Name: Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Poznaj zoptymalizowane metody analizy stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro. Techniki te umożliwiają nieinwazyjną ocenę postępu choroby metabolicznej oraz badanie mechanizmów lipidów i glukozy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Feifei Zhang za pomocne dyskusje. Jesteśmy wdzięczni Jing Gao i Yixuan Sun za pomoc techniczną oraz Zhengshuai Liu i Fengguang Ma za badania na zwierzętach.

Wszystkie protokoły eksperymentalne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez instytucjonalny komitet ds. opieki i użytkowania zwierząt w Instytucie Nauk o Żywieniu, Szanghajskim Instytucie Nauk Biologicznych, Chińskiej Akademii Nauk (Szanghaj, Chiny).
1. Model myszy DIO
<ol>
	<li>Karmienie HFHS
	<ol>
		<li>Nakarm ośmiotygodniowego samca myszy C57BL/6 HFHS, który zawiera 40 kcal% tłuszczu i 40 kcal% sacharozy. Umieść je w 12-godzinnym cyklu ciemnego światła.</li>
		<li>Utrzymuj myszy w stanie odżywiania HFHS przez cztery do szesnastu tygodni. Sprawdzaj masę ciała co tydzień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza składu ciała i analiza obrazu pseudo-kolorowego
	<ol>
		<li>Poddaj myszy analizie analizatora składu ciała.
		<ol>
			<li>Zabezpiecz przytomne, nie znieczulone myszy w plastikowej tubie w. Zmierz masę tkanki tłuszczowej, beztłuszczową masę i płyny za pomocą systemu NMR, jak opisano wcześniej2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zeskanuj całe ciało każdej myszy za pomocą systemu MRI.
		<ol>
			<li>Znieczulić myszy 1% awertyną za pomocą wstrzyknięcia dootrzewnowego (25 μL/g) i przeprowadzić analizę obrazową w specjalistycznych szklanych rurkach. 
			UWAGA: Proces obrazowania trwa blisko 0,5 godziny dla każdej myszy. Po zakończeniu pomiaru włóż myszy z powrotem do klatki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Skanuj całe ciała myszy w warstwie grzbietowej, środkowej i brzusznej; skanuj wątrobę w kierunku pionowym. Użyj magnesu 0,55 T i następujących parametrów instrumentalnych: przestrzeń K = 192 x 256 μm, grubość przekroju = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm i liczba skanów = 8. Skanuj przy użyciu tych samych warunków magnetycznych dla wszystkich grup myszy.</li>
		<li>Odwzoruj obraz w skali szarości na obraz pseudokolorowy zgodnie z intensywnością sygnału9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Eutanazja myszy
	<ol>
		<li>Sterylizuj narzędzia preparacyjne, takie jak kleszcze i nożyczki.</li>
		<li>Wlej wystarczającą ilość izofluranu na ręcznik papierowy i pozwól izofluranowi ulatniać się w szklanym słoiku. Upewnij się, że myszy są uśpione za pomocą izofluranu.</li>
		<li>Zamocuj myszy na stole operacyjnym. Spryskaj każdy brzuch 75% etanolem, wykonaj nacięcie w skórze właściwej wyrostka mieczykowatego za pomocą nożyczek i rozerwij skórę właściwą wzdłuż linii środkowej rękami, aby odsłonić otrzewną.</li>
		<li>Zacisnąć wyrostek mieczykowaty za pomocą kleszczy i przeciąć otrzewną wzdłuż dna żeber, aby odsłonić wnętrzności.</li>
		<li>Zebrać krew w probówkach pokrytych EDTA przez nakłucie serca.</li>
		<li>Przetnij przeponę wzdłuż wątroby i ostrożnie usuń wątrobę z enterocelii za pomocą cienkich nożyczek. Wytnij trzy kawałki tkanki wątroby do następujących pomiarów lipidów: a) 6 x 3 x 3 mm do barwienia H&E, b) 6 x 3 x 3 mm do barwienia czerwienią olejową O i c) 20-40 mg wątroby do ekstrakcji chloroformem/metanolem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie H&E
	<ol>
		<li>Utrwalić wątrobę w 4% buforowanym fosforanem octanie formaliny w temperaturze 4 °C przez noc, a następnie zanurzyć ją w wosku parafinowym.</li>
		<li>Wytnij skrawki parafiny (5 μm) i zamontuj je na szkiełkach do barwienia H&E, jak opisano wcześniej3,10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie czerwienią olejową O
	<ol>
