Name: Izolacja komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy w celu dencdualizacji in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek nabłonka i zrębu endometrium myszy do badania dencdualizacji in vitro. Technika ta umożliwia analizę sygnałowania parakrynnego między komórkami w kontrolowanym systemie współkultury.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty z Fundacji Badawczej Flandrii (FWO G.0856.13N) i Rady Badawczej KU Leuven (OT/13/113). K.D.C. jest finansowany przez FWO Belgium. A.H. jest finansowany przez OT/13/113. Chcielibyśmy podziękować ośrodkowi Cell Imaging Core Uniwersytetu Kalifornijskiego w Leuven (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) za korzystanie z mikroskopu konfokalnego.

<ol><li>Cummings, A. M., Yochim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+the+uterus+in+preparation+for+gestation%3A+a+model+for+the+action+of+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone.</a> J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).</li>
<li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li>
<li>Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+signals+direct+the+formation+of+tight+junctional+permeability+barrier+in+the+decidualizing+stroma+during+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Embryonic signals direct the formation of tight junctional permeability barrier in the decidualizing stroma during embryo implantation.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 1), 53-62 (2004).</li>
<li>Zygmunt, M., Herr, F., Munstedt, K., Lang, U., Liang, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+vasculogenesis+in+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Obstet+Gynecol+Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and vasculogenesis in pregnancy.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110 Suppl 1, S10-S18 (2003).</li>
<li>Power, M. L., Schulkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPower%2C+ML+%22The+evolution+of+the+human+placenta%22">The evolution of the human placenta</a>. , Johns Hopkins University Press. (2012).</li>
<li>Finn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiation+of+the+decidual+cell+reaction+in+the+uterus+of+the+aged+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">The initiation of the decidual cell reaction in the uterus of the aged mouse.</a> J Reprod Fertil. 11 (3), 423-428 (1966).</li>
<li>Grant, K. S., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mouse+uterine+stromal+cells+on+epithelial+cell+transepithelial+resistance+%28TER%29+and+TNFalpha+and+TGFbeta+release+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture.</a> Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).</li>
<li>De Clercq, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+transient+receptor+potential+channels+in+human+endometrial+stromal+cells+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).</li>
<li>Pieper, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vimentin+expression+in+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells.</a> Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).</li>
<li>Greaves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+model+of+endometriosis+mimics+human+phenotype+and+reveals+insights+into+the+inflammatory+contribution+of+shed+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium.</a> Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).</li>
<li>Pierro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions+modulate+estrogen+responsiveness+in+normal+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium.</a> Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).</li>
<li>Kim, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone-dependent+release+of+transforming+growth+factor-beta1+from+epithelial+cells+enhances+the+endometrial+decidualization+by+turning+on+the+Smad+signalling+in+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).</li>
<li>Chen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coculturing+human+endometrial+epithelial+cells+and+stromal+fibroblasts+alters+cell-specific+gene+expression+and+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production.</a> Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li>
<li>Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+stromal+cells+regulate+epithelial+cell+growth+in+vitro%3A+a+new+co-culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: a new co-culture model.</a> Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).</li>
<li>Park, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+well-defined+in+vitro+three-dimensional+culture+of+human+endometrium+and+its+applicability+to+endometrial+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A well-defined in vitro three-dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invasion.</a> Cancer Lett. 195 (2), 185-192 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Decydualizacja to zależne od progesteronu różnicowanie komórek zrębu endometrium w okrągłe wydzielające komórki dziesiętne. U człowieka proces ten zachodzi spontanicznie podczas fazy lutealnej cyklu miesiączkowego i jest inicjowany w komórkach zrębu otaczających komórki naczyniowe, tworząc predecidua. Jednak u gryzoni obecność blastocysty jest niezbędna do wywołania decydualizacji. Fakt, że decydualizacja następuje dopiero po kontakcie z komórkami nabłonka endometrium, oznacza, że ważne czynniki są wydzielane przez komórki nabłonkowe w celu wywołania decydualizacji w leżącym poniżej zrębie. Chociaż należy uznać tę różnicę w inicjacji procesu decydualizacji, fakt, że decydualizacja człowieka staje się bardziej silna po zagnieżdżeniu się zarodka, sugeruje, że w grę mogą wchodzić podobne mechanizmy. Hodowle komórkowe in vitro są często wykorzystywane do badania wpływu określonych cząsteczek podczas procesu decydualizacji. Niemniej jednak dostępność i ilość tkanek ludzkich, które można pobrać, jest często ograniczona i towarzyszą jej różnice, np. faza cyklu, liczba ciąż i obecność chorób ginekologicznych, takich jak endometrioza lub adenomioza. Wielu z tych problemów można zapobiec, stosując mysią tkankę, która jest łatwo dostępna i niezależna od fazy cyklu. Kolejną mocną zaletą wykorzystania tkanki mysiej jest możliwość wykorzystania genetycznie modyfikowanych gryzoni oraz możliwość przeprowadzenia dużej liczby eksperymentów. Obecnie w literaturze opisano wiele różnych protokołów izolacji, które charakteryzują się dużą zmiennością w wieku zwierząt i okresie w fazie rui w momencie użytkowania.
