Name: Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Poznaj metodę analizy plastyczności synaptycznej w fotoreceptorach Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło. Technika umożliwia półautomatyczną kwantyfikację stref aktywnych synaps i ich rozkładu przestrzennego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni T. Stürnerowi za pomocne poprawki, dyskusje i komentarze do manuskryptu; S.L. Zipursky za dostarczenie zapasów much; M Schölling do obróbki obrazu. Część analizy obrazu została wykonana w laboratorium A. Kakita. Prace te były wspierane przez Fundację Alexandra von Humboldta oraz JSPS Fellowships for Research Abroad (A.S.), JSPS Fellows (S.H.-S.), Grant-In-Aid for Start-up (24800024), On Innovative Areas (25110713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi-Sankyo, Toray Foundations (T.S.), DZNE core funding (G.T.) oraz DZNE Light Microscopy Facility (CM).

Procedury eksperymentalne opisane w tym protokole obejmują wyłącznie pracę z Drosophila i nie podlegają przepisom dotyczącym dobrostanu zwierząt w Niemczech i Japonii.
1. Warunki ekspozycji na światło
<ol>
	<li>Przygotuj muchy przenoszące bezsensowną flippazę (sens-flp) i bruchpilot-frt-stop-frt-gfp (brp-FSF-gfp)15 do wizualizacji Brp-GFP w neuronach fotoreceptora R8 (R8s). Locus genomowy kodujący brp w sztucznym chromosomie bakteryjnym (BAC) został zmodyfikowany w celu wygenerowania tego konstruktu brp-FSF-gfp. U muszek przenoszących ten zmodyfikowany BAC ekspresja Brp-GFP jest pod kontrolą endogennych sekwencji regulatorowych, ale ograniczona do fotoreceptorów R8 po bezsensownym usunięciu kasety FRT-STOP-FRT za pośrednictwem bezsensownej flippazy15. Zauważ, że sens-flp rzadko wyraża flippazę w R7.</li>
	<li>Utrzymuj muchy w cyklu 12 godzin światła/12 godzin ciemności (LD) w temperaturze 25 °C od stadium larwy do eklozji (ryc. 1A).</li>
	<li>Zbierz muchy 0 - 6 godzin po eklozji i umieść je w nowej fiolce zawierającej pokarm dla much.</li>
	<li>Umieścić fiolki w przezroczystym stojaku wykonanym z żywicy akrylowej w trzech stopniach (wysokość 41 cm, podstawa 21 cm, grubość 4 cm i wysokość 13 cm dla każdego stopnia) (Rysunek 1B).</li>
	<li>Dostosuj odległość między szafą rack a panelem LED, aby zapewnić oświetlenie o średnim natężeniu 1,000 luksów za pomocą cyfrowego światłomierza (Rysunek 1C).</li>
	<li>Muchy należy trzymać przez 1–3 dni w jednym z następujących warunków: stała ciemność (DD), 12 godzin światła/12 godzin cyklu ciemności (LD) lub stałe światło (LL) w temperaturze 25 °C w małym inkubatorze (rysunki 1A i 1C).</li>
</ol>
2. Preparacja, immunohistochemia i obrazowanie
<ol>
	<li>Wypreparuj mózgi much za pomocą kleszczy, utrwal je 4% formaldehydem i barwnikiem immunologicznym za pomocą pierwotnego przeciwciała przeciwko Chaoptin (1:50) i drugiego przeciwciała do wizualizacji fotoreceptorów na podstawie poprzednich procedur eksperymentalnych25. Krótko:
	<ol>
		<li>Przygotuj 0,1% Triton X-100 w PBS (0,1% PBT). Roztwór ten stosuje się w celu poprawy penetracji tkanek przeciwciał.</li>
		<li>Znieczulij muchy na elektrodce CO2 , posortuj prawidłowy genotyp i przenieś je na szalkę Petriego wypełnioną 0,1% PBT.</li>
		<li>Wbij kleszcze pod trąbkę i ściągnij odpowiednio prawe i lewe oko za pomocą innych kleszczy.</li>
		<li>Usuń trąbkę i tchawicę przyczepioną do mózgu.</li>
		<li>Przenieś mózg za pomocą kleszczy do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 150 μl 0,1% PBT w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>W ciągu 10 minut powtórz od 2.1.3 - 2.1.5, aby uzyskać jak najwięcej mózgów.</li>
		<li>Dodać 50 μl 16% formaldehydu do probówki i wymieszać pipetując.</li>
		<li>Inkubować mózgi w utrwalaczu w temperaturze pokojowej przez 50 minut.</li>
		<li>Przemyć trzykrotnie 200 μl 0,1% PBT za pomocą mikropipety, zwracając uwagę, aby pozostawić mózgi w probówce.</li>
		<li>Po ostatnim przemyciu usunąć 0,1% PBT i dodać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, przygotowany w następujący sposób: dodać do 196 μl 0,3% PBT (0,3% Triton X-100 w PBS) 4 μl przeciwciała anty-Chaoptin (końcowe rozcieńczenie 1:50) w celu wizualizacji fotoreceptorów.</li>
		<li>Inkubować mózgi w pierwszorzędowym roztworze przeciwciała w temperaturze 4 °C O/N.</li>
		<li>Przemyć 3x 200 μL 0,1% PBT za pomocą mikropipety.</li>
		<li>Po ostatnim przemyciu należy usunąć 0,1% PBT i dodać 200 μl 0,3% PBT zawierającego przeciwciało drugorzędowe.</li>
