Name: Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Poznaj technikę przygotowania poziomych wycinków siatkówki myszy do badań elektrofizjologicznych. Metoda zachowuje integralność neuronów poziomych, umożliwiając badanie ich roli w obwodach synaptycznych siatkówki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG FOR701 i FE464/11-1 do A.F. Autorzy pragną podziękować Andrei Nerzowi za doskonałą pomoc techniczną.

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dla eksperymentów na zwierzętach wydanymi przez Republikę Federalną Niemiec.
UWAGA: Ponieważ tkanka siatkówki będzie pozbawiona tlenu podczas dłuższych części tej procedury, wszystkie kroki powinny być wykonane tak szybko, jak to możliwe. Myszy powinny być przystosowane do ciemności co najmniej 3 godziny przed preparacją. Aby uniknąć adaptacji siatkówki do światła, przygotowanie i krojenie należy przeprowadzać w słabym czerwonym świetle.
1. Przygotowanie pożywek i innych chemikaliów
<ol>
	<li>Przygotuj klasę Medium6. Po rozwarstwieniu należy przez cały czas zanurzać tkankę siatkówki w pożywce Amesa.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 2,2 g pożywki Amesa i 298 mg HEPES w 250 ml wody destylowanej. Stężenie HEPES wyniesie 5 mM. Mieszaj delikatnie, aż wszystkie cząstki się rozpuszczą.</li>
		<li>Pęcherzyk Podłoże Amesa w temperaturze pokojowej z karbogenem (95% tlenu, 5% dwutlenku węgla) przez co najmniej 5 minut. Dostarczyć karbogen szklaną pipetą Pasteura do roztworu. Podłącz pipetę Pasteura za pomocą odpowiedniego przewodu do wylotu reduktora gazu.</li>
		<li>Do roztworu dodać 475 mg wodorowęglanu sodu. Dodanie wodorowęglanu po bulgotaniu zapobiega wytrącaniu się węglanu wapnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj agarozę o niskiej temperaturze żelowania. Agaroza jest niezbędna do osadzania tkanki siatkówki podczas cięcia wibratomem.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 180 mg agarozy w 9 ml pożywki Amesa i 1 ml wody destylowanej. Użyj kuchenki mikrofalowej, aby powoli podgrzać roztwór agarozy, aż wszystkie ciała stałe się rozpuszczą. Podgrzewaj w odstępach co 5 - 10 sekund, aby uniknąć przelania. Rozwiązanie powinno być jasne i przejrzyste.</li>
		<li>Rozpuszczoną agarozę przechowywać w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C na czas trwania zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Konfiguracja Vibratome
UWAGA: Wszystkie przekroje zostały przeprowadzone za pomocą wibratomu wymienionego w Tabeli Materiałów. Podane ustawienia odnoszą się tylko do tego typu wibratomu. Więcej informacji na temat wibratomu w sekcji tkanki nerwowej można znaleźć w odnośniku7.
<ol>
	<li>Umieść ostrze wtryskiwacza wibratomu w uchwycie ostrza.</li>
	<li>Zmierz odchylenie pionowe ostrza za pomocą urządzenia "vibrocheck". Użyj regulacyjnej na uchwycie ostrza, aby przechylić ostrze, aż będzie równoległe do płaszczyzny cięcia. Dokładne ustawienie ostrza jest konieczne, aby zapobiec efektom żaluzji weneckich na powierzchni przekroju i wytworzyć płaski przekrój, który zawiera żywe komórki na swojej powierzchni.</li>
	<li>Ustaw wibratom na następujące ustawienia: amplituda, 1.00; prędkość, 0.20; grubość, 180 - 200 μm.</li>
</ol>
3. Sekcja siatkówki myszy
<ol>
	<li>Dorosłą mysz C57BL/6 należy znieczulić poprzez odparowanie około 1 ml izofluranu w hermetycznym pojemniku. Po zakończeniu znieczulenia należy poddać zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Mysz nie powinna być starsza niż 3 miesiące, w przeciwnym razie jakość plastrów ulegnie pogorszeniu.</li>
