Name: Mikroskopia przyżyciowa i indukcja skrzepliny w płatku ucha myszy bezwłosej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj mikroskopię przyżyciową i indukcję skrzepliny w płatku ucha myszy bezwłosej SKH1-Hrhr. Ta metoda pozwala badać wpływ leków wazoaktywnych na mikrokrążenie i identyfikować nowe substancje przeciwzakrzepowe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Wszystkie eksperymenty in vivo (7221.3-1-006/15) zostały przeprowadzone zgodnie z niemieckim ustawodawstwem dotyczącym ochrony zwierząt oraz Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Instytut Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych, Krajowa Rada ds. Badań).
1. Ogólne trzymanie zwierząt
<ol>
	<li>Wykonaj eksperymenty na samcach myszy SKH1-Hrhr w wieku od 4 do 6 tygodni. Używaj zwierząt o wadze od 20 do 25 g.</li>
	<li>Trzymaj zwierzęta w obiekcie wolnym od patogenów, w znormalizowanych warunkach od 24 do 26 °C i wilgotności względnej około 60%, ze stałym dostępem do wody i pożywienia ad libitum.</li>
	<li>Trzymaj do pięciu samców w jednej klatce. Zapewnienie ściółki i materiałów urozmaicających warunki pobytu podczas przetrzymywania zwierząt w celu zapewnienia ich dobrostanu.</li>
</ol>
2. Wstępne rozmieszczenie zwierząt
<ol>
	<li>Zważ mysz i załaduj odpowiedni lek (np. kannabinoid, 5 mg/kg masy ciała (m.c.)) do strzykawki insulinowej. Lek należy podać 30 minut przed indukcją skrzepliny.</li>
	<li>Trzymając szyję myszy między kciukiem a palcem wskazującym, a ogon myszy małym palcem, rozciągnij zwierzę i wstrzyknij lek dootrzewnowo (ip) w lewy dolny kwadrant brzucha. Włóż zwierzę z powrotem do klatki na 15 minut.</li>
	<li>Przygotuj znieczulenie ketaminą (90 mg/kg m.c.) i ksylazyną (25 mg/kg m.c.). 15 minut przed indukcją skrzepliny znieczulij mysz. Umieść mysz w klatce, lekko pociągnij za ogon i wstrzyknij środki znieczulające za pomocą strzykawki insulinowej.</li>
	<li>Włóż mysz z powrotem do klatki do momentu rozpoczęcia znieczulenia. Aby sprawdzić, czy znieczulenie jest wystarczające, uszczypnij ogon kleszczami.</li>
	<li>Załadować 0,05 ml rozmrożonego dekstranu znakowanego izotiocyjanianem fluoresceiny (dekstran FITC; 5%, 150 kDa) do strzykawki insulinowej. Podczas napełniania strzykawki należy upewnić się, że nie pozostały żadne pęcherzyki powietrza, ponieważ nawet małe pęcherzyki powietrza podawane dożylnie mogą być śmiertelne dla zwierzęcia.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na płycie grzewczej w pozycji zadrukowaną do dołu. Ustawić płytę grzewczą na 37 °C.</li>
	<li>Nałóż maść na oko na rogówkę myszy. Zdezynfekuj skórę i używaj sterylnych narzędzi.</li>
	<li>Zszyj dwa szwy z polipropylenu 7/0 w krawędź czaszki i ogona prawego ucha. Umieść ściegi jak najbliżej krawędzi i jak najbliżej podstawy (Rysunek 1B).</li>
	<li>Przesuń mysz do pozycji grzbietowej. Przymocuj wszystkie nogi do platformy z akrylszkła za pomocą pasków samoprzylepnych. Zaczepić szew pod przednimi zębami i ustawić głowę w zgięciu grzbietowym, przyklejając szew do szkła akrylowego za pomocą pasków samoprzylepnych.</li>
	<li>Przenieś zwierzę na platformę pod stereoskopowym mikroskopem operacyjnym. Użyj 16-krotnego powiększenia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie lewej żyły szyjnej i wstrzyknięcie FITC-Dekstranu
Uwaga: Do mikroskopii prawego ucha przygotuj lewą żyłę szyjną.
<ol>
	<li>Za pomocą skalpela wykonaj 5-milimetrowe nacięcie w skórze po lewej stronie szyi w kierunku czaszkowo-ogonowym. Wypreparuj tkankę podskórną za pomocą mikrokleszczy i mikronożyczek. Podwiązywać naczynia krzyżowe za pomocą szwów poliestrowych 8/0 lub z elektrokoagulacją.</li>
	<li>Uwolnij żyłę z przydanki za pomocą mikrokleszczy i mikronożyczek bez dotykania naczynia.</li>
	<li>Do wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego należy użyć przygotowanej strzykawki insulinowej. Ostrożnie chwyć ścianę naczynia mikrokleszkami, nie perforując żyły. Przeniknąć strzykawką do rozdętej ściany naczynia i wstrzyknąć FITC-dekstran dożylnie.</li>
	<li>Krwawienie należy zatamować po wyjęciu strzykawki za pomocą bawełnianych wacików. Unikaj zanieczyszczenia ucha krwią i barwnikiem.</li>
</ol>
4. Umiejscowienie prawego ucha w przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Przenieś zwierzę na płycie grzewczej do konstrukcji ze szkła akrylowego ze szczeliną na płytę grzewczą i płaszczyzną o wysokości 0,5 cm do ustawienia ucha.</li>
	<li>Przymocuj zwierzę twarzą do dołu na płycie grzewczej za pomocą pasków samoprzylepnych. Umieść stosunkowo mocną i wypukłą chrząstkę u podstawy ucha obok płaszczyzny ucha o wysokości 0,5 cm (ryc. 1B), tak aby wierzchołkowa część ucha mogła być umieszczona płasko na płaszczyźnie.</li>