		<li>Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C O/N.</li>
		<li>Przemyć trzykrotnie 200 μl 0,1% PBT za pomocą mikropipety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do montażu umieść dwie małe krople (po 2 μl każda) podłoża mocującego za pomocą mikropipety na środku szkiełka mikroskopowego w odległości około 2 cm od siebie.</li>
	<li>Umieść dwa szkiełka nakrywkowe, po jednym na każdej kropli i pozostaw wąską przerwę między szkiełkami nakrywkowymi wynoszącą około 0,2 mm.</li>
	<li>Umieścić 15 μl podłoża mocującego na wierzchu szkiełka nakrywkowego i dodać mózgi za pomocą mikropipety do podłoża mocującego.</li>
	<li>Pod mikroskopem preparacyjnym umieść mózgi brzuszną stroną do góry w wąskiej szczelinie między dwoma szkiełkami nakrywkowymi (ryc. 2).</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu i uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, aby utrwalić próbkę (Rysunek 2).</li>
	<li>Uzyskaj obrazy mózgów za pomocą mikroskopu konfokalnego. Użyj 63-krotnego obiektywu olejowego (1,4 N. A.) i 2,6-krotnego zoomu cyfrowego. Wygeneruj ponad 20 odcinków optycznych rdzenia drugiego zwoju wzrokowego z krokiem o wielkości 0,5 μm.</li>
</ol>
3. Generowanie punktów, obiektów powierzchniowych, punktów początkowych i końcowych
<ol>
	<li>Aby określić ilościowo liczbę, rozkład i poziom delokalizacji punkcji Brp-GFP, otwórz stos uzyskany za pomocą mikroskopii konfokalnej w oprogramowaniu do analizy obrazu i odtwórz obrazy 3D (ryc. 3A). Należy zauważyć, że krok w tym badaniu został wykonany z użyciem leku Imaris.</li>
	<li>Zidentyfikuj punkt Brp-GFP za pomocą modułu wykrywania punktowego dla każdego terminala aksonu R8.
	<ol>
		<li>Wybierz opcję "Dodaj nowe miejsca".</li>
		<li>Wybierz opcję "Segmentuj tylko obszar zainteresowania" w ustawieniach algorytmu. Ręcznie wybierz zakończenie aksonu R8 w rdzeniu.</li>
		<li>Wybierz kanał źródłowy sygnału Brp-GFP. 
		UWAGA: Aksony fotoreceptorów R7 i R8 były znakowane immunologicznie anty-Chaoptin (Figura 3A). Jednak tylko R8 zawiera Brp-GFP puncta i dlatego można go łatwo odróżnić (ryc. 3A). Co więcej, punkt końcowy R8 można zidentyfikować przez rozrzedzenie aksonów anty-chaoptin-dodatnich w punkcie wejścia do warstwy rdzenia M3.</li>
		<li>Ustaw szacowaną średnicę XY na 0,35 μm i zaznacz "Odejmowanie tła" w wykrywaniu punktowym.</li>
		<li>Wybierz "Jakość" w typie filtra i filtruj automatycznie. Następnie kliknij przycisk Zakończ.</li>
		<li>Powtórzyć od 3.2.1 t- 3.2.5 dla innych aksonów R (Rysunek 3B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zmierzyć poziom delokalizacji Brp-GFP w aksonach R8, wygeneruj obiekty powierzchniowe z funkcją "Powierzchnia" dla każdego aksonu (rysunek 3C).
	<ol>
		<li>Wybierz opcję "Dodaj nowe powierzchnie".</li>
		<li>Wybierz opcję "Segmentuj tylko obszar zainteresowania" w ustawieniach algorytmu. Następnie ręcznie wybierz zakończenie aksonu R8 w rdzeniu.</li>
		<li>Wybierz kanał źródłowy fotoreceptorów.</li>
		<li>Zaznacz "Gładkie".</li>
		<li>Wybierz "Intensywność bezwzględna" w progu.</li>
		<li>Zaznacz "Włącz". "Średnica punktów wysiewu" wynosi 0,5 μm.</li>
		<li>Wybierz typ filtru "Jakość" i "Liczba wokseli", a następnie filtruj automatycznie.</li>
		<li>Przejdź do "Edytuj" i usuń fragmenty powierzchni wygenerowane na innych nieinteresujących aksonach.</li>
		<li>Powtórz od 3.3.1 - 3.3.8 dla innych aksonów R (Rysunek 3C). Zauważ, że niektóre obiekty na powierzchni zostały przerwane z powodu cienkiego i słabego sygnału w fotoreceptorach w warstwie M2, ale nadal były one uważane za pojedynczy obiekt od punktu początkowego do końcowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zidentyfikować rozkład punktów Brp-GFP wzdłuż każdego neuronu w rdzeniu neuropil, zdefiniuj punkt początkowy i końcowy za pomocą funkcji punktu pomiaru (ryc. 3D).
	<ol>
		<li>Wybierz opcję "Dodaj nowe punkty pomiaru". Następnie wybierz "Edytuj" i wybierz "Powierzchnia obiektu", aby przeciąć się z górną częścią obiektów powierzchni.</li>
		<li>Umieść punkty pomiarowe na powierzchni obiektów aksonów R w warstwie M1 w kolejności. Są one teraz zdefiniowane jako punkty początkowe (rysunek 3D).</li>
		<li>Wybierz opcję "Dodaj nowe punkty pomiaru". Następnie wybierz "Edytuj" i wybierz "Powierzchnia obiektu", aby przeciąć się z dolną częścią obiektów powierzchni.</li>