	<li>Usuń gałkę oczną, umieszczając zakrzywione kleszcze pod okiem. Delikatne uniesienie gałki ocznej odsłoni nerw wzrokowy. Przeciąć nerw wzrokowy nożyczkami sprężynowymi i przenieść gałkę oczną na szalkę Petriego o średnicy 35 mm zawierającą 2 ml pożywki Amesa.</li>
	<li>Wykonaj wszystkie kolejne kroki na stoliku mikroskopu stereoskopowego. Dostosuj powiększenie do wartości, która umożliwia optymalną kontrolę wzrokową następujących procedur (kroki 3.4 - 3.9).</li>
	<li>Nakłuć rogówkę w miejscu przejścia do twardówki za pomocą spiczastych kleszczy lub igły 20 G. Podczas tego kroku ustabilizuj gałkę oczną za pomocą innych kleszczy. Uważaj, aby nie uszkodzić siatkówki za pomocą urządzenia do nakłuwania.</li>
	<li>Włóż nożyczki sprężynowe do małego otworu wykonanego w kroku 3.3 i wytnij okrąg wokół rogówki. Ponownie ustabilizuj gałkę oczną kleszczami podczas cięcia. Nacięcie należy trzymać bardzo blisko powierzchni, aby nie wciąć się w siatkówkę.</li>
	<li>Ostrożnie usuń rogówkę, soczewkę i ciało szkliste za pomocą kleszczy. Ciało szkliste składa się tylko z cienkiej przezroczystej warstwy w tylnej części oka. Jednak do sekcji wibratomu ważne jest, aby ciało szkliste zostało całkowicie usunięte.</li>
	<li>Na szalce Petriego umieść muszlę oczną w taki sposób, aby patrzyło się przez otwór w dół na siatkówkę. Brzeg otworu powinien składać się wyłącznie z tkanki twardówki. Jeśli okrągłe cięcie (krok 3.4) zostało wykonane zbyt blisko równika muszli ocznej, tkanka siatkówki będzie również obecna w pobliżu nacięcia. Uważaj więc, aby nie uszkodzić siatkówki w kroku 3.8.</li>
	<li>Chwyć twardówkę kleszczami i ostrożnie rozerwij tkankę. Ważne jest, aby na tym etapie nie pęknąć siatkówki. W razie potrzeby odłącz siatkówkę od ora serrata, stabilizując twardówkową część tkanki kleszczami i ostrożnie odklejając siatkówkę innymi kleszkami. Trzymaj kleszcze zamknięte; Nigdy nie dotykaj siatkówki kleszczami, ponieważ tkanka jest bardzo miękka i natychmiast ustąpi. 
	UWAGA: Na tym etapie siatkówka i reszta muszli ocznej zostaną połączone tylko na głowie nerwu wzrokowego.</li>
	<li>Wytnij miejsce mocowania na głowie nerwu wzrokowego za pomocą nożyczek sprężynowych. Siatkówka powinna teraz swobodnie unosić się w powietrzu jako pojedynczy fragment tkanki w pożywce Amesa.</li>
	<li>Pokrój siatkówkę na 4 - 6 małych prostokątów o długości około 23 mm za pomocą zakrzywionego ostrza skalpela, przytrzymując siatkówkę wzdłuż krawędzi kleszczykami, aby manipulować nią na miejscu. Unikaj szczypania tkanki siatkówki w prostokątach. Weź fragmenty z centralnych części siatkówki, a nie z dalekich obrzeży.</li>
	<li>Przenieść kawałki siatkówki za pomocą plastikowej pipety Pasteura o dużej średnicy na plastikową szalkę Petriego o średnicy 35 mm, której spód został zastąpiony siatką o rozmiarze siatki mniejszym niż 1 mm. Zamocować szalkę Petriego w górnej jednej trzeciej zlewki lub kolby stożkowej i zanurzyć kawałki siatkówki w pożywce Amesa z pęcherzykami karbogenu.</li>
</ol>
4. Osadzanie kawałków siatkówki w agarozie
<ol>
	<li>Ostrożnie przenieś 2-3 kawałki siatkówki na plastikową szalkę Petriego o średnicy 35 mm razem z odrobiną pożywki Amesa. Do przenoszenia najwygodniej jest używać plastikowej pipety Pasteura o dużej średnicy. Na tym etapie dokładna orientacja części siatkówki nie ma znaczenia.</li>
	<li>Usuń jak najwięcej pozostałej pożywki Amesa za pomocą szklanej pipety Pasteura. Jak tylko płyn zostanie usunięty, przejdź do kroku 4.3. Nie dopuścić do wyschnięcia tkanki siatkówki.</li>