		<li>Przygotowanie Regenta
		<ol>
			<li>Przygotuj roztwór roboczy Oil Red O z 10% formaliną, 60% izopropanolem, hematoksyliną i galaretką glicerolową. Rozpuścić 0,5 g proszku Oil Red O w 100 ml izopropanolu i podgrzać w łaźni o temperaturze 60 °C, aby uzyskać 0,5% roztwór podstawowy.</li>
			<li>Rozcieńczyć wodą podwójnie destylowaną (ddH2O) w stosunku 3:2 (3 ml roztworu podstawowego i 2 ml ddH2O). Przefiltrować roztwór roboczy i odstawić na co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Osadź wątrobę w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) w plastikowym pudełku do zatapiania. Zamrażać w temperaturze -20 °C przez 30 min. Pokrój ją na odcinki o grubości 8 μm w zamrażającym mikrotomie, zamontuj chusteczkę na szkiełku podstawowym i umieść w temperaturze pokojowej na 30 minut.</li>
		<li>Umieść ręcznik papierowy na dnie wanny do barwienia i wlej niewielką ilość 10% formaliny, aby zwilżyć ręcznik papierowy. Umieścić szkiełko w pojemniku do barwienia i utrwalić zamrożone fragmenty w oparach formaldehydu na 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zanurz szkiełko w 60% izopropanolu w wannie barwiącej na 3 sekundy; powtórz raz.</li>
		<li>Dodać kilka kropli roztworu roboczego Oil Red O do szkiełka, aby pokryć całą tkankę i inkubować przez 15 minut. Chronić tkankę przed światłem w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Płucz szkiełko w nowym 60% izopropanolu w wannie barwiącej przez 3 sekundy; powtórz dwukrotnie.</li>
		<li>Delikatnie przepłucz szkiełko dwukrotnie w wodzie destylowanej i usuń wodę z tkanki. Pamiętaj, aby nie wysuszyć chusteczki.</li>
		<li>Umieść szkiełko w Hematoxylin na 1 minutę i delikatnie spłukuj wodą z kranu przez 5-10 minut. Delikatnie opłucz szkiełko dwukrotnie w wodzie destylowanej i trzymaj je w wodzie destylowanej, aż będzie gotowe do nałożenia na szkiełko nakrywkowe.</li>
		<li>Podgrzej galaretkę glicerolową w kuchence mikrofalowej i umieść kilka kropli na chusteczce. Delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na wierzchu i uważaj, aby nie tworzyły się bąbelki.</li>
		<li>Obserwuj plamę pod mikroskopem i uchwyć charakterystyczne obrazy za pomocą obiektywów 20X i 40X.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar lipidów w wątrobie
	<ol>
		<li>Umieść wypreparowaną tkankę wątroby w nowej plastikowej probówce wirówkowej o pojemności 2 ml. Homogenizować w 1 ml PBS za pomocą homogenizatora i przenieść lizat do nowej szklanej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Dodać 5 ml roztworu chloroformu/metanolu (2:1, v/v), energicznie mieszać mieszaninę przez 1 minutę i odstawić na 2 godziny na lód.</li>
		<li>Wirować przy 1,650 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C; mieszanina powinna zostać podzielona na 3 warstwy: górną warstwę metanolu, środkową warstwę białka i dolną warstwę chloroformu i lipidów.</li>
		<li>Przenieść dolną fazę do nowej szklanej rurki za pomocą szklanej pipety Pasteura; nie ma potrzeby pobierania każdej kropli dolnej frakcji. Odłóż rurkę na bok na lodzie.</li>
		<li>Dodać 600 μl 4 mM MgCl2 i 1,5 ml chloroformu do frakcji sklarowanej nad osadem pozostawionej w poprzedniej probówce i energicznie wirować. Inkubować na lodzie przez 30 minut i odwirowywać przy 1,650 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Połączyć dolną fazę z pierwszą rurką dolnej fazy za pomocą pipety Pasteura. Odrzuć górną i środkową warstwę.</li>
		<li>Odparować chloroform w gazowym azocie w łaźni o temperaturze 37 °C. Dokładnie umyć boki szklanych probówek 200 μl 1% Triton X-100/chloroform (v/v). Odparować w gazowym azocie. Rozpuść lipid w 200 μl ddH2O i dobrze odwiruj, aby uzyskać ostateczną emulsję.</li>
		<li>Zmierz całkowity poziom trójglicerydów (TG) i cholesterolu (TC) za pomocą zestawu do pomiaru trójglicerydów lub cholesterolu zgodnie z protokołem producenta3. 