	<li>Dodaj jedną kroplę 0,9% NaCl o temperaturze pokojowej do płaszczyzny szkła akrylowego, aby ustawić ucho. Umieść prawe ucho, z wstępnie ułożonymi szwami na jego wklęsłej stronie brzusznej skierowanej w dół, na kropli 0,9% NaCl. Za pomocą bawełnianych wacików zaabsorbuj kroplę NaCl i pozwól, aby siły kapilarne przymocowały płaszczyznę ucha do szkła akrylowego.</li>
	<li>Przyklej szwy do szkła akrylowego, aby ustalić pozycję ucha.</li>
	<li>Dodaj jedną kroplę 0,9% NaCl o temperaturze pokojowej do wypukłej grzbietowej strony ucha. Ostrożnie przyłóż jedno szkiełko nakrywkowe (o średnicy 0,5 cm) do ucha, nie uciskając naczyń podstawowych wchodzących do ucha. Za pomocą bawełnianych wacików usuń jak najwięcej NaCl spod szkiełka nakrywkowego, aby zminimalizować odległość między szkiełkiem nakrywkowym a naczyniami docelowymi ucha.</li>
</ol>
5. Przyżyciowa mikroskopia fluorescencyjna i indukcja skrzepliny w prawym uchu
<ol>
	<li>Dostosuj przyżyciowy mikroskop fluorescencyjny do wizualizacji FITC-dekstranu (450 - 490 nm; FT: 510; LP: 520). Użyj zmiennej lampy rtęciowej o mocy 100 W jako źródła światła. Podłącz czarno-białą kamerę CCD o wysokiej rozdzielczości do nagrywarki DVD.</li>
	<li>Przenieś zwierzę na szkle akrylowym zawierającym płytkę grzewczą ze stałym odwodzonym uchem na biurko przyżyciowego mikroskopu fluorescencyjnego.</li>
	<li>Korzystając z 20-krotnego powiększenia (apertura numeryczna 20x/0,95) i 20% natężenia światła, wyszukaj naczynie żylne o średnicy 50 - 60 μm i następczym przepływie krwi 400 - 600 μm/s.</li>
	<li>Dodaj jedną kroplę wody o temperaturze pokojowej do szkiełka nakrywkowego, aby zanurzyć się w wodzie obiektywu o powiększeniu 63x (apertura numeryczna 63x/0,95). Użyj strzykawki z kaniulą o średnicy 1 mm i umieść kroplę na obiektywie mikroskopu. Dodaj tyle wody, aby zetknęło się z szkiełkiem nakrywkowym i obiektywem z kroplą wody.</li>
	<li>Natychmiast po nałożeniu kropli wody rozpocznij nagrywanie naczynia przez 20 s przy 20% natężeniu światła w celu pomiaru średnicy i przepływu krwi w trybie offline.</li>
	<li>Indukcję skrzepliny należy rozpocząć 5 minut po wstrzyknięciu FITC-dextranu. W tym celu należy zwiększyć natężenie światła do 100%.</li>
	<li>Podczas indukcji skrzepliny zamknij otwór mikroskopu na 2 sekundy w ciągu 30 sekund, aby sprawdzić przepływ krwi. W przypadku utrzymującego się przepływu krwi należy ponownie otworzyć otwór. W przypadku zatrzymania przepływu krwi obserwować naczynie przez 30 s. 
	UWAGA: Naczynie jest klasyfikowane jako niedrożne, jeśli przepływ stoi w miejscu przez 30 s lub dłużej lub jeśli krew płynie wstecz. Jeśli przepływ krwi w ortogonii zacznie się ponownie, całkowicie otwórz otwór i kontynuuj indukcję skrzepliny, aż dojdzie do niedrożności naczynia, jak opisano powyżej. Podczas wczesnej indukcji skrzepliny należy upewnić się, że czas, w którym otwór był zamknięty w celu sprawdzenia przepływu krwi, był jak najkrótszy, aby utrzymać prawie ciągłe epi-oświetlenie. Później, podczas wzrostu skrzepliny, naczynie jest perfundowane mniejszą ilością barwnika fluorescencyjnego, dzięki czemu można to obserwować w sposób ciągły.</li>
	<li>Wybierz i zamknij 5 naczyń na ucho. Ograniczyć czas indukcji skrzepliny pod mikroskopem do około 1 godziny po wstrzyknięciu FITC-dextranu.</li>
</ol>
6. Działania uzupełniające
<ol>
	<li>Wykonać zamknięcie rany szyi za pomocą przezskórnych szwów polipropylenowych 6/0.</li>
	<li>Podczas rekonwalescencji po znieczuleniu włóż mysz z powrotem do klatki i ogrzej zwierzę za pomocą światła podczerwonego.</li>
	<li>Przenieś nagrane dane z nagrywarki DVD do oprogramowania pozwalającego na pomiar średnicy naczyń i prędkości przepływu krwi.</li>
</ol>
7. Badanie lewego ucha
<ol>
	<li>Pozwól zwierzęciu dojść do siebie i wyeliminować cały wstrzyknięty dekstran FITC przez 48 godzin.</li>
	<li>Powtórz czynności opisane powyżej, tym razem przygotowując prawą żyłę szyjną i lewe ucho.</li>
</ol>
8. Konserwacja tkanek
<ol>
	<li>Po przyżyciowym mikroskopie fluorescencyjnym ucha lewego należy pobrać 0,5 ml krwi ze splotu żyły zagałkowej oka za pomocą szklanej kapilary. Ostrożnie penetruj wewnętrzny kąt powiekowy ruchami śrubowymi, aż krew żylna przepłynie przez naczynia włosowate. Zebrać sondę w probówce z krwią z kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA).</li>
	<li>Po pobraniu próbki krwi należy złożyć zwierzę w ofierze, wstrzykując 500 mg/kg masy ciała ketaminy do żyły ogonowej.</li>
	<li>Policz komórki krwi za pomocą analizatora hematologicznego w celu ilościowej oceny leukocytów, erytrocytów, trombocytów, hemoglobiny i hematokrytu.</li>
	<li>Odwirować pozostałą krew EDTA o sile 2 500 x g i temperaturze pokojowej przez 10 minut. Odpipetować i zamrozić osocze krwi w celu dalszych badań.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek przetnij małżowiny uszne i utrwal je w 4% formaldehydzie do badania histologicznego.</li>
</ol>

<ol><li>White, R. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12814979">The epidemiology of venous thromboembolism.</a> Circulation. 107 (23), I4-I18 (2003).</li>
<li>Benavides, F., Oberyszyn, T. M., VanBuskirk, A. M., Reeve, V. E., Kusewitt, D. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2646590/">The hairless mouse in skin research.</a> J Dermatol Sci. 53 (1), 10-18 (2009).</li>
<li>Grambow, E., Strüder, D., Klar, E., Hinz, B., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+endogenous%2C+phyto+and+synthetic+cannabinoids+on+thrombogenesis+and+platelet+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Differential effects of endogenous, phyto and synthetic cannabinoids on thrombogenesis and platelet activity.</a> Biofactors. , (2016).</li>
<li>Eriksson, E., Boykin, J. V., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+in+vivo+microscopy+of+the+cutaneous+microcirculation+of+the+hairless+mouse+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Method for in vivo microscopy of the cutaneous microcirculation of the hairless mouse ear.</a> Microvasc Res. 19 (3), 374-379 (1980).</li>
<li>Barker, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hairless+mouse+ear+for+in+vivo+studies+of+skin+microcirculation%5BTitle%5D)+AND+%22Plast+Reconstr+Surg%22%5BJournal%5D)">The hairless mouse ear for in vivo studies of skin microcirculation.</a> Plast Reconstr Surg. 83 (6), 948-959 (1989).</li>
<li>Goertz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+novel+polihexanide-preserved+wound+covering+gel+on+dermal+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a novel polihexanide-preserved wound covering gel on dermal wound healing.</a> Eur Surg Res. 44 (1), 23-29 (2010).</li>
<li>Goertz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microcirculatory+changes+and+angiogenesis+in+a+model+of+frostbite+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of microcirculatory changes and angiogenesis in a model of frostbite injury in vivo.</a> J Surg Res. 168 (1), 155-161 (2011).</li>
<li>Roesken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+for+quantitative+in+vivo+microscopic+analysis+of+thrombus+formation+and+vascular+recanalisation%3A+the+ear+of+the+hairless+%28hr%2Fhr%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">A new model for quantitative in vivo microscopic analysis of thrombus formation and vascular recanalisation: the ear of the hairless (hr/hr) mouse.</a> Thromb Haemost. 78 (5), 1408-1414 (1997).</li>
<li>Sorg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antithrombin+is+as+effective+as+heparin+and+hirudin+to+prevent+formation+of+microvascular+thrombosis+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemos%22%5BJournal%5D)">Antithrombin is as effective as heparin and hirudin to prevent formation of microvascular thrombosis in a murine model.</a> Thromb Haemos. 96 (3), 371-377 (2006).</li>
<li>Sorg, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+antithrombin+in+the+prevention+of+microvascular+thrombosis+during+endotoxemia%3A+an+intravital+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Efficacy of antithrombin in the prevention of microvascular thrombosis during endotoxemia: an intravital microscopic study.</a> Thromb Res. 121 (2), 241-248 (2007).</li>
<li>Kovács, I. B., Sebes, A., Trombitás, K., Csalay, L., Görög, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proceedings%3A+Improved+technique+to+produce+endothelial+injury+by+laser+beam+without+direct+damage+of+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Diath+Haemorrh%22%5BJournal%5D)">Proceedings: Improved technique to produce endothelial injury by laser beam without direct damage of blood cells.</a> Thromb Diath Haemorrh. 34 (1), 331(1975).</li>
<li>Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dorsal+skinfold+chamber%3A+window+into+the+dynamic+interaction+of+biomaterials+with+their+surrounding+host+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Cell+Mat%22%5BJournal%5D)">The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue.</a> Eur Cell Mat. 20 (22), 147-167 (2011).</li>
<li>Grambow, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+hydrogen+sulfide+donor+GYY4137+on+platelet+activation+and+microvascular+thrombus+formation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Effect of the hydrogen sulfide donor GYY4137 on platelet activation and microvascular thrombus formation in mice.</a> Platelets. 25 (3), 166-174 (2014).</li>
<li>Fiebig, E., Ley, K., Arfors, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+leukocyte+accumulation+by+spontaneous+rolling+and+adhesion+in+the+exteriorized+rabbit+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Microcirc+Clin+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid leukocyte accumulation by spontaneous rolling and adhesion in the exteriorized rabbit mesentery.</a> Int J Microcirc Clin Exp. 10 (2), 127-144 (1991).</li>
<li>Harder, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender-specific+ischemic+tissue+tolerance+in+critically+perfused+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks.+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Gender-specific ischemic tissue tolerance in critically perfused skin.</a> Langenbecks. Arch Surg. 395 (1), 33-40 (2010).</li>
<li>Langer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polyvinylpyrrolidone-iodine+liposomal+hydrogel+on+wound+microcirculation+in+SKH1-hr+hairless+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of polyvinylpyrrolidone-iodine liposomal hydrogel on wound microcirculation in SKH1-hr hairless mice.</a> Eur Surg Res. 38 (1), 27-34 (2006).</li>
<li>Saniabadi, A. R., Umemura, K., Matsumoto, N., Sakuma, S., Nakashima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vessel+wall+injury+and+arterial+thrombosis+induced+by+a+photochemical+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Vessel wall injury and arterial thrombosis induced by a photochemical reaction.</a> Thromb Haemost. 73 (5), 868-872 (1995).</li>
<li>Herrmann, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+aggregation+induced+in+the+hamster+cheek+pouch+by+a+photochemical+process+with+excited+fluorescein+isothiocyanate-dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Platelet aggregation induced in the hamster cheek pouch by a photochemical process with excited fluorescein isothiocyanate-dextran.</a> Microvasc Res. 26 (2), 238-249 (1983).</li>
<li>Rumbaut, R. E., Slaff, D. W., Burns, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+thrombosis+models+in+venules+and+arterioles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Microvascular thrombosis models in venules and arterioles in vivo.</a> Microcirculation. 12 (3), 259-274 (2005).</li>
<li>Lee, W. M., Lee, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+coronary+atherosclerosis+in+swine+produced+by+combination+of+balloon-catheter+injury+and+cholesterol+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Advanced coronary atherosclerosis in swine produced by combination of balloon-catheter injury and cholesterol feeding.</a> Exp Mol Pathol. 23 (3), 491-499 (1975).</li>
<li>Callahan, A. B., Lutz, B. R., Fulton, G. P., Degelman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+and+thrombus+thresholds+to+unipolar+stimulation+of+small+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Angiology%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle and thrombus thresholds to unipolar stimulation of small blood vessels.</a> Angiology. 11, 35-39 (1960).</li>
<li>Rosen, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-induced+noninvasive+vascular+injury+models+in+mice+generate+platelet-+and+coagulation-dependent+thrombi%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Laser-induced noninvasive vascular injury models in mice generate platelet- and coagulation-dependent thrombi.</a> Am J Pathol. 158 (5), 1613-1622 (2001).</li>
<li>Agero, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mutalysin+II+on+vascular+recanalization+after+thrombosis+induction+in+the+ear+of+the+hairless+mice+model%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicon%22%5BJournal%5D)">Effect of mutalysin II on vascular recanalization after thrombosis induction in the ear of the hairless mice model.</a> Toxicon. 50 (5), 698-706 (2007).</li>
<li>Menger, M. D., Rösken, M., Rücker, M., Seiffge, D., Vollmar, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14518203">Antithrombotic and thrombolytic effectiveness of rhirudin in microvessels.</a> Langenbecks Arch Chir. 115 (1), 19-20 (1998).</li>
<li>Bilheiro, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrombolytic+action+of+a+proteolytic+fraction+%28P1G10%29+from+Carica+candamarcensis%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">The thrombolytic action of a proteolytic fraction (P1G10) from Carica candamarcensis.</a> Thromb Res. 131 (4), 175-182 (2013).</li>
<li>Kram, L., Grambow, E., Mueller-Graf, F., Sorg, H., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-thrombotic+effect+of+hydrogen+sulfide+is+partly+mediated+by+an+upregulation+of+nitric+oxide+synthases%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">The anti-thrombotic effect of hydrogen sulfide is partly mediated by an upregulation of nitric oxide synthases.</a> Thromb Res. 132 (2), 112-117 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Istnieje kilka kluczowych etapów pomyślnej indukcji skrzepliny w płatku ucha myszy SKH1-Hrhr . W celu rozwiązywania problemów odpowiednie kroki protokołu są wskazane w nawiasach.
Warunki do badania są idealne u młodych zwierząt w wieku 4 - 6 tygodni i przy niskim rogowaceniu naskórka. U starszych zwierząt jakość wizualizacji naczyń krwionośnych jest gorsza i mniej porównywalna ze względu na większą odległość między powierzchnią skóry a naczyniami docelowymi (krok 1.1).
<p class=...

Celem tego artykułu jest opisanie techniki mikroskopii przyżyciowej zastosowanej do małżowiny usznej bezwłosej myszy do bezpośredniej obserwacji i analizy mikrokrążenia, powstawania skrzepliny i ewolucji skrzepliny. Przy częstości występowania 1 na 1,000, zakrzepica żylna jest nadal częstą przyczyną zachorowalności. Chociaż w ostatnich latach opracowano diagnostykę, strategie zapobiegawcze i terapie, jedna trzecia zakrzepicy żylnej objawia się zatorowością płucną1. Zakrzepica tętnicza odgrywa kluczową rolę w chorobach sercowo-naczyniowych, które są najczęstszą przyczyną zgonów w krajach uprzemysłowionych. Zakrzepica tętnicza polegająca na pęknięciu blaszek miażdżycowych bierze udział w zawałach serca, zawałach krezki i udarach mózgu. Każda operacja naraża struktury podśródbłonkowe na działanie składników krwi, zmienia dynamikę przepływu krwi i unieruchamia pacjenta. W chirurgii endoprotezoplastyki kończyny dolnej, transplantacji narządów i chirurgii płatowej zakrzepica jest częstą przyczyną powikłań. Szczególnie zakrzepica mikronaczyniowa często powoduje nieodwracalne uszkodzenia z powodu braku objawów klinicznych. Podobnie, zakrzepica mikronaczyniowa odgrywa kluczową rolę w wielu chorobach, w tym między innymi zakrzepowej plamicy małopłytkowej, posocznicy, rozsianego wykrzepiania wewnątrznaczyniowego, zespołu antyfosfolipidowego i przewlekłej niewydolności żylnej.
W ostatnich latach opracowano kilka nowych leków do terapii i zapobiegania zakrzepicy, ale leki przeciwpłytkowe i przeciwzakrzepowe nadal mają skutki uboczne, nie mają antagonistów i charakteryzują się długotrwałym działaniem. Braki te prowadzą do problemów w ratownictwie medycznym. Dlatego potrzebne są dalsze badania, aby odkryć złożone procesy zachodzące podczas zakrzepicy, które trudno symulować in vitro.
Bezwłosa mysz SKH1-Hrhr została odkryta w 1926 roku w zoo w Londynie. Z powodu defektu genu na chromosomie 14 zwierzę traci sierść po 10 dniu po urodzeniu. Dzięki temu dobrze unaczyniona małżowina uszna jest dostępna do mikroskopii przyżyciowej naczyń. Średnia grubość ucha wynosi 300 μm. Składa się z dwóch warstw skóry właściwej, które są oddzielone chrząstką. Na wypukłej grzbietowej stronie chrząstki do płatka ucha wchodzą 3 wiązki naczyniowe. Wierzchołkowe łuki naczyniowe i zastawki podstawy łączą trzy wiązki. Żyłki mają średnicę od 200 μm (podstawa) do 10 μm (wierzchołkowa). Puste mieszki włosowe otaczają naczynia włosowate o gęstych oczkach2. Anatomia bezwłosej myszy SKH1-Hrhr sprawia, że małżowina uszna jest potężnym i opłacalnym modelem do badań nad zakrzepicą.

<table><tbody><tr><td>Myszy SKH-1/hr</td><td>Charles River</td><td>477</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>standardowy laboratoryjny</td><td>ssniff żywności Spezialdiaeten</td><td>V1594-0&nbsp;</td><td>można kupić od innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>operacja mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica&nbsp;</td><td>M651/M655&nbsp;</td><td>można kupić od innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>mikroskop przyżyciowy</td><td>Zeiss</td><td>Axiotech Vario 100&nbsp;</td><td>można kupić od innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>obiektyw (20x/0,95)&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR&nbsp;</td><td>można kupić od innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>obiektyw (63x/0.95)</td><td>Zeiss</td><td>63x/0,95 W; ACHROPLAN&nbsp;</td><td>można kupić od innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>czarno-biała kamera CCD&nbsp;</td><td>Pieper&nbsp;</td><td>FK 6990 IQ-S&nbsp;</td><td>można kupić od innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Nagrywarka DVD</td><td>Panasonic</td><td>DMR-EX99V&nbsp;</td><td>można kupić od innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Braun</td><td>5/12612055/1011</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamina 10%</td><td>Bela pharm</td><td>F3901-6</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Ksylazynę 2%</td><td>Bayer</td><td>6293841.00.00</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>FITC-dekstran 5%</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>46945-100MG-F</td><td>można kupić od innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>deksapantenol 5% maść do oczu</td><td>Bayer</td><td>6029009.00.00</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>formaldehyd 4%</td><td>Sigma</td><td>HT501128-4L</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td>można kupić od innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe 5 x 5 x 1 mm</td><td>Menzel</td><td>L4339</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Paski samoprzylepne</td><td>Leukosilk</td><td>4683400</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Wirówkę</td><td>Beckman Coulter</td><td>CLGS 15</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Analizator hematologiczny</td><td>Sysmex</td><td>KX-21 A6980</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Probówkę z krwią EDTA</td><td>Sarstedt</td><td>201,341</td><td>można kupić od innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Waciki bawełniane</td><td>Sanyo</td><td>604-A-1</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>światło podczerwone</td><td>Beurer</td><td>5/13855</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>jednorazowy synringe</td><td>Braun&nbsp;</td><td>2020-08</td><td>można kupić od innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>strzykawkę insulinową</td><td>Braun</td><td>9161502</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>jednorazowe igły podskórne</td><td>Braun</td><td>465 7640</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>kapilarę end-to-end</td><td>Sarstedt</td><td>19,447</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytę grzewczą</td><td>Klaus Effenberg</td><td>OP-T 185/03</td><td>można nabyć u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Nożyczki 14,5 cm</td><td>Aesculap</td><td>BC259R</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Uchwyt igły</td><td>Aesculap</td><td>BM081R</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>mikrokleszcze</td><td>Aesculap</td><td>BD331R</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikronożyczki</td><td>Aesculap</td><td>OC496R</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>skalpel 21</td><td>Dahlhausen</td><td>11.000.00.511</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Prolene 7-0</td><td>Ethicon</td><td>XNEH7470</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>Prolene 6-0</td><td>Ethicon</td><td>XN8706. P33</td><td>można kupić od innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr><td>elektrokoagulację</td><td>Servoprax</td><td>H40140</td><td>można kupić u innych dostawców&nbsp;</td></tr><tr>Zintegrowane ogrzewanie <td>podkładki</td><td></td><td></td> ze szkła akrylowego<td>, 0,5&nbsp; cm wysokości płaszczyzny</td></tr></tbody></table>

mikroskopia przyżyciowa i indukcja skrzepliny w płatku ucha myszy bezwłosej

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Zakrzepowe powikłania chorób naczyniowych są jedną z głównych przyczyn zachorowalności i śmiertelności w krajach uprzemysłowionych. Ze względu na złożone interakcje między komórkowymi i niekomórkowymi składnikami krwi podczas tworzenia skrzepliny, wiarygodne badania fizjologii i patofizjologii zakrzepicy można przeprowadzić tylko in vivo. Dlatego w niniejszym artykule przedstawiono model ucha u myszy bezwłosych i skupiono się na analizie in vivo mikrokrążenia, tworzenia skrzeplin i ewolucji skrzepliny. Dzięki zastosowaniu przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej i dożylnemu (iv) zastosowaniu odpowiednich barwników fluorescencyjnych, można łatwo przeprowadzić powtarzalną analizę mikrokrążenia w małżowinie usznej, bez konieczności przygotowania chirurgicznego. Co więcej, model ten można zaadaptować do badań in vivo różnych problemów, w tym gojenia się ran, uszkodzenia reperfuzyjnego lub angiogenezy. Podsumowując, ucho myszy bezwłosych jest idealnym modelem do badania in vivo mikrokrążenia skórnego w warunkach fizjologicznych lub patofizjologicznych oraz do oceny jego reakcji na różne leczenie ogólnoustrojowe lub miejscowe.

Wpływ leczenia kannabinoidami na trombogenezę
Po wstrzyknięciu 0,05 ml dekstranu FITC, fototoksyczna indukcja zakrzepu prowadzi do powstania uszkodzenia śródbłonka oraz utworzenia przyściennej czopu płytkowego (Ryciny 2 i 3). W niniejszym badaniu indukcja zakrzepicy po wstrzyknięciu do jam brzusznej kannabinoidów (5 mg/kg mc.) lub nośnika doprowadziła do zakrzepowej okluzji naczyń we wszystkich żyl...

Model ucha bezwłosej myszy SKH1-Hrhr umożliwia przyżyciowe mikroskopowanie fluorescencyjne mikrokrążenia i fototoksyczną indukcję skrzepliny bez wcześniejszego przygotowania chirurgicznego w badanym łożysku mikronaczyniowym. Dlatego ucho bezwłosej myszy jest doskonałym modelem in vivo do badania złożonych interakcji podczas tworzenia skrzeplin mikronaczyniowych, ewolucji skrzepliny i trombolizy.

Mikroskopia przyżyciowa i indukcja skrzepliny w płatku ucha myszy bezwłosej

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie wpływu potencjalnych leków naczynioaktywnych na tworzenie zakrzepów w naczyniach mikrokrażeniowych in vivo. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące powstawania zakrzepów, takie jak identyfikacja nowych substancji przeciwzakrzepowych, które mogłyby pomóc w zapobieganiu zakrzepicy mikronaczyniowej, będącej jedną z głównych komplikacji w sepsie oraz podczas transplantacji tkanek. Główną zaletą tej techniki jest to, że model ucha myszy bezwłosej umożliwia intravitalną mikroskopię fluorescencyjną i fototoksyczną indukcję zakrzepów bez konieczności wcześniejszego przygotowania chirurgicznego badanego łożyska mikronaczyniowego.Należy rozpocząć od zważenia myszy i zapisania jej masy. Następnie do strzykawki insulinowej należy nabrać odpowiednią objętość substancji badanej. Lek należy podać na 30 minut przed indukcją zakrzepu.Po znieczuleniu myszy na 15 minut przed indukcją zakrzepu, umieść mysz z powrotem w klatce do czasu wystąpienia działania znieczulenia. Aby zweryfikować wystarczający poziom znieczulenia, uciśnij ogon pęsetą i odnotuj brak reakcji. Następnie nabierz 0,05 ml rozmrożonego 50 Dextran

intravital-microscopy-thrombus-induction-earlobe-hairless

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Mikroskopia wewnątrzżyciowa do śledzenia czasowych i przestrzennych zdarzeń hemodynamicznych i zapalnych w mikrokrążeniu opony miękkiej.

