Izolacja komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy w celu dencdualizacji in vitro
2 marca 2017
To badanie przedstawia standaryzowaną i zweryfikowaną metodę izolacji i hodowli pierwotnych komórek zrębu i nabłonka endometrium myszy, które mogą być używane w systemie kokultury do badania decydualizacji in vitro.
Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i hodowla pierwotnych komórek endometrium, zrębu i nabłonka myszy w celu ich kohodowli w celu zbadania decydualizacji in vitro. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie medycyny reprodukcyjnej, takie jak jaka jest sygnalizacja parakrynna między komórkami nabłonkowymi i zrębu podczas ważnych procesów, takich jak decydualizacja i inwazja trofoblastów, oraz jak regulowany jest ten szlak sygnałowy. Techniki te można wykorzystać do badania procesu decydualizacji w systemie kokultury nabłonkowej i zrębowej.
Korzystając z tego systemu, można ocenić, czy cząsteczki sygnałowe wydzielane przez jedną z dwóch komórek mogą wpływać na ten proces. Przed pobraniem macicy należy wykonać badanie wymazu z pochwy, aby sprawdzić fazy cyklu zwierząt. Aby wybrać tylko myszy w fazie rui.
Charakteryzuje się obecnością komórek nabłonka rogówki w płukaniu pochwy. Następnie użyj kleszczy i nożyczek, aby otworzyć brzuch pierwszego zwierzęcia z ruią i odbić jelita na bok, aby uwidocznić oba rogi macicy. Chwytając jeden róg na najbardziej dystalnym końcu, pod jajowodem, wypreparuj tkankę macicy z jajowodu za pomocą kleszczy preparacyjnych i kleszczy Dumonta numer pięć w celu usunięcia tkanki tłuszczowej i łącznej.
Następnie usuń róg na dystalnym końcu, nad trzonem macicy. Po usunięciu rogów macicy umieść je na 35-milimetrowej szalce Petriego z trzema mililitrami HBSS. Po pobraniu wszystkich rogów macicy przenieś naczynie pod mikroskop stereoskopowy i użyj kleszczy, aby usunąć resztki tkanki tłuszczowej i łącznej.
Następnie, używając kleszczy Dumonta numer pięć, kleszczy preparacyjnych i małych nożyczek sprężynowych, otwórz rogi macicy wzdłużnie, aby odsłonić ich światło, i spłucz tkanki na nowej szalce Petriego zawierającej świeży HBSS. Teraz przenieś wszystkie rogi do 15-mililitrowej probówki zawierającej pankreatynę i trypsynę. I inkubować tkanki poziomo przez 60 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 50 obr./min na wytrząsarce orbitalnej.
Pod koniec godziny przenieść probówkę na ławkę na 45-minutową inkubację poziomą bez wstrząsania, a następnie 15-minutową inkubację poziomą bez wstrząsania w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji w łaźni wodnej ostrożnie zdekantować supernatant i przenieść macicę na szalkę Petriego zawierającą zimne podłoże komórek nabłonka endometrium myszy na pięć minut, aby dezaktywować aktywność trypsyny. Następnie przenieś tkanki do 15-mililitrowej probówki zawierającej trzy mililitry zimnego HBSS i wiruj tkanki przez 10 sekund, aby uwolnić arkusze nabłonka.
Następnie przepłucz macicę na nowej szalce Petriego zawierającej trzy mililitry świeżego HBSS i zbierz dwie kolejne zawiesiny nabłonkowe w dwóch nowych 15-mililitrowych probówkach, jak właśnie pokazano. Po trzecim wirze tkankowym przenieś macicę do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej mieszankę do trawienia komórek zrębu endometrium myszy na 30-minutową inkubację w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 200 obr./min. Odzyskaj arkusze nabłonka, delikatnie pipetując trzy zawiesiny komórek przez nylonową siatkę o grubości 100 mikronów w celu usunięcia resztek tkanki, a następnie odwiruj zawiesinę powstałych komórek.
Ponownie zawiesić osad w 12 mililitrach pożywki z komórek nabłonka endometrium myszy po dokładnym wymieszaniu, a następnie pozostawić roztwór na pięć minut, aby oddzielić grawitacyjnie pozostałą komórkę zrębu endometrium myszy. Pod koniec sedymentacji użyj pięciomililitrowej pipety, aby ostrożnie usunąć dwa górne mililitry supernatantu i odwirować zebrane komórki. Następnie ponownie zawiesić osad nabłonka myszy w podłożu nabłonkowym, delikatnie pipetując.