		UWAGA: Wartości lipidów są znormalizowane do stężeń białka w początkowym homogenacie, zgodnie z określeniem ilościowym białka3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pierwotny model hepatocytów myszy
<ol>
	<li>Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy
	<ol>
		<li>Znieczulij każdą mysz 6% hydratem chloralu (10 μl/g dootrzewnowo).</li>
		<li>Wyizoluj pierwotne hepatocyty, jak opisano wcześniej10. Hoduj komórki na szkiełkach nakrywkowych pokrytych kolagenem w 6-dołkowej płytce do barwienia czerwienią olejową O. W celu ekstrakcji lipidów umieść komórki na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Leczenie komórkowe i barwienie czerwienią olejową O
	<ol>
		<li>Zastąp pożywkę 2 ml pożywki głodowej i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Potraktuj ją 30 mM glukozy i 100 nM insuliny. Inkubować w inkubatorze hodowli w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.</li>
		<li>Zassać pożywkę. Dodaj 2 ml PBS i delikatnie zamieszaj, aby spłukać pożywkę; Powtórz raz.</li>
		<li>Przymocuj szkiełko nakrywkowe do szkiełka za pomocą gumki. Odsłoń komórki przylegające do powierzchni zewnętrznej. Wykonaj barwienie czerwienią olejową O, jak opisano powyżej (krok 1.5). 
		UWAGA: Podstawowe poziomy akumulacji lipidów są stymulowane przez leczenie wysokim poziomem glukozy i insuliną po głodzeniu surowicy. Krople lipidów są wizualizowane przez barwienie czerwienią olejową O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar lipidów
	<ol>
		<li>Leczyć hepatocyty wysokim poziomem glukozy i insuliną w tym samym stanie (krok 2.2.1). Dodaj 1 ml PBS do każdego 10-centymetrowego naczynia do hodowli komórkowych. Zeskrobać komórki i zebrać je do nowych szklanych probówek o pojemności 15 ml, z których porcje 100 μl przenosi się do świeżych probówek o pojemności 1,5 ml w celu ilościowego określenia białka.</li>
		<li>Dodać 4 ml chloroformu/metanolu (2:1, v/v) do pozostałych 900 μl komórek. Sonikuj przez około 20 sygnałów dźwiękowych, a następnie energicznie wiruj, aby uwolnić lipid w komórkach. Inkubować mieszaninę na lodzie przez 2 godziny. Wykonaj ekstrakcję lipidów (krok 1.6).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Angulo, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11961152">Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease.</a> New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+ATF6+Increases+Fatty+Acid+Oxidation+to+Attenuate+Hepatic+Steatosis+in+Mice+through+Peroxisome+Proliferator-Activated+Receptor+Alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha.</a> Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPK+phosphorylates+and+inhibits+SREBP+activity+to+attenuate+hepatic+steatosis+and+atherosclerosis+in+diet-induced+insulin-resistant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice.</a> Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+SIRT1+attenuates+hepatic+steatosis+and+controls+energy+balance+in+mice+by+inducing+fibroblast+growth+factor+21%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21.</a> Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).</li>
<li>Esau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-122+regulation+of+lipid+metabolism+revealed+by+in+vivo+antisense+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting.</a> Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).</li>
<li>Kanda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCP-1+contributes+to+macrophage+infiltration+into+adipose+tissue%2C+insulin+resistance%2C+and+hepatic+steatosis+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity.</a> Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).</li>
<li>Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fatty+liver+disease%3A+old+questions+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human fatty liver disease: old questions and new insights.</a> Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).</li>
<li>Hebbard, L., George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+inhibition+of+lung+cancer+growth+and+metastasis+by+systemic+delivery+of+siRNA+via+multimodal+mesoporous+silica-based+nanocarrier%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier.</a> Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).</li>
<li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+21+improves+hepatic+insulin+sensitivity+by+inhibiting+mammalian+target+of+rapamycin+complex+1+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice.</a> Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).</li>
<li>Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23507799">Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Finansowanie: Praca ta była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81270930, 31471129 i 31671224) oraz Programu Stu Talentów Chińskiej Akademii Nauk (2013OHTP04) dla Y.L.