		<li>Umieść punkty pomiarowe na spodzie obiektów powierzchniowych aksonów R w warstwie M3 w kolejności. Są one teraz zdefiniowane jako punkty końcowe (rysunek 3D).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby odjąć sygnał tła od kanału GFP, wygeneruj obiekty powierzchniowe, punkty, punkty początkowe i końcowe dla dwóch aksonów R w warstwie M6 (rysunek 3E).
	<ol>
		<li>Wybierz opcję "Dodaj nowe powierzchnie".</li>
		<li>Wybierz opcję "Segmentuj tylko obszar zainteresowania" w ustawieniach algorytmu. Następnie ręcznie wybierz terminal aksonowy R7 między warstwą M5 i M6.</li>
		<li>Wybierz kanał źródłowy fotoreceptora.</li>
		<li>Zaznacz "Gładkie".</li>
		<li>Wybierz "Intensywność bezwzględna" w progu.</li>
		<li>Wybierz typ filtra "Jakość" i "Liczba wokseli", a następnie filtruj automatycznie.</li>
		<li>Wybierz opcję "Dodaj nowe miejsca".</li>
		<li>Zaznacz opcję "Pomiń automatyczne tworzenie, edytuj ręcznie".</li>
		<li>Wybierz "Środek obiektu" i dodaj punkt w wewnętrznym obszarze obiektu powierzchni wygenerowanego z 3.5.1 - 3.5.6.</li>
		<li>Powtórz od 3.5.1 do 3.5.9 dla innego terminala aksonu R7.</li>
		<li>Wybierz opcję "Dodaj nowe punkty pomiaru". Następnie wybierz "Edytuj" i umieść punkty pomiarowe na dwóch obiektach powierzchniowych końcówki terminala aksonu R7 w warstwie M6. Są one teraz definiowane jako punkty początkowe.</li>
		<li>Wybierz opcję "Dodaj nowe punkty pomiaru". Następnie wybierz "Edytuj" i umieść punkty pomiarowe na spodzie dwóch obiektów powierzchniowych końcówki terminala aksonowego R7 w warstwie M6. Są one teraz zdefiniowane jako punkty końcowe (rysunek 3E).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Obliczanie liczby plamek, rozkładu częstotliwości plamek i poziomu wzbogacenia Brp-GFP za pomocą dostosowanego oprogramowania do analizy danych obrazu
<ol>
	<li>Skopiuj plik "XtquantifySynapseSNR.m" i folder "functions" do folderu Imaris XT matlab. Należy pamiętać, że obliczenia w tym badaniu zostały wykonane za pomocą dostosowanej wtyczki zaimplementowanej w Matlabie. Pobierz wtyczkę ze strony internetowej (<a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a>).</li>
	<li>Otwórz zestaw danych z n punktami, n powierzchniami i 2 obiektami punktów pomiarowych, z których każdy zawiera n punktów pomiarowych (przygotowanych na podstawie 3.1 - 3.4). Pierwszy obiekt punktu pomiarowego definiuje pozycje początkowe dla wszystkich aksonów. Drugi obiekt punktu pomiarowego określa położenie końcowe wszystkich aksonów. Oba obiekty punktów pomiarowych muszą mieć taką samą liczbę punktów pomiarowych (czyli liczbę aksonów).</li>
	<li>Wykonywanie przetwarzania obrazu>>CUSTOM>atsushis wykrywania synaps Vs 6.</li>
	<li>Sprawdź metadane i zmień rozmiary pikseli w oprogramowaniu do analizy obrazu, jeśli nie jest poprawne.</li>
	<li>Wybierz kanał do przeprowadzenia analizy intensywności regionów plamek i regionów cytoplazmatycznych (kanał z Brp-GFP).</li>
	<li>Zdefiniuj nazwę pliku do eksportowania wyników.</li>
	<li>Określ liczbę pojemników i długość aksonów w procentach. Wprowadź liczbę pojemników jako "10" i zakres pojemników jako "100%" (rysunki 4A i 4B).</li>
	<li>Zdefiniuj regiony plam i inne regiony cytoplazmatyczne do analizy delokalizacji Brp-GFP. Wprowadź promień plamki jako "0,35 μm" i szerokość otaczającego obszaru jako "50 μm". Promień plamki określa obszar dla sygnału puncta GFP (średnica 0,35 μm, wyśrodkowany na jednym punkcie). Szerokość otaczającego obszaru określa obszar dla sygnału GFP w obszarze cytoplazmatycznym (średnica 50 μm, wyśrodkowany na punkcie, ale obejmujący tylko R8 i wykluczający wszystkie obszary plamki w cytoplazmie) (ryc. 4A i 4C).</li>
	<li>Poczekaj, aż wszystkie maski neuronów zostaną przetworzone i wyeksportowane jako pliki PDF (rysunki 4B i 4C) oraz tabelę csv do dalszej analizy w arkuszu kalkulacyjnym. Tabela csv zawiera liczbę plamek, średnią intensywność sygnału w "obszarze cytoplazmatycznym" oraz maksymalną intensywność sygnału w "plamce" w każdym pojemniku dla wszystkich aksonów R8.</li>
	<li>Otwórz zestaw danych przygotowany w wersji 3.5 w celu odjęcia sygnału tła.</li>
	<li>Wykonaj przetwarzanie obrazu zgodnie z opisem w 4.3 - 4.9.</li>
	<li>Oblicz średnią całkowitej liczby i rozkładu punktów Brp-GFP w arkuszu kalkulacyjnym (rysunki 4D i 4E).</li>
	<li>Oblicz średnią delokalizacji sygnału Brp-GFP w arkuszu kalkulacyjnym przez stosunek średniej intensywności w "obszarze cytoplazmatycznym" do maksymalnej intensywności w "plamce" odjętej przez średnią intensywność sygnału tła (rysunek 4F).</li>
</ol>

