Name: Produkcja i oczyszczanie przeciwciała terapeutycznego na skalę laboratoryjną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj metodę produkcji przeciwciał terapeutycznych na skalę laboratoryjną z wykorzystaniem komórek HEK-293 w warunkach bezsurowicowych. Protokół obejmuje transfekcję stabilną, adaptację do środowiska bezsurowicowego oraz oczyszczanie chromatografią afinitacyjną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania były wspierane przez Uniwersytet w Sydney. pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ był prezentem od Andrew Beavila (plazmid Addgene # 61883). Dziękujemy Tihomirowi S. Dodevowi za użyteczne dyskusje na temat pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ.

UWAGA: Dla tego protokołu należy użyć odpowiedniego wektora ekspresji ssaków. W tym przypadku używana jest pojedyncza konstrukcja zawierająca dwie kasety wyrażeń (tj. wyrażenie łańcucha ciężkiego i lekkiego jest sterowane przez oddzielne promotory). Ciężkie i lekkie łańcuchy trastuzumabu były wcześniej klonowane do wektora. Ten wektor był prezentem od Andrew Beavil, uzyskanym za pośrednictwem repozytorium plazmidów non-profit 13.
1. Odzyskiwanie i zwiększanie skali DNA wektora
UWAGA: DNA wektora otrzymano jako miękką kulturę ukłucia agarem w szczepie Escherichia coli XL-1 Blue; wektor jest odporny na higromycynę.
<ol>
	<li>Włożyć sterylną szczepionkę lub pętelkę do miękkiego agaru kultury kłującej, a następnie przetrzeć płytkę agarową Luria Bertani (LB) przygotowaną z 75 μg/ml higromycyny dla izolowanych kolonii. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 18-24 godziny.</li>
	<li>Zaszczepić pojedynczą kolonię w 5 ml Terrific bulion (TB) zawierający 75 μg/ml higromycyny. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przez 18-24 godziny z wytrząsaniem 225 obr./min.</li>
	<li>Użyć kultury przez noc, aby przygotować zapas glicerolu z DNA wektora, delikatnie mieszając 800 μl kultury z 200 μl 80% glicerolu w kriowiale i zamrażając w temperaturze -80 °C.
	<ol>
		<li>Dodać 100 μl nocnej kultury do 100 ml gruźlicy zawierającej 75 μg/ml higromycyny w przegrodzie wytrząsającej (t.j. rozcieńczenie 1:1 000). Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C przez 18-24 godziny z wytrząsaniem 225 obr./min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po całonocnej hodowli wyekstrahuj i oczyść DNA zgodnie z instrukcjami producenta zestawu do przygotowania midi/maxi, z następującym wyjątkiem: podczas ostatniego etapu, wymyj lub ponownie zasmów DNA wodą (pH 7,0-8,5).</li>
	<li>Sprawdzić stężenie i czystość DNA za pomocą odczytów absorbancji przy 260 i 280 nm, a następnie przechowywać DNA w temperaturze -20 °C. 
	UWAGA: Opcjonalnie (wysoce zalecane): Sekwencjonuj DNA przy użyciu starterów specyficznych dla wektora, aby potwierdzić tożsamość.</li>
</ol>
2. Stabilna transfekcja komórek HEK-293
<ol>
	<li>Hoduj i utrzymuj komórki HEK-293 (komórki zawiesinowe) zgodnie ze standardowymi protokołami w pożywkach bez surowicy uzupełnionych 0,1% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym w kolbach Erlenmeyera. Utrzymywać w dawce 2 x 105 komórek/ml i subkulturować co czwarty dzień. Komórki hodowlane w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i obrotem 120 obr./min. 
	UWAGA: Komórki powinny znajdować się w hodowli nie krócej niż 4 dni i nie dłużej niż 4 tygodnie przed transfekcją. Komórki HEK-293 hodowane jako monowarstwy w pożywkach zawierających surowicę mogą być również używane do tej procedury.</li>
	<li>W dniu poprzedzającym transfekcję, wysiewaj komórki HEK-293 w ilości 3 x 105 komórek/ml w dołkach 12-dołkowej płytki w 2 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionego 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS). W dniu transfekcji sprawdź, czy komórki osiągnęły 80-90% zbiegu</li>
	<li>Rozcieńczyć DNA i polietyleniminę (PEI) oddzielnie w pożywce transfekcyjnej, a następnie wymieszać ze sobą.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 1,25 μg wektora DNA na studzienkę (15 μg na 12 dołków) w 300 μl pożywki transfekcyjnej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Rozcieńczyć 2,5 μl 1 mg/ml roztworu PEI (30 μl na 12 studzienek; tj. stosunek 1:2 DNA do PEI) w pożywkach transfekcyjnych o objętości 300 μl. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
		<li>Dodaj rozcieńczone DNA do rozcieńczonego PEI, delikatnie wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodawać kroplami 50 μl mieszaniny DNA/PEI do każdego dołka płytki. Delikatnie kołysz płytką, aby rozprowadzić mieszaninę transfekcji, a następnie umieść płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 na 24 godziny.</li>
	<li>Dodać 50 μg/ml higromycyny B na studzienkę i przywrócić płytkę do temperatury 37 °C, 5% CO2 przez 10 dni. 
	UWAGA: Do 10 dnia nietransfekowane komórki obumrą i oderwą się od powierzchni płytki, podczas gdy stabilnie transfekowane komórki będą żywotne i przyczepione do płytki.</li>
	<li>Zastąp pożywkę w studzienkach pożywką bez surowicy o objętości 1/4 i DMEM o objętości 3/4 objętości uzupełnioną 10% FBS (tj. 0,5 ml pożywki bez surowicy + 1,5 ml DMEM = 7,5% końcowego stężenia w surowicy) i inkubuj przez 4 dni.</li>
	<li>Zastąp pożywkę w studzienkach pożywką bez surowicy o objętości 1/2 i DMEM o objętości 1/2 objętości uzupełnioną 10% FBS (tj. 1 ml pożywki bez surowicy + 1 ml DMEM = 5% końcowe stężenie w surowicy) i inkubuj przez 4 dni.</li>
	<li>Zastąp pożywkę w studzienkach pożywką bez surowicy o objętości 3/4 i DMEM o objętości 1/4 uzupełnioną 10% FBS (tj. 1,5 ml pożywki bez surowicy + 0,5 ml DMEM = 2,5% końcowego stężenia w surowicy) i inkubuj przez 4 dni.</li>
	<li>Zastąp pożywkę w studzienkach 2 ml pożywki bez surowicy uzupełnionej 0,1% niejonowym środkiem powierzchniowo czynnym (tj. 0% końcowym stężeniem surowicy) i inkubuj przez 4 dni. 
	UWAGA: Utrzymuj selektywny nacisk higromycyny B na komórki na poziomie 50 μg/ml podczas adaptacji bez surowicy. Komórki przystosowane do pożywek bezsurowicowych odrywają się od powierzchni studzienek i mogą gromadzić się w zawiesinie. Patrz krok 2.1, aby zapoznać się z warunkami hodowli z dodatkowym dodatkiem 50 μg/ml higromycyny B.</li>