Badanie to przedstawia nową metodę pierwotnych kohodowli komórek zrębu i nabłonka endometrium, w której wykorzystano standaryzowany cykl rujowy poprzez codzienne wstrzykiwanie estrogenu przed izolacją. Ponadto wiadomo, że estrogen indukuje proliferację w komórkach nabłonka i zrębu, co dodatkowo zwiększa wydajność izolacji. Protokół izolacji opisany w tym artykule został oparty na Grant i wsp.7 Uwzględniono jednak dalsze kroki optymalizacyjne w celu zwiększenia wydajności, czystości i żywotności różnych kultur komórkowych. Po pierwsze, HBSS był zawsze uzupełniany antybiotykami, aby uniknąć zanieczyszczenia pierwotnej hodowli. Podczas izolacji MEEC dokonano adaptacji temperatury (15 minut w temperaturze 37 °C) w celu zwiększenia poboru komórek nabłonka podczas pierwszego trawienia. Następnie uwzględniono dodatkowy etap w celu ograniczenia aktywności enzymatycznej po trawieniu trypsyną poprzez dodanie pożywki zawierającej FBS w celu zahamowania jego aktywności. Ponadto MEEC przepuszczono przez filtr, którego oczka była większa niż powszechnie określa się (100 μm), ponieważ często występują one w skupiskach i arkuszach komórek. Co więcej, zanieczyszczenie komórkami zrębu zostało zmniejszone poprzez wykonanie dodatkowego etapu, w którym MEEC i MESC zostały rozdzielone na podstawie sedymentacji grawitacyjnej. Wreszcie, MEEC wysiewano na szkiełkach nakrywkowych pokrytych kolagenem, aby zwiększyć przyczepność komórek do szklanych szkiełek nakrywkowych, ponieważ stało się jasne, że mocowanie do szkiełek nakrywkowych bez powłoki lub powlekanych PLL było niewystarczające. Podczas izolacji MESC kolagenaza (1 mg/ml) była suplementowana w celu poprawy trawienia. Co więcej, ten etap mineralizacji został przeprowadzony w dwóch powtórzeniach, aby uniknąć zanieczyszczenia pozostałych MEEC. Wszystkie te dodatkowe etapy zaowocowały czystymi i żywotnymi hodowlami jednorodnych populacji komórek.
Czystość populacji komórek oceniano za pomocą barwienia immunologicznego i qRT-PCR przy użyciu wimentyny jako markera zrębu i cytokeratyny jako markera nabłonkowego. Wyraźnie zaobserwowano przeciwny wzorzec ekspresji wimentyny i cytokeratyny w MEEC i MESC. Można jednak zauważyć, że względna ekspresja mRNA wimentyny i cytokeratyny jest podobna w kulturach MEEC. Podobne wyniki publikują inne grupy badawcze, w których komórki nabłonkowe w hodowli nabywają ekspresję wimentyny9. Ważniejsza jest różnica w ekspresji białek między wimentyną a cytokeratyną, którą zaobserwowano w barwieniach immunohistologicznych różnych populacji komórek. Podwójne barwienie immunologiczne wykazało, że EEC były dodatnie dla cytokeratyny, a ESC były dodatnie dla wimentyny. Zastosowanie tych markerów w barwieniu immunologicznym jest uznaną metodą i standardowo stosowaną do oznaczania typów komórek10.
Chociaż przeprowadzono wiele badań nad decydualizacją MESC, możliwe jest, że obecność komórek nabłonkowych w tym modelu może zmienić wyniki decydualizacji. Po pierwsze, wykazano, że jeśli MEEC wyrośnie do monowarstwy w obecności pożywki kondycjonowanej przez MESC lub w warunkach jednoczesnej hodowli, monowarstwa ma zwiększoną oporność elektryczną przeznabłonkową komórek nabłonka (TEER), wynikającą z czynników wydzielanych przez MESC7. Co więcej, Pierro i wsp.11 dostarczyło dowodów na to, że proliferacja nabłonka, na którą wpływa 17β-estradiol, może być pośredniczona przez czynniki wydzielane z komórek zrębu, a alternatywnie, komórki nabłonkowe mogą uwalniać czynniki modulujące decydualizację zrębu12,13. Ogólnie rzecz biorąc, oczywiste jest, że środowisko kokultury nabłonkowo-zrębowej zapewnia bardziej fizjologiczną sytuację, która pozwala na interakcję i komunikację parakrynną. Metoda hodowli dwóch różnych typów komórek przy użyciu systemu kohodowli inkubacyjnej została opisana wcześniej14,15 i została dostosowana do stosowania mysich komórek pierwotnych. Dzięki wykrywaniu poziomów mRNA prolaktyny jako odczytu dla decydualizacji, opisana technika ma bardzo powtarzalny odczyt dla decydualizacji i pozwala tym samym na badanie relacji nabłonkowo-zrębowej podczas decydualizacji. Sygnały parakrynne, w których pośredniczy MEEC, mogą zmieniać zakres decydualizacji w komórkach zrębu. Co więcej, model pozwala na specyficzną modulację strony nabłonkowej bez bezpośredniego wpływu na komórki zrębu. Dlatego ta kokultura MEEC i MESC oferuje doskonałe narzędzie do oceny wpływu hormonów, cytokin itp. na komórki nabłonkowe z odczytem decydualizacji zrębu. Kolejną zaletą tego systemu kohodowli jest to, że pozwala on naukowcom badać udział określonego białka w procesie decydualizacji w przedziale nabłonkowym lub zrębowym przy użyciu komórek wyizolowanych od zwierząt transgenicznych. Ponadto technika ta będzie bardzo pomocna w badaniu adhezji blastocyst w celu oceny, czy czynniki parakrynne wydzielane przez komórki nabłonkowe w obecności blastocysty są wystarczające do wywołania decydualizacji leżących poniżej komórek zrębu. Ważny etap inwazji trofoblastów korelował z degradacją macierzy zewnątrzkomórkowej, w której pośredniczy działanie enzymów proteolitycznych. Zaproponowana technika może być zastosowana jako model in vitro do badania wzajemnych oddziaływań między blastocystą, komórkami nabłonkowymi i podścieliskiem.
Jednak w tej chwili niewiele wiadomo o pochodzeniu komórek nabłonkowych, które mogą być zarówno luminalne, jak i gruczołowe. Dlatego konieczna jest dalsza charakterystyka profilu genetycznego i molekularnego komórek nabłonkowych. Ponadto opisana metoda jest ograniczona dostępną wiedzą na temat polaryzacji komórek nabłonka. W tej chwili nie brano pod uwagę polaryzacji komórek nabłonkowych. Jednak różnice w ekspresji białek błonowych są opisane w błonach wierzchołkowych i podstawnych. Niewłaściwa polaryzacja warstwy nabłonkowej może mieć wpływ na oddziaływanie parakrynne między komórkami nabłonkowymi i zrębowymi. Opisano jednak metody otrzymywania spolaryzowanych komórek nabłonkowych i można je włączyć do opisanej techniki15,16.
Podsumowując, w opisanym protokole zaproponowano technikę skutecznego ustanowienia pierwotnych kultur komórkowych komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy. W wyniku tej techniki uzyskuje się czyste hodowle komórkowe, co potwierdza qRT-PCR oraz barwienie immunologiczne wimentyny i cytokeratyny. Ostatecznie wprowadzono kokulturę nabłonkową i zrębową, która pozwala na badanie sygnałów parakrynnych, w których pośredniczy MEEC i/lub MESC w procesie decydualizacji.