<ol><li>Alabi, A. A., Tsien, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Vesicle+Pools+and+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Synaptic Vesicle Pools and Dynamics.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (8), (2012).</li>
<li>Couteaux, R., Pecot-Dechavassine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BSynaptic+vesicles+and+pouches+at+the+level+of+%26%2334%3Bactive+zones%26%2334%3B+of+the+neuromuscular+junction%5D%5BTitle%5D)+AND+%22C+R+Acad+Sci+Hebd+Seances+Acad+Sci+D%22%5BJournal%5D)">[Synaptic vesicles and pouches at the level of &#34;active zones&#34; of the neuromuscular junction].</a> C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 271 (25), 2346-2349 (1970).</li>
<li>Schoch, S., Gundelfinger, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+organization+of+the+presynaptic+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular organization of the presynaptic active zone.</a> Cell and Tissue Research. 326 (2), 379-391 (2006).</li>
<li>Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22794257">The Presynaptic Active Zone.</a> Neuron. 75 (1), 11-25 (2012).</li>
<li>Owald, D., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0896627301001854">Assembling the presynaptic active zone.</a> Curr Opin Neurobiol. 19 (3), 311-318 (2009).</li>
<li>Lazarevic, V., Schone, C., Heine, M., Gundelfinger, E. D., Fejtova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+remodeling+of+the+presynaptic+cytomatrix+upon+homeostatic+adaptation+to+network+activity+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extensive remodeling of the presynaptic cytomatrix upon homeostatic adaptation to network activity silencing.</a> J Neurosci. 31 (28), 10189-10200 (2011).</li>
<li>Matz, J., Gilyan, A., Kolar, A., McCarvill, T., Krueger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+structural+alterations+of+the+active+zone+lead+to+sustained+changes+in+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid structural alterations of the active zone lead to sustained changes in neurotransmitter release.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (19), 8836-8841 (2010).</li>
<li>Spangler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liprin-alpha2+promotes+the+presynaptic+recruitment+and+turnover+of+RIM1%2FCASK+to+facilitate+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Liprin-alpha2 promotes the presynaptic recruitment and turnover of RIM1/CASK to facilitate synaptic transmission.</a> J Cell Biol. 201 (6), 915-928 (2013).</li>
<li>Sugie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Remodeling+of+the+Presynaptic+Active+Zone+of+Drosophila+Photoreceptors+via+Activity-Dependent+Feedback%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Molecular Remodeling of the Presynaptic Active Zone of Drosophila Photoreceptors via Activity-Dependent Feedback.</a> Neuron. 86 (3), 711-725 (2015).</li>
<li>Sigrist, S. J., Schmitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+plasticity+of+the+cytoplasmic+active+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional plasticity of the cytoplasmic active zone.</a> Curr Opin Neurobiol. 21 (1), 144-150 (2011).</li>
<li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+zone+assembly+and+synaptic+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Active zone assembly and synaptic release.</a> Biochem Soc Trans. 34 (Pt 5), 939-941 (2006).</li>
<li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruchpilot+promotes+active+zone+assembly%2C+Ca2%2B+channel+clustering%2C+and+vesicle+release%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release.</a> Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).</li>
<li>Hallermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+dense+bodies+provoke+depression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Naked dense bodies provoke depression.</a> J Neurosci. 30 (43), 14340-14345 (2010).</li>
<li>Wagh, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruchpilot%2C+a+protein+with+homology+to+ELKS%2FCAST%2C+is+required+for+structural+integrity+and+function+of+synaptic+active+zones+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Bruchpilot, a protein with homology to ELKS/CAST, is required for structural integrity and function of synaptic active zones in Drosophila.</a> Neuron. 49 (6), 833-844 (2006).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+labeling+of+synapses+in+vivo+through+synaptic+tagging+with+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific labeling of synapses in vivo through synaptic tagging with recombination.</a> Neuron. 81 (2), 280-293 (2014).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2012 (4), 490-493 (2012).</li>
<li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+synapses%3A+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li>
<li>Schmitz, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+neuronal+morphology%2C+synapse+number+and+synaptic+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment.</a> J Neurosci Methods. 195 (2), 185-193 (2011).</li>
<li>Danielson, E., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynPAnal%3A+software+for+rapid+quantification+of+the+density+and+intensity+of+protein+puncta+from+fluorescence+microscopy+images+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">SynPAnal: software for rapid quantification of the density and intensity of protein puncta from fluorescence microscopy images of neurons.</a> PLoS One. 9 (12), e115298(2014).</li>
<li>Sanders, J., Singh, A., Sterne, G., Ye, B., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning-guided+automatic+three+dimensional+synapse+quantification+for+drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Learning-guided automatic three dimensional synapse quantification for drosophila neurons.</a> BMC Bioinformatics. 16, 177(2015).</li>
<li>Peng, H., Ruan, Z., Atasoy, D., Sternson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+reconstruction+of+3D+neuron+structures+using+a+graph-augmented+deformable+model%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Automatic reconstruction of 3D neuron structures using a graph-augmented deformable model.</a> Bioinformatics. 26 (12), i38-i46 (2010).</li>
<li>Sturt, B. L., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+quantification+of+synaptic+fluorescence+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Automated quantification of synaptic fluorescence in C. elegans.</a> J Vis Exp. (66), (2012).</li>
<li>Kremer, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+long-term+changes+at+mushroom+body+input+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural long-term changes at mushroom body input synapses.</a> Curr Biol. 20 (21), 1938-1944 (2010).</li>
<li>Mosca, T. J., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+of+the+Drosophila+antennal+lobe+and+its+regulation+by+the+Teneurins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization of the Drosophila antennal lobe and its regulation by the Teneurins.</a> Elife. 3, e03726(2014).</li>
<li>Wu, J. S., Luo, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17487202">A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining.</a> Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).</li>
<li>Fischbach, K. F., Dittrich, A. P. M. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF00218858">The Optic Lobe of Drosophila-Melanogaster .1 A Golgi Analysis of Wild-Type Structure.</a> Cell and Tissue Research. 258 (3), 441-475 (1989).</li>
<li>Berger-Muller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+role+of+cell-surface+molecules+in+central+synaptogenesis+in+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessing the role of cell-surface molecules in central synaptogenesis in the Drosophila visual system.</a> PLoS One. 8 (12), e83732(2013).</li>
<li>Fouquet, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+active+zone+assembly+by+Drosophila+Bruchpilot%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot.</a> J Cell Biol. 186 (1), 129-145 (2009).</li>
<li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolution+Mapping+of+Neuronal+Circuitry+With+an+Index-Optimized+Clearing+Agent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent.</a> Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li>
<li>Ehmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+of+Bruchpilot+distinguishes+active+zone+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states.</a> Nat Commun. 5, 4650(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym badaniu pokazaliśmy, jak przygotować warunki świetlne, aby wystawić muchy na działanie jednakowego natężenia światła. Określiliśmy ilościowo nie tylko liczbę markerów synaptycznych puncta, ale mogliśmy również przestrzennie określić gęstość synaps wzdłuż aksonów i zmierzyć poziom delokalizacji białka markerowego w obszarach cytoplazmatycznych. Te trzy oceny pozwalają nam ocenić szczegóły dynamiki synaptycznej na poziomie pojedynczego neuronu w różnych warunkach środowiskowych. Nasz protokół można dostosować do różn...