	<li>Za pomocą pipety delikatnie wymieszać kultury zawiesinowe na płytce 12-dołkowej i komórki puli w osobnej probówce.
	<ol>
		<li>Za pomocą hemocytometru zliczyć połączone komórki i nasiona w 30 ml pożywki bez surowicy w kolbie Erlenmeyera przy 2 x 105 komórek/ml. Hodowla komórek w temperaturze 37 °C przy 5% CO2 i rotacji 120 obr./min. Subkultura i rozwijaj się co czwarty dzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj zwiększanie wielkości hodowli do wymaganej gęstości komórek, aby uzyskać 10 fiolek o wymiarach 1 x 107 komórek/fiolkę do kriokonserwacji w ciekłym azocie. Zamrozić komórki w pożywce bez surowicy zawierającej 10% dimetylosulfotlenku (DMSO). 
	UWAGA: Kondycjonowane pożywki zawierające przeciwciała mogą być zbierane w każdej subkulturze w celu potwierdzenia produkcji białka lub wykorzystane do optymalizacji warunków oczyszczania. Aby zebrać kondycjonowaną pożywkę i utrzymać komórki do subkultury, odwiruj kulturę przy 300 x g przez 5 minut, a następnie przefiltruj i wysterylizuj supernatant przez filtr 0,22 μm. Przefiltrowany supernatant może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez 1–2 tygodnie lub -20 °C w przypadku dłuższego przechowywania.</li>
</ol>
3. Produkcja przeciwciał na dużą skalę z hodowli nadmiernej przyrostu
UWAGA: Wytwarzanie przeciwciał można śledzić od kroku 2.11, w którym istniejące komórki są rozszerzane do wymaganej gęstości komórek w oparciu o objętość hodowli przerostu partii, która ma zostać ustawiona. W przeciwnym razie komórki, które zostały rozmrożone w wyniku kriokonserwacji, rozpoczynają się na tym etapie, gdy zostaną rozszerzone do odpowiedniej gęstości i objętości komórek. W celu optymalizacji produkcji przeciwciał można stosować różne suplementy hodowlane; W protokole tym wykazano zastosowanie tryptonu w celu zwiększenia wydajności przeciwciał.
<ol>
	<li>Komórki nasienne w ilości 2 x 10 5 komórek/ml w 100 ml pożywki bez surowicy w dwóch kolbach Erlenmeyera (w celu porównania wydajności przeciwciał z kultur niesuplementowanych i uzupełniających składniki odżywcze). Kultura w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 120 obr./min.</li>
	<li>Po 24 godzinach dodaj trypton do końcowego stężenia 0,5% do kultury wzbogaconej składnikami odżywczymi. Wyrównaj objętość nieuzupełnionej kultury za pomocą pożywki bez surowicy.</li>
	<li>Od 8 dnia codziennie wykonuj zliczanie komórek w kulturach za pomocą hemocytometru w celu monitorowania żywotności komórek. Zebrać supernatanty hodowlane, gdy żywotność komórek jest mniejsza niż 80%.
	<ol>
		<li>Zebrać supernatant przez odwirowanie kultur przy 3 000 x g przez 15 minut, a następnie przefiltrować i wysterylizować supernatant (zawierający przeciwciało) przez filtr 0,22 μm. Przechowywać supernatanty w temperaturze 4 °C (krótkotrwale) lub zamrażać w temperaturze -20 °C (długotrwale).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Oczyszczanie przeciwciał metodą chromatografii powinowactwa przy użyciu zautomatyzowanego systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC)
UWAGA: Poniższa procedura może być ogólnie stosowana do większości zautomatyzowanych systemów. Oczyszczanie można przeprowadzić w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 4 °C (jeśli system FPLC jest przechowywany w chłodnym pomieszczeniu). Można przeprowadzić serię testów zwiadowczych w celu określenia optymalnych warunków oczyszczania, w tym odpowiedniej matrycy kolumny, buforu wiążącego, buforu elucyjnego i pH, aby zapewnić maksymalny odzysk oczyszczonego przeciwciała z kondycjonowanych pożywek (patrz sekcja Wyniki). Optymalne warunki zależą od oczyszczanego przeciwciała lub białka. Oczyszczanie przeprowadzono na zautomatyzowanym systemie FPLC. Oczyszczanie przeprowadzono w temperaturze pokojowej przy użyciu 5 ml kolumny białka A.
<ol>
	<li>Przygotuj następujące przy użyciu ultraczystej wody i dostosuj do zalecanego pH, a następnie przefiltruj przez filtr 0,22 μm.
	<ol>
		<li>Przygotować 1 l soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o pH 7,4 (bufor wiążący), mieszając następujące elementy: 0,14 M NaCl, 0,0027 M KCl, 0,01 M Na2HPO4 i 0,001 M KH2PO4. W razie potrzeby dostosować pH przed filtrowaniem buforu.</li>
		<li>Przygotować 500 ml 0,1 M glicyny-HCl o pH 2,7 (bufor elucyjny). Dostosuj pH przed przefiltrowaniem buforu.</li>
		<li>Przygotować 50 ml 1 M Tris pH 9,0 (bufor neutralizacyjny).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie połączenia zasilania systemu i komunikacji z komputerem są wykonane. Urządzenia powinny być widoczne w module oprogramowania "Kontrola systemu". Upewnij się, że ogniwo UV jest ustawione na długość fali 280 nm. Opcjonalnie: Skalibruj pH-metr, jeśli jest podłączony i ma być używany.</li>
	<li>Zanurz rurki wlotowe A, B i pompę próbki w ultraczystej wodzie, aby umyć system. Przedmuchnąć pompy strzykawką, jeśli w przewodzie znajduje się powietrze lub istnieje podejrzenie, że w układzie znajduje się powietrze. Umyj system wodą ręcznie za pomocą sterownika systemu lub metodą automatyczną. Należy zwrócić uwagę, że ciśnienie, przewodność, śledzenie UV280 i pH pozostają stałe oraz że limit ciśnienia w kolumnie nie jest przekroczony zgodnie ze specyfikacją producenta. 
	UWAGA: Nieprawidłowości mogą wskazywać na powietrze lub blokadę w systemie, którą należy się zająć przed kontynuowaniem.</li>
	<li>W module sterownika systemu uruchomić natężenie przepływu na poziomie 1 ml/min ręcznie za pomocą pompy A w pozycji obciążenia (z pominięciem pętli próbki) lub wtrysku (przez pętlę próbki), aby rozpocząć podłączanie kolumny. Odłącz rurkę systemową na wlocie kolumny w pozycji kolumny i usuń korek podłączony do wlotu kolumny.
	<ol>
		<li>Pozwól, aby woda spływała z rurki systemu kroplami na górze kolumny, a następnie przymocuj rurkę systemu do kolumny. Przelewanie się wlotu kolumny i armatury wlotowej z kroplami wody zapewnia połączenie wolne od pęcherzyków powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj wylot kolumny do wylotu za kolumną i sprawdź, czy wszystkie złączki są dobrze dokręcone. Gdy kolumna jest teraz podłączona do systemu, nie należy przekraczać limitów maksymalnego limitu ciśnienia i natężenia przepływu, jak opisano w specyfikacji kolumny.</li>
	<li>Przemyć kolumnę 5 objętościami kolumny (CV) wody. W razie potrzeby kontynuuj mycie kolumny, aż śledzenie UV280 się ustabilizuje.</li>
	<li>Zanurzyć rurki wlotowe A w buforze wiążącym, B w buforze elucyjnym, a pompę próbki w buforze wiążącym, aby zrównoważyć system w odpowiednich. Napełnij rurki wlotowe buforem za pomocą PumpWash ręcznie.</li>
	<li>W module "Edytor metod" oprogramowania użyj kreatora metody, aby skonfigurować metodę chromatografii powinowactwa dla kolumny, która ma być używana. 
	UWAGA: Zautomatyzowane systemy FPLC są dostarczane z metodami wstępnie wypełnionymi zalecanymi ustawieniami (tj. natężeniem przepływu i limitem ciśnienia) i uruchamiają kroki w oparciu o kolumnę (producenta, matrycę i rozmiar) wybraną do oczyszczania.
	<ol>
		<li>Wykonaj następujące kroki uruchamiania dla chromatografii powinowactwa białka A:
		<ol>
			<li>System równowagi z buforem wiążącym o mocy 5 CV i przepływem zbiorczym do pojemnika na odpady.</li>
			<li>Załadować próbkę do kolumny (objętość do załadowania jest określana ręcznie w metodzie) i zebrać przepływ do oddzielnego pojemnika.</li>
			<li>Przemyć system z 5 CV buforu wiążącego i zebrać przepływ do oddzielnego pojemnika.</li>
			<li>Kolumnę elutyczną z frakcjonowaniem izokratycznym 5 CV za pomocą buforu elucyjnego i zebrać oczyszczoną próbkę przeciwciał jako frakcje przez kolektor frakcji.</li>
			<li>System równowagi z buforem wiążącym o mocy 5 CV i przepływem zbiorczym do pojemnika na odpady.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po skonfigurowaniu metody określ objętość kondycjonowanego nośnika, który ma zostać zastosowany do kolumny, i zapisz metodę. 
	UWAGA: Objętość podana w metodzie powinna być o 5-10 ml mniejsza niż rzeczywista objętość, aby uniknąć wprowadzania powietrza podczas pobierania próbki. Określona objętość używana w tym protokole to 90-120 ml.</li>
	<li>Zanurzyć rurkę pompy do pobierania próbek w naczyniu zawierającym kondycjonowane media.</li>
	<li>Przygotować oddzielny pojemnik do pobierania próbki przepływającej przez określony przewód wylotowy. 
	UWAGA: Ważne jest, aby zebrać przepływ w przypadku wystąpienia błędu podczas przebiegu lub przekroczenia zdolności wiązania kolumny, co wymaga ponownego nałożenia przepływu na kolumnę lub powtórzenia oczyszczania.</li>
	<li>Przygotować probówki zbiorcze w kolektorze frakcji. Dodać 100 μl buforu neutralizacyjnego na 1 ml objętości frakcji. System FPLC automatycznie eluuje frakcje do probówek zbiorczych.</li>
	<li>W module "Kontrola systemu" oprogramowania otwórz metodę, która ma zostać uruchomiona. 
	UWAGA: Uruchomienie metody jest inicjowane w serii stron, które obejmują sprawdzenie zmiennych metody, ustawienia kolektora frakcji oraz zdefiniowanie nazwy pliku wynikowego i miejsca przechowywania.</li>
	<li>Kliknij przycisk START, aby zainicjować uruchomienie. Przebieg można monitorować w module "Sterowanie systemem".</li>
	<li>Po zakończeniu procesu oczyszczania sprawdzić wynikowy chromatogram w module "Ocena" w oprogramowaniu systemowym.</li>
	<li>Połączyć wszystkie frakcje zawierające białko w oddzielnej probówce, wymienić bufor i zagęścić w PBS za pomocą filtra odśrodkowego z odciętą masą cząsteczkową 30 kDa. Wykonać etapy wirowania zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Zmierz stężenie przeciwciał za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA) zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Jeżeli ma być przeprowadzony kolejny cykl oczyszczania, należy zalać rurkę pompy próbki w buforze wiążącym i powtórzyć kroki 4.9-4.14.</li>
	<li>Po zakończeniu procesów oczyszczania zanurzyć rurki wlotowe A, B i pompę do pobierania próbek w wodzie ultraczystej i umyć układ i kolumnę, jak wykonano w kroku 3.</li>
	<li>Zanurz rurki A, B i rurki pompy do pobierania próbek w 20% etanolu i powtórz procedurę mycia w celu przechowywania układu i kolumny.</li>
	<li>Odłącz kolumnę od dolnego wylotu i załóż korek kolumny, a następnie odłącz kolumnę na wlocie i wymień korek, ponownie podłącz rurkę do systemu. Przechowywać kolumnę w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, A. L., Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+trends+for+therapeutic+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development trends for therapeutic antibody fragments.</a> Nat Biotechnol. 27 (4), 331-337 (2009).</li>
<li>Drake, P. M., Rabuka, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+playbook+for+antibody-drug+conjugates%3A+lessons+from+the+laboratory+and+clinic+suggest+a+strategy+for+improving+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">An emerging playbook for antibody-drug conjugates: lessons from the laboratory and clinic suggest a strategy for improving efficacy and safety.</a> Curr Opin Chem Biol. 28, 174-180 (2015).</li>
<li>Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies.</a> Drug Discov Today. 20 (7), 838-847 (2015).</li>
<li>Beck, A., Wurch, T., Bailly, C., Corvaia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+challenges+for+the+next+generation+of+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strategies and challenges for the next generation of therapeutic antibodies.</a> Nat Rev Immunol. 10 (5), 345-352 (2010).</li>
<li>Food and Drug Administration. 22, Food and Drug Administration. eds U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), & Center for Biologics Evaluation and Research (CBER) (2015).</li>
<li>European Medicines Agency. 13, European Medicines Agency. eds European Medicines Agency (EMA) & Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) (2014).</li>
