 500 µL sterylnego PBS.Następnie nanieś pasowo po 20 µL na płytki z agarem krwi oraz agarem BCYE, aby wykluczyć kontaminację bakteryjną przygotowanego pęcherzyka. Inkubuj płytkę z agarem krwi przez noc, a płytkę z agarem BCYE przez trzy dni. Przeprowadź analizę BCYE zgodnie z instrukcją producenta, aby określić ilość białka w otrzymanym preparacie OMV.Po zróżnicowaniu komórek THP-1 w makrofagi zgodnie z protokołem tekstowym, należy zastąpić medium do zróżnicowania 500 µL świeżego medium i inkubować komórki przez kolejne 24 godziny w temperaturze 37 °C. Aby potraktować komórki THP-1 lub mysie BMDM za pomocą OMV, należy rozmrozić wcześniej przygotowane OMV i dodać odpowiednią ilość do komórek. Inkubować makrofagi z OMV w temperaturze 37 °C przez co najmniej 20 godzin, aby zainfekować uprzednio potraktowane lub niepotraktowane komórki THP-1 szczepem dzikim L.pneumophila core B lub mysie komórki BMDM mutantem tego szczepu pozbawionym flageli, bez wymiany medium z komórek.Dodaj bakterie przy MOI wynoszącym 0,5, co odpowiada 1 × 10⁵ L.pneumophila na dołek. Inkubuj kultury odpowiednio przez 24 i 48 godzin. W celu lizy komórek dodaj saponinę do stężenia końcowego 0,1% i inkubuj komórki przez pięć minut.Następnie resuspenduj lizowane makrofagi poprzez pipetowanie i przenieś zawiesinę do naczynia reakcyjnego. Użyj sterylnego PBS do przygotowania rozcieńczeń seryjnych zawiesiny L.pneumophila. Następnie nanieś smugowo 50 µL wymaganych rozcieńczeń na płytki z agarem BCYE i inkubuj płytki przez trzy dni.Należy wizualnie policzyć powstałe kolonie i przeprowadzić obliczenia zgodnie z protokołem tekstowym. W tym doświadczeniu, podczas badania potencjału prozapalnego OMV L.pneumophila, komórki THP-1 różnicowane za pomocą PMA odpowiadają zależnym od czasu i dawki wzrostem sekrecji IL-8 oraz IL-6. Tutaj wpływ różnych receptorów Toll-podobnych na rozpoznawanie OMV L.pneumophila analizowano w mysich BMDM o różnych profilach genetycznych, wykorzystując test ELISA dla CXCL-1.Mysie BMDM pochodzące od myszy typu dzikiego wydzielały CXCL-1 po stymulacji OMV, podczas gdy mysie BMDM z podwójnym nokautem TLR2/4 wydzielały go znacznie mniej. Aby zbadać wpływ OMV L.pneumophila na replikację bakteryjną w makrofagach THP-1, komórki inkubowano wstępnie z OMV przez 20 godzin, a następnie dodatkowo zainfekowano L.pneumophila. Wstępna stymulacja makrofagów pochodnych z linii THP-1 początkowo redukuje replikację bakteryjną w sposób zależny od dawki po 24 godzinach infekcji, podczas gdy w późniejszym punkcie czasowym prowadzi do dwukrotnego wzrostu liczby CFU.Jak pokazano w tym eksperymencie, wstępna stymulacja mysich makrofagów BMDM za pomocą OMV skutkuje dziesięciokrotnym wzrostem liczby CFU w BMDM myszy pochodzących od zwierząt typu dzikiego, podczas gdy makrofagi z knockoutem TLR2 oraz TRIF/MyD88 nie wykazują takiego wzrostu replikacji L.pneumophila po inkubacji z OMV. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o pracy w warunkach sterylnych i sprawdzeniu, czy oczyszczone OMV nie są zanieczyszczone bakteriami. W przeciwnym razie analiza końcowa nie daje rozstrzygających wyników.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak analiza śledzenia nanocząsteczek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład który mutant Legionella produkuje więcej lub mniej OMV, lub aby zbadać wpływ różnych warunków stresowych na sekrecję OMV. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie OMV do zgłębiania wpływu OMV na interakcje gospodarz-patogen in vitro, a następnie in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak oczyszczać OMV oraz jak rozpocząć analizę ich wpływu na późniejszą infekcję makrofagów.Niniejszy protokół można zastosować w przypadku różnych bakterii gram-ujemnych i ich odpowiednich komórek gospodarza, po dostosowaniu czasów inkubacji i wzrostu. Należy pamiętać, że praca z Legionella pneumophila może być niezwykle zakaźna dla ludzi, dlatego podczas manipulacji z Legionella i przeprowadzania tej procedury prace powinny być zawsze wykonywane pod komorą sterylną.

legionella-pneumophila-outer-membrane-vesicles-isolation-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Niniejszy artykuł opisuje metodę izolacji i oczyszczania nienaruszonych wakuol zawierających Legionella (LCV) z ameb i makrofagów. Dwuetapowy protokół obejmuje wzbogacanie LCV poprzez separację immunomagnetyczną z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko bakteryjnemu markerowi LCV oraz dalsze oczyszczanie za pomocą wirowania w gradiencie gęstości.