Modulacja funkcji synaptycznych przyczynia się do niezwykłej zdolności układu nerwowego do precyzyjnego reagowania lub dostosowywania się do zmieniających się bodźców środowiskowych. Regulacja prawdopodobieństwa uwolnienia pęcherzyków presynaptycznych jest jednym ze sposobów kontrolowania siły synaptycznej1. Uwalnianie pęcherzyków synaptycznych odbywa się w strefie aktywnej (AZ), wyspecjalizowanym regionie błony presynaptycznej 2. AZ charakteryzuje się kasetą określonych białek3,4. Większość białek biorących udział w składaniu AZ jest wysoce konserwatywna u nicieni, owadów i ssaków5. Ostatnie badania sugerują, że poziom aktywności neuronalnej reguluje skład molekularny AZ, co z kolei przyczynia się do regulacji funkcjonalnej wydajności zarówno in vitro, jak i in vivo6,7,8. Wcześniej odkryliśmy, że fotoreceptory AZ ulegają przebudowie molekularnej u Drosophila po długotrwałej ekspozycji na naturalne światło otoczenia9. W tym stanie zaobserwowaliśmy, że liczba AZ Bruchpilot (Brp) dodatnich została zmniejszona w aksonach fotoreceptorów.
Białka rodziny Brp/CAST/ELKS są podstawowymi elementami budulcowymi AZ w synapsach kręgowców i bezkręgowców10. U mutantów Drosophila brp wywołane uwalnianie pęcherzyków jest stłumione11,12. 17 C-końcowych reszt aminokwasowych Brp jest niezbędnych do grupowania pęcherzyków synaptycznych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila (NMJ)13,14. Badania te wykazały centralną rolę tej cząsteczki w organizacji i funkcji AZ. Dzięki niedawno opracowanemu narzędziu genetycznemu, znakowaniu synaptycznemu z rekombinacją (STaR), Brp można obserwować in vivo w określonych typach komórek, na endogennych poziomach ekspresji i przy rozdzielczości pojedynczej synapsy15. Narzędzie to umożliwia ilościową ocenę endogennej dynamiki synaps w złożonym ośrodkowym układzie nerwowym.
Przeprowadzono kilka badań, w tym kwantyfikację synaps na podstawie danych uzyskanych z mikroskopii konfokalnej. Zmiany synaptyczne zostały ocenione poprzez pomiar długości, powierzchni, objętości, gęstości i zliczanie liczby w oparciu o wyrafinowane aplikacje. Na przykład, darmowe oprogramowanie ImageJ zapewnia metodę kwantyfikacji dla całkowitej powierzchni synaptycznej i pomiarów gęstości synaptycznej w Drosophila NMJ16. Liczba miejsc kolokalizacji markerów pre i postsynaptycznych została określona ilościowo za pomocą wtyczki "Puncta Analyzer" dostępnej na platformie oprogramowania ImageJ17. Alternatywnie, wieloparadygmatowy program oparty na numerycznym środowisku obliczeniowym, Synapse Detector (SynD), może automatycznie śledzić dendryty neuronów znakowanych markerem fluorescencyjnym, a następnie określać ilościowo poziomy białek synaptycznych w funkcji odległości od ciała komórki18. Oprogramowanie Synaptic Puncta Analysis (SynPAnal) zostało zaprojektowane do szybkiej analizy obrazów 2D neuronów uzyskanych z mikroskopii konfokalnej lub fluorescencyjnej. Podstawową funkcją tego oprogramowania jest automatyczna i szybka kwantyfikacja gęstości i intensywności białka puncta19. Ostatnio wygenerowano algorytm automatycznego wykrywania synaps oparty na uczeniu się do kwantyfikacji liczby synaptycznej w 3D20, korzystając z oprogramowania do analizy wspomaganej wizualizacją 3D (Vaa3D)21.
Komercyjne oprogramowanie do analizy obrazów jest również potężnym narzędziem do kwantyfikacji synaptycznej. Na przykład, znakowane fluorescencyjnie receptory neuroprzekaźników lub presynaptyczny komponent AZ zostały określone ilościowo w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy w C. elegans22 lub Drosophila olfactory system23,24, co pozwala na szybkie scharakteryzowanie setek synaps w jednej próbce.
Tutaj prezentujemy metodę za pomocą dostosowanej wtyczki do analizy obrazu, zaimplementowanej w wieloparadygmatowym środowisku obliczeń numerycznych, która pozwala na półautomatyczną analizę wielu aspektów AZ, w tym ich liczby, rozkładu i poziomu wzbogacenia składników molekularnych w AZ. Tak więc ta złożona analiza pozwoliła nam ocenić dynamikę składników synaptycznych w zakończeniach aksonów w różnych warunkach środowiskowych. Zbadaliśmy wpływ ekspozycji na światło na synapsy wyjściowe fotoreceptorów dorosłych much. Zabieg wykonywany jest w trzech etapach: 1) przygotowanie do ekspozycji na światło, 2) preparacja, immunohistochemia i obrazowanie konfokalne oraz 3) analiza obrazu.

<table><tbody><tr><td>Fiolka</td><td>Hightech, Japonia</td><td>MKC-20</td><td></td></tr><tr><td>Plug</td><td>Thermo Fisher Sciehtific, USA</td><td>AS-275</td><td></td></tr><tr><td>Dostosowany przezroczysty stojak wykonany z żywicy akrylowej&nbsp;</td><td>Shin-Shin Corporation, Japonia</td><td></td><td>wysokość 41 cm, podstawa 21 cm, grubość 4 cm i wysokość 13 cm dla każdego stopnia</td></tr><tr><td>Chłodny inkubator</td><td>MITSUBISHI ELECTRIC, Japonia</td><td>CN-40A</td><td></td></tr><tr><td>Panel LED</td><td>MISUMI, Japonia</td><td>LEDXC170-W</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy światłomierz</td><td>CEM</td><td>DT-1301</td><td></td></tr><tr><td>Podkładka pod muchy</td><td>Tokken, Japonia</td><td>TK-HA03-S</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego (35 x 10 mm)</td><td>Greiner Bio-One International, Niemcy</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>tabletka PBS</td><td>Takara, Japonia</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako, Japonia</td><td>160-24751</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Kleszcze</td><td>Narzędzia do nauki o naprawie</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka</td><td>Sarstedt, Niemcy</td><td>A. 152X</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 16%</td><td>NEM, Japonia</td><td>3152</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-chaoptynowe</td><td>DSHB</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>Alexa568-sprzężone przeciwciało anty-mysie</td><td>Life Technologies</td><td>A-11031</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Podłoże montażowe</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td>Szkiełko mikroskopowe <td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>(76 x 26 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko nakrywkowe (18 x 18 mm, 0,17 mm)</td><td>Zeiss, Niemcy</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy przemysłowe</td><td>Olympus, Japonia</td><td>SZ61-C-SET</td><td></td></tr><tr><td>Stereoskop Oświetlenie</td><td>Olympus, Japonia</td><td>KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>mikroskopia konfokalna</td><td>Zeiss, Niemcy</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane, Szwajcaria</td><td></td><td>Wersja 7.6.4 lub nowsza</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks, Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel dla komputerów Mac&nbsp;</td><td>Firmy Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Układ nerwowy ma niezwykłą zdolność do adaptacji i reagowania na różne bodźce. To dostosowanie neuronalne jest w dużej mierze osiągane poprzez plastyczność na poziomie synaptycznym. Strefa aktywna (AZ) to region błony presynaptycznej, który pośredniczy w uwalnianiu neuroprzekaźników i składa się z gęstego zbioru białek rusztowania. AZ Drosophila melanogaster (Drosophila) fotoreceptory ulegają molekularnej przebudowie po długotrwałej ekspozycji na naturalne światło otoczenia. W ten sposób poziom aktywności neuronalnej może zmienić skład molekularny AZ i przyczynić się do regulacji funkcjonalnego wyjścia wyjściowego.
Począwszy od przygotowania do ekspozycji na światło, a skończywszy na immunohistochemii, ten protokół szczegółowo opisuje, jak określić liczbę, rozkład przestrzenny i poziom delokalizacji cząsteczek synaptycznych w AZ w fotoreceptorach Drosophila. Korzystając z oprogramowania do analizy obrazu, zidentyfikowano klastry komponentu AZ z fuzją GFP Bruchpilot dla każdego terminala aksonu fotoreceptora R8 (R8). Wykryte plamki Bruchpilot były automatycznie przypisywane do poszczególnych aksonów R8. Aby obliczyć rozkład częstotliwości plamki wzdłuż aksonu, zaimplementowaliśmy dostosowaną wtyczkę oprogramowania. Punkt początkowy i końcowy każdego aksonu został zdefiniowany ręcznie, a położenie każdego punktu Bruchpilot zostało odwzorowane na linii łączącej punkt początkowy i końcowy. Oprócz liczby klastrów Bruchpilot określiliśmy również ilościowo poziom delokalizacji Bruchpilot-GFP w klastrach. Pomiary te szczegółowo odzwierciedlają przestrzennie rozdzieloną dynamikę synaptyczną w pojedynczym neuronie w różnych warunkach środowiskowych dla bodźców.