<li>Lopez-Morales, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+and+biological+characterization+of+a+biosimilar+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Physicochemical and biological characterization of a biosimilar trastuzumab.</a> Biomed Res Int. 2015, 427235(2015).</li>
<li>Jung, S. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25517302">Physicochemical characterization of Remsima.</a> MAbs. 6 (5), 1163-1177 (2014).</li>
<li>Visser, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+and+functional+comparability+between+the+proposed+biosimilar+rituximab+GP2013+and+originator+rituximab%5BTitle%5D)+AND+%22BioDrugs%22%5BJournal%5D)">Physicochemical and functional comparability between the proposed biosimilar rituximab GP2013 and originator rituximab.</a> BioDrugs. 27 (5), 495-507 (2013).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+different+vector+designs+for+the+mammalian+expression+of+recombinant+IgG+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative study of different vector designs for the mammalian expression of recombinant IgG antibodies.</a> J Immunol Methods. 318 (1-2), 113-124 (2007).</li>
<li>Fitzgerald, K. D., Semler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+IRES+elements+in+mRNAs+to+the+eukaryotic+translation+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Bridging IRES elements in mRNAs to the eukaryotic translation apparatus.</a> Biochim Biophys Acta. 1789 (9-10), 518-528 (2009).</li>
<li>Ho, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+Tricistronic+vectors+for+enhancing+generation+of+high+monoclonal+antibody+expressing+CHO+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of high monoclonal antibody expressing CHO cell lines.</a> J Biotechnol. 157 (1), 130-139 (2012).</li>
<li>Dodev, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tool+kit+for+rapid+cloning+and+expression+of+recombinant+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A tool kit for rapid cloning and expression of recombinant antibodies.</a> Sci Rep. 4, 5885(2014).</li>
<li>Walsh, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+protein+biopharmaceuticals%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals.</a> Drug Discov Today. 15 (17-18), 773-780 (2010).</li>
<li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+vector+design+and+multi-pathway+modulation+of+HEK+293E+cells+yield+recombinant+antibody+titers+exceeding+1+g%2Fl+by+transient+transfection+under+serum-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rational vector design and multi-pathway modulation of HEK 293E cells yield recombinant antibody titers exceeding 1 g/l by transient transfection under serum-free conditions.</a> Nucleic Acids Res. 36 (15), 96(2008).</li>
<li>Bebbington, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+expression+of+a+recombinant+antibody+from+myeloma+cells+using+a+glutamine+synthetase+gene+as+an+amplifiable+selectable+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">High-level expression of a recombinant antibody from myeloma cells using a glutamine synthetase gene as an amplifiable selectable marker.</a> Biotechnology (N Y). 10 (2), 169-175 (1992).</li>
<li>Kaufman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coamplification+and+coexpression+of+human+tissue-type+plasminogen+activator+and+murine+dihydrofolate+reductase+sequences+in+Chinese+hamster+ovary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coamplification and coexpression of human tissue-type plasminogen activator and murine dihydrofolate reductase sequences in Chinese hamster ovary cells.</a> Mol Cell Biol. 5 (7), 1750-1759 (1985).</li>
<li>Dalton, A. C., Barton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Sci. 23 (5), 517-525 (2014).</li>
<li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+gene+expression+in+HEK293+cells%3A+peptone+addition+posttransfection+improves+recombinant+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis.</a> Biotechnol Bioeng. 90 (3), 332-344 (2005).</li>
<li>Pham, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+transient+transfection+of+serum-free+suspension-growing+HEK293+EBNA1+cells%3A+peptone+additives+improve+cell+growth+and+transfection+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Large-scale transient transfection of serum-free suspension-growing HEK293 EBNA1 cells: peptone additives improve cell growth and transfection efficiency.</a> Biotechnol Bioeng. 84 (3), 332-342 (2003).</li>
<li>Yang, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+valproic+acid+to+CHO+cell+fed-batch+cultures+improves+monoclonal+antibody+titers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Addition of valproic acid to CHO cell fed-batch cultures improves monoclonal antibody titers.</a> Molecular Biotechnology. 56 (5), 421-428 (2014).</li>
<li>Backliwal, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valproic+acid%3A+a+viable+alternative+to+sodium+butyrate+for+enhancing+protein+expression+in+mammalian+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures.</a> Biotechnol Bioeng. 101 (1), 182-189 (2008).</li>
<li>Jiang, Z., Sharfstein, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+butyrate+stimulates+monoclonal+antibody+over-expression+in+CHO+cells+by+improving+gene+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility.</a> Biotechnol Bioeng. 100 (1), 189-194 (2008).</li>
<li>Jordan, M., Wurm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+adherent+and+suspended+cells+by+calcium+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate.</a> Methods. 33 (2), 136-143 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten szczegółowo opisuje transfekcję, stabilną ekspresję i oczyszczanie przeciwciała terapeutycznego w komórkach HEK-293. Stabilna ekspresja genów przeciwciał jest pierwszym krokiem w generowaniu linii komórkowej wytwarzającej przeciwciała w celu opracowania i wytworzenia przeciwciała terapeutycznego. Podczas gdy komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) pozostają platformą ekspresji z wyboru dla białek terapeutycznych, linia komórkowa HEK-293 zyskuje na znaczeniu wraz ze świadomością, że białka wytwarzane w tych ...

Sukces przeciwciał terapeutycznych nadal napędza znaczne inwestycje w rozwój przeciwciał, ponieważ rozpoczyna się fala terapii nowej generacji. Oczekuje się, że rynek przeciwciał zostanie przekształcony przez fragmenty przeciwciał 1, koniugaty przeciwciało-lek 2, przeciwciała bispecyficzne 3 oraz zmodyfikowane przeciwciała o korzystnych właściwościach 4. Kolejną klasą, która cieszy się zainteresowaniem farmaceutycznym, są leki biopodobne. Przeciwciała biopodobne są "wysoce podobnymi" produktami replikującymi przeciwciało terapeutyczne, które zostało już zatwierdzone przez organy regulacyjne. Proponowany lek biopodobny musi być porównywalny z przeciwciałem pierwotnym pod względem jego struktury, funkcji, toksyczności dla zwierząt, bezpieczeństwa klinicznego i skuteczności, farmakokinetyki u ludzi (PK), farmakodynamiki (PD) i immunogenności 5,6.
Wskaźniki zatwierdzania przeciwciał biopodobnych były niskie ze względu na ścisłe ograniczenia dotyczące końcowej jakości produktu. Dokładne procesy produkcyjne, takie jak określone linie komórkowe i warunki hodowli, aż do końcowych etapów przetwarzania, mogą pozostać zastrzeżone. Co więcej, wytwarzanie przeciwciał z natury wiąże się z pewną zmiennością, co może stanowić dodatkowe wyzwanie związane z wytwarzaniem bardzo podobnego produktu. Kompleksowa charakterystyka i porównanie fizykochemiczne i biofizyczne jest dość trudne, jednak w literaturze pojawia się szereg badań wykazujących charakterystykę przeciwciał biopodobnych 7,8,9.
Generowanie przeciwciała terapeutycznego rozpoczyna się od transfekcji komórek gospodarza ssaków z wektorem przenoszącym geny dla odpowiedniego przeciwciała. Projekt wektora, linia komórkowa i warunki hodowli są kluczowymi kwestiami przy tworzeniu systemu ekspresji.
Sekwencje DNA przeciwciał mogą pochodzić z Drug Bank (www.drugbank.ca), IMGT (www.igmt.org) lub publikacji naukowych, w tym patentów. Na przykład sekwencja trastuzumabu jest dostępna w Banku Leków (DB ID: DB00072). Sekwencja aminokwasowa regionów zmiennych może zostać poddana projektowaniu i optymalizacji genów w celu syntezy u pożądanych gatunków gospodarzy. W przypadku przeciwciała biopodobnego ważne jest, aby nie dokonywały one modyfikacji sekwencji aminokwasów. Po zsyntetyzowaniu geny przeciwciał mogą zostać subklonowane do odpowiedniego wektora z wyboru.
Ludzkie przeciwciała IgG składają się z dwóch identycznych łańcuchów ciężkich i dwóch identycznych łańcuchów lekkich. Ściśle regulowana ekspresja obu łańcuchów jest niezbędna do optymalnej produkcji heterologicznego białka IgG w komórkach ssaków 10. Konieczne jest wytworzenie wewnątrz- i międzyłańcuchowych wiązań dwusiarczkowych, a podczas biosyntezy białek musi zostać wprowadzony szereg modyfikacji potranslacyjnych. Dostępnych jest wiele wektorów, które zostały zaprojektowane specjalnie do ekspresji genów przeciwciał (patrz tabela materiałów). Te specyficzne dla przeciwciał wektory zwykle wyrażają stałe regiony zarówno dla łańcuchów ciężkich, jak i lekkich, więc klonowania wymagają tylko zmienne regiony każdego łańcucha.
Transfekcja komórek z dwoma niezależnymi konstruktami (kotransfekcja) jest najczęstszym podejściem do dostarczania ciężkich i lekkich genów kodujących łańcuchy. Oznacza to, że każdy gen jest napędzany przez własny promotor i transkrybowany jako oddzielne łańcuchy przeciwciał przed złożeniem w retikulum endoplazmatycznym. Z drugiej strony, wektory multi-cistroniczne mają wbudowane wewnętrzne elementy miejsca wejścia rybosomów (IRES), które umożliwiają ekspresję wielu genów jako pojedynczego transkryptu mRNA z translacją dozwoloną z wewnętrznych regionów mRNA 11. W tym przypadku geny kodujące łańcuchy ciężkie i lekkie są sprzężone w układzie umożliwiającym osiągnięcie koekspresji obu łańcuchów przeciwciał 10,12.
Podczas gdy przejściowo transfekowane komórki dają wystarczającą ilość białka do przeprowadzenia ograniczonej liczby eksperymentów, stabilnie transfekowane linie komórkowe, które przeszły selekcję do integracji genomu, mogą dostarczyć wyższych plonów. Wyższe ilości białka pozwalają na opracowanie testów związanych z charakterystyką in vitro i mogą stanowić wskazówkę co do jakości przeciwciał pod kątem dalszych zastosowań, takich jak selekcja linii komórek klonalnych i głównych kandydatów.
Celem tego artykułu jest opisanie stabilnej ekspresji i oczyszczania przeciwciała terapeutycznego wytwarzanego w systemie ekspresji ssaków. Rzeczywiście, metodę tę można zastosować do ekspresji przeciwciała biopodobnego. Metoda ta może być wykorzystana do wstępnej charakterystyki przeciwciał przed przejściem do krytycznych, choć czasochłonnych etapów identyfikacji pożądanego klonu do produkcji na większą skalę. Co więcej, metoda ta może być stosowana do ekspresji innych białek, a nie tylko przeciwciał.
Poniższy szczegółowy protokół opisuje ekspresję terapeutycznego przeciwciała trastuzumab. Polega ona na przygotowaniu DNA wektora, a następnie stabilnej transfekcji w linii komórkowej HEK-293 i oczyszczeniu białka przeciwciała za pomocą zautomatyzowanej metody chromatograficznej.

<table><tbody><tr><td>Seria wektorów pFUSE</td><td>InvivoGen</td><td>N/A</td><td>Geny przeciwciał ciężkich i lekkich ulegające ekspresji w oddzielnych wektorach, które wymagają kotransfekcji.</td></tr><tr><td>Seria wektorów mAbXpress</td><td>ACYTE Biotech Pty Ltd.</td><td></td><td>Ciężkie i lekkie geny przeciwciał ulegające ekspresji w oddzielnych wektorach, które wymagają kotransfekcji. Patrz: Jones, M. L. i wsp. Metoda szybkiego, niezależnego od ligacji formatowania rekombinowanych przeciwciał monoklonalnych. J Metody immunologiczne. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).</td></tr><tr><td>Wektor pVITRO1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Geny ciężkich i lekkich przeciwciał są napędzane przez oddzielny promotor w jednym wektorze.&nbsp; Patrz: Dodev, T. S. et al. Zestaw narzędzi do szybkiego klonowania i ekspresji rekombinowanych przeciwciał. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).</td></tr><tr><td>Seria wektorów GS</td><td>Lonza</td><td></td><td>Wektor multi-cistroniczny z ciężkimi i lekkimi genami przeciwciał ulegającymi koekspresji i translacji jako pojedynczy transkrypt.</td></tr><tr><td>Wektor multi-cistroniczny seria 1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Wektor multi-cistroniczny z ciężkimi i lekkimi genami przeciwciał współeksprymowanymi i translowanymi jako pojedynczy transkrypt. Patrz: Li, J. et al. Badanie porównawcze różnych projektów wektorów dla ssaczej ekspresji rekombinowanych przeciwciał IgG. J Metody immunologiczne. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).</td></tr><tr><td>Wektor multi-cistroniczny seria 2</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Wektor multi-cistroniczny z ciężkimi i lekkimi genami przeciwciał współeksprymowanymi i translowanymi jako pojedynczy transkrypt. Patrz: Ho, SC et al. Wektory tricistroniczne za pośrednictwem IRES w celu zwiększenia wytwarzania linii komórkowych CHO o wysokiej ekspresji przeciwciał monoklonalnych. J Biotechnol. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).</td></tr><tr><td>pVITRO1-trastuzumab-IgG1/&kappa;</td><td>Addgene</td><td>61883</td><td>Wektor ekspresyjny ssaków zawierający geny przeciwciała trastuzumabu z genem oporności na higromycynę; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/&kappa; był prezentem od Andrew Beavila.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro Agar</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-s</td><td>Służy do przygotowania agaru LB o niskiej zawartości soli zawierającego 75 &mikro; g/ml higromycyny.</td></tr><tr><td>Fast-Media Hygro TB</td><td>Jomar Life Research</td><td>fas-hg-l</td><td>Służy do przygotowania bulionu TB o niskiej zawartości soli zawierającego 75 &mikro; g/ml higromycyny.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glicerol, BioXtra, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279</td><td>Przygotować do 80% z wodą i autoklawem. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>Jestar 2.0/LFU Plasmid Maxi Kit</td><td>Astral Scientific</td><td>G221020</td><td>Plasmid Maxi Prep Kit; eluować lub ponownie zawiesić DNA w wodzie (pH 7,0-8,5).</td></tr><tr>Linia komórkowa <td>FreeStyle 293-F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td>HEK-293 przystosowana do hodowli zawiesinowej w pożywkach bez surowicy.</td></tr><tr><td>FreeStyle 293 Expression Medium</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>Pożywka bez surowicy specjalnie opracowana do utrzymania linii komórkowej 293-F i wysokiej ekspresji białka.</td></tr><tr><td>Kolliphor P188</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4894</td><td>Niejonowy środek powierzchniowo czynny; pluroniczny F-68; przygotować do 10% w wodzie i wysterylizować filtrem za pomocą 0,22 &mu; m filtr. Przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowana termicznie płodowa surowica bydlęca</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Polietyleninina, liniowa, MW 25 000&nbsp;</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td>Przygotować do spożycia 1 mg/ml w wodzie. Dostosować do pH 7,0 za pomocą 1 M HCl (roztwór staje się klarowny) i wysterylizować filtrem za pomocą 0,22 &mu; m filtr. Przechowywać w temperaturze -80 stopni; C do momentu użycia.</td></tr><tr><td>OptiPro SFM</td><td>Life Technologies</td><td>12309-050</td><td>Pożywka bez surowicy opracowana przez transfekcję</td></tr><tr><td>Roztwór higromycyny B</td><td>Jomar Life Research</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulphoxide (DMSO)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AJA2225</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone (pepton kazeinowy)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LP0042B</td><td>Przygotować do 20% w PBS i wysterylizować metodą filtracji za pomocą 0,22 &mu; m filtr. Przechowywać w temperaturze 4 stopni.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tabletki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4, 100 ml</td><td>Astral Scientific</td><td>09-2051-100</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Protein A High Performance, 1 x 5 ml kolumna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0403-01</td><td></td></tr><tr><td>AKTApurifier 100</td><td>GE Healthcare</td><td>28406266</td><td>Zautomatyzowany system FPLC, który może zawierać pompę do próbek P-960 i kolektor frakcji Frac-920.</td></tr><tr><td>Glycine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2879</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy, monohydrat</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOC2123</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian sodu, sól trisodowa dwuwodna&nbsp;</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOCB0035</td><td></td></tr><tr><td>1 M roztwór Tris-HCl pH 9,0</td><td>Astral Scientific</td><td>BIOSD8146</td><td></td></tr><tr><td>Filtry odśrodkowe Amicon Ultra (30 MWCO)</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC803008/UFC903008</td><td>Służy do buforowania, wymiany i koncentratu oczyszczonego białka.</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania kwasu bicynchoninowego (BCA)</td><td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>System BLItz</td><td>fort&eacute; BIO</td><td>45-5000</td><td>Przyrząd służący do pomiarów interferometrii biowarstwowej (BLI).</td></tr><tr><td>Biosensory białka A</td><td>fort&eacute; BIO</td><td>18-5010</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid/Bisakryloamid (37,5:1), roztwór 40%</td><td>Astral Scientific</td><td>786-502</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0486</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Astral Scientific</td><td>AM0761</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Błękit brylantowy R-250</td><td>Astral Scientific</td><td>786-498</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Dwukolorowe białko Standardowy</td><td>1610374</td><td></td> <td>Bio-Rad</td></tr></tbody></table>