NAFLD to szereg postępujących chorób wątroby, które są związane z zespołem metabolicznym, otyłością, insulinoopornością lub cukrzycą typu 2 (T2DM)11. Cechą charakterystyczną NAFLD jest stłuszczenie, czyli nagromadzenie lipidów w hepatocytach. W tym miejscu przedstawiono spektrum metod charakteryzujących fenotypy i parametry stłuszczenia wątroby przy użyciu myszy DIO i pierwotnych hepatocytów myszy. Procedura ta może być pomocna w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych NAFLD i innych powiązanych cho...

Otyłość jest rosnącym problemem zdrowotnym w krajach rozwiniętych i rozwijających się. Doniesiono, że jest to jeden ze współistniejących stanów często związanych z niealkoholową stłuszczeniową chorobą wątroby (NAFLD), z częstością występowania od 30 do 100 procent u pacjentów z NAFLD1. Ze względu na silną korelację między stłuszczeniem wątroby a otyłością, modele myszy otyłości wywołanej dietą (DIO) są szeroko stosowane do badania złożonych mechanizmów molekularnych związanych z rozwojem NAFLD2,3,4,5,6. Stłuszczenie wątroby jest najwcześniejszym stadium NAFLD i może przekształcić się w niealkoholowe stłuszczeniowe zapalenie wątroby (NASH), marskość wątroby i ostatecznie raka wątroby7. Dlatego ogólnym celem tej metody jest wygenerowanie zwierzęcych i komórkowych modeli stłuszczeniowych wątroby oraz dostarczenie szczegółowych protokołów do wydajnego i dokładnego pomiaru lipidów. Te modele i pomiary są również przydatne do badania innych zaburzeń metabolicznych, takich jak insulinooporność i cukrzyca typu 2.
Ponieważ otyłość jest uznawana za jeden z kluczowych czynników ryzyka NAFLD, do wywoływania otyłości u myszy stosuje się dietę wysokotłuszczową o wysokiej zawartości sacharozy (HFHS), która naśladuje dietę wysokotłuszczową w stylu zachodnim. Następnie stopień stłuszczenia wątroby można ocenić różnymi metodami. Po pierwsze, analiza masy ciała i składu ciała za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) pokazuje akumulację lipidów w czasie karmienia. Masę tłuszczową i beztłuszczową masę można określić ilościowo w sposób nieinwazyjny i w czasie rzeczywistym.
Ponadto, rezonans magnetyczny (MRI) jest używany do pokazania zarówno rozkładu tłuszczu w całym ciele, jak i w wątrobie. Sygnał skali szarości analizy MRI można przekształcić w czytelny pseudokolorowy obraz, a intensywność skali szarości i koloru jest półkwantyfikowalna. Technologia ta zapewnia wyjątkowe korzyści w zakresie pomiaru akumulacji lipidów u żywych zwierząt. Po drugie, analiza histologiczna wątroby jest najczęściej stosowaną metodą określania stłuszczenia wątroby. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) dostarcza informacji histologicznych, takich jak morfologia hepatocytów i infiltracja makