Analiza modulacji synaptycznej fotoreceptorów Drosophila melanogaster po ekspozycji na przedłużone światło
10 lutego 2017
Tutaj pokazujemy, jak określić ilościowo liczbę i rozkład przestrzenny aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster, wyróżnionych genetycznie zakodowanym markerem molekularnym, oraz ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.
Ogólnym celem tej eksperymentalnej procedury jest zrozumienie dynamiki synaps w pojedynczym neuronie w różnych warunkach aktywacji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie plastyczności synaptycznej, takie jak ujawnienie zmian w składzie molekularnym synaps po dojrzewaniu aktywności neuronu. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na półautomatyczną analizę wielu aspektów synaps, w tym ich liczby, dystrybucji i poziomu wzbogacenia składników molekularnych po synapsach.
W tym eksperymencie zbierz muchy do normalnych fiolek w ciągu sześciu godzin od eklizacji. Załadować fiolki do pobierania próbek do przezroczystego stojaka akrylowego. W małym inkubatorze ustawionym na 25 stopni Celsjusza ustaw stojak w precyzyjnej odległości od panelu LED, w którym naświetlanie wynosi średnio 1000 luksów.
Następnie tył leci przez jeden do trzech dni w jednym z następujących warunków: albo stała ciemność, 12 godzin światła, a następnie 12 godzin ciemności, albo stałe światło. Później wypreparuj i zabarwij mózgi przy użyciu standardowych technik. Aby zamontować mózg muchy, załaduj mikropipetę z podłożem montażowym i umieść dwie krople o pojemności 2 mikrolitrów na środku szkiełka mikroskopowego w odległości około 2 cm od siebie.
Umieść szkiełko nakrywkowe na każdej kropli i odstęp między około 0,2 mm. Następnie nałóż 15 mikrolitrów podłoża montażowego na szkiełka pokrywy i do szczeliny. Pod mikroskopem preparacyjnym umieść mózg w szczelinie z mikropipety.
A następnie ustaw mózgi, brzuszną stroną do góry. Na koniec przymocuj szkiełko nakrywkowe i uszczelnij je wzdłuż krawędzi za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci. Mózgi można następnie zobrazować przy użyciu standardowych technik w celu odtworzenia obrazów 3D.
W tym przypadku luminescencja GFP jest udokumentowana w komórkach z aktywną ekspresją Brp przy użyciu metody gwiazdy. Również w tym przykładzie aksony fotoreceptorów R7 i R8 poddano immunolabilarni za pomocą antyciaoptyny, którą oglądano przy użyciu przeciwciał drugorzędowych znakowanych RFP. Aby określić ilościowo liczbę, rozkład i poziom delokalizacji Brp GFP puncta pierwsze obciążenie odtworzyło obrazy 3D mózgu wykonane ze stosów obrazów.
Brp puncta są wyświetlane w kolorze białym. Teraz znajdź interesujący Cię region. W tym przypadku zakończenia aksonu R8 są zlokalizowane poprzez podążanie za przerzedzeniem aksonów antyciaoptyny dodatniej w punkcie wejścia do warstwy rdzenia M3.
Na każdym terminalu aksonowym R8 zidentyfikuj punkt Brp GFP za pomocą modułu wykrywania punktowego. Wybierz opcję dodaj nowe miejsca, a następnie w ustawieniach algorytmu wybierz obszar zainteresowania tylko segment. Po zdefiniowaniu obszaru analizy ustaw kanał źródłowy na Brp GFP, a następnie ustaw szacowaną średnicę XY na 0,35 mikrona.
A następnie zaznacz odejmowanie tła w wykrywaniu punktowym. Następnie wybierz jakość jako typ filtra, a puncta zostaną automatycznie przefiltrowane. Wykonaj ten krok, klikając przycisk Zakończ.
Powtórz metodę wykrywania punktowego dla wszystkich aksonów R8 w zestawie danych. Następnym regionem do zidentyfikowania jest cytoplazma aksonów. Najpierw wygeneruj obiekty powierzchni z funkcją powierzchni.
Następnie wybierz opcję dodaj nowe powierzchnie, a następnie w ustawieniach algorytmu przełącz opcję Segment tylko obszar zainteresowania. Teraz ręcznie wybierz obszar zainteresowania. Następnie ustaw obwody obliczeń.
Aby znaleźć kanał fotoreceptora jako źródło, wybierz opcję gładką. Jako wartość progową wybierz intensywność bezwzględną. Włącz opcję podziel stykające się obiekty.
Ustaw średnicę punktów osadzenia na 0,5 mikrona i użyj domyślnych ustawień filtra dla jakości i liczby wokseli. Filtr jest następnie stosowany automatycznie. Teraz przejdź do edycji i usuń fragmenty powierzchni wygenerowane poza obszarem zainteresowania.
W tym przypadku pozostałe aksony. Po powtórzeniu wykrywania regionu aksonu dla wszystkich aksonów R8 w zestawie danych, wszystkie aksony Brp puncta i R8 są identyfikowane jako zestaw obiektów punktowych. A odpowiednie obszary cytoplazmatyczne są identyfikowane jako obiekty powierzchniowe.
Teraz kontynuuj, ręcznie definiując orientację i przestrzeń każdego aksonu. Jest to ważne dla późniejszej oceny ilościowej gęstości Brp GFP wzdłuż każdego neuronu w rdzeniu neuropil. Aby to zrobić, najpierw zdefiniuj ich punkty początkowe i końcowe.
Wybierz opcję dodaj nowe punkty pomiaru, a następnie wybierz opcję edycji, a następnie wybierz powierzchnię obiektu, aby pracować z górną częścią obiektów powierzchni. Aby zdefiniować punkty początkowe, umieść punkty pomiarowe na wszystkich obiektach powierzchniowych aksonów R w warstwie M1. Umieść te punkty w systematycznej, powtarzalnej kolejności.
Następnie zdefiniuj punkty końcowe. Wybierz dodaj nowe punkty pomiaru, edytuj i ponownie powierzchnię obiektu. Następnie, powtarzając tę samą systematyczną kolejność, umieść punkty pomiarowe na spodzie aksonów R w warstwie M3.
Aby określić ilościowo intensywność tła Brp, przeanalizuj regiony cytoplazmatyczne dwóch aksonów R7. Wybierz opcję dodaj nowe powierzchnie i ręcznie zdefiniuj obszar aksonu R7, tak jak to zostało zrobione dla aksonów R8. Użyj identycznych ustawień, z wyjątkiem tego, że nie włączaj opcji włącz podzielone dotykające się obiekty.
Zostaw to. Następnie dodaj fikcyjny obiekt plam wewnątrz zdefiniowanego regionu aksonu R7. Wybierz pozycję dodaj nowe miejsca, a następnie wybierz opcję Pomiń automatyczne tworzenie i edytuj ręcznie.
Następnie wybierz środek obiektu i kliknij obiekt powierzchni, aby umieścić fikcyjny obiekt punktowy wewnątrz aksonu R7. Teraz powtórz kroki wykrywania powierzchni i miejsca dla drugiego aksonu R7. A następnie zdefiniuj początkowe i końcowe punkty końcowe aksonów R7, tak jak to ma miejsce w przypadku aksonów R8.
Na potrzeby tej analizy upewnij się, że masz zainstalowane odpowiednie oprogramowanie. Otwórz zestaw danych zawierający dane punktowe, dane powierzchni i dwa obiekty punktów pomiarowych, z których każdy zawiera taką samą liczbę punktów pomiarowych. Sprawdź dane.
Aby obliczenia działały, oba obiekty punktów pomiarowych muszą mieć taką samą liczbę punktów pomiarowych. Po zdefiniowaniu miejsc, regionów aksonów oraz punktów początkowych i końcowych uruchom wtyczkę. Najpierw sprawdź metadane, w szczególności rozmiar woksela.
Otwórz właściwości obrazu z edycji, a następnie sprawdź 3 wymiary woksela i mikronów w obszarze współrzędne w geometrii. Następnie wybierz kanał do analizy intensywności. W takim przypadku wybrany jest kanał pokazujący Brp GFP.
Następnie zdefiniuj nazwę pliku dla wyników. Następnie zdefiniuj liczbę pojemników jako 10 i ustaw długość aksonu na 100%Następnie zdefiniuj regiony puncta, ustawiając promień plamki na 0,35 mikrona, a otaczający region cytoplazmatyczny na 50 mikronów. Na koniec wykonaj polecenie wykrywania synapsy, a później przeanalizuj statystycznie dane wyjściowe.
Zgodnie z opisanymi protokołami, Brp GFP puncta analizowano w synapsach R8 much wystawionych na ciągłą ciemność, stałe światło lub normalny cykl światło/ciemność. Liczba Brp puncta była istotnie zmniejszona w fotoreceptorach R8 muszek trzymanych w stałym świetle. Dystrybucja puncta została obliczona za pomocą niestandardowej wtyczki.
Synapsy R8 były rozmieszczone wzdłuż całego trzonu aksonalnego od warstwy M1 do warstwy M3, ale ich gęstość była wyższa w warstwach M1 i M3. Podobnie obliczono poziomy delokalizacji puncta. Były one niezmienione we wszystkich warunkach, jednak poziomy delokalizacji Brp GFP różniły się od innych reporterów, takich jak Brp-short-cherry, który staje się wyraźnie rozbrojony w ciągłym świetle.
Możliwe, że po demontażu z AZ dochodzi do niewłaściwej obróbki krótkiego fragmentu Brp. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować właściwości plastyczne synaps w pojedynczym neuronie. Takie plastyczne właściwości obejmują liczbę synaps, ich rozmieszczenie i etykietę wzbogacenia określonego składnika molekularnego po synapsach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia metodę ilościowego określenia liczby i rozmieszczenia przestrzennego aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach Drosophila melanogaster. Technika ta wykorzystuje genetycznie zakodowany marker molekularny do wizualizacji synaps oraz bada ich modulację po długotrwałej ekspozycji na światło.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- plastyczność synaptyczna
- biologia komórki
Wstęp
- Zrozumienie dynamiki synaptycznej ma kluczowe znaczenie dla poznania funkcji neuronów.
