Mikroskopia przyżyciowa i indukcja skrzepliny w płatku ucha myszy bezwłosej
2 kwietnia 2017
Model ucha bezwłosej myszy SKH1-Hrhr umożliwia przyżyciowe mikroskopowanie fluorescencyjne mikrokrążenia i fototoksyczną indukcję skrzepliny bez wcześniejszego przygotowania chirurgicznego w badanym łożysku mikronaczyniowym. Dlatego ucho bezwłosej myszy jest doskonałym modelem in vivo do badania złożonych interakcji podczas tworzenia skrzeplin mikronaczyniowych, ewolucji skrzepliny i trombolizy.
Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie wpływu potencjalnych leków naczynioaktywnych na tworzenie zakrzepów w naczyniach mikrokrażeniowych in vivo. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące powstawania zakrzepów, takie jak identyfikacja nowych substancji przeciwzakrzepowych, które mogłyby pomóc w zapobieganiu zakrzepicy mikronaczyniowej, będącej jedną z głównych komplikacji w sepsie oraz podczas transplantacji tkanek. Główną zaletą tej techniki jest to, że model ucha myszy bezwłosej umożliwia intravitalną mikroskopię fluorescencyjną i fototoksyczną indukcję zakrzepów bez konieczności wcześniejszego przygotowania chirurgicznego badanego łożyska mikronaczyniowego.
Należy rozpocząć od zważenia myszy i zapisania jej masy. Następnie do strzykawki insulinowej należy nabrać odpowiednią objętość substancji badanej. Lek należy podać na 30 minut przed indukcją zakrzepu.
Po znieczuleniu myszy na 15 minut przed indukcją zakrzepu, umieść mysz z powrotem w klatce do czasu wystąpienia działania znieczulenia. Aby zweryfikować wystarczający poziom znieczulenia, uciśnij ogon pęsetą i odnotuj brak reakcji. Następnie nabierz 0,05 ml rozmrożonego 50 Dextran do strzykawki insulinowej.
Po napełnieniu strzykawki należy upewnić się, że nie pozostały w niej pęcherzyki powietrza, ponieważ nawet małe pęcherzyki podane dożylnie mogą być śmiertelne dla zwierzęcia. Zanurzoną w narkozie mysz należy umieścić na podkładce acroglass z zintegrowaną płytką grzewczą w pozycji brzusznej. Płytkę grzewczą należy ustawić na 37 °C.
Pokryć rogówki oczu myszy maścią oftalmiczną. Następnie nałożyć dwa szwy z polipropylenu 7.0 na krawędzi przedniej (cranial) i tylnej (caudal) prawego ucha. Szwy należy umieścić jak najbliżej krawędzi i jak najbliżej nasady ucha.
Ustaw mysz w pozycji grzbietowej. Przymocuj wszystkie kończyny do platformy za pomocą plastra przylepnego. Zahacz nici chirurgiczne pod przednimi zębami i ustaw głowę w wygięciu grzbietowym, mocując nici do platformy plastrem przylepnym.
Umieść zwierzę na platformie pod stereomikroskopem. Użyj powiększenia 10X. Aby przeprowadzić badanie mikroskopowe prawego ucha, przygotuj lewą żyłę szyjną, wykonując najpierw nacięcie skóry szyi o długości 5 mm w kierunku czaszkowo-ogonowym.
Następnie za pomocą mikrochwytaków i mikronozycyzów należy rozciąć tkankę podskórną. Następnie należy uwolnić żyłę z otoczki zewnętrznej, nie dotykając naczynia. Teraz należy użyć wcześniej przygotowanej strzykawki insulinowej do wstrzyknięcia barwnika fluorescencyjnego.
Ostrożnie chwyć ścianę naczynia za pomocą mikro pęsety, nie przebijając żyły. Przebij rozszerzoną ścianę naczynia igłą strzykawki i wstrzyknij 50 Dextran dożylnie. Wyjmij igłę i zatamuj krwawienie za pomocą tamponów bawełnianych.