Ludzka błona śluzowa macicy jest wewnętrzną wyściółką macicy i przechodzi comiesięczne cykle rozpadu i naprawy w ramach przygotowań do ewentualnej ciąży. Składa się z pojedynczej warstwy komórek nabłonkowych wyściełających światło macicy i leżący pod nią zrąb, którego grubość zmienia się w zależności od wahań hormonów jajnikowych, estrogenu i progesteronu. Podczas fazy lutealnej poowulacyjny wzrost progesteronu indukuje różnicowanie komórek zrębu endometrium w większe, okrągłe komórki dziesiętne, proces zwany decydualizacją1,2. U człowieka zjawisko to występuje spontanicznie w celu wytworzenia predecidua, ale staje się bardziej wyraźne po zagnieżdżeniu się zarodka. Funkcjonalną konsekwencją decydualizacji jest to, że macica przejściowo staje się podatna na zagnieżdżenie się zarodka. Interwał ten jest oznaczony jako "okno implantacji". We wczesnym okresie implantacji zarodka, dziesiętne komórki zrębu endometrium otaczające zagnieżdżający się zarodek będą stanowić barierę zapobiegającą przedostawaniu się szkodliwych substancji do zarodka3. W czasie ciąży decidua ta dostarczy składników odżywczych rozwijającemu się płodowi przed łożyskiem, a później utworzy matczyną część łożyska4.
Względy etyczne i praktyczne ograniczają projektowanie badań na ludziach w celu zbadania procesu decydualizacji i skłoniły do użycia modeli zwierzęcych. Będąc członkiem grupy łożyska hemochorialnego, endometrium gryzoni również ulegnie decydualizacji przed łożyskiem5. Jednak u gryzoni rozpoczęcie procesu decydualizacji zależy od obecności blastocyst w świetle macicy, co wskazuje, że dodatkowy bodziec jest niezbędny do wywołania reakcji dziesiętnych6. Oznacza to skomplikowaną komunikację między komórkami nabłonka endometrium, które mają bezpośredni kontakt z blastocystą, a leżącymi poniżej komórkami zrębu. Niemniej jednak decydualizacja może być sztucznie wywołana za pomocą bodźców, takich jak mechaniczne drapanie lub wkraplanie oleju do hormonalnie zagruntowanej macicy. Chociaż badania in vivo z wykorzystaniem sztucznych modeli decydualizacji pozwoliły nam poprawić nasze spostrzeżenia na temat złożonego procesu sygnalizacji decydualizacji, mechanistyczne badania pogłębione, np. badanie niezbędnej komunikacji między komórkami nabłonkowymi i zrębowymi, są ograniczone. Dlatego badania decydualizacji in vitro mogą być wykorzystywane do manipulowania ważnymi szlakami i badania podstawowych procesów. W tym celu można założyć pierwotne hodowle komórek zrębu endometrium z endometrium ludzkiego lub gryzonia. Zatrudnianie gryzoni wyraża zgodę na wykorzystanie genetycznie zmodyfikowanych zwierząt w celu zbadania roli określonego białka będącego przedmiotem zainteresowania podczas procesu decydualizacji. Jednak niedojrzałe myszy przed okresem dojrzewania są często wykorzystywane w celu uniknięcia powikłań cyklu rujowego, podczas gdy w innych przypadkach macice są pobierane ze wszystkich faz cyklu rujowego, co powoduje niejednorodność kultur. Co więcej, proces decydualizacji był badany w różnych protokołach, np. poprzez (i) suplementację hormonów (estrogenu, progesteronu lub cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP)) do pożywki hodowlanej lub przez (ii) izolację komórek dziesiętnych od myszy w 4,5 dniu (pseudo)ciąży, co wymaga dodatkowej potrzeby sprawdzenia zatyczki i wazektomii samców. Ograniczenia te wskazują na konieczność stosowania ustandaryzowanej metody badania decydualizacji in vitro. W tym badaniu zostanie przedstawiony model fizjologiczny do badania decydualizacji in vitro, począwszy od dorosłych, nie(pseudo)ciężarnych myszy. W tej metodzie codzienne wstrzykiwanie 17β-estradiolu (E2) indukuje proliferację komórek endometrium, co skutkuje zwiększoną wydajnością jednorodnych i czystych populacji komórek. Ponadto zastosowanie systemu kokulturacji pozwala na badanie przesłuchów nabłonkowo-zrębowych oraz możliwość manipulowania procesem decydualizacji na różnych poziomach.

<table><tbody><tr><td>ThinCert Wkładka do hodowli tkankowych na płytki 24-dołkowe; 1 &mikro; m wielkość porów; przezroczyste</td><td>wkładki Greiner Bio-one</td><td>662610</td><td>są również dostępne dla innych płytek wielodołkowych i/lub innych rozmiarów porów. Inni dostawcy: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/&nbsp;</td></tr><tr><td>Hodowla Nunc Cell traktowana 24-dołkowe płytki</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475</td></tr><tr><td>8-bromoadenozyna 3&,,5&prime;-cykliczna sól sodowa monofosforanu</td><td>Sigma</td><td>Aldrich B7880</td><td>Przygotować roztwór podstawowy 100 mM w wodzie Milli Q. Przechowywać porcje w temperaturze -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&region=BE&nbsp; </td></tr><tr><td>17-octan medroksyprogesteronu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1629</td><td>Przygotować roztwór podstawowy 250 &mikro; M w etanolu. Przechowywać porcje w temperaturze -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&region=BE&nbsp; </td></tr><tr><td>Olej arachis</td><td>Supermarket</td><td></td><td>Standardowy olej arachis do gotowania, który można znaleźć w każdym supermarkecie, jest używany</td></tr><tr><td>Odczynnik żywotności komórek PrestoBlue</td><td>Thermo Scientific</td><td>A13261</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1</td></tr><tr><td>HBSS 1x, bez wapnia, bez magnezu, bez czerwieni fenolowej</td><td>Gibco</td><td>14175-046</td><td>Przechowywać w lodówce tak długo, jak to możliwe. Używaj zimnego HBSS+ podczas protokołu. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046&nbsp; </td></tr><tr><td>17-&beta; Estradiol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E8875</td><td>Przygotować roztwór podstawowy 1 mg/ml w EtOH przed rozcieńczeniem w oleju arachis (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&amp; region=BE</td></tr><tr><td>Filtr pożywki komórkowej Stericup, 0.22 &micro; m, polieterosulfon, 500 mL, sterylizowany radioaktywnie</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063</td></tr><tr><td>DMEM/F12, czerwień fenolowa, L-glutamina, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie, zatwierdzona przez UE, pochodzenie z Ameryki Południowej</td><td>Gibco</td><td>10500-056</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064</td></tr><tr><td>Amfoterycyna B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018</td></tr><tr><td>Gentamycyna (50 mg/ml)</td><td>Gibco</td><td>15750-037</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037</td></tr><tr><td>DMEM, niska glukoza, pirogronian, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5921</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>MCDB-105</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6395</td><td>Rozcieńczyć w wodzie Milli Q, dostosować pH do 7 za pomocą NaOH i przefiltrować przed użyciem. Przechowywać w ciemności. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&region=BE&nbsp; </td></tr><tr><td>Insulina z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1882</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, szkło, 18 mm i Oslash;</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td><td>1001/18</td><td>http://www.hecht-assistant.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 & tx_rmproducts_pi1[p]=3504 & tx_rmproducts_pi1[v]=20088 & cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06</td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2636</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Kolagenaza typu IA z Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2674</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>DPBS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094</td></tr><tr><td>Trypsyna z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7409</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Przed użyciem ogrzać do temperatury pokojowej. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054&nbsp; </td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 40 i mikro; m siatka, jednorazowy</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>Sitko do komórek, 100 &mikro; m siatkowy, jednorazowy</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy Millex-GP, 0,22&nbsp; &mikro; M, polieterosulfon, 33&nbsp; mm, sterylizowany promieniami gamma</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1</td></tr><tr><td>Kwas octowy (lodowaty) 100%</td> <td>Merck Millipore</td><td>1.00063</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063</td></tr><tr><td>Kolagen I</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354236</td><td>Z ogona szczura. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&amp; productid=354236%28 Lifesciences%29#&nbsp; </td></tr><tr><td>Pankreatyna z trzustki świni</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3292</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>35 mm Naczynia do hodowli tkankowych, polistyren, sterylne</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td>https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630</td></tr><tr><td>Etanol absolutny AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. odczynnik analityczny</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821296</td><td>https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP</td></tr><tr><td>monoklonalna królicza anty-ludzka wimentyna (D21H3)&nbsp;</td><td>Technika sygnalizacji komórkowej</td><td>#5741</td><td>Użyj 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 </td></tr><tr><td>Monoklonalna mysia anty-ludzka cytokeratyna pan&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2562</td><td>Użyj 1/1 000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&amp; region=BE</td></tr><tr><td>Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&region=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&region=BE Kozia anty-królik Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11034</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&amp; resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=słowo kluczowe& productTypeSelect=przeciwciało& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=sorticsort2:\%22Capra%20hircus\%22;; generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;; sprzężone:^\%22Alexa%20Fluor& reg;%20488\%22$;;</td></tr><tr><td>Kozia anty-mysz Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11032</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&amp; resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=przeciwciało& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2: \%22Capra%20hircus\%22;; generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;</td></tr><tr><td>Podłoże montażowe VECTASHIELD z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html</td></tr><tr><td>DPBS, z https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133 14040174 wapniowo-magnezowym</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy w celu dencdualizacji in vitro

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Dziesiątkowanie jest zależnym od progesteronu procesem różnicowania komórek zrębu endometrium i jest warunkiem wstępnym udanej implantacji zarodka. Chociaż podjęto wiele wysiłków, aby ujawnić mechanizmy leżące u podstaw decydualizacji, dokładna sygnalizacja między komórkami nabłonka, które mają kontakt z zarodkiem, a leżącymi poniżej komórkami zrębu, pozostaje słabo poznana. Dlatego badanie decydualizacji w sposób, który uwzględnia zarówno komórki nabłonkowe, jak i zrębowe, może poszerzyć naszą wiedzę na temat molekularnych szczegółów decydualizacji. W tym celu najbardziej odpowiednie są fizjologicznie najbardziej odpowiednie modele sztucznego decydualizacji in vivo; Jednak manipulacja komunikacją międzykomórkową jest ograniczona. Obecnie hodowle in vitro komórek zrębu endometrium są wykorzystywane do badania modulacji decydualizacji przez kilka cząsteczek sygnałowych. Konwencjonalnie stosuje się ludzkie lub mysie komórki zrębu endometrium. Jednak dostępność próbek pochodzących od ludzi jest bardzo często ograniczona. Ponadto stosowaniu tkanek mysich towarzyszy różnorodność metod hodowli. W badaniu przedstawiono zwalidowaną i znormalizowaną metodę uzyskiwania czystych kultur komórek nabłonka endometrium (EEC) i komórek zrębu (ESC) przy użyciu dorosłych nienaruszonych myszy leczonych estrogenem przez trzy kolejne dni. Protokół jest zoptymalizowany w celu poprawy wydajności, żywotności i czystości komórek i został dodatkowo rozszerzony w celu zbadania decydualizacji w kokulturze EWG i ESC. Model ten może być odpowiedni do wykorzystania znaczenia obu typów komórek w decydualizacji i oceny udziału istotnych cząsteczek sygnałowych wydzielanych przez EWG lub ESC podczas komunikacji międzykomórkowej.

Ogólny przegląd protokołu
Rycina 1A przedstawia ogólny przegląd protokołu. W celu synchronizacji zwierząt i standaryzacji fazy cyklu rujowego zastosowano codzienne iniekcje E2 (100 ng) przez trzy kolejne dni. Fazę cyklu rujowego można ocenić za pomocą płukania pochwy; cykl ten dzieli się na fazę proestrus, estrus, diestrus i metestrus. Fazę cyklu określa się na podstawie stosunku złuszczonych komórek w płuczce, które podlegają zmianom hormonalnym. Rosnące poziomy estrogenu powodują przejście zwierząt do fazy estrus. Fazę tę można łatwo wykryć poprzez obecność wyłącznie zrogowaciałych komórek nabłonkowych przy jednoczesnym braku leukocytów (Rycina 1B). W 4. dniu pobiera się macice zwierząt znajdujących się w fazie estrus, a następnie izoluje się MEEC i MESC (Rycina 1C). Decidualizację można indukować poprzez dodanie 0,5 mM cAMP oraz 1 µM MPA do pożywki z 2% FBS podczas 5-dniowej inkubacji.
Kontrola jakości hodowli MEEC i MESC
Czystość pierwotnych kultur komórkowych można ocenić na podstawie różnic w ekspresji wimentyny i cytokeratyny. Wimentyna jest filamentem pośrednim, który ulega ekspresji w komórkach mezenchymalnych, a tym samym w komórkach zrębu endometrium. Cytokeratyna jest filamentem pośrednim występującym w cytoszkielecie tkanki nabłonkowej. Rysunek 2A przedstawia poziom ekspresji mRNA wimentyny i cytokeratyny w MEEC i MESC oceniony za pomocą qRT-PCR. Poziomy wimentyny są wysokie w MESC i niskie w MEEC (2,2x wyższe, p &lt; 0,001), podczas gdy poziomy cytokeratyny są wysokie w MEEC i niskie w MESC (36x wyższe, p &lt; 0,001). Wykonano podwójne barwienie na wimentynę/cytokeratynę, które wykazało, że komórki zrębu wykazują ekspresję wimentyny, natomiast komórki nabłonkowe wykazują ekspresję cytokeratyny (Rysunek 2B, C). Brak przeciwciała pierwszorzędowego posłużył jako kontrola negatywna dla immunobarwienia (Rysunek 2D, E). Te barwienia immunohistochemiczne pokazują, że obie kultury komórek endometrium (MEEC i MESC) mają czystość do 90%.
Decidualizacja w kokulturach MEEC/MESC
Po izolacji komórki nabłonka i zrębu endometrium myszy wysiano w systemie kokultury, aby odtworzyć środowisko endometrium. Komórki hodowano do momentu, aż komórki nabłonkowe utworzyły monowarstwę w insertach do hodowli komórkowych (wartości TEER od 800 do 1 000/studnię), a komórki zrębu osiągnęły stan podkonfluencyjny. Decidualizację w komórkach zrębu indukowano poprzez zastosowanie 0,5 mM cAMP oraz 1 µM MPA. Po pięciu dniach inkubacji poziom mRNA prolaktyny w komórkach zrębu oceniono za pomocą qRT-PCR jako wskaźnik decidualizacji (Rysunek 3A). Poziomy prolaktyny były silnie wyrażone w komórkach poddanych działaniu hormonów i niewykrywalne w komórkach inkubowanych w medium kontrolnym (p &lt; 0,01).
Ponieważ komórki nabłonkowe są trudne do wizualizacji wewnątrz wkładów do hodowli komórkowych, bezpośrednio po pięciodniowym okresie inkubacji przeprowadzono test żywotności (Rysunek 3B). Do dołków dodano mieszaninę standardowej pożywki wzrostowej i odczynnika do oznaczania żywotności, a następnie inkubowano przez minimum 8 - 12 h. Zmiana barwy z niebieskiej na jaskraworóżową wskazywała na obecność żywych komórek nabłonkowych. Należy zauważyć, że zmiana barwy następuje tylko w obecności żywych komórek.
<img alt="Oś czasu decidualizacji, izolacja MEEC vs MESC, ko-kultura, obrazy komórek; wyniki mikroskopowe." src="/files/ftp_upload/55168/55168fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Ogólny przegląd protokołu. (A) Schemat protokołu izolacji rozpoczynający się od trzech kolejnych dni iniekcji estrogenu. W dniu 3. należy przygotować niezbędne materiały. W dniu 4. ocenia się fazę rujej (oznaczoną gwiazdką) poprzez wykonanie płukania pochwy. MESC i MEEC są izolowane przy użyciu różnych etapów trawienia. W dniu 6., lub gdy komórki osiągną konfluencję, decidualizację można indukować w systemie ko-kultury poprzez dodanie cAMP i MPA do medium i inkubację przez pięć dni (dzień 6. – 11.). (B) Reprezentatywny obraz fazy rujej, charakteryzującej się obecnością zrogowaciałych komórek nabłonkowych w płukaniu pochwy (powiększenie 10X). (C) Reprezentatywny obraz MESC i MEEC (powiększenie 20X, pasek skali: 100 µm). <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres ekspresji genów i mikroskopia fluorescencyjna MESC i MEEC dla analizy vimentyny i cytokeratyny." src="/files/ftp_upload/55168/55168fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Immunobarwienie i ilościowe RT-PCR dla vimentyny i cytokeratyny w MEEC i MESC. (A) Poziomy mRNA dla ekspresji vimentyny i cytokeratyny wskazujące na czystość kultur. Poziomy RNA zostały zrelatywizowane do średniej geometrycznej genów pomocniczych ACTB i TBP. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM. Podwójne barwienie na vimentynę/cytokeratynę w kulturach MESC (B) i kulturach MEEC (C). Wstawka po lewej stronie pokazuje widok przy powiększeniu 63X. Kontrola negatywna z pominięciem przeciwciała pierwszorzędowego dla MESC (D) i MEEC (E) (Pasek skali: 50 µm). ***: p &lt;0.001 przy zastosowaniu dwuczynnikowej analizy wariancji (Two-way ANOVA) z poprawką Bonferroniego dla wielokrotnych porównań. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>

<img alt="Wykres ekspresji prolaktyny, hodowle komórkowe i mikroskopia dla analizy badania decidualizacji." src="/files/ftp_upload/55168/55168fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Walidacja decidualizacji za pomocą RT-PCR. (A) Poziomy mRNA ekspresji prolaktyny w komórkach macierzystych w celu oceny decidualizacji. Poziomy RNA ilościowo określono względem średniej geometrycznej genów housekeepingowych PGK1 i TBP. Krotność zmiany (fold change) w komórkach hodowanych w medium kontrolnym lub medium decidualizującym przedstawiono jako średnia ±SEM. (B) Przykładowe obrazy komórek macierzystych przed (góra) i po (dół) stymulacji do decidualizacji. Wstawka po prawej stronie przedstawia powiększenie zdecidualizowanej komórki macierzystej. Decidualizacja charakteryzuje się obecnością komórek wielojądrowych, zaznaczonych czarnymi strzałkami. (C) Reprezentatywne obrazy oceny żywotności komórek nabłonkowych we wstawce po przeprowadzeniu analizy. Zdjęcia wykonano bezpośrednio po podaniu odczynnika do oceny żywotności (Prestoblue) (0 h) oraz następnego ranka (ON). **: p <0,01 w teście U Manna-Whitneya. ON: overnight (przez noc). Pasek skali: 100 µm. <a href="https://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

To badanie przedstawia standaryzowaną i zweryfikowaną metodę izolacji i hodowli pierwotnych komórek zrębu i nabłonka endometrium myszy, które mogą być używane w systemie kokultury do badania decydualizacji in vitro.

Izolacja komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy w celu dencdualizacji in vitro

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja i hodowla pierwotnych komórek nabłonkowych oraz stromalnych błony śluzowej macicy myszy w celu ich kokultury do badania decydualizacji in vitro. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu medycyny reprodukcyjnej, takie jak: jakie sygnały parakrynne zachodzą między komórkami nabłonkowymi a stromalnymi podczas istotnych procesów, takich jak decydualizacja i inwazja trofoblastów, oraz w jaki sposób regulowana jest ta ścieżka sygnałowa. Techniki te mogą być wykorzystane do badania procesu decydualizacji w systemie kokultury nabłonkowej i stromalnej.Wykorzystując ten system, można ocenić, czy cząsteczki sygnałowe wydzielane przez jedną z dwóch komórek mogą wpłynąć na ten proces. Przed pobraniem macicy należy przeprowadzić badanie cytologiczne pochwy, aby sprawdzić fazę cyklu zwierząt, w celu wyselekcjonowania wyłącznie myszy w fazie rui.O rozpoznaniu na podstawie obecności złuszczonych komórek nabłonka rogówki w płukaninach z pochwy. Następnie, używając pęsety i nożyczek, otwórz jamę brzuszną zwierzęcia w pierwszym dniu estrusu i odsuń jelita na bok, aby uwidocznić oba rogi macicy. Chwyć jeden róg na najbardziej dystalnym końcu, poniżej jajowodu, i oddziel tkankę macicy od jajowodu za pomocą pęsety anatomicznej oraz pęsety Dumont numer pięć w celu usunięcia tkanki tłuszczowej i łącznej.Następnie należy usunąć róg w części dystalnej, powyżej trzonu macicy. Po usunięciu rogów macicy należy umieścić je w 35 milimetrowej szalce Petriego z trzema mililitrami HBSS. Po zebraniu wszystkich rogów macicy należy przenieść szalkę pod stereomikroskop i za pomocą pęsety usunąć wszelkie pozostałości tkanki tłuszczowej i łącznej.Następnie, używając pęsety Dumont nr 5, pęsety anatomicznej i małych nożyczek sprężynowych, rozetnij rogi macicy wzdłużnie, aby odsłonić ich światła, a następnie wypłucz tkanki w nowej płytce Petri zawierającej świeży roztwór HBSS. Teraz przenieś wszystkie rogi do probówki o pojemności 15 ml zawierającej pankreatynę i trypsynę. Inkubuj tkanki w pozycji poziomej przez 60 minut w temperaturze 4 °C przy 50 rpm na wytrząsarce orbitalnej.Po upływie godziny przenieść probówkę na blat w celu 45-minutowej inkubacji poziomej bez wytrząsania, a następnie przeprowadzić 15-minutową inkubację poziomą bez wytrząsania w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Po zakończeniu inkubacji w kąpieli wodnej ostrożnie odlać nadsącz i przenieść macice do szalki Petriego zawierającej zimną pożywkę dla komórek nabłonkowych endometrium myszy na pięć minut, aby dezaktywować działanie trypsyny. Następnie przenieść tkanki do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml zimnego HBSS i wortexować tkanki przez 10 sekund w celu uwolnienia płatów nabłonka.Następnie należy wypłukać macice w nowej szalce Petri zawierającej 3 ml świeżego HBSS i zebrać dwie kolejne zawiesiny płatów nabłonkowych do dwóch nowych probótek 15 ml, zgodnie z wcześniejszą demonstracją. Po trzecim wirowaniu tkanek w vortexie należy przenieść macice do stożkowej probówki 15 ml zawierającej mieszaninę do trawienia komórek zrębu błony śluzowej macicy myszy i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C przy 200 rpm. Płaty nabłonkowe odzyskuje się, delikatnie pipetując trzy zawiesiny komórkowe przez nylonowe sito o oczkach 100 µm w celu usunięcia resztek tkankowych, a następnie centrując otrzymaną zawiesinę komórkową.Resuspender osad w 12 mililitrach pożywki dla komórek nabłonkowych endometrium myszy, dokładnie mieszając, a następnie pozostawić roztwór na pięć minut, aby pozostałe komórki zrębu endometrium myszy oddzieliły się w wyniku sedymentacji grawitacyjnej. Po zakończeniu sedymentacji za pomocą pipety pięciomililitrowej ostrożnie usunąć górne dwa mililitry nadsączu i odwirować zebrane komórki. Następnie resuspender osad komórek nabłonkowych myszy w pożywce dla komórek nabłonkowych, delikatnie pipetując.Następnie wysiać komórki na szkiełka podstawowe pokryte kolagenem, zachowując gęstość odpowiednią dla planowanej analizy końcowej. Po izolacji komórek nabłonkowych przejść do izolacji komórek zrębu i wyjąć z inkubatora probówkę do trawienia komórek zrębu myszy zawierającą macice. Po 30-minutowej inkubacji, zgodnie z wcześniejszą demonstracją, delikatnie potrząsnąć probówką ręcznie przez 10 sekund, a następnie przenieść macice do szalki Petriego zawierającej 3 mL HBSS w temperaturze 4 °C.Dokładnie wypłucz tkanki, następnie dodaj trzy mililitry pożywki do komórek zrębowych do probówki z trawieniem, aby dezaktywować działanie trypsyny, a macice przenieś do 15 mililitrowej probówki stożkowej zawierającej trzy mililitry świeżej pożywki do komórek zrębowych endometrium myszy. Delikatnie potrząśnij probówką z tkanką przez 10 sekund. Następnie przenieś macice do naczynia z zimnym HBSS, a następnie przenieś je do nowej 15 mililitrowej probówki z pożywką do komórek zrębowych.Po trzecim płukaniu tkanek i ich przeniesieniu, inkubuj tkanki macicy w świeżej mieszaninie do trawienia komórek podścieliska endometrium myszy przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Po zakończeniu trawienia przepuść zawiesiny komórkowe z probówek od pierwszej do trzeciej oraz z probówki z trypsyną przez nylonowe sito o rozmiarze oczek 40 µm i przepłucz sito dodatkowymi 5 mL pożywki do komórek podścieliska endometrium myszy. Następnie odwirowuj komórki w celu ich zebrania.Następnie należy zawiesić osad w świeżej pożywce do mysich komórek zrębu endometrium w celu wysiania na szkiełka podstawowe pokryte polilizyną z gęstością odpowiednią dla planowanych dalszych analiz. Czystość pierwotnych kultur komórkowych można ocenić na podstawie różnic w ekspresji wimentyny i cytokeratyny, ponieważ poziom wimentyny jest wysoki w mysich komórkach zrębu endometrium i niski w mysich komórkach nabłonkowych endometrium, podczas gdy poziom cytokeratyny jest wysoki w mysich komórkach nabłonkowych endometrium i niski w mysich komórkach zrębu endometrium.Podwójne barwienie na mentynę/cytokeratynę dodatkowo ilustruje ekspresję mentyny przez komórki zrębu, a także wyłączną ekspresję cytokeratyny przez komórki nabłonkowe. Indukcja decidualizacji w kulturach komórek zrębu poprzez zastosowanie cyklicznego adenozynomonofosforanu oraz MPA wykazuje, że poziomy mRNA prolaktyny gwałtownie wzrastają po pięciu dniach traktowania w porównaniu z kontrolnymi kulturami komórek zrębu. Ponieważ komórki nabłonkowe są trudne do wizualizacji w insertach do hodowli komórkowej, bezpośrednio po pięciodniowej symulacji decidualizacji można przeprowadzić test żywotności, w którym zmiana barwy z niebieskiej na jaskraworóżową wskazuje na obecność żywych komórek nabłonkowych.Po zastosowaniu tej techniki można przeprowadzić inne metody, takie jak testy adhezji blastocysty, w celu oceny, czy czynniki wydzielane przez komórki nabłonkowe w obecności blastocysty mogą indukować decydualizację komórek podścieliska.

isolation-mouse-endometrial-epithelial-stromal-cells-for-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe podczas wczesnych etapów rozwoju stanowi idealny model do zweryfikowania naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad w embrionach myszy w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (post coitum).

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

Pierwotna hodowla komórkowa jest użyteczną techniką do analizy określonych populacji komórek, szczególnie z transgenicznych zarodków myszy w określonych stadiach rozwoju. W tym przypadku komory embrionalne są preparowane i dysocjowane, a kulki sprzężone z przeciwciałami rozpoznają i oddzielają komórki śródbłonka do dalszej analizy.

Izolacja embrionalnych komórek śródbłonka komór

Ustalenie pierwotnych systemów hodowli komórek zrębu endometrium na podstawie próbek z histerektomii jest cenną techniką biologiczną i kluczowym krokiem przed realizacją szerokiego wachlarza celów badawczych. W tym miejscu opisujemy dwie metody stosowane do ustanawiania kultur zrębu z chirurgicznie wyciętych tkanek endometrium u ludzi.

Dwie metody ustalania pierwotnych ludzkich komórek zrębu endometrium z próbek do histerektomii

Ten protokół demonstruje metodę izolacji pierwotnych ludzkich komórek dziesiętnych pobranych z błon płodowych łożysk terminowych, które mogą być używane do różnych zastosowań (np. immunocytochemia, cytometria przepływowa, itp.), mając na celu zbadanie roli różnych populacji komórek w komplikacjach ciąży.

Izolacja pierwotnych ludzkich komórek liściastych z błon płodowych łożysk donoszonych

To badanie przedstawia zweryfikowaną i zoptymalizowaną procedurę izolacji i hodowli ludzkich komórek zrębu endometrium do przeprowadzenia testu decydualizacji in vitro. Co więcej, badanie to dostarcza szczegółowej metody skutecznego knockdown określonego genu za pomocą siRNA w ludzkich komórkach zrębu endometrium.

Izolacja ludzkich komórek zrębu endometrium do dendualizacji in vitro

Tutaj opisujemy metodę generowania sztucznego modelu decydualizacji za pomocą myszy z owariektomią, klasyczny eksperyment decydualizacji endometrium w dziedzinie badań nad decydualizacją endometrium.

Generowanie mysiego modelu sztucznego decydualizacji z owariektomią do badań nad decydualizacją endometrium

Ten protokół opisuje metodologie tworzenia organoidów nabłonka endometrium myszy do ekspresji genów i analiz histologicznych.

Ustalanie organoidów endometrialnych 3D z macicy myszy

Badanie to wprowadza nowy model mysi zaprojektowany specjalnie do symulacji endometriozy, klinicznie istotnego podtypu endometriozy. Wykorzystując myszy C57BL/6J, model ma na celu wyjaśnienie patofizjologicznych mechanizmów leżących u podstaw niepłodności związanej z endometrioma, oferując wyrafinowane narzędzie do wypełnienia obecnej luki w wiedzy w medycynie reprodukcyjnej.

Stworzenie eksperymentalnego mysiego modelu endometrioma w celu zbadania związanej z nim niepłodności

Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania niezawodnego i powtarzalnego cienkiego endometrium o bardzo niskiej śmiertelności i minimalnych zrostach wewnątrzmacicznych poprzez wstrzyknięcie 95% etanolu do macicy myszy w ciągu 1-3 minut.

Ustalenie mysiego modelu cienkiego endometrium

Opisujemy metody izolowywania komórek somatycznych jajnika mysiego z frakcji stromy wzbogaconej jajnika oraz generowania organoidów somatycznych jajnika mysiego przy użyciu podejścia bez scaffoldu.

Badanie mikrośrodowiska jajnika: metody izolacji, hodowli 2D i hodowli organoidalnej komórek somatycznych jajnika mysiego

Poznaj metodę izolacji komórek nabłonka i zrębu endometrium myszy do badania dencdualizacji in vitro. Technika ta umożliwia analizę sygnałowania parakrynnego między komórkami w kontrolowanym systemie współkultury.

Izolacja komórek nabłonka endometrium i zrębu myszy w celu dencdualizacji in vitro

Przeglądaj więcej filmów