Name: Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T11:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Naucz się izolować wyspy trzustkowe od noworodków myszy za pomocą kolagenazy. Ta prosta metoda pozwala uzyskać 20–80 klastrów wysp na trzustkę do badań nad insuliną i ekspresją genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem z NIDDK (DK065949 dla GG). Dziękujemy dr Brendzie M. Jarvis i Jeffowi Duryea Jr. za przeczytanie manuskryptu.

Wykorzystanie zwierząt odbywa się zgodnie z procedurami określonymi w protokole M/11/181 zatwierdzonym przez Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee dla Gu. Myszy CD1 lub CBA/Bl6 zakupiono od komercyjnych dostawców i skrzyżowano w ośrodku dla zwierząt Vanderbilt w celu uzyskania myszy nowonarodzonych.
1. Przygotowanie myszy, roztworów podstawowych i sprzętu
<ol>
	<li>Dla krzyżyka myszy: ustaw krzyżyk myszy i zapisz daty podłączenia, aby pomóc w planowaniu eksperymentów. Myszy CD1 zwykle rodzą około 19 dnia po kryciu. Użyj krzyżówek CD1 lub CBA/Bl6, aby uzyskać odpowiednio noworodki CD1 lub CBA/Bl6. Krzyżówki między tymi dwiema liniami wykorzystują samice CD1 i samce CBA/Bl6.</li>
	<li>W przypadku kolagenazy: zważyć 200 mg kolagenazy typu IV za pomocą wagi o wysokiej precyzji. Przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Rozpuścić w 40 ml HBSS z Ca2+/Mg2+ (odpowiednio 1,26 i 0,5 mM) w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 5 mg/ml.
	<ol>
		<li>Pozostaw kolagenazę do rozpuszczenia na ~ 30 minut, delikatnie wstrząsając. Podwielokrotność roztworu należy podtrzymać i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C jako zapas, który pozostaje aktywny przez co najmniej jeden rok.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Autoklaw do sterylizacji kilku par pęset, nożyczek i końcówek P20 do preparowania i wybierania wysepek.</li>
	<li>Dla 1 M zapasu glukozy: zważyć 9 g glukozy w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml, dodać 50 ml pożywki RPMI 1640 w celu rozpuszczenia glukozy. Przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia, ale nie dłużej niż 6 miesięcy.</li>
</ol>
2. Działające rozwiązania
UWAGA: W dniu izolacji wysepek przygotuj następujące odczynniki.
<ol>
	<li>Dla roztworu roboczego kolagenazy typu IV: rozmrozić i rozcieńczyć wywar kolagenazy na lodzie. Dozuj 0.15 ml bulionu do każdej probówki o pojemności 1.7 ml do mikrofuge. Dodać 1,35 ml HBSS z Ca2+/Mg2+. Odwróć rurkę 5 razy. Pozostaw na lodzie na 15 minut.
	<ol>
		<li>Wirować na wysokich obrotach przez 3 minuty w mikrowirówce. Przenieść supernatant do nowej probówki. Pozostaw na lodzie do czasu użycia. Wyrzuć probówkę z nierozpuszczalnymi zanieczyszczeniami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby uzyskać kompletne pożywki RPMI 1640: dodaj 2,5 ml 1 M glukozy, 50 ml inaktywowanego termicznie FBS i 5 ml 100x Pen-strep do 500 ml pożywki RPMI 1640. Pozostaw na lodzie do czasu użycia.</li>
</ol>
3. Izolacja i trawienie trzustki
<ol>
	<li>Eutanazja noworodków za pomocą izofluranu, a następnie dekapitacja zgodnie z zatwierdzonymi protokołami.</li>
	<li>Połóż mysz brzuchem do góry. Spryskaj 70% etanolem do sterylizacji.</li>
	<li>Podnieś skórę brzucha do góry pęsetą i przetnij warstwy skóry i mięśni wzdłuż linii środkowej nożyczkami, od okolicy narządów płciowych do klatki piersiowej. Otwiera to jamę brzuszną, aby odsłonić wszystkie narządy wewnętrzne.</li>
	<li>Przenieś wszystkie narządy wewnętrzne do naczynia o średnicy 100 cm za pomocą pęsety. Zlokalizuj trzustkę, która jest rozproszonym narządem z częścią grzbietową, która przylega do żołądka i śledziony oraz częścią brzuszną, która przylega do dwunastnicy11.</li>
	<li>Dodaj HBSS do naczynia, aby zanurzyć narządy. W roztworze tkanki trzustki nie przylegają już do dwunastnicy, żołądka lub śledziony. Jest łatwo rozpoznawalny pod lunetą sekcyjną ze względu na typowy biały kolor. Za pomocą pęsety oderwij tkanki trzustki od otaczających tkanek i przenieś do nowego naczynia o średnicy 60 mm z HBSS.</li>
	<li>Pokrój każdą trzustkę nożyczkami na kawałki mniejsze niż 5 mm w dowolnych wymiarach. Przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. W jednej probówce można strawić do pięciu trzustek (młodszych niż P7). W przypadku myszy P8-P16 użyj jednej rurki na trzustkę.</li>
	<li>Dodaj 0,5 - 1 ml roztworu roboczego kolagenazy do każdej probówki (0,2 ml na każdą trzustkę P1-P7). Użyj 0,5 ml na każdą trzustkę P8-P16). Pozostawić probówkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na maksymalnie 15 minut. Odwróć rurkę dwa razy co minutę.</li>
	<li>Po ~ 5 minutach dotknij rurki, aby monitorować stan trawienia tkanki trzustki. Kontynuuj proces trawienia, aż większość tkanki trzustki pojawi się jako rozdrobnione skupiska komórek o średnicy < 2 mm. Lisat będzie wyglądał na mętny, co jest spowodowane normalną autolizą komórek groniastych.</li>
</ol>
4. Mycie lizatu
<ol>
	<li>Wirować lizat przy 500 x g przez 10 s w mikrowirówce. Usunąć warstwę sklarowanego osadu za pomocą pipetmana P1,000. Supernatant powinien wydawać się mętny, ale pozbawiony skupisk komórek. Nie należy stosować aspiracji, która może szybko odessać fragmenty tkanki na dnie ze względu na obecność lepkiego DNA.</li>
	<li>Dodaj 1 ml kompletnej pożywki RPMI 1640. Delikatnie postukaj w rurkę, aby ponownie zawiesić rozdrobniony lizat. Odwróć w górę i w dół 10 razy. Powtórz krok 4.1.</li>
	<li>Powtórzyć krok 4.2 jeszcze dwa razy lub do momentu, gdy supernatant okaże się przezroczysty. Ponownie zawiesić umyte fragmenty trzustki w 1 ml kompletnego podłoża RPMI 1640.</li>
</ol>
5. Izolacja wysepek
UWAGA: Dla małej liczby trzustki, bezpośrednie ręczne zbieranie, jak poniżej (5.1), może być użyte do izolacji wysp trzustkowych. W przypadku dużej liczby trzustki (> 6) preferowana jest metoda opisana w ppkt 5.2.
<ol>
	<li>Bezpośrednia kompletacja ręczna:
	<ol>
		<li>Przenieś lizat z kroku 4.3 na szalkę o średnicy 60 mm. Dodaj 5 ml kompletnej pożywki RPMI 1640. Przynieś pod mikroskop preparacyjny.</li>
		<li>Ustaw oświetlenie jasnego pola w mikroskopie. Dostosuj natężenie światła do ~ 50% mocy maksymalnej. W tym stanie wysepki pojawiają się jako lekko różowe skupiska, podczas gdy komórki groniaste jako ciemne skupiska o nieregularnym kształcie (ryc. 1A). Zalecane jest powiększenie ~ 50X (łączące moc obiektywu i okularu), aby zapewnić najlepszy sposób jednoczesnej wizualizacji wysepek i otworu końcówki pipety podczas wybierania.</li>
		<li>Zbieraj wysepki za pomocą końcówki do pipet P20, unikając tworzenia się grona zrazisk. Dozować frakcje wzbogacone w wysepki do nowej płytki o średnicy 60 mm z kompletnymi pożywkami RPMI (rysunek 1B).</li>
		<li>Powtórz proces ręcznego zbierania jeszcze dwa razy. Pozostaw czyste wysepki w nowym naczyniu o średnicy 60 mm z 4 ml kompletnej pożywki RPMI (Rysunek 1C).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wirowanie gradientowe:
	<ol>
		<li>Przygotować probówkę wirówkową o pojemności 15 ml, która jest wstępnie załadowana 2 ml polisacharozy i ditrizoinianu sodu o gęstości 1,077 g/ml. Pozostaw tubkę na lodzie do czasu użycia.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę z kroku 4.3 na wierzch roztworu polisacharozy i ditrizoinianu sodu za pomocą pipety Pasteura. Nie naruszaj dolnej warstwy. Do każdej probówki o pojemności 15 ml można załadować tkanki z maksymalnie 10 noworodków lub 2 trzustki P17.</li>
		<li>Obracać rurkę przy ~ 600 x g w wirniku obrotowym przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Stosować ustawienia hamowania.</li>
		<li>Po odwirowaniu przenieś pożywkę i warstwy międzyfazowe (należy pamiętać, że w idealnych warunkach pracy wysepki będą znajdować się w interfazie między polisacharozy a pożywką hodowlaną po odwirowaniu) do nowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 10 ml pożywki, delikatnie, ale dokładnie wymieszaj.</li>
		<li>Wirować frakcję wzbogaconą w wyspy o masie 300 x g przez 5 minut. Usunąć płyn myjący. Powtórz pranie jeszcze raz z pełnymi mediami RPMI. Ponownie zawiesić granulki w podłożu o pojemności 4 ml, które zawiera głównie wysepki i kanały (rysunek 1D).</li>
		<li>Ręcznie wybierz wysepki, jak opisano w sekcji 5.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Testy GSIS na izolowanych wysepkach
<ol>
	<li>Inkubować wyspy trzustkowe z etapu 5.1.4 w kompletnych pożywkach RPMI przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Użyj pipety, aby usunąć RPMI pod mikroskopem preparacyjnym. Dodaj 3 ml roztworu KRB z 2,8 mM glukozy do płytki3. Zakręć 10 razy, aby umyć wysepki. Usuń rozwiązania KRB.
	<ol>
		<li>Powtórz proces prania raz. Inkubować wyspy trzustkowe w 3 ml roztworu KRB w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w inkubatorze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podwielokrotność 1 ml KRB do każdego dołka na płytce 12-dołkowej. Podgrzej bulion i płytkę KRB do temperatury 37 °C w inkubatorze.</li>
	<li>Przemyć wysepki dwukrotnie wstępnie podgrzanym KRB, jak w ppkt 6.2. Przenieś 10 wysepek do każdej studzienki wstępnie podgrzanych talerzy. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Po 45 minutach pobrać 50 μl supernatantu. Zawiera roztwór insuliny wydzielany pod podstawową glukozą.</li>
	<li>Dodać 32 μl 500 mM glukozy. Zakręć płytką 20 razy, aby wymieszać roztwór. Inkubować w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Obracaj płytką 5 razy raz na 5 minut.</li>
	<li>Po 45 minutach pobrać 50 μl supernatantu. Jest to insulina wydzielana pod wysokim poziomem glukozy.</li>
	<li>Przenieść wszystkie wysepki do probówki o pojemności 1,5 ml. Zamrażać w temperaturze -20 °C przez 30 min. Rozmrażać w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Powtórz proces zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml 70% etanolu z 20 mM HCl. Pozostaw na noc. Jest to insulina pozostawiona w wyspach trzustkowych.</li>
	<li>Użyj konwencjonalnego testu ELISA do oznaczenia poziomu insuliny, opisanego wcześniej3.</li>
</ol>

<ol><li>Matsumoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+pancreatic+islet+cell+isolation+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+%28Bayl+Univ+Med+Cent%29%22%5BJournal%5D)">Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation.</a> Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J Vis Exp. (50), (2011).</li>
<li>Zhao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galphao+represses+insulin+secretion+by+reducing+vesicular+docking+in+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).</li>
<li>Planas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+for+the+human+pancreas+and+purified+islets+in+type+1+diabetes%3A+new+findings+at+clinical+onset+and+in+long-standing+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes.</a> Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).</li>
<li>Tonne, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiling+of+pancreatic+islets+in+mice+during+streptozotocin-induced+beta-cell+damage+and+pancreatic+Glp-1+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy.</a> Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).</li>
<li>London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+functional+evaluation+of+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).</li>
<li>Rorsman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+glucose+to+elicit+a+normal+secretory+response+in+fetal+pancreatic+beta+cells+results+from+glucose+insensitivity+of+the+ATP-regulated+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).</li>
<li>Hellerstrom, C., Swenne, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+and+proliferation+of+fetal+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells.</a> Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).</li>
<li>Blum, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+beta-cell+maturation+is+marked+by+an+increased+glucose+threshold+and+by+expression+of+urocortin+3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).</li>
<li>Hegre, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonenzymic+in+vitro+isolation+of+perinatal+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans.</a> In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).</li>
<li>Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), e102445(2015).</li>
<li>White, J., White, D. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+J+%22Source+Book+of+Enzymes%2C+Source+Book+of+Enzymes%22">Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes</a>. , C.R.C. Press. (1997).</li>
<li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).</li>
<li>Bouwens, L., Rooman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pancreatic+beta-cell+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Regulation of pancreatic beta-cell mass.</a> Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych w odniesieniu do opisywanej pracy.

Tutaj przedstawiamy protokół krok po kroku dotyczący izolacji wysp trzustkowych, które są zbyt małe do konwencjonalnej perfuzji. Oczekuje się, że uzyska wyspy trzustkowe gotowe do wszystkich badań opartych na wyspach trzustkowych, takich jak oczyszczanie komórek beta, analiza ekspresji genów, dojrzewanie komórek beta wysp trzustkowych, proliferacja, reakcje komórek na stres, przeżycie komórek, metabolizm i funkcjonalne utrzymanie GSIS itp. Będzie to, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, pierwszy szczegółowy protokó...

Izolowanie czystych wysp trzustkowych jest niezbędne do badania stymulowanego glukozą wydzielania insuliny (GSIS) komórek beta oraz do przeszczepu wysp trzustkowych od zmarłych dawców 1-3. Konieczne jest również ustalenie ekspresji genów endokrynnych w komórkach wysp trzustkowych 4, 5. W tym celu opracowano szczegółowe protokoły pozwalające na izolację wysp trzustkowych od dużej trzustki (6 i odniesienia w nich). Metody te opierają się na perfuzji enzymatycznej w celu dysocjacji tkanek kowatych od tkanek wysp trzustkowych, w połączeniu z separacją gradientową i ręcznym zbieraniem. W ten sposób izolację wysp trzustkowych od dużej trzustki można łatwo przeprowadzić w większości laboratoriów. Z drugiej strony nie istnieje szczegółowy protokół krok po kroku, który pozwoliłby na odizolowanie wysp trzustkowych, które są zbyt małe, aby można je było ulegać perfuzji.
Badanie ekspresji genów i funkcji noworodkowych wysp trzustkowych jest ważne. Noworodki mają inne właściwości niż dorosłe pod względem wydzielania i proliferacji insuliny 7, 8. Jednak izolowanie wysepek od nowo narodzonych zwierząt, zwłaszcza myszy, jest trudne ze względu na niewielki rozmiar nowo narodzonej trzustki. Rozmiar zapobiega zwykłemu procesowi perfuzji, gdy kolagenaza jest wstrzykiwana przez przewód trzustkowy. Rzeczywiście, w kilku artykułach przedstawiono badania w tym kierunku, z procedurami izolacji wspomaganymi enzymami lub nieenzymami 7, 9, 10. Brakuje jednak szczegółowego opisu procesu izolacji wysepek za pomocą wizualną 7, 9, co sprawia, że przeprowadzenie podobnych badań jest wyzwaniem dla większości badaczy. 
Zbadaliśmy kilka różnych warunków, które dają wysokiej jakości wysepki od nowonarodzonych myszy. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który ma pomóc naukowcom w poznaniu kluczowych szczegółów procesu izolacji wysepek. Protokół ten ma zastosowanie do trzustki myszy do drugiego tygodnia życia, po której można wykonać perfuzję w celu rutynowej izolacji wysp trzustkowych. Wyspy trzustkowe mogą być bezpośrednio wykorzystywane do oznaczania wydzielania insuliny i ekspresji genów.

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza Typ IV</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, VA</td><td>MT21020CV</td><td></td></tr> Jeśli uzyskano <tr><td></td> HBSS bez Ca<2+</Mg2+<td>>/Mg2+</td><td>Cellgro, Manassas, VA</td><td>Jeśli HBSS bez Casup2+/sup/Mg2+, można dodać do CaClsub>2 i MgSO4 Odpowiednio 1,26 i 0,5 mM.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 bez glukozy</td><td>Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA</td><td>11879-020</td><td>Glukoza musi być dodawana do określonych poziomów, aby nie przeszkadzać w późniejszym wykorzystaniu wysp.&nbsp;</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>G-7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>roztwór polisacharozy i diatrizoinianu sodu</td><td>Sigma Aldrich, St Louis, MO</td><td>Histopaque-10771</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Carl-Zeiss, Oberkochen, Niemcy</td><td>Stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop</td><td>Leica, Wetzlar, Niemcy</td> Mikrowirówka <td>Leica M165</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Wirówka 5417C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf, Hauppauge, NY</td><td>Wirówka 5810R</td><td></td></tr><tr><td>15 ml probówki wirówkowe</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>50-mL probówki wirówkowe</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Waga precyzyjna</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>VWR-225AC</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do mikrofugi</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P1000</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P20</td><td>Fisher Scientific,&nbsp; Waltham, MA</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Talerz 100 x 15 mm</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Talerz 60 x 15 mm</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>25384-168</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 12-dołkowe</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>Nożycowe</td><td>narzędzia naukowe, Foster City, CA</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Drobne narzędzia naukowe, Foster City, CA</td><td>5708-5</td><td></td></tr><tr><td>Myszy CD1</td><td>Charles River Laboratories, Wilminton, MA&nbsp;</td><td>CD-1</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>Laboratorium Jacksona, Farmington, CT&nbsp;</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>B6CBAF1/J</td><td>Laboratorium Jacksona, Farmington, CT&nbsp;</td><td>B6CBAF1/J</td><td></td></tr></tbody></table>

skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Protokoły izolacji wysp trzustkowych opartych na perfuzji z trzustki dużych ssaków są dobrze znane. Takie protokoły są chętnie przeprowadzane w wielu laboratoriach ze względu na duży rozmiar przewodu trzustkowego, który pozwala na gotowe wstrzyknięcie kolagenazy i późniejszą perfuzję tkanek. Natomiast izolacja wysp trzustkowych od małej trzustki, podobnie jak u nowonarodzonych myszy, jest trudna, ponieważ perfuzja nie jest łatwo osiągalna w małej trzustce. Tutaj opisujemy szczegółową prostą procedurę, która odzyskuje znaczną liczbę wysepek od nowo narodzonych myszy z pomocą wizualną. Świeżo wypreparowaną całą trzustkę trawiono 0,5 mg / ml kolagenazy dożylnej rozpuszczonej w zrównoważonym roztworze soli Hanksa (HBSS) w temperaturze 37 °C, w probówkach do mikrowirówek. Rurki były regularnie stukane, aby pomóc w dyspersji tkanek. Gdy większość tkanki została rozproszona na małe skupiska około 1 mm, lizaty przemyto trzy do czterech razy pożywką hodowlaną z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Skupiska wysp trzustkowych, pozbawione rozpoznawalnych tkanek groniastych, można następnie odzyskać pod stereoskopem preparacyjnym. Ta metoda pozwala odzyskać od 20 do 80 małych i dużych wysp trzustkowych na trzustkę nowo narodzonej myszy. Te wysepki są odpowiednie dla większości możliwych dalszych testów, w tym wydzielania insuliny, ekspresji genów i hodowli. Przedstawiono przykład testu wydzielania insuliny w celu walidacji procesu izolacji. Podłoże genetyczne i stopień trawienia są największymi czynnikami decydującymi o plonie. Preferowany jest świeżo przygotowany roztwór kolagenazy o wysokiej aktywności, ponieważ pomaga w izolacji endokrynologicznej i zewnątrzwydzielniczej. Obecność kationów [wapnia (Ca2+) i magnezu (Mg2+)] we wszystkich roztworach oraz płodowej surowicy bydlęcej w pożywce do przemywania / pobierania jest niezbędna dla uzyskania dobrego plonu wysp trzustkowych o odpowiedniej integralności. Pomocna będzie również luneta sekcyjna o dobrym kontraście i powiększeniu.

W optymalnych warunkach przedstawiona metoda pozwala na uzyskanie od 20 do 80 wysepek z każdej małej trzustki mysiej. Liczba ta zależy od tła genetycznego, wieku myszy oraz wielkości wyizolowanych wysepek. Wśród powszechnie stosowanych linii, myszy nieinbredne CD1 i inbredne C57BL/6J dają mniej wysepek o mniejszym rozmiarze niż hybrydy CD1 i C57BL/6 lub komercyjne myszy B6CBAF1/J. Bezpośrednie wybieranie ręczne zazwyczaj pozwala na uzyskanie mniejszej liczby wysepek, co prawdopodobnie wyn...

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie nienaruszonych wysepek Langerhansa z trzustki noworodka myszy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące rozwoju i funkcji, takie jak wydzielanie insuliny, ekspresja genów, przeżywalność komórek oraz utrzymanie funkcji.Główną zaletą tej metody jest jej prostota i przejrzystość, co jednocześnie umożliwia nowym badaczom wyizolowanie znacznej liczby nienaruszonych wysepek do dalszych badań. Należy rozpocząć od spryskania noworodka w pozycji na plecach 70% ethanol. Następnie, za pomocą pęsety należy unieść skórę w okolicy brzucha i przeciąć warstwy skóry oraz mięśni wzdłuż linii środkowej, od narządów płciowych do klatki piersiowej.Następnie przenieś wszystkie narządy wewnętrzne do szalki o średnicy 100 centymetrów i zlokalizuj trzustkę, która jest białym, rozproszonym narządem z częścią brzuszną przylegającą do dwunastnicy oraz częścią grzbietową przylegającą do żołądka i śledziony. Dodaj do szalki HBSS, aby zanurzyć narządy, tak aby tkanka trzustki przestała przylegać do dwunastnicy, żołądka lub śledziony. Następnie za pomocą pęsety oddziel trzustkę od otaczających ją tkanek.Przenieś trzustkę do nowej szalki 60 mm zawierającej HBSS i za pomocą nożyczek potnij jedną do pięciu trzustek na kawałki o wielkości 5 mm lub mniejsze. Po rozdrobnieniu całej tkanki przenieś fragmenty do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i dodaj do próbek robocze roztwory kolagenazy. Następnie inkubuj fragmenty tkanki w temperaturze 37 °C, odwracając probówki dwa razy w każdej minucie.Po pięciu minutach opukaj probówkę, aby monitorować stan trawienia fragmentów. Kontynuuj trawienie przez kolejne dziesięć minut, aż lizat stanie się mętny, a większość trzustek będzie wyglądać jak pofragmentowane skupiska komórek o średnicy mniejszej niż 2 mm. Po zakończeniu trawienia odwiruj lizat w mikrocentryfudze i za pomocą pipety p1000 ostrożnie usuń nadosad, który powinien być mętny, ale wolny od skupisk komórek.Następnie do osadu należy dodać 1 mL świeżej kompletnej pożywki RPMI 16/40. Po tym delikatnie opukać probówkę, aby resuspendować fragmenty lizatu, a następnie odwrócić ją dziesięciokrotnie. Po wirowaniu resuspendowany lizat należy odwrócić co najmniej dwa razy więcej, tak jak pokazano przed chwilą, aż nadsącz stanie się klarowny.Następnie zawiesinę z końcowego osadu należy resuspender w 1 ml świeżej pożywki kompletnej, a do 15 ml stożkowej probówki umieszczonej w lodzie dodać 2 ml polisukrozy i azotku sodu o gęstości 1,077 g/ml. Za pomocą pipety Pasteura ostrożnie nałożyć lizat na wierzch roztworu gradientowego, unikając wymieszania warstw, a następnie oddzielić komórki poprzez wirowanie. Pożywkę oraz warstwę interfazy zawierającą wyspki należy przenieść do nowej probówki o pojemności 15 ml i delikatnie, lecz dokładnie wymieszać wyspki z 10 ml świeżej pożywki przed wirowaniem.Po drugim przemyciu i dodaniu świeżej pożywki kompletnej, resuspenduj pellet zawierający wyspy i przewody w czterech mililitrach świeżej pożywki kompletnej. Następnie wysiej wyspy na szalkę o średnicy 60 milimetrów i dodaj do komórek pięć mililitrów pożywki kompletnej. Przenieś szalkę pod stereomikroskop i włącz oświetlenie w polu jasnym, ustawiając natężenie światła na około 50% mocy maksymalnej.Przy 50-krotnym powiększeniu wyspy będą widoczne jako lekko różowe skupiska, natomiast komórki acinarne jako ciemne skupiska o nieregularnych kształtach. Używając końcówki do pipety p20, należy zebrać poszczególne wyspy, uważając, aby uniknąć skupisk acinarnych, i przenieść frakcje wzbogacone w wyspy do nowej szalki 60 mm zawierającej pożywkę kompletną. Po zebraniu wszystkich wysp z pierwotnej szalki, należy przenieść wyspy z szalki zbiorczej do nowej szalki 60 mm zawierającej 4 mL świeżej pożywki kompletnej jeszcze dwukrotnie, aż w końcowej szalce zbiorczej pozostaną wyłącznie czyste wyspy.Prawidłowe trawienie i izolacja pozwolą na uzyskanie wysepek o gładkich powierzchniach zewnętrznych. Niedostateczne trawienie kolagenazą może prowadzić do powstania dużych, łatwo widocznych wysepek, których nie można całkowicie oddzielić od tkanek acinarnych, co zmniejsza całkowitą wydajność izolacji wysepek, mimo że powstają wysepki o większych rozmiarach. W przypadku nadmiernego trawienia, choć tkanki acinarne można całkowicie oddzielić od wysepek, struktura wysepek może zostać naruszona, co objawia się chropowatością ich powierzchni obserwowaną pod mikroskopem.Wyspki noworodkowe wyizolowane tą metodą wykazują wysoki podstawowy poziom wydzielania insuliny oraz profile wydzielania insuliny stymulowanego glukozą typowe dla niedojrzałych beta-komórek wyspkowych, co sugeruje, że ta procedura izolacji wyspkowych w dużej mierze zachowuje właściwości funkcjonalne wyspkowek noworodkowych. Po opanowaniu technika ta może zostać ukończona w zaledwie dwie godziny, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania procedury ważne jest, aby pamiętać o uprzednim odwirowaniu kolagenazy w celu usunięcia nierozpuszczalnych zanieczyszczeń, a także o zastosowaniu buforu płuczącego uzupełnionego wapniem i magnezem oraz wstępnie potraktowanego buforu płuczącego, aby szybko zatrzymać dysocjację tkanki.W ramach niniejszej procedury można przeprowadzić eksperymenty, takie jak stymulowana glukozą sekrecja insuliny, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące dynamiki sekrecji insuliny w beta-komórkach noworodków. Technika ta otwiera również drogę badaczom w dziedzinie biologii beta-komórek do prowadzenia dodatkowych analiz, takich jak badania ekspresji genów czy inne badania metaboliczne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak izolować nienaruszone wyspy trzustkowe z trzustki myszy noworodka na potrzeby dalszych badań.Należy pamiętać, że praca z kolagenazą w proszku jest niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas korzystania z tego materiału należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i maseczki ochronnej.

effective-isolation-of-functional-islets-from-neonatal-mouse-pancreas

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przeszczepianie wyizolowanych wysepek zostało zaproponowane jako potencjalna metoda leczenia cukrzycy typu 1. W niniejszym materiale opisujemy metodę izolacji wysepek z trzustek myszy oraz ich transplantacji do przestrzeni podtorebkowej nerki.

Metoda izolacji wysepek mysich i przeszczepiania podtorebkowego do nerki

Dostępność wysepek trzustkowych od osób z cukrzycą typu 2 do celów badawczych jest niewystarczająca. Przedstawiamy tutaj nasz protokół izolacji wysepek od pacjentów poddawanych częściowej pankreatektomii. Podejście to stanowi unikalną możliwość pozyskania wysepek od osób z cukrzycą typu 2 oraz klinicznie dopasowanych osób niediabetycznych w liczbie odpowiedniej do badań podstawowych i klinicznych.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka od pacjentów po częściowej pankreatektomii

Szczegółowy opis izolacji wysepek trzustkowych myszy został przedstawiony z wykorzystaniem techniki kanulacji przewodu trzustkowego in situ oraz perfuzji mieszaniną oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej.

Izolacja wysepek Langerhansa myszy z wykorzystaniem kombinacji oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Ten protokół demonstruje izolację mysich wysepek i zasiewanie ich na rusztowaniu zdecelularycznym. Wyspy trzustkowe wsparte na rusztowaniach przeszczepiono do poduszeczki tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ). Wyspy trzustkowe przetrwały w miejscu przeszczepu i odwróciły stan hiperglikemii.

Wspomagany rusztowaniem przeszczep wysp trzustkowych w poduszce tłuszczowej najądrza myszy z cukrzycą

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Przeszczep wysp trzustkowych jest sposobem na osiągnięcie normoglikemii w cukrzycy typu 1. Ten artykuł koncentruje się na technice przeszczepiania drogą wewnątrzwrotną w celu utrzymania prawidłowego poziomu glukozy u myszy z cukrzycą.

Wewnątrzportalowy przeszczep wysp trzustkowych w modelu mysim

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Naucz się izolować wyspy trzustkowe od noworodków myszy za pomocą kolagenazy. Ta prosta metoda pozwala uzyskać 20–80 klastrów wysp na trzustkę do badań nad insuliną i ekspresją genów.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Przeglądaj więcej filmów