Izolacja komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy w celu dencdualizacji in vitro

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i hodowla pierwotnych komórek nabłonkowych oraz stromalnych błony śluzowej macicy myszy w celu ich kokultury do badania decydualizacji in vitro. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu medycyny reprodukcyjnej, takie jak: jakie sygnały parakrynne zachodzą między komórkami nabłonkowymi a stromalnymi podczas istotnych procesów, takich jak decydualizacja i inwazja trofoblastów, oraz w jaki sposób regulowana jest ta ścieżka sygnałowa. Techniki te mogą być wykorzystane do badania procesu decydualizacji w systemie kokultury nabłonkowej i stromalnej.

Wykorzystując ten system, można ocenić, czy cząsteczki sygnałowe wydzielane przez jedną z dwóch komórek mogą wpłynąć na ten proces. Przed pobraniem macicy należy przeprowadzić badanie cytologiczne pochwy, aby sprawdzić fazę cyklu zwierząt, w celu wyselekcjonowania wyłącznie myszy w fazie rui.

O rozpoznaniu na podstawie obecności złuszczonych komórek nabłonka rogówki w płukaninach z pochwy. Następnie, używając pęsety i nożyczek, otwórz jamę brzuszną zwierzęcia w pierwszym dniu estrusu i odsuń jelita na bok, aby uwidocznić oba rogi macicy. Chwyć jeden róg na najbardziej dystalnym końcu, poniżej jajowodu, i oddziel tkankę macicy od jajowodu za pomocą pęsety anatomicznej oraz pęsety Dumont numer pięć w celu usunięcia tkanki tłuszczowej i łącznej.

Następnie należy usunąć róg w części dystalnej, powyżej trzonu macicy. Po usunięciu rogów macicy należy umieścić je w 35 milimetrowej szalce Petriego z trzema mililitrami HBSS. Po zebraniu wszystkich rogów macicy należy przenieść szalkę pod stereomikroskop i za pomocą pęsety usunąć wszelkie pozostałości tkanki tłuszczowej i łącznej.

Następnie, używając pęsety Dumont nr 5, pęsety anatomicznej i małych nożyczek sprężynowych, rozetnij rogi macicy wzdłużnie, aby odsłonić ich światła, a następnie wypłucz tkanki w nowej płytce Petri zawierającej świeży roztwór HBSS. Teraz przenieś wszystkie rogi do probówki o pojemności 15 ml zawierającej pankreatynę i trypsynę. Inkubuj tkanki w pozycji poziomej przez 60 minut w temperaturze 4 °C przy 50 rpm na wytrząsarce orbitalnej.

Po upływie godziny przenieść probówkę na blat w celu 45-minutowej inkubacji poziomej bez wytrząsania, a następnie przeprowadzić 15-minutową inkubację poziomą bez wytrząsania w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Po zakończeniu inkubacji w kąpieli wodnej ostrożnie odlać nadsącz i przenieść macice do szalki Petriego zawierającej zimną pożywkę dla komórek nabłonkowych endometrium myszy na pięć minut, aby dezaktywować działanie trypsyny. Następnie przenieść tkanki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml zimnego HBSS i wortexować tkanki przez 10 sekund w celu uwolnienia płatów nabłonka.

Następnie należy wypłukać macice w nowej szalce Petri zawierającej 3 ml świeżego HBSS i zebrać dwie kolejne zawiesiny płatów nabłonkowych do dwóch nowych probótek 15 ml, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Po trzecim wirowaniu tkanek w vortexie należy przenieść macice do stożkowej probówki 15 ml zawierającej mieszaninę do trawienia komórek zrębu błony śluzowej macicy myszy i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy 200 rpm. Płaty nabłonkowe odzyskuje się, delikatnie pipetując trzy zawiesiny komórkowe przez nylonowe sito o oczkach 100 µm w celu usunięcia resztek tkankowych, a następnie centrując otrzymaną zawiesinę komórkową.