Złożone oko Muszka owocówka składa się z ok. 780 ommatidiów, z których każde zawiera osiem typów fotoreceptorów (R1-8). Aksony R7 i R8 biegną do drugiego zwoju optycznego, rdzenia (medulla), gdzie tworzą synapsy odpowiednio w warstwach M6 i M326Aby zbadać wpływ przedłużonej ekspozycji na światło na skład molekularny stref aktywnych fotoreceptorów R8, wykorzystaliśmy metodę STaR15Poziomy ekspresji endogennej Brp zostały oznakowane fl...

Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest zrozumienie dynamiki synaptycznej w pojedynczym neuronie w różnych warunkach aktywacji. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny plastyczności synaptycznej, takie jak ujawnienie zmian w składzie molekularnym synaps podczas dojrzewania aktywności neuronu. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona półautomatyczną analizę wielu aspektów synaps, w tym ich liczby, rozmieszczenia oraz poziomu wzbogacenia w komponenty molekularne w obrębie synaps.W tym doświadczeniu należy zebrać muchy do zwykłych fiolek w ciągu sześciu godzin od eclosji. Fiolki z zebranymi muchami należy umieścić w przezroczystym akrylowym statywie. W małej inkubatorze ustawionym na 25 °C należy ustawić statyw w precyzyjnej odległości od panelu LED, tak aby ekspozycja na światło wynosiła średnio 1000 lux.Następnie hoduj muchy przez jeden do trzech dni w jednym z następujących warunków: w stałej ciemności, w cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności lub w stałym świetle. Później wypreparuj i zabarw mózgi, stosując standardowe techniki. Aby zamontować mózgi much, nabierz do mikropipety medium montażowego i nanieś dwie krople o objętości 2 µL na środek szkiełka przedmiotowego w odstępach około 2 cm.Na każdą kroplę nałóż szkiełko nakrywkowe, pozostawiając szczelinę o szerokości około 0.2 mm. Następnie nanieś 15 µL medium montażowego na szkiełka nakrywkowe i do szczeliny. Korzystając z mikroskopu stereoskopowego, umieść mózg w szczelinie za pomocą mikropipety.Następnie należy ułożyć mózgi stroną brzuszną do góry. Na koniec należy przymocować szkiełko nakrywkowe i uszczelnić je wzdłuż krawędzi za pomocą bezbarwnego lakieru do paznokci. Mózgi można następnie obrazować przy użyciu standardowych technik w celu zrekonstruowania obrazów 3D.W tym przypadku luminescencja GFP jest dokumentowana w komórkach z aktywną ekspresją Brp przy użyciu metody star. W tym przykładzie aksony fotoreceptorów R7 i R8 zostały poddane immunoznakowaniu przeciwciałem anty-ciaoptyna, co obrazowano przy użyciu przeciwciał wtórnych znakowanych RFP. Aby określić liczbę, rozmieszczenie i poziom delokalizacji punktów Brp GFP, należy najpierw wczytać zrekonstruowane obrazy 3D mózgu utworzone ze stosów obrazów.Punkta Brp są wyświetlone na biało. Teraz należy wyznaczyć obszar zainteresowania. W tym przypadku zakończenia aksonu R8 lokalizuje się, śledząc zwężenie aksonów wykazujących pozytywną reakcję z anty-synaptotagminą w punkcie wejścia do warstwy M3 rdzenia.W każdym terminalu aksonalnym R8 należy zidentyfikować punkty Brp GFP za pomocą modułu detekcji punktów. Wybrać opcję dodaj nowe punkty, a następnie w ustawieniach algorytmu wybrać segmentuj tylko obszar zainteresowania. Po zdefiniowaniu obszaru analizy ustawić kanał źródłowy na Brp GFP, a następnie ustawić szacowaną średnicę XY na 0.35 micronów.Następnie zaznacz opcję odejmowania tła (background subtraction) w ustawieniach wykrywania plamek (spot detection). Dalej wybierz jako typ filtra jakość (quality), a punkta zostaną przefiltrowane automatycznie. Zakończ ten krok, klikając przycisk finish.Powtórz metodę detekcji punktów dla wszystkich aksonów R8 w zbiorze danych. Kolejnym regionem do zidentyfikowania jest cytoplazma aksonu. Najpierw wygeneruj obiekty powierzchniowe za pomocą funkcji surface.Następnie wybierz opcję dodawania nowych powierzchni, a w ustawieniach algorytmu zaznacz opcję segmentacji tylko obszaru zainteresowania. Teraz ręcznie zaznacz obszar zainteresowania. Następnie ustaw parametry obliczeń.Aby ustawić kanał fotoreceptorów jako źródło, wybierz opcję smooth. W przypadku progu (threshold) wybierz absolute intensity. Włącz opcję split touching objects.Ustaw średnicę punktów styku na 0,5 mikrona i zastosuj domyślne ustawienia filtra dla jakości oraz liczby wokseli. Filtr zostanie następnie zastosowany automatycznie. Teraz przejdź do edycji i usuń fragmenty powierzchni wygenerowane poza obszarem zainteresowania.W tym przypadku dotyczy to pozostałych aksonów. Po powtórzeniu detekcji obszaru aksonów dla wszystkich aksonów R8 w zbiorze danych, wszystkie punkta Brp oraz aksony R8 zostają zidentyfikowane jako zestaw obiektów punktowych. Odpowiadające im regiony cytoplazmatyczne zostają zidentyfikowane jako obiekty powierzchniowe.Następnie należy ręcznie zdefiniować orientację i przestrzeń każdego aksonu. Jest to istotne dla późniejszej kwantyfikacji gęstości Brp GFP wzdłuż każdego neuronu w neuropilu ciała grzybkowatego (medulla). Aby to zrobić, najpierw zdefiniuj punkty początkowe i końcowe.Wybierz opcję dodawania nowych punktów pomiarowych, następnie wybierz edytuj, a potem wybierz powierzchnię obiektu, aby pracować z górną częścią obiektów powierzchniowych. Aby zdefiniować punkty początkowe, umieść punkty pomiarowe na wszystkich obiektach powierzchniowych aksonów R w warstwie M1. Rozmieść te punkty w systematycznej, powtarzalnej kolejności.Następnie należy zdefiniować punkty końcowe. Wybierz opcję dodawania nowych punktów pomiarowych, edytuj i ponownie wybierz powierzchnię obiektu. Następnie, zachowując tę samą kolejność systematyczną, umieść punkty pomiarowe na spodzie aksonów R w warstwie M3.Aby określić intensywność tła Brp, należy przeanalizować regiony cytoplazmatyczne dwóch aksonów R7. Wybierz opcję dodawania nowych powierzchni i ręcznie zdefiniuj obszar aksonu R7 w taki sam sposób, jak zrobiono to dla aksonów R8. Użyj identycznych ustawień, z wyjątkiem opcji enable split touching objects, której nie należy włączać.Wyłączyć tę opcję. Następnie dodać obiekt pozornych punktów (dummy spots) wewnątrz zdefiniowanego obszaru aksonu R7. Wybrać opcję dodawania nowych punktów, wybrać pominięcie automatycznego tworzenia i przejść do edycji ręcznej.Następnie wybierz środek obiektu i kliknij na obiekt powierzchniowy, aby umieścić obiekt punktów pomocniczych (dummy spots) wewnątrz aksonu R7. Teraz powtórz etapy wykrywania powierzchni i punktów dla drugiego aksonu R7. Następnie zdefiniuj początkowe i końcowe punkty terminalne aksonów R7, analogicznie do tego, jak zrobiono to w przypadku aksonów R8.Przed przystąpieniem do analizy należy upewnić się, że zainstalowano odpowiednie oprogramowanie. Otwórz zestaw danych zawierający dane o plamkach (spot data), dane o powierzchniach (surfaces data) oraz dwa obiekty punktów pomiarowych, z których każdy zawiera tę samą liczbę punktów pomiarowych. Przejrzyj dane.Oba obiekty punktów pomiarowych muszą posiadać taką samą liczbę punktów pomiarowych, aby obliczenia przebiegły pomyślnie. Po zdefiniowaniu plamek, obszarów aksonów oraz punktów początkowego i końcowego, uruchom wtyczkę. Najpierw sprawdź metadane, w szczególności wielkość woksela.Otwórz właściwości obrazu z menu edycji, a następnie sprawdź 3 wymiary woksela oraz mikrony w sekcji współrzędnych w geometrii. Następnie wybierz kanał do analizy intensywności. W tym przypadku wybrano kanał pokazujący Brp GFP.Następnie określ nazwę pliku dla wyników. Dalej, ustaw liczbę koszy (bins) na 10 oraz długość aksonu na 100%. Następnie zdefiniuj obszary punktów (puncta), ustawiając promień plamki na 0,35 microns oraz otaczający obszar cytoplazmatyczny na 50 microns. Na koniec wykonaj polecenie detekcji synaps, a następnie przeprowadź analizę statystyczną otrzymanych wyników.Zgodnie z opisanymi protokołami, punkty Brp GFP analizowano w synapsach R8 much narażonych na stałą ciemność, stałe światło lub normalny cykl światło/ciemność. Liczba punktów Brp była znacząco zredukowana w fotoreceptorach R8 much utrzymywanych w stałym świetle. Rozkład punktów obliczono przy użyciu dedykowanego wtyku.Synapsy R8 były rozmieszczone wzdłuż całego trzonu aksonalnego od warstwy M1 do M3, jednak ich gęstość była wyższa w warstwach M1 i M3. Podobnie obliczono poziomy delokalizacji punktów. Pozostawały one niezmienne we wszystkich warunkach, jednak poziomy delokalizacji Brp GFP różniły się od innych reporterów, takich jak Brp-short-cherry, który ulega wyraźnej dyfuzji pod wpływem stałego światła.Możliwe jest wystąpienie nieprawidłowego przetwarzania krótkiego fragmentu Brp po rozmontowaniu z AZ. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat analizy właściwości plastyczności synaptycznej w pojedynczym neuronie. Właściwości plastyczne te obejmują liczbę synaps, ich rozmieszczenie oraz stopień wzbogacenia konkretnego komponentu molekularnego w synapsach.