	<li>Natychmiast przykryj kawałki siatkówki 2 ml rozpuszczonej agarozy (37 °C). Biorąc pod uwagę rozmiar wymieniony w kroku 3.10, kawałki nie zwiną się w agarozie.</li>
	<li>W płynnej agarozie delikatnie wepchnij kawałki siatkówki na dno szalki Petriego. Warstwa komórek zwojowych powinna być skierowana w dół. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby ocenić dokładną pozycję. Do pozycjonowania należy obchodzić się z kawałkami siatkówki za pomocą małej szpatułki. Ustaw siatkówkę tak szybko i precyzyjnie, jak to możliwe, ponieważ agaroza szybko się zestala.
	<ol>
		<li>Ułóż kawałki siatkówki równolegle do dna szklanego naczynia, w przeciwnym razie sekcje będą styczne lub ukośne. Poszczególne elementy nie powinny się ze sobą stykać, ale też nie powinny być zbyt daleko od siebie. Staraj się umieszczać kawałki siatkówki mniej więcej na tym samym poziomie poziomym.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szklaną szalkę Petriego z zatopionymi kawałkami siatkówki włożyć do lodówki (4 - 6 °C) na co najmniej 2 minuty. To szybko utwardzi agarozę do dalszego przetwarzania. Jak tylko agaroza spolimeryzuje się, przejdź do następnego kroku.</li>
</ol>
5. Montaż części siatkówki
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń blok agarozy zawierający kawałki siatkówki z szalki Petriego. Użyj szpatułki lub podobnego urządzenia, aby podnieść blok agarozy ze szkła. Ze względu na siły adhezyjne może się to okazać dość trudne. Unikaj jednak rozbijania bloku agarozy. Wykonaj ten i wszystkie kolejne kroki w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść blok agarozy na szklanym szkiełku nakrywkowym i dostosuj jego rozmiar za pomocą ostrza skalpela. Pozostaw 1 - 2 mm agarozy z każdej strony kawałków siatkówki. Ostateczny rozmiar bloku powinien wynosić około 1 066 mm (10 mm odnosi się do wysokości bloku, 6 mm do długości jego krawędzi).</li>
	<li>Przyklej blok agarozy do uchwytu próbki wibratomu za pomocą kleju błyskawicznego. Części siatkówki powinny znajdować się w górnej części bloku o wysokości 10 mm i być zorientowane równolegle do jego powierzchni, podczas gdy spód jest przymocowany do uchwytu.</li>
	<li>Natychmiast przykryj blok, wlewając wcześniej bąbelkowaną pożywkę Amesa do tacki buforowej wibratomu.</li>
</ol>
6. Przygotowanie poziomych sekcji wibratomu
<ol>
	<li>Rozpocznij dzielenie na sekcje. Na początku należy ręcznie ustawić grubość krojenia, aż w plastrze pojawią się fragmenty tkanki siatkówki. Następnie przejdź do ustawień w kroku 2.3. Ponieważ siatkówka myszy ma tylko około 200 μm grubości, na blok agarozy nie będzie więcej niż 2-3 plasterki.</li>
	<li>Wyjąć skrawki z tacki buforowej za pomocą szklanej pałeczki i przenieść je do 2 ml pożywki Amesa na szalce Petriego o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Skrawki należy natychmiast przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C (5% CO2 / 55% O2 ). Agaroza otaczająca skrawki pozostanie stała w inkubatorze i może być używana do przenoszenia skrawków bez uszkadzania siatkówki. Lepszą jakość plastrów uzyskuje się przy przechowywaniu w temperaturze 37 °C w danej atmosferze w porównaniu z natlenionym podłożem Amesa w temperaturze pokojowej. Sekcje można zużyć natychmiast lub można je przechowywać do 4 godzin w inkubatorze z dobrymi wynikami fizjologicznymi.</li>
	<li>Zanurz kolejne kawałki siatkówki w agarozie i powtórz sekcje 4 - 6.</li>
</ol>