Resuspender osad w 12 mililitrach pożywki dla komórek nabłonkowych endometrium myszy, dokładnie mieszając, a następnie pozostawić roztwór na pięć minut, aby pozostałe komórki zrębu endometrium myszy oddzieliły się w wyniku sedymentacji grawitacyjnej. Po zakończeniu sedymentacji za pomocą pipety pięciomililitrowej ostrożnie usunąć górne dwa mililitry nadsączu i odwirować zebrane komórki. Następnie resuspender osad komórek nabłonkowych myszy w pożywce dla komórek nabłonkowych, delikatnie pipetując.

Następnie wysiać komórki na szkiełka podstawowe pokryte kolagenem, zachowując gęstość odpowiednią dla planowanej analizy końcowej. Po izolacji komórek nabłonkowych przejść do izolacji komórek zrębu i wyjąć z inkubatora probówkę do trawienia komórek zrębu myszy zawierającą macice. Po 30-minutowej inkubacji, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, delikatnie potrząsnąć probówką ręcznie przez 10 sekund, a następnie przenieść macice do szalki Petriego zawierającej 3 mL HBSS w temperaturze 4 °C.

Dokładnie wypłucz tkanki, następnie dodaj trzy mililitry pożywki do komórek zrębowych do probówki z trawieniem, aby dezaktywować działanie trypsyny, a macice przenieś do 15 mililitrowej probówki stożkowej zawierającej trzy mililitry świeżej pożywki do komórek zrębowych endometrium myszy. Delikatnie potrząśnij probówką z tkanką przez 10 sekund. Następnie przenieś macice do naczynia z zimnym HBSS, a następnie przenieś je do nowej 15 mililitrowej probówki z pożywką do komórek zrębowych.

Po trzecim płukaniu tkanek i ich przeniesieniu, inkubuj tkanki macicy w świeżej mieszaninie do trawienia komórek podścieliska endometrium myszy przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu trawienia przepuść zawiesiny komórkowe z probówek od pierwszej do trzeciej oraz z probówki z trypsyną przez nylonowe sito o rozmiarze oczek 40 µm i przepłucz sito dodatkowymi 5 mL pożywki do komórek podścieliska endometrium myszy. Następnie odwirowuj komórki w celu ich zebrania.

Następnie należy zawiesić osad w świeżej pożywce do mysich komórek zrębu endometrium w celu wysiania na szkiełka podstawowe pokryte polilizyną z gęstością odpowiednią dla planowanych dalszych analiz. Czystość pierwotnych kultur komórkowych można ocenić na podstawie różnic w ekspresji wimentyny i cytokeratyny, ponieważ poziom wimentyny jest wysoki w mysich komórkach zrębu endometrium i niski w mysich komórkach nabłonkowych endometrium, podczas gdy poziom cytokeratyny jest wysoki w mysich komórkach nabłonkowych endometrium i niski w mysich komórkach zrębu endometrium.

Podwójne barwienie na mentynę/cytokeratynę dodatkowo ilustruje ekspresję mentyny przez komórki zrębu, a także wyłączną ekspresję cytokeratyny przez komórki nabłonkowe. Indukcja decidualizacji w kulturach komórek zrębu poprzez zastosowanie cyklicznego adenozynomonofosforanu oraz MPA wykazuje, że poziomy mRNA prolaktyny gwałtownie wzrastają po pięciu dniach traktowania w porównaniu z kontrolnymi kulturami komórek zrębu. Ponieważ komórki nabłonkowe są trudne do wizualizacji w insertach do hodowli komórkowej, bezpośrednio po pięciodniowej symulacji decidualizacji można przeprowadzić test żywotności, w którym zmiana barwy z niebieskiej na jaskraworóżową wskazuje na obecność żywych komórek nabłonkowych.

Po zastosowaniu tej techniki można przeprowadzić inne metody, takie jak testy adhezji blastocysty, w celu oceny, czy czynniki wydzielane przez komórki nabłonkowe w obecności blastocysty mogą indukować decydualizację komórek podścieliska.