- Zmiany w składzie synaps mogą następować wraz z dojrzewaniem aktywności neuronalnej.
- Kwantyfikacja cech synaptycznych wspomaga badanie plastyczności synaptycznej.
- Drosophila melanogaster służy jako organizm modelowy w tego typu badaniach.
Cel badania
- Ilościowe określenie aktywnych stref synaptycznych w fotoreceptorach.
- Analiza wpływu ekspozycji na światło na modulację synaptyczną.
- Pogłębienie wiedzy na temat dynamiki synaptycznej w neuronach.
Zastosowane metody
- Zbieranie much Drosophila melanogaster krótko po wykluciu.
- Wykorzystanie przezroczystych akrylowych regałów do utrzymywania much.
- Kontrolowana ekspozycja na światło z użyciem panelu LED ustawionego na 1000 lux.
- Półautomatyczna analiza cech synaptycznych.
Główne wyniki
- Pomyślnie przeprowadzono kwantyfikację aktywnych stref synaptycznych.
- Skutecznie zmapowano rozkład przestrzenny synaps.
- Zaobserwowano modulację cech synaptycznych pod wpływem ekspozycji na światło.
- Metoda ta umożliwia kompleksową analizę dynamiki synaptycznej.
Wnioski
- Technika ta dostarcza cennych informacji na temat plastyczności synaptycznej.
- Zrozumienie zmian synaptycznych może wesprzeć szersze badania z zakresu neuronauki.
- Metodę tę można zastosować w innych badaniach neuronów u Drosophila.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Metoda ta umożliwia ilościową ocenę plastyczności synaptycznej w genetycznie dostępnym modelu, co wspiera walidację celów w procesie odkrywania leków w neuronauce. Poprzez pomiar przebudowy stref aktywnych w odpowiedzi na bodźce środowiskowe, dostarcza ona wglądu w mechanizmy szlaków adaptacji neuronalnej. Podejście to pomaga w ograniczaniu ryzyka związanego z celami terapeutycznymi zaangażowanymi w funkcję synaptyczną i przetwarzanie sensoryczne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących dynamiki białek synaptycznych w neuronach fotoreceptorowych.
- Wartość operacyjna: Wyjaśnia zmiany w składzie molekularnym czynnych stref presynaptycznych w określonych warunkach stymulacji.
- Wartość prognostyczna: Wspiera biologiczną minimalizację ryzyka w odniesieniu do celów zaangażowanych w zależną od aktywności przebudowę synaptyczną.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość analizy: Przygotowanie zwalidowanych układów biologicznych do późniejszego screeningu związków w programach dotyczących neurodegeneracji.
- Wyniki ilościowe: Umożliwienie standaryzowanego pomiaru liczby, rozkładu oraz delokalizacji punktów synaptycznych.
- Użyteczność platformy: Ułatwienie powtarzalnej oceny związków dzięki półautomatycznym przepływom pracy w analizie obrazu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Modeluje zależne od aktywności zmiany synaptyczne istotne dla zaburzeń przetwarzania sensorycznego.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki badań podstawowych z przedkliniczną walidacją modulatorów synaptycznych.
- Decyzje skorygowane o ryzyko: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o mierzalne wskaźniki funkcjonalne synaps.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w wczesne etapy procesów odkrywania leków, wspierając testowanie hipotez oraz identyfikację związków wiodących za pomocą mierzalnych fenotypów synaptycznych.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez dotyczących transportu białek synaptycznych i stabilności strefy aktywnej.
- Przesiewanie: Dostarczanie gotowych do analizy wyników dotyczących gęstości synaptycznej i organizacji przestrzennej.
- Analityka: Generowanie danych o rozkładzie przestrzennym wzdłuż aksonów w celu porównania różnych warunków.
- Badania translacyjne: Łączenie strukturalnych zmian synaptycznych z efektami funkcjonalnymi w obwodach neuronalnych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzenie powtarzalnej platformy do badania plastyczności synaptycznej w różnych podtypach neuronów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w funkcji synaptycznej.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność fenotypowania synaptycznego w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez kwantyfikację efektów zaangażowania celu w strukturę synaptyczną.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków modulujących szlaki synaptyczne z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu genetyki Drosophila, neuroanatomii i mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależność od systemów obrazowania konfokalnego oraz oprogramowania do detekcji punktów w celu analizy puncta.
- Konieczność standaryzacji śledzenia aksonów i definicji obszarów zainteresowania (ROI) pomiędzy użytkownikami.
- Wymaga rozważenia modyfikacji przy zastosowaniu w innych typach neuronów lub modelach chorób.
- Ograniczenie wynikające z konieczności genetycznego znakowania komponentów synaptycznych oraz etapów ręcznego śledzenia aksonów.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Title
0:47
Treatment of Flies and Imaging Brains
2:54
Image Analysis: Generating the Spots, Surface Objects, Start-points, and End-points
8:04
Image Analysis: Calculating the Number of Spots, Distribution of Spot Frequency and Enrichment Level of Brp-GFP
9:48
Results: Brp-GFP Expression in R8 Synapses of the Medulla
11:02
Conclusion