<ol><li>DeVries, S. H., Li, W., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+two+transmitter+microenvironments+at+the+cone+photoreceptor+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in two transmitter microenvironments at the cone photoreceptor synapse.</a> Neuron. 50, 735-748 (2006).</li>
<li>Jackman, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+synaptic+ribbon+in+transmitting+the+cone+light+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Role of the synaptic ribbon in transmitting the cone light response.</a> Nature Neuroscience. 12 (3), 303-310 (2009).</li>
<li>Rabl, K., Cadetti, L., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+exocytosis+is+faster+in+cones+than+in+rods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Kinetics of exocytosis is faster in cones than in rods.</a> J. Neurosci. 25 (18), 4633-4640 (2005).</li>
<li>Singer, J. H., Lassová, L., Vardi, N., Diamond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+multivesicular+release+at+a+mammalian+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coordinated multivesicular release at a mammalian ribbon synapse.</a> Nature Neuroscience. 7 (8), 826-833 (2004).</li>
<li>Peichl, L., González-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+types+of+horizontal+cell+in+rodent+retinae%3A+a+comparison+of+rat%2C+mouse%2C+gerbil%2C+and+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Vis.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological types of horizontal cell in rodent retinae: a comparison of rat, mouse, gerbil, and guinea pig.</a> Vis. Neurosci. 11, 501-517 (1994).</li>
<li>Ames, A., Nesbett, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+retina+as+an+experimental+model+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">In vitro retina as an experimental model of the central nervous system.</a> J. Neurochem. 37 (4), 867-877 (1981).</li>
<li>Mathis, D. M., Furman, J. J., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology.</a> J. Vis. Exp. (49), (2011).</li>
<li>Peichl, L., Sandmann, D., Boycott, B. B. Comparative anatomy and function of mammalian horizontal cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeichl%2C+L+%22Development+of+the+Retina%22">Development of the Retina</a>. , Plenum Press. New York. (1998).</li>
<li>Feigenspan, A., Babai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+spontaneous+excitatory+currents+and+encoding+of+light%2Fdark+transitions+in+horizontal+cells+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional properties of spontaneous excitatory currents and encoding of light/dark transitions in horizontal cells of the mouse retina.</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2615-2632 (2015).</li>
<li>Enoki, R., Jakobs, T. C., Koizumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+slice+preparation+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Horizontal slice preparation of the retina.</a> J. Vis. Exp. (1), e108(2006).</li>
<li>Babai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+complexin3+and+complexin4+at+mouse+photoreceptor+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional roles of complexin3 and complexin4 at mouse photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 36, 6651-6667 (2016).</li>
<li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+slices+of+mouse+retina+expose+horizontal+cells+and+their+properties+%28Commentary+on+Feigenspan+%26+Babai%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Horizontal slices of mouse retina expose horizontal cells and their properties (Commentary on Feigenspan & Babai).</a> Eur. J. Neurosci. 42 (9), 2613-2614 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W przeciwieństwie do pionowych warstw, morfologia dendrytyczna neuronów zorientowanych promieniowo, takich jak komórki poziome i komórki amakrynowe, jest dobrze zachowana. W porównaniu z preparatami całej siatkówki, te typy komórek są łatwo dostępne dla mikroelektrod i mogą być badane zarówno za pomocą technik elektrofizjologicznych, jak i obrazowania. Tutaj skupiliśmy się na zewnętrznej siatkówce; Jednak podobne podejście zostało zgłoszone szczególnie w przypadku komórek amakrynowych wewnętrznej siatkówki<sup class="xre...