produkcja i oczyszczanie przeciwciała terapeutycznego na skalę laboratoryjną

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Zapewnienie pomyślnej produkcji przeciwciała terapeutycznego zaczyna się na wczesnym etapie procesu rozwoju. Pierwszym etapem jest wektorowa ekspresja genów przeciwciał, a następnie stabilna transfekcja do odpowiedniej linii komórkowej. Stabilne klony są poddawane badaniom przesiewowym w celu wybrania tych klonów, które mają pożądane cechy produkcyjne i wzrostowe. Jest to krytyczny, choć czasochłonny krok w procesie. Protokół ten uwzględnia selekcję wektorów i pozyskiwanie sekwencji przeciwciał w celu ekspresji przeciwciała terapeutycznego. Metody opisują przygotowanie wektorowego DNA do stabilnej transfekcji wariantu zawiesinowego ludzkiej embrionalnej linii komórkowej nerki 293 (HEK-293) przy użyciu polietyleneniminy (PEI). Komórki są transfekowane jako komórki przylegające w pożywce zawierającej surowicę w celu maksymalizacji wydajności transfekcji, a następnie dostosowywane do warunków wolnych od surowicy. Produkcja na dużą skalę, ustawiana jako hodowle nadmierne w partiach, jest wykorzystywana do uzyskania białka przeciwciała, które jest oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC). Wydajność przeciwciał wytworzona tą metodą może dostarczyć wystarczającą ilość białka, aby rozpocząć wstępną charakterystykę przeciwciała. Może to obejmować opracowanie testu in vitro lub charakterystykę fizykochemiczną, aby pomóc w czasochłonnym zadaniu klonalnych badań przesiewowych dla głównych kandydatów. Metodę tę można zastosować do opracowania systemu ekspresji do produkcji przeciwciał biopodobnych.

Stabilną produkcję trastuzumabu przez przetransfekowane komórki HEK-293 potwierdzono za pomocą interferometrii warstwowej (BLI), co przedstawiono na Rysunku 1. Krzywą wzorcową dla IgG wygenerowano poprzez pomiar szybkości wiązania między wzorcem przeciwciała IgG a biosensorem Protein A (Rysunek 1A). W podobny sposób zmierzono surową próbkę supernatantu, a następnie interpolowano jej stężenie z krzywej wzorcowej (Rysunek 1B). Stężenie w su...

Ten protokół opisuje produkcję przeciwciała terapeutycznego w systemie ekspresji ssaków. Opisane metody obejmują przygotowanie DNA wektora, stabilną transfekcję i adaptację ludzkiej linii komórkowej 293 zarodka nerki bez surowicy, stworzenie kultur na dużą skalę i oczyszczanie za pomocą chromatografii powinowactwa.