analyzing-synaptic-modulation-drosophila-melanogaster-photoreceptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszej procedurze wykorzystano aktywowany niebieskim światłem kanał glonowy oraz narzędzia do specyficznej dla komórek ekspresji genetycznej w celu wywołania potencjałów synaptycznych za pomocą impulsów świetlnych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) u larw Drosophila. Technika ta stanowi niedrogą i łatwą w użyciu alternatywę dla stymulacji elektrodami ssącymi w badaniach nad fizjologią synaptyczną w laboratoriach badawczych i dydaktycznych.

Stymulacja potencjałów synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych Drosophila za pośrednictwem kanalorodopsyny 2

Ten film przedstawia protokół elektrofizjologicznego zapisu aktywności fotoreceptorów w oku unieruchomionej Drosophila, umożliwiając precyzyjny pomiar zmian napięcia w odpowiedzi na bodźce świetlne.

Elektrofizjologiczny zapis napięciowych odpowiedzi fotoreceptorów siatkówki Drosophila na bodźce świetlne

Ten film demonstruje eksperymentalny protokół badania przedłużonego depolaryzującego potencjału (PDA) u białookich Drosophila. Oko muchy jest wystawione na intensywne impulsy niebieskiego światła w celu przekształcenia fotopigmentu rodopsyny w metarodopsynę, inicjując kaskadę sygnalizacyjną, która otwiera kanały jonów dodatnich i powoduje depolaryzację błony. Ponieważ niebieskie światło zapobiega rekonwersji metarodopsyny do rodopsyny, ciągły napływ jonów dodatnich powoduje trwałą...

Badanie przedłużonego depolaryzacyjnego potencjału wtórnego (PDA) w fotoreceptorach Drosophila

Ten film pokazuje hodowlę Drosophila melanogaster w określonych warunkach oświetleniowych, aby zbadać rolę białek Bruchpilot w uwalnianiu neuroprzekaźników i wynikającej z tego modulacji aktywności synaptycznej.

Modulacja synaptyczna u Drosophila po ekspozycji na długotrwałe światło

Ten film demonstruje protokół badania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w połączeniach nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila wykazujących ekspresję rodopsyny kanałowej za pomocą barwnika fluorescencyjnego. Niebieskie światło aktywuje rodopsyny kanałowe, powodując napływ wapnia i egzocytozę pęcherzyków synaptycznych. Barwnik integruje się z błonami neuronalnymi i jest internalizowany podczas endocytozy, co powoduje zwiększoną fluorescencję. Dalsza stymulacja światłem niebieskim indukuje...

Analiza recyklingu pęcherzyków synaptycznych i wychwytu barwnika fluorescencyjnego przez larwy Drosophila

Tutaj opisujemy test preferencji jasno-ciemnej dla larw Drosophila. Test ten dostarcza informacji na temat wrodzonej i okołodobowej regulacji wykrywania światła i przetwarzania fotozachowania.

Test preferencji świetlnej w celu zbadania wrodzonego i okołodobowego regulowanego fotozachowania u larw Drosophila

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Ten protokół wprowadza test plamki świetlnej do zbadania fototaktycznego zachowania larw Drosophila. W tym teście plamka świetlna jest generowana jako stymulacja światłem, a proces unikania światła larwalnego jest rejestrowany przez system obrazowania oparty na świetle podczerwonym.

Test punktowy świetlny do analizy fototaksji larw Drosophila

Tutaj opisano nieinwazyjne metody lokalizacji białek błony fotoreceptorowej i oceny zwyrodnienia siatkówki w oku złożonym Drosophila za pomocą fluorescencji eGFP.

Badanie transportu białek błonowych w komórkach fotoreceptorowych Drosophila przy użyciu białek znakowanych eGFP

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

Poznaj metodę analizy plastyczności synaptycznej w fotoreceptorach Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło. Technika umożliwia półautomatyczną kwantyfikację stref aktywnych synaps i ich rozkładu przestrzennego.

Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło

Przeglądaj więcej filmów