Informacje wizualne są kodowane jako dynamiczny czasoprzestrzenny wzorzec aktywacji fotoreceptorów, a synapsa wstęgowa między fotoreceptorami a neuronami drugiego rzędu decyduje o dalszym przekazywaniu informacji wizualnej. Pionowe przygotowanie warstwy siatkówki ssaków jest bardzo cennym narzędziem do badania przetwarzania sygnałów w szlakach pionowych, tj. między fotoreceptorami a komórkami dwubiegunowymi oraz między komórkami dwubiegunowymi a niektórymi typami komórek amakrynowych1,2,3,4.
Jednak pionowe cięcie zawsze powoduje poważne obcięcie pól dendrytycznych wielu neuronów siatkówkowych, prowadząc do znacznej utraty kontaktów synaptycznych. Szczególnie w zewnętrznej siatkówce, komórki poziome są dotknięte ze względu na ich bocznie rozciągnięte pola dendrytyczne i systemy końcowe aksonów5. W pionowym przygotowaniu plasterków wejście synaptyczne setek końcówek fotoreceptorów stożków do dendrytów komórki poziomej jest w ten sposób zredukowane do kilku rzadkich kontaktów. To może wystarczyć do zbadania właściwości poszczególnych synaps, ale w żadnym wypadku nie reprezentuje możliwości przetwarzania sygnału leżących u podstaw zsynchronizowanej aktywacji synaps wstęgowych fotoreceptorów.
Dlatego opracowaliśmy preparat do poziomego warstwowania, który pozostawia prawie wszystkie wejścia synaptyczne fotoreceptora stożka do dendrytów komórek poziomych nienaruszone i funkcjonalne. Płaszczyzna przekroju przebiega równolegle do powierzchni siatkówki, idealnie przecinając wewnętrzną warstwę jądrową między komórkami poziomymi a komórkami amakrynowymi. W ten sposób powstają poziome wycinki siatkówki zewnętrznej zawierające w miejscu presynaptycznym fotoreceptory z segmentami wewnętrznymi i zewnętrznymi oraz zakończeniami synaptycznymi oraz komórki poziome i komórki dwubiegunowe w miejscu postsynaptycznym. Preparat ten doskonale nadaje się do badania skoordynowanych wejść synaptycznych do poziomych dendrytów komórkowych przez wszystkie fotoreceptory czopków w ich polu dendrytycznym. W związku z tym może okazać się przydatne do lepszego zrozumienia działania synapsy wstęgowej fotoreceptora, która ma kluczowe znaczenie dla transferu informacji wizualnych z macierzy aktywacji fotoreceptorów do odpowiedzi postsynaptycznej.