Należy unikać zanieczyszczenia ucha krwią oraz barwnikiem. Przenieś zwierzę znajdujące się na płycie grzewczej do konstrukcji z wyrobu szklanego acro z listwą na płytę grzewczą i płaszczyzną o wysokości 0,5 cm do pozycjonowania ucha. Unieruchom zwierzę w pozycji brzusznej na płycie grzewczej za pomocą plastra przylepnego.
Umieść wypukłą chrząstkę u nasady ucha obok płaszczyzny ucha w taki sposób, aby wierzchołkowa część ucha mogła zostać płasko ułożona na płaszczyźnie. Dodaj jedną kroplę wody w temperaturze pokojowej na szklaną płytkę acro. Za pomocą patyczków bawełnianych wchłoń kroplę wody i pozwól, aby siły kapilarne przymocowały płaszczyznę ucha do szkła acro.
Małżowinę uszną należy ułożyć tak płasko, jak to możliwe, mimo że chrząstka nadaje jej kształt wypukły. W związku z tym na płytce z pleksiglasu powinna spoczywać jedynie bardziej elastyczna, dystalna część małżowiny. Aby uniknąć uszkodzenia tkanek oraz wycieku płynów i barwnika, należy ograniczyć kontakt pęsety z uchem do niezbędnego minimum.
Następnie nanieś kroplę wody na wypukłą stronę grzbietową ucha. Ostrożnie nałóż szkiełko podstawowe na ucho, uważając, aby nie ucisnąć naczyń podstawnych wchodzących do ucha. Użyj patyczków bawełnianych, aby usunąć jak najwięcej wody spod szkiełka podstawowego, w celu zminimalizowania odległości między szkiełkiem a docelowymi naczyniami ucha.
Rozpocznij od ustawienia mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania wewnątrzżyciowego w celu wizualizacji 50 Dextran. Przenieś przygotowane zwierzę na platformę mikroskopu fluorescencyjnego do obrazowania wewnątrzżyciowego. Przy powiększeniach 5X, 10X i 20X oraz 20% intensywności światła wyszukaj naczynie żylne o średnicy od 50 do 60 mikronów z przepływem krwi w kierunku anterogradnym.
Nanieś jedną kroplę wody o temperaturze pokojowej na szkiełko nakrywkowe w celu imersji obiektywu o powiększeniu 63X. Bezpośrednio po naniesieniu kropli wody rozpocznij 20-sekundową rejestrację naczynia w celu oceny bazowej średnicy i przepływu krwi. Indukcję zakrzepu rozpocznij pięć minut po wstrzyknięciu 50 Dextran.
W tym celu należy zwiększyć natężenie światła do 100%. Podczas indukcji fototoksycznego zakrzepu, należy przymknąć przysłonę mikroskopu na dwie sekundy w odstępie 30 sekund, aby sprawdzić, czy doszło do zamknięcia przepływu krwi. Jeśli przepływ krwi nadal występuje, należy ponownie otworzyć przysłonę. Naczynie uznaje się za zamknięte, jeśli przepływ zostaje zatrzymany na 30 sekund lub dłużej albo jeśli przepływ krwi jest wsteczny.
W ciągu godziny po wstrzyknięciu Dextranu 50 należy wybrać i zamknąć pięć naczyń w każdym uchu. W tym badaniu zwierzęta otrzymywały wehikuł lub kannabinoidy: anandamid, WIN 155, 212-2 lub kannabidiol przed wstrzyknięciem Dextranu 50 i indukcją zakrzepicy. Anandamid, ale nie CBD oraz WIN 155, 212-2, znacząco przyspieszył wzrost zakrzepu po jednorazowym podaniu w porównaniu z kontrolą otrzymującą wehikuł.
W innym układzie anandamid połączono z indometacyną, aby ocenić wpływ produktów zależnych od cyklooksygenazy na powstawanie zakrzepu za pośrednictwem anandamidu. Podawanie indometacyny jednocześnie z anandamidem zniosło jego działanie prozakrzepowe. Zatem ostra ekspozycja na anandamid wywołuje zależny od cyklooksygenazy efekt prozakrzepowy in vivo.
