Legionella pneumophila (Legionella pneumophila) Pęcherzyki błony zewnętrznej: izolacja i analiza ich potencjału prozapalnego na makrofagach

Ogólnym celem tego badania jest oczyszczenie pęcherzyków błony zewnętrznej lub OMV z Legionella pneumophila w standaryzowany sposób oraz analiza ich wpływu na replikację bakterii w makrofagach ludzkich i mysich. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań pęcherzyków błony zewnętrznej. Na przykład ustandaryzowana procedura przygotowania OMV może pomóc w badaniu ich wpływu na interakcję gospodarz-patogen

Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewni ona ustandaryzowany protokół do badania wpływu OMV Legionella pneumophila na ludzkie lub mysie makrofagi, co poprawi naszą wiedzę na temat patogenności Legionella pneumophila. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zastanawialiśmy się nad możliwym potencjałem prozapalnym OMV i jego wpływem na przebieg infekcji, ponieważ OMV są uwalniane przez Legionellę zarówno wewnątrz komórki gospodarza, jak i zewnątrzkomórkowo. Procedura zostanie zademonstrowana przez Kerstin Hoffmann, technika z mojego laboratorium i Analinę Young, badaczkę z tytułem doktora.

Na początek, podczas pracy w sterylnych warunkach, rozprowadź szczep L.pneumophila rdzeń B na płytkach agarowych BCYE i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy dni. Użyj L.pneumophila z płytki przed hodowlą, aby zaszczepić 10 mililitrów pożywki YEB przy OD600 0,3 i inkubować bakterie w temperaturze 37 stopni Celsjusza na obrotowej wytrząsarce przez sześć godzin. Sprawdź czystość płynnej kultury, rozprowadzając 100 mikrolitrów zawiesiny na płytce z agarem do krwi.

Inkubuj płytkę z agarem z krwią przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj pozostałą płynną kulturę do 90 mililitrów świeżej pożywki YEB i inkubuj kulturę na obracającej się wytrząsarce, aż osiągnie OD600 od 3,0 do 3,5. Odwirować płynną kulturę o stężeniu 4 000 g przez 20 minut, aby bakterie były granulowane.

Następnie przenieść supernatant do świeżych probówek wirówkowych. Wyrzuć granulki bakteryjne i ponownie odwiruj próbki przed powtórzeniem etapu wirowania. Następnie przefiltruj pozostały supernatant dwukrotnie.

Następnie przenieś wolny od bakterii supernatant do probówek ultrawirówek i wiruj próbki w temperaturze 100 000 g w czterech stopniach Celsjusza przez trzy godziny. Zdekantować supernatant i wyrzucić go. Następnie użyj sterylnego PBS, aby ponownie zawiesić granulki OMV i połączyć je.

Powtórz etap ultrawirowania, aby usunąć zanieczyszczające białka i wolny LPS. Teraz wyrzuć sklarowany soczent i osusz probówkę ultrawirówki sterylnym wacikiem. Zawiesić granulat OMV z 500 mikrolitrami sterylnego PBS.

Następnie rozprowadź po 20 mikrolitrów na płytkach agaru z krwią i agaru BCYE, aby wykluczyć zanieczyszczenie bakteryjne przygotowanego pęcherzyka. Inkubuj płytkę z agarem z krwią przez noc, a płytkę z agarem BCYE przez trzy dni. Użyj testu BCYE zgodnie z instrukcjami producenta, aby określić ilościowo ilość białka dla otrzymanego preparatu OMV.

Po różnicowaniu komórek THP-1 w makrofagi zgodnie z protokołem tekstowym, użyj 500 mikrolitrów świeżej pożywki do wymiany pożywki różnicującej i inkubuj komórki przez kolejne 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby leczyć THP-1 lub mysie komórki BMDM za pomocą OMV, należy rozmrozić wcześniej przygotowane OMV i dodać odpowiednią ilość do komórek. Inkubować makrofagi z OMV w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 20 godzin, aby zainfekować wstępnie potraktowane lub nieleczone komórki THP-1 dzikimi komórkami rdzenia B szczepu L.pneumophila typu dzikiego lub mysimi komórkami BMDM z pozbawionym wici mutantem tego szczepu bez zmiany pożywki z komórek.

Dodaj bakterie o MOI 0,5, co odpowiada jeden razy 10 do piątej L.pneumophila na studzienkę. Inkubuj kultury odpowiednio przez 24 i 48 godzin. Aby poddać komórki lizie, dodaj saponinę o końcowym stężeniu 0,1% i inkubuj komórki przez pięć minut.

Następnie ponownie zawiesić zlizowane makrofagi przez pipetowanie i przenieść zawiesinę do naczynia reakcyjnego. Użyć sterylnego PBS do przygotowania seryjnych rozcieńczeń zawiesiny L.pneumophila. Następnie rozpyl 50 mikrolitrów wymaganych rozcieńczeń na płytkach agarowych BCYE i inkubuj płytki przez trzy dni.

Wizualnie policz utworzone kolonie na oko i przeprowadź obliczenia zgodnie z protokołem tekstowym. W tym eksperymencie, badającym potencjał prozapalny OMV L.pneumophila, zróżnicowane PMA komórki THP-1 reagują zależnym od czasu i dawki wzrostem wydzielania IL-8 i IL-6. W tym przypadku przeanalizowano wpływ różnych receptorów toll-podobnych na rozpoznawanie L.pneumophila OMV u mysich BMDM o różnym pochodzeniu genetycznym za pomocą testu CXCL-1 ELISA.

Mysie BMDM z myszy typu dzikiego wydzielały CXCL-1 po stymulacji OMV, podczas gdy mysie BMDM z podwójnym nokautem TLR2/4 wydzielały znacznie mniej. Aby zbadać wpływ OMV L. pneumophila na replikację bakterii w makrofagach THP-1, komórki były wstępnie inkubowane z OMV przez 20 godzin, a następnie dodatkowo zakażone L. pneumophila. Wstępna stymulacja makrofagów pochodzących z THP-1 najpierw zmniejsza dawkę replikacji bakterii w zależności od 24 godzin od infekcji, podczas gdy prowadzi do podwojenia liczby CFU w późniejszym czasie.

Jak wykazano w tym eksperymencie, wstępna stymulacja mysich BMDM za pomocą OMV powoduje dziesięciokrotny wzrost liczby CFU w mysim BMDM od zwierząt typu dzikiego, podczas gdy nokaut TLR2 i makrofagi TRIF/MyD88 nie wykazują tego wzrostu replikacji L.pneumophila po wstępnej inkubacji OMV. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pracy w sterylnych warunkach i sprawdzaniu, czy oczyszczone OMV nie są skażone bakteryjnie. W przeciwnym razie dalsza analiza nie daje rozstrzygających wyników.

Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza śledzenia nanocząstek, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, który mutant Legionella wytwarza więcej lub mniej OMV lub zbadać wpływ różnych warunków stresu na wydzielanie OMV. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się badaniami nad OMV do zbadania wpływu OMV na interakcje gospodarz-patogen in vitro, a następnie in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyszczać OMV i jak zacząć analizować ich wpływ na późniejszą infekcję makrofagów.

Protokół ten można następnie zastosować do różnych bakterii Gram-ujemnych i ich odpowiednich komórek gospodarza po dostosowaniu czasu inkubacji i wzrostu. Nie zapominaj, że praca z Legionella pneumophila może być niezwykle zakaźna dla ludzi, dlatego praca powinna być zawsze wykonywana pod sterylnym stołem podczas obchodzenia się z Legionellą i wykonywania tej procedury.