Oczyszczanie wakuol patogennych z fagocytów zainfekowanych Legionella

Źródło: Jung, A. L. et al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego na makrofagach. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia wstępne traktowanie makrofagów pęcherzykami błony zewnętrznej (OMV) Legionella pneumophila w celu zbadania ich wpływu na replikację bakterii. Zmieniając sygnalizację immunologiczną gospodarza, OMV sprawiają, że makrofagi są bardziej podatne na infekcje. Wyższa liczba kolonii w leczonych komórkach, w porównaniu z...

Oznaczanie replikacji Legionella pneumophila w makrofagach poddanych działaniu pęcherzyków błony zewnętrznej

Źródło: Jung, A. L. i in. Pęcherzyki zewnętrznej błony Legionella pneumophila: izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego u makrofagów. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje izolację zewnętrznych pęcherzyków błonowych (OMV) od Legionella pneumophila za pomocą sekwencyjnej wirowania, sterylnej filtracji oraz ultrawirowania. Oczyszczone OMV, wzbogacone o białka błonowe i lipopolisacharydy, nadają się do badań interakcji gospodarz-patogen.

Izolacja zewnętrznych pęcherzyków błonowych Legionella pneumophila oparta na ultrawirowaniu

W tym filmie określamy ilościowo wewnątrzkomórkową i zewnątrzkomórkową Listeria monocytogenes, wewnątrzkomórkową bakterię chorobotwórcze, po ich zakażeniu hodowanymi makrofagami in vitro za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej wewnątrzkomórkowych i pojawiających się zewnątrzkomórkowych Listeria monocytogenes in vitro

Ten film demonstruje technikę badania tworzenia inflamasomu w pierwotnej makrofagach za pomocą immunofluorescencji receptorów podobnych do NOD, rodziny receptorów pirynowych, zawierających domenę 3 (NLRP3). Makrofagi są najpierw przygotowywane za pomocą bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS) w celu zwiększenia ekspresji białka NLRP3. Wystawienie makrofagów na działanie nigerycyny - jonoforu potasu - prowadzi do aktywacji NLRP3 i powstania inflamasomów, które są wizualizowane za pomocą...

Technika in vitro do badania tworzenia kompleksów inflamasomów w makrofagach

Ta technika dostarcza metody zbierania, normalizacji i ilościowego określania wzrostu wewnątrzkomórkowego patogenów bakteryjnych, które są wstępnie hodowane w naturalnych komórkach gospodarza pierwotniaków przed infekcjami komórek ssaków. Metodę tę można zmodyfikować w celu uwzględnienia szerokiej gamy komórek gospodarza na etapie zasysania, a także typów komórek docelowych.

Możliwe do leczenia infekcje komórek ssaków bakteriami zaszczepionymi przez pierwotniaki

Larwa woskowej Galleria mellonella została niedawno ustanowiona jako model in vivo do badania infekcji Legionella pneumophila. W tym miejscu demonstrujemy podstawowe techniki charakteryzujące patogenezę Legionelli w larwach, w tym inokulację, pomiar zjadliwości i replikacji bakterii, a także ekstrakcję i analizę zakażonych hemocytów.

Wykorzystanie Galleria mellonella jako organizmu modelowego do badania zakażenia Legionella pneumophila

Makrofagi od dawna są uznawane za kluczowy składnik wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej. Niedawna eksplozja wiedzy dotyczącej ewolucyjnych, genetycznych i biochemicznych aspektów interakcji między makrofagami a mikroorganizmami ponownie zwróciła uwagę naukowców na makrofagi. W artykule opisano metodę różnicowania makrofagów od szpiku kostnego myszy.

Produkcja makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Obrazowanie komórek bakteryjnych to nowe podejście do biologii systemowej, skoncentrowane na definiowaniu statycznych i dynamicznych procesów, które dyktują funkcjonowanie dużych maszyn makromolekularnych. W tym przypadku integracja ilościowego obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej jest wykorzystywana do badania architektury i funkcji systemu wydzielania Legionella pneumophila typu IV.

Zastosowanie obrazowania żywych komórek i tomografii krioelektronowej w celu określenia czasoprzestrzennych cech systemu wydzielania kropk/icm Legionella pneumophila

Poznaj metodę izolacji pęcherzyków błony zewnętrznej Legionella pneumophila i analizę ich wpływu na makrofagi. Technika ta pozwala badać potencjał prozapalny OMV oraz ich rolę w interakcjach patogen-gospodarz.

Legionella pneumophila (Legionella pneumophila) Pęcherzyki błony zewnętrznej: izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego na makrofagach (Wideo) | JoVE Journal

Legionella pneumophila (Legionella pneumophila) Pęcherzyki błony zewnętrznej: izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego na makrofagach

Przeglądaj więcej filmów