Produkcja i oczyszczanie przeciwciała terapeutycznego na skalę laboratoryjną

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

Ogólnym celem tej metody jest opracowanie wysokowydajnego systemu ekspresji bezsurowiczego do produkcji przeciwciała terapeutycznego w skali laboratoryjnej. Metoda ta pozwala uwzględnić kluczowe kwestie podczas projektowania systemu ekspresji przeciwciał, takie jak wytworzenie stabilnej linii komórkowej, dodawanie suplementów oraz optymalizacja strategii oczyszczania. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że wytworzenie stabilnej linii komórkowej zaadaptowanej do pożywek bezsurowiczych pozwoli na uzyskanie trwałych i powtarzalnych ilości przeciwciała terapeutycznego.W celu rozpoczęcia, należy hodować komórki HEK-293 zgodnie ze standardowymi protokołami w medium bezsurowiczym uzupełnionym o 0,1% niejonowego surfaktantu, w kolbach Erlenmeyera. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przy 120 obr./min. Utrzymywać kulturę na poziomie 2 × 10⁵ komórek/ml i przeprowadzać pasaż co czwarty dzień.Dzień przed transfekcją wysiej komórki HEK-293 w zagłębieniach płytki 12-dołkowej w zagęszczeniu 3 × 10⁵ komórek/ml, w 2 ml pożywki DMEM z 10% inaktywowanego ciepłem FBS. W dniu transfekcji sprawdź, czy komórki osiągnęły 80 do 90% konfluencji. Rozcieńcz 1,25 µg wektora DNA na każde zagłębien

laboratory-scale-production-and-purification-of-a-therapeutic-antibody

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Ten film demonstruje technikę badania in vivo lokalizacji przeciwciał specyficznych dla nowotworu w modelu ksenoprzeszczepu guza myszy. Po podskórnym wstrzyknięciu komórek rakowych myszom w celu powstania guza, wstrzykuje się fluorescencyjnie znakowane przeciwciała, które wiążą się z receptorami specyficznymi dla guza, umożliwiając ocenę in vivo lokalizacji przeciwciał za pomocą obrazowania.

Technika oceny lokalizacji in vivo przeciwciał specyficznych dla nowotworu

Film wyjaśnia proces wytwarzania przeciwciał w komórkach gospodarza ssaków, od ekspresji genów do wydzielania. Obejmuje transkrypcję, translację, rozpoznawanie sygnału, prawidłowe fałdowanie i ostateczne uwolnienie do ośrodka zewnątrzkomórkowego przez pęcherzyki wydzielnicze.

Produkcja i oczyszczanie rekombinowanych przeciwciał z komórek ssaków

Ten film demonstruje test do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z płynu do hodowli komórkowych pobranego z komórek jajnika chomika chińskiego. Wykorzystuje porowatą żywicę szklaną z unieruchomionym białkiem A, które wiąże się z regionem Fc przeciwciał w próbce, skutecznie oddzielając je od zanieczyszczeń. Zastosowanie buforu elucyjnego o niskim pH osłabia interakcję, ułatwiając pobieranie oczyszczonych przeciwciał.

Technika oczyszczania przeciwciał monoklonalnych wytwarzanych przez komórki jajnika chomika chińskiego

Film demonstruje metodę wytwarzania przeciwciał terapeutycznych przy użyciu stabilnie transfekowanych komórek ssaków. Suplementacja tryptonem stymuluje podział komórek, powodując przerost i wspierając wyższą wydajność przeciwciał. Pożywka zawierająca przeciwciała jest zbierana, filtrowana i przechowywana do dalszego wykorzystania.

Wytwarzanie przeciwciał z okresowej hodowli przerostu transfekowanych komórek ssaków

Ten film demonstruje technikę oczyszczania przeciwciał monoklonalnych z supernatantu hodowli uzyskanego z hodowli komórkowej wytwarzającej przeciwciała. Proces ten polega na wykorzystaniu matrycy usieciowanych kulek agarozy ze sprzężonym białkiem A, które unieruchamia przeciwciała w supernatancie na kulkach, co pozwala na skuteczne oddzielenie od zanieczyszczeń. Poprzez zastosowanie buforu elucyjnego o niskim pH oddziaływanie białka A z przeciwciałem zostaje rozluźnione, co ułatwia zbieranie...

Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania przeciwciał monoklonalnych

Ten film demonstruje metodę wykrywania szczepów cyjanobakterii w próbce środowiskowej za pomocą mikromatrycy przeciwciał. Próbki zawierające różne bakterie wchodzą w interakcje z wydrukowanymi przeciwciałami, a barwienie immunologiczne przeciwciałami anty-cyjanobakterii znakowanymi fluoroforem ujawnia obecność specyficznych szczepów cyjanobakterii poprzez fluorescencję w różnych miejscach.

Technika wykrywania szczepów sinic za pomocą chipa mikromacierzy przeciwciał

Obecność toksyn cyjanobakteryjnych w zbiornikach słodkiej wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi jest głównym problemem dla organów zarządzających gospodarką wodną. Aby ocenić ryzyko zanieczyszczenia wody, w artykule opisano protokół wykrywania w terenie szczepów sinic w próbkach ciekłych i stałych przy użyciu chipa mikromacierzy przeciwciał.

Eksperymentalny protokół wykrywania sinic w próbkach ciekłych i stałych za pomocą chipa mikromacierzy przeciwciał

Opisano szczegółowy protokół oczyszczania i późniejszej analizy przeciwciała monoklonalnego z pobranego płynu do hodowli komórek (HCCF) zautomatyzowanych mikrobioreaktorów. Przedstawiono również wykorzystanie analiz do określenia krytycznych atrybutów jakości (CQA) i maksymalizacji ograniczonej objętości próbki w celu wyodrębnienia istotnych informacji.

Oczyszczanie i analiza przeciwciała monoklonalnego z komórek jajnika chomika chińskiego przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktora

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalizacji in vivo przeciwciał w modelach ksenoprzeszczepów guza myszy.

Analiza rozmieszczenia nowotworów i tkanek przeciwciała terapeutycznego specyficznego dla antygenu docelowego

Poznaj metodę produkcji przeciwciał terapeutycznych na skalę laboratoryjną z wykorzystaniem komórek HEK-293 w warunkach bezsurowicowych. Protokół obejmuje transfekcję stabilną, adaptację do środowiska bezsurowicowego oraz oczyszczanie chromatografią afinitacyjną.

Produkcja i oczyszczanie przeciwciała terapeutycznego na skalę laboratoryjną

Przeglądaj więcej filmów