I pokryj komórki na szkiełkach nakrywkowych pokrytych kolagenem o odpowiedniej gęstości do planowanej dalszej analizy. Po izolacji komórek nabłonkowych kontynuuj z komórkami zrębu i usuń rurkę do trawienia komórek zrębu myszy z macicą z inkubatora. Po 30 minutach inkubacji, jak właśnie pokazano, delikatnie potrząsaj probówką ręcznie przez 10 sekund i przenieś macicę na szalkę Petriego zawierającą trzy mililitry HBSS o temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Dobrze wypłucz tkanki, a następnie dodaj trzy mililitry pożywki z komórek zrębu do rurki wytrawiającej, aby dezaktywować aktywność trypsyny, i przenieś macicę do 15-mililitrowej stożkowej rurki zawierającej trzy mililitry świeżej pożywki z komórek zrębu endometrium myszy. Delikatnie potrząsaj tubką z chusteczką przez 10 sekund. Następnie przenieś macicę do naczynia z zimnym HBSS, a następnie przenieś je do nowej 15-mililitrowej probówki z pożywką z komórek zrębu.
Po trzecim płukaniu tkanek i przeniesieniu, inkubuj tkanki macicy w świeżej mieszance trawienia komórek zrębu śródlądowego myszy przez 30 minut inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Pod koniec trawienia przepuść zawiesiny komórkowe z probówki pierwszej do trzeciej i rurkę trypsyny przez nylonową siatkę o grubości 40 mikronów i przepłucz siatkę dodatkowymi pięcioma mililitrami pożywki z komórek zrębu sercowego myszy. Następnie zbierz komórki przez odwirowanie.
I ponownie zawiesić osad w świeżym pożywce z komórek zrębu endometrium myszy w celu posiewu na szkiełkach nakrywkowych pokrytych polilizyną o odpowiedniej gęstości do planowanej dalszej analizy. Czystość pierwotnych kultur komórkowych można ocenić na podstawie różnic w ekspresji wimentyny i cytokeratyny, ponieważ poziomy wimentyny są wysokie w komórkach zrębu endometrium myszy i niskie w komórkach nabłonka endometrium myszy. Podczas gdy poziomy cytokeratyny są wysokie w komórkach nabłonka endometrium myszy i niskie w komórkach zrębu endometrium myszy.
Podwójne barwienie mentyny/cytokeratyny dodatkowo ilustruje ekspresję mentyny przez komórki zrębu, a także wyłączną ekspresję cytokaratyny przez komórki nabłonka. Indukcja decydualizacji w hodowlach komórek zrębu przez zastosowanie cyklicznego monofosforanu adenozyny i MPA ujawnia, że poziomy prolaktyny MRNA są dramatycznie zwiększone po pięciu dniach leczenia w porównaniu z kontrolnymi hodowlami komórek zrębu. Ponieważ komórki nabłonkowe są trudne do wizualizacji we wstawkach do hodowli komórek bocznych, test żywotności można przeprowadzić natychmiast po pięciodniowej symulacji decydualizacji, ze zmianą koloru z niebieskiego na jasnoróżowy wskazujący na obecność żywotnych komórek nabłonkowych.
Zgodnie z tą techniką można wykonać inne metody, takie jak testy adhezji blastocyst, w celu oceny, czy czynniki wydzielane przez komórki nabłonka w obecności blastocysty mogą indukować decydualizację komórek zrębu.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zestandaryzowaną i zwalidowaną metodę izolacji i hodowli pierwotnych komórek zrębowych i nabłonkowych endometrium myszy, które mogą być wykorzystywane w systemie kokultury do badania decidualizacji in vitro.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Medycyna Rozrodu
- Techniki Hodowli Komórkowych
- Biologia Endometrium
Wstęp
- Zrozumienie procesu decydualizacji jest kluczowe dla zdrowia reprodukcyjnego.
- Sygnalizacja parakrynna między komórkami nabłonkowymi a komórkami zrębu odgrywa kluczową rolę w tym procesie.
- Pierwotne hodowle komórkowe mogą dostarczyć wiedzy na temat tych szlaków sygnalizacyjnych.
- Znormalizowane metody są niezbędne dla zapewnienia powtarzalności badań.
Cel badania
- Izolacja i hodowla pierwotnych komórek endometrium myszy.
- Ustanowienie systemu kokultury do badania decydualizacji.
- Badanie mechanizmów sygnalizacyjnych zaangażowanych w decydualizację.
Zastosowane metody
- Badanie wymazu z pochwy w celu wyselekcjonowania myszy w fazie proestrusu.
- Disekcja i pobranie rogów macicy w warunkach sterylnych.
- Inkubacja z pankreatyną i trypsyną w celu dysocjacji komórek.
- Hodowla i oczyszczanie komórek przy użyciu siatki nylonowej oraz wirowania.
Główne wyniki
- Skuteczna izolacja komórek nabłonkowych i zrębowych z endometrium myszy.
- Wykazanie zdolności systemu kokultury do badania decidualizacji.
- Ocena czystości komórek poprzez ekspresję wimentyny i cytokeratyny.
- Obserwacja indukcji decidualizacji po zastosowaniu specyficznych zabiegów.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia wiarygodne podejście do badania oddziaływań komórek endometrium.
- Uzyskane informacje mogą przyczynić się do lepszego zrozumienia procesów rozrodczych.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tym schemacie w celu dalszego zgłębiania szlaków sygnalizacyjnych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia mechanistyczną minimalizację ryzyka w badaniach nad interakcjami między podścieliskiem a nabłonkiem endometrium w medycynie rozrodu, zapewniając ustandaryzowany i powtarzalny system badania sygnalizacji parakrynnej podczas decidualizacji. Wspiera ona walidację celów terapeutycznych oraz opracowywanie testów dla szlaków związanych z implantacją, oferując wartość prognostyczną w preklinicznych modelach płodności i komunikacji między embrionem a endometrium. Podejście oparte na kokulturze zwiększa ciągłość translacyjną poprzez uchwycenie dynamiki międzykomórkowej, która zostaje pominięta w systemach monokulturowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biopharmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie paracrynnego sygnalizowania między nabłonkiem a zrębem w procesie decydualizacji, wyjaśniając molekularne mechanizmy implantacji zarodka.
- Wartość operacyjna: Pozwala na uzyskanie czystych, żywotnych populacji pierwotnych komórek o sprawdzalnej czystości za pomocą markerów wimentyny i cytokeratyny, co redukuje szum biologiczny podczas przesiewania celów terapeutycznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Wspiera rozwój testów opartych na kokulturach do oceny czynników wydzielniczych (np. z komórek nabłonkowych), które modulują decydualizację zrębu, umożliwiając dekonwolucję ligand-receptor.
- Wartość operacyjna: Zestandaryzowany protokół izolacji zwiększa wydajność i żywotność, poprawiając powtarzalność i skalowalność testów w badaniach przesiewowych związków lub siRNA.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Modeluje istotną dla przebiegu choroby komunikację stroma-nabłonek w systemie przygotowanym hormonalnie, co jest zgodne z przedkliniczną oceną etiologii niepowodzeń implantacji.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przejście od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej, umożliwiając późniejsze analizy funkcjonalne, takie jak indukcja mRNA prolaktyny oraz testy żywotności.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od biologii odkrywczej do identyfikacji potencjalnych leków, szczególnie w przypadku celów pośredniczących w oddziaływaniach zrazikowo-nabłonkowych w procesach receptywności macicy i utrzymania wczesnej ciąży.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących wyzwalaczy decydualizacji zrębu oraz cząsteczek sygnalizacyjnych pochodzenia nabłonkowego w kontrolowanym systemie kokultury.
- Przesiewanie: Umożliwia ilościową ocenę wskaźników decydualizacji (np. ekspresji prolaktyny, zmian morfologicznych) w odpowiedzi na pożywki warunkowane nabłonkiem lub potencjalne modulatory.
- Analityka: Generuje mierzalne zmienne zależne, takie jak zmiany w ekspresji genów i przeżywalności, co umożliwia porównanie statystyczne pomiędzy różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z istotnością przedkliniczną poprzez modelowanie odpowiedzi zrębu przygotowanego hormonalnie w fizjologicznie kontekstualizowanej kokulturze.
- Zastosowania instytucjonalne: Tworzy wielokrotnie wykorzystywalną platformę izolacji komórek pierwotnych do iteracyjnego testowania szlaków sygnalizacyjnych, co zmniejsza zależność od zmiennych modeli in vivo.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad implantacją poprzez izolację zmiennych w komunikacji nabłonkowo-zrębowej.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane etapy dysocjacji enzymatycznej i oczyszczania poprawiają spójność między partiami w różnych laboratoriach.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji typu go/no-go w programach ukierunkowanych na płodność, zapewniając wczesną pewność prognostyczną w zakresie fenotypów odpowiedzi zrębu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o ich zdolność do modulowania decydualizacji w systemie kokultury mysiej istotnej dla człowieka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie preparatyki tkanek pierwotnych, trawienia enzymatycznego oraz sterylnych technik hodowli komórkowych.
- Zależne od dostępu do HBSS, pankreatyny, trypsyny, powierzchni powlekanych kolagenem i polilizyną oraz mikroskopii fazowo-kontrastowej do monitorowania procesu.
- Konieczna jest synchronizacja cykli rujki myszy poprzez wymazy z pochwy w celu zapewnienia homogeniczności tkanki.
- Adaptacja do innych gatunków lub warunków hormonalnych może wymagać optymalizacji stężeń enzymów i czasów inkubacji.
- Ocena czystości za pomocą immunobarwienia na vimentin i cytokeratynę stanowi dodatkowy etap walidacji, który według źródła jest metodą niezawodną.