Mikroskopia intravitalna mikrokrążenia mózgu myszy z wykorzystaniem zamkniętego okna czaszkowego

Ten film demonstruje procedurę generowania udaru fotozakrzepowego w modelu mysim poprzez laserowe oświetlenie nienaruszonej czaszki po podaniu barwnika światłoczułego.

Modelowanie udaru fotozakrzepowego w modelu mysim: technika oświetlenia laserowego przez czaszkę myszy po podaniu barwnika światłoczułego w celu wywołania fotozakrzepicy

Ten film demonstruje technikę mikroskopii fluorescencyjnej w celu zbadania powstawania skrzepliny w modelu mysim. Myszowi wstrzykuje się polisacharyd znakowany fluoroforem w celu monitorowania krążenia krwi. Po oświetleniu światłem o dużym natężeniu, fototoksyczna indukcja urazu w mikrokrążeniu ucha prowadzi do powstania skrzepliny, co potwierdza się poprzez wizualizację przeszkody w przepływie krwi.

Przyżyteczna mikroskopia fluorescencyjna do badania tworzenia się skrzeplin mikronaczyniowych

Źródło: Kim, D., et. al. Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i mikrotomografia komputerowa do bezpośredniej wizualizacji zakrzepowej choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia wizualizację skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT). Mysi model zakrzepliny mózgowej jest wstrzykiwany z nanocząstkami złota ukierunkowanymi na fibrynę, działającymi jako środek kontrastujący. Mysz jest...

Wizualizacja skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Macierz zewnątrzkomórkowa ulega znacznej przebudowie podczas gojenia się ran, stanów zapalnych i nowotworzenia. Przedstawiamy nowatorskie podejście do mikroskopii immunofluorescencyjnej przyżyciowej do wizualizacji dynamiki fibrylarnych, a także siatkowych składników matrycy z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową przy użyciu mikroskopii epifluorescencyjnej lub dwufotonowej.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie immunofluorescencyjne składników macierzy tkankowej z mikroskopią epifluorescencyjną i dwufotonową

To uproszczone zastosowanie mikroskopii przyżyciowej żył krezkowych u myszy może być używane w różnych modelach zapalenia do obserwacji interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów.

Mikroskopia przyżyciowa interakcji leukocytów-śródbłonka i płytek krwi-leukocytów w żyłach krezkowych u myszy

Opisujemy udoskonaloną procedurę modeli zakrzepicy indukowanej chlorkiem żelaza (FeCl3) na tętnicy szyjnej i krezkowej oraz żyle, scharakteryzowaną efektywnie za pomocą mikroskopii przyżyciowej do monitorowania czasu do powstania skrzeplin okluzyjnych.

Modele zakrzepicy myszy indukowanej chlorkiem żelaza

Ten protokół opisuje indukcję modelu niedokrwienia-reperfuzji (IR) na skórze ucha myszy za pomocą zaciskania magnesem. Korzystając z niestandardowego modelu obrazowania przyżyciowego, badamy in vivo reakcje zapalne po reperfuzji. Uzasadnieniem dla opracowania tej techniki jest poszerzenie wiedzy na temat tego, w jaki sposób leukocyty reagują na uszkodzenia skóry w podczerwieni.

Indukowanie uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w skórze ucha myszy w celu przyżyciowego obrazowania wielofotonowego odpowiedzi immunologicznych

Opisujemy tutaj metodę obrazowania megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kości czaszki żywych myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy

Protokół przedstawia nowe narzędzie do uproszczenia obrazowania przyżyciowego za pomocą odwróconej mikroskopii konfokalnej.

Uproszczone podejście do obrazowania przyżyciowego do długoterminowego monitorowania dynamiki tkanki nabłonkowej pod odwróconym mikroskopem konfokalnym

Poznaj mikroskopię przyżyciową i indukcję skrzepliny w płatku ucha myszy bezwłosej SKH1-Hrhr. Ta metoda pozwala badać wpływ leków wazoaktywnych na mikrokrążenie i identyfikować nowe substancje przeciwzakrzepowe.

Mikroskopia przyżyciowa i indukcja skrzepliny w płatku ucha myszy bezwłosej

Przeglądaj więcej filmów