<table><tbody><tr><td>Ames' Medium</td><td>Sigma</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A9045</td><td></td></tr><tr><td>35 mm szalka Petriego (plastikowa)</td><td>Nunc Thermofisher</td><td>150318</td><td></td></tr><tr><td>Glass Petri naczynie</td><td>Chemoline</td><td>50-1470-40</td><td></td></tr><tr><td>Ambulatorium</td><td>Isoflurane</td> szpital uniwersytecki <td></td><td></td></tr><tr><td>Ostrze wtryskiwacza Vibratome</td><td>Biosystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica Microsystems</td><td>VT1200</td><td></td></tr><tr><td>Vibrocheck</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrofalowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>łaźnia wodna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 G Igły</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td></td><td></td><td></td>sprężynowe</tr><tr><td>Zakrzywione ostrza skalpela</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta</td><td></td><td></td><td></td>Pasteura</tr><tr><td>Szklana pipeta</td><td></td><td></td> <td>Pasteura</td></tr></tbody></table>

przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych

Preparation of Horizontal Slices of Adult Mouse Retina for Electrophysiological Studies

Preparaty pionowe są dobrze znane do badania obwodów i transmisji sygnałów w siatkówce dorosłego ssaka. Płaszczyzna przekroju w tych preparatach jest prostopadła do powierzchni siatkówki, dzięki czemu idealnie nadaje się do badania neuronów zorientowanych promieniowo, takich jak fotoreceptory i komórki dwubiegunowe. Jednak duże dendrytyczne altany komórek poziomych, szerokokątnych komórek amakrynowych i komórek zwojowych są w większości obcięte, pozostawiając znacznie zmniejszoną aktywność synaptyczną w tych komórkach. Podczas gdy komórki zwojowe i przemieszczone komórki amakrynowe można badać w całościowym preparowaniu siatkówki, komórki poziome i komórki amakrynowe znajdujące się w wewnętrznej warstwie jądrowej są słabo dostępne dla elektrod w całej tkance siatkówki.
Aby osiągnąć maksymalną dostępność i integralność synaptyczną, opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki myszy i badaliśmy transmisję sygnału w synapsie między fotoreceptorami a komórkami poziomymi. Podział poziomy pozwala (1) na łatwą i jednoznaczną identyfikację wizualną poziomych ciał komórek w celu namierzenia elektrod oraz (2) zachowanie rozszerzonych horyzontalnych pól dendrytycznych komórek, jako warunek wstępny dla nienaruszonego i funkcjonalnego wejścia synaptycznego stożka do poziomych dendrytów komórkowych.
Poziome komórki z poziomych warstw wykazywały toniczną aktywność synaptyczną w ciemności, a na krótkie błyski światła reagowały zmniejszeniem prądu wewnętrznego i zmniejszoną aktywnością synaptyczną. Dowody immunocytochemiczne wskazują, że prawie wszystkie czopki w polu dendrytycznym komórki poziomej tworzą synapsy z jej dendrytami obwodowymi. Preparat warstwowy doskonale nadaje się zatem do badania właściwości fizjologicznych poziomo wydłużonych neuronów siatkówki, a także transmisji sygnałów sensorycznych i integracji między wybranymi synapsami.

W poziomych skrawkach siatkówki myszy ciała komórek poziomych można było łatwo zidentyfikować na podstawie ich charakterystycznej morfologii, z kilkoma dendrytami pierwotnymi wychodzącymi z wielobocznego ciała komórki (Rycina 1A). Ciała komórek poziomych znajdujące się blisko powierzchni skrawka były rutynowo dostępne dla elektrod do techniki patch-clamp. Podczas rejestracji komórki wypełniano barwnikiem fluorescencyjnym, co ujawniło ich złożone arboryzacje dendrytyczne, ...

Opracowaliśmy poziome przygotowanie siatkówki dorosłego ssaka z płaszczyzną przekroju równoległą do powierzchni siatkówki. Pola dendrytyczne neuronów siatkówki o orientacji niepromieniowej nie zostały obcięte, co pozwoliło na badanie przetwarzania sygnału za pomocą patch-clamp i technik obrazowania.

Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych

Vertical slice preparations are well established to study circuitry and signal transmission in the adult mammalian retina. The plane of sectioning in ...

Ogólnym celem przygotowania horyzontalnego skrawka siatkówki myszy jest zachowanie integralności morfologicznej i fizjologicznej neuronów zorientowanych horyzontalnie, aby móc badać ich funkcjonalną rolę w obwodach synaptycznych siatkówki. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny przetwarzania informacji wzrokowej, takie jak sposób kodowania i integrowania sygnałów sensorycznych w synapsach wstążkowych siatkówki. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że horyzontalnie zorientowane interneurony, takie jak komórki horyzontalne i komórki amakrynowe, pozostają funkcjonalnie nienaruszone i są dostępne do rejestracji elektronicznej.Procedurę zademonstruje Andrea Nerz, technik w moim laboratorium. Aby rozpocząć procedurę, należy usunąć gałkę oczną, umieszczając parę pęset zakrzywionych pod okiem. Delikatnie unieś gałkę oczną, aby odsłonić nerw wzrokowy, a następnie przetnij go nożyczkami sprężynowymi.Następnie przenieś gałkę oczną do 35 milimetrowej szalki Petriego zawierającej 2 ml pożywki AMS. Pod mikroskopem stereoskopowym ustaw powiększenie umożliwiające optymalną kontrolę wizualną. Następnie unieruchom gałkę oczną pęsetą i przebij rogówkę w miejscu przejścia w twardówkę za pomocą drugiej pęsety z ostrym końcem lub igły 20G.Należy uważać, aby nie uszkodzić siatkówki podczas nakłuwania rogówki. Następnie należy wprowadzić nożyczki sprężynowe do powstałego małego otworu. Gałkę oczną należy ustabilizować pęsetą podczas wycinania okręgu wokół rogówki, dbając o to, aby nacięcie znajdowało się bardzo blisko powierzchni, aby nie przeciąć siatkówki.Ostrożnie usuń rogówkę, soczewkę i ciało szkliste. Ciało szkliste stanowi jedynie cienką, przezroczystą warstwę w tylnej części oka. Jest jednak niezbędne, aby ciało szkliste zostało całkowicie usunięte przedykowaniem na wibratomie.W szalce Petri ustaw gałkę oczną tak, aby widoczny był wyraźny otwór prowadzący do siatkówki. Krawędź otworu powinna składać się wyłącznie z tkanki twardówki. Następnie chwyć twardówkę pęsetą i ostrożnie rozdarj tkankę.Kluczowe jest, aby nie przerwać siatkówki podczas tego etapu. Na tym etapie siatkówka i reszta oczodołu powinny być połączone jedynie w obrębie główki nerwu wzrokowego. Przetnij punkt przyczepu w obrębie główki nerwu wzrokowego za pomocą nożyczek sprężynowych.Siatkówka powinna teraz swobodnie unosić się jako pojedynczy fragment tkanki w medium AMS. Następnie, za pomocą pipety Pasteura o dużej średnicy, przenieś siatkówkę na szkiełko nakrywkowe i podziel ją na cztery do sześciu małych prostokątów o wymiarach około dwóch na trzy milimetry kwadratowe, używając zakrzywionego ostrza skalpela. Unikaj ściskania tkanki siatkówki wewnątrz wycinanych prostokątów.W tej procedurze, za pomocą plastikowej pipety Pasteura o dużej średnicy, ostrożnie przenieść dwa do trzech fragmentów siatkówki wraz z niewielką ilością pożywki AMS do szklanej szalki Petriego. Za pomocą szklanej pipety Pasteura usunąć jak największą ilość pozostałej pożywki AMS. Następnie niezwłocznie przykryć fragmenty siatkówki dwiema mililitrami rozpuszczonej agarozy o temperaturze 37 °C.Delikatnie dociśnij fragmenty siatkówki do dna szalki Petriego. Ustaw warstwę komórek zwojowych tak, aby była skierowana w dół, robiąc to tak szybko i precyzyjnie, jak to możliwe, ponieważ agaroza szybko twardnieje. Jednocześnie ułóż fragmenty siatkówki równolegle do dna szklanego naczynia, aby zapobiec ustawieniu sekcji stycznie lub pod kątem.Następnie przenieś fragmenty siatkówki zatopione w agarozie do lodówki, aby agaroza stwardniała przed dalszą obróbką. Teraz ostrożnie oddziel blok agarozy zawierający fragmenty siatkówki od szalki Petriego. Użyj ostrza skalpela, aby ostrożnie podnieść blok agarozy z powierzchni szkła.Następnie umieść blok agarozowy na szkiełku nakrywce. Dopasuj jego rozmiar za pomocą ostrza skalpela, pozostawiając jeden do dwóch milimetrów agarozy po każdej stronie fragmentów siatkówki. Następnie przyklej blok agarozowy do uchwytu na próbki w wibrotomie, używając kleju błyskawicznego.Natychmiast przykryj blok, wlewając wcześniej napowietrzone medium AMS do kuwety buforowej wibratomu. Na tej rycinie pozioma komórka znajdująca się w pobliżu powierzchni skrawka została zwizualizowana za pomocą optyki kontrastowej dote. Obraz przedstawia poziomą komórkę wypełnioną Oregon Green 488 BAPTA-1 poprzez elektrodę patch, która wciąż pozostawała przyczepiona do komórki.Przedstawiono tutaj nałożenie obrazu komórki poziomej z wstrzykniętym barwnikiem oraz macierzy pedikułów czopków oznakowanych aglutyniną z orzeszków ziemnych sprzężoną z fluoresceiną, co ujawnia domniemałe kontakty synaptyczne. Na tym rysunku rejestracja metodą voltage clamp z całej komórki przy potencjale spoczynkowym minus 60 mV wykazuje wysokoczęstotliwościową toniczną aktywność synaptyczną. Przy wyższej rozdzielczości czasowej zdarzenia synaptyczne wykazują monofazowe przebiegi lub bardziej złożone trajektorie prądowe.Na tej ilustracji przedstawiono odpowiedź prądową komórki poziomej na bodziec świetlny. Światło indukuje zamknięcie kanałów jonowych i blokadę aktywności synaptycznej. Natomiast na tej ilustracji fotoreceptory czopkowe zostały stymulowane elektrycznie za pomocą elektrody zewnątrzkomórkowej.Postsynaptyczne prądy pobudzające są stopniowalne w zależności od siły stymulacji. Po opanowaniu tej procedury można ją przeprowadzić w czasie krótszym niż jedna godzina, o ile jest wykonywana prawidłowo. Po realizacji tej procedury można zastosować inne metody, takie jak obrazowanie wapnia, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące przetwarzania informacji wizualnych w sieciach siatkówki.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat sposobu wycinania poziomych przekrojów siatkówki ssaków z funkcjonalnymi wejściami synaptycznymi dla typów komórek o rozległych wypustkach poziomych.

preparation-horizontal-slices-adult-mouse-retina-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Tradycyjnie w pionie kawałek i cały montażu przygotowanie siatkówce były używane w badaniach funkcji siatkówki obwodów. Poniżej opiszemy powieści krojenia metody zachowania dendrytycznych morfologii neuronów siatkówki nienaruszone.

Poziome Przygotowanie Kromka Retina

W niniejszej pracy opisujemy procedurę przygotowywania adaptowanych do ciemności skrawków siatkówki mysiej do pomiarów elektrofizjologicznych.

Rejestracja metodą patch-clamp z neuronów siatkówki myszy w preparacie skrawka adaptowanego do ciemności

Ten film demonstruje technikę całokomórkowego patch-clamp do elektrofizjologicznego zapisu z płaskiej siatkówki myszy. Cienka szklana pipeta z elektrodą służy do zbliżania się do gwiazdotwórczych komórek amakrynowych (SAC) w siatkówce. Po uformowaniu uszczelki stosuje się ssanie w celu pęknięcia membrany i utworzenia konfiguracji zacisku krosowego całej komórki. Na koniec mierzy się przepływ jonów przez receptory synaptyczne SAC za pomocą konfiguracji.

Ustanawianie opaski krosowej całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z siatkówki myszy z płaskim mocowaniem

Film opisuje elektrofizjologiczny zapis synaps retinogenikulacyjnych i kortykogenicznych w wycinkach mózgu myszy. Plastry zawierające grzbietowe jądro kolankowate boczne (dLGN) umieszcza się w komorze rejestracyjnej. Pipetę stymulującą umieszcza się na przewodzie wzrokowym w celu stymulacji komórek zwojowych siatkówki (RGC) i zbadania synaps retinogenikulacyjnych lub jądra reticularis thalami w celu stymulacji neuronów korowych i zbadania synaps kortogenicznych. Po stymulacji RGC i neurony...

Badanie elektrofizjologiczne synaps retinogenikulacyjnych i kortykopochodnych w wycinkach mózgu myszy

Źródło: Laboissonniere, et. al. Jednokomórkowy sekwencjoner RNA zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki. J. Vis. exp. (2017).  Ten film demonstruje technikę fluorescencyjnego śledzenia w celu identyfikacji podtypów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w transgenicznej siatkówce myszy. Proces ten polega na zabezpieczeniu izolowanej siatkówki w komorze rejestracyjnej, utrzymaniu żywotności komórek za pomocą natlenionej perfuzji i celowaniu w znakowane fluorescencyjnie RGC za pomocą...

Identyfikacja podtypów komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą śledzenia fluorescencyjnego

Pokażemy, jak przygotować wycinki siatkówki z oka myszy i rejestrować reakcje świetlne w neuronach siatkówki. Cała procedura przeprowadzana jest w warunkach przystosowanych do ciemności.

Rejestrowanie wywołanych światłem odpowiedzi postsynaptycznych w neuronach w adaptowanych do ciemności, mysich preparatach siatkówki przy użyciu technik patch clamp

Opisujemy protokół monitorowania dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów czopków za pomocą preparatu ex-vivo siatkówki myszy. Protokół ten umożliwia kompleksowe badania sygnalizacji stożka Ca2 + w ważnym systemie modelowym ssaków, myszy.

Obrazowanie dynamiki Ca2+ w zakończeniach aksonów fotoreceptorów stożkowych siatkówki myszy

Po usunięciu z organizmu, tkanka neuronalna jest bardzo podatna na wpływ warunków środowiskowych, co prowadzi do ostatecznej degradacji tkanki po 6 - 8 godzinach. Dzięki unikalnej metodzie inkubacji, która ściśle monitoruje i reguluje zewnątrzkomórkowe środowisko tkanki, żywotność tkanek może być znacznie przedłużona przez &gt;24 godziny.

Przedłużona inkubacja ostrej tkanki neuronalnej do elektrofizjologii i obrazowania wapnia

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Poznaj technikę przygotowania poziomych wycinków siatkówki myszy do badań elektrofizjologicznych. Metoda zachowuje integralność neuronów poziomych, umożliwiając badanie ich roli w obwodach synaptycznych siatkówki.

Przygotowanie poziomych wycinków siatkówki dorosłej myszy do badań elektrofizjologicznych

Przeglądaj więcej filmów