Po opanowaniu techniki, indukcja zakrzepu w naczyniach wąskich może zostać przeprowadzona w ciągu 90 minut, wliczając w to przygotowanie. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby za każdym razem bardzo ostrożnie obchodzić się z małżowiną uszną, aby uniknąć ekstrawazacji płynów i barwnika. Choć metoda ta pozwala na analizę powstawania zakrzepów, może być ona zastosowana również w innych układach, takich jak gojenie ran, martwica płatów tkankowych oraz angiogeneza.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat dożylnego podawania barwnika fluorescencyjnego, lokalizacji małżowiny usznej oraz oświetlania konkretnych naczyń w celu przeprowadzenia intravitalnej fototoksycznej indukcji zakrzepu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym badaniu wykorzystano model ucha bezwłosej myszy SKH1-Hrhr do intravitalnej mikroskopii fluorescencyjnej w celu zbadania tworzenia zakrzepów w naczyniach mikrokrążenia. Model ten umożliwia fototoksyczną indukcję zakrzepu bez konieczności wstępnego przygotowania chirurgicznego, co czyni go idealnym do badania ewolucji zakrzepów oraz trombolizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia mikrokrążenia
- Tworzenie zakrzepów
Wstęp
- Tworzenie zakrzepów w naczyniach mikrokrążenia jest istotnym powikłaniem w sepsie oraz podczas transplantacji tkanek.
- Model ucha zapewnia unikalne środowisko in vivo do badania dynamiki zakrzepów.
- Intrawitalna mikroskopia fluorescencyjna umożliwia obserwację mikrokrążenia w czasie rzeczywistym.
- Potencjalne leki naczyniożylne mogą być testowane pod kątem ich wpływu na proces tworzenia zakrzepów.
Cel badania
- Ocena wpływu leków naczynioaktywnych na tworzenie się zakrzepów w mikrokrążeniu in vivo.
- Identyfikacja nowych substancji przeciwzakrzepowych, które mogłyby zapobiegać powstawaniu zakrzepów.
- Badanie mechanizmów ewolucji zakrzepów oraz trombolizy.
Zastosowane metody
- Podawanie substancji testowych za pomocą strzykawki insulinowej przed indukcją zakrzepu.
- Stosowanie środków znieczulających i technik chirurgicznych w celu przygotowania modelu mysiego.
- Intrawitalna mikroskopia fluorescencyjna do wizualizacji tworzenia zakrzepu.
- Fototoksyczna indukcja zakrzepu i ocena zamknięcia przepływu krwi.
Główne wyniki
- Anandamid przyspieszył wzrost zakrzepu w porównaniu z kontrolą pojazdu.
- Współpodanie indometacyny zneutralizowało prozakrzepowy efekt anandamidu.
- Indukcję zakrzepu można przeprowadzić efektywnie w ciągu 90 minut.
- Technika ta umożliwia szczegółową obserwację dynamiki zakrzepu in vivo.
Wnioski
- Model ucha jest skuteczny w badaniu tworzenia się zakrzepów w naczyniach mikrokrążeniowych.
- Leki naczynioaktywne mogą znacząco wpływać na dynamikę zakrzepów.
- Dalsze badania są niezbędne w celu zgłębienia mechanizmów leżących u podstaw tych efektów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten model mikroskopii wewnątrzorganizowej umożliwia ocenę tworzenia zakrzepów w naczyniach mikrokrążenia w czasie rzeczywistym w fizjologicznie istotnych warunkach in vivo, co wspiera wczesną ewaluację związków wazoaktywnych pod kątem ich potencjału przeciwtrombotycznego. Dzięki eliminacji konieczności przygotowania chirurgicznego, model ucha myszy bezwłosej zwiększa przepustowość i powtarzalność w przedklinicznych badaniach nad zakrzepicą. System ten dostarcza wglądu w mechanizmy dynamiki zakrzepów, pomagając w walidacji punktów uchwytu oraz identyfikacji związków wiodących w terapii zaburzeń zakrzepowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących wpływu leków wazoaktywnych na szlaki powstawania zakrzepów.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią obserwację wzrostu zakrzepu i okluzji w nienaruszonej mikrokrążeniu.
- Wartość prognostyczna: Generuje ilościowe dane o rozdzielczości czasowej dotyczące ewolucji zakrzepu, co zwiększa pewność co do wyników modulacji celu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na wytworzenie zestandaryzowanych i powtarzalnych łożysk mikronaczyniowych, co zapewnia spójność przesiewania związków w różnych laboratoriach.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza mierzalnych punktów końcowych, takich jak czas do wystąpienia okluzji oraz wielkość zakrzepu, do analizy zależności dawka-odpowiedź.
- Skalowalność: Umożliwia ocenę wielu naczyń u jednego zwierzęcia w określonym czasie, co wspiera przesiewanie o średniej przepustowości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie chorobowe: Modeluje zakrzepicę mikronaczyniową istotną w przypadku sepsy oraz powikłań po transplantacjach tkanek.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki badań in vitro z patofizjologią in vivo poprzez bezpośrednią wizualizację tworzenia się zakrzepu.
- Minimalizacja ryzyka: Umożliwia wczesną ocenę ryzyka związanego ze związkami poprzez identyfikację potencjału prozakrzepowego przed zaawansowanymi badaniami przedklinicznymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, dostarczając odczytów funkcjonalnych, które stanowią podstawę do podejmowania decyzji go/no-go w programach koncentrujących się na zakrzepicy.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących szlaków molekularnych regulujących powstawanie zakrzepów przy użyciu interwencji farmakologicznych lub genetycznych.
- Przesiewanie: Pozwala na powtarzalną, ilościową ocenę wpływu związków na kinetykę zakrzepów w nienaruszonej mikrokrążeniu.
- Analityka: Generuje dane czasowe i morfologiczne dotyczące rozwoju zakrzepu, co wspiera analizę porównawczą pomiędzy grupami badawczymi.
- Badania translacyjne: Łączy ustalenia mechanistyczne z klinicznymi modelami zakrzepicy poprzez zachowaną patofizjologię mikrokrążenia.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny różnorodnych czynników wazoaktywnych w wielu projektach przedklinicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia jasność mechanistyczną w zakresie szlaków powstawania zakrzepów, ograniczając niejednoznaczność w walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje procedury indukcji i obrazowania zakrzepów, zwiększając powtarzalność międzylaboratoryjną.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wczesną identyfikację ryzyk prozakrzepowych w procesie odkrywania leków.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o profile podatności na zakrzepicę in vivo.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii intravitalnej, mikrosurgicalnej kaniulacji naczyń oraz pracy z barwnikami fluorescencyjnymi.
- Zależne od specjalistycznego sprzętu, w tym podgrzewanego stolika, stereomikroskopu oraz systemu obrazowania fluorescencyjnego z regulowaną intensywnością światła.
- Wymaga ustandaryzowanych protokołów znieczulenia i obchodzenia się ze zwierzętami w celu zminimalizowania zmienności w tworzeniu zakrzepów.
- Wymaga umiejętności technicznych w zakresie unieruchamiania ucha i ustawiania ostrości optycznej w celu utrzymania spójnej wizualizacji naczyń.
- Ograniczone do powierzchownych łożysk mikronaczyniowych, co zawęża zastosowanie do skórnych lub dostępnych modeli naczyniowych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:54
Administration of Test Substance and Preparation of FITC-Dextran
2:42
Preparation of the Left Jugular Vein and Injection of FITC-Dextran
3:51
Positioning the Right Ear for Intravital Fluorescence Microscopy
5:24
Intravital Fluorescence Microscopy and Thrombus Induction of the Right Ear
7:01
Venular Thrombus Formation after Single Cannabinoid Treatment and Cyclooxygenase Inhibition
8:03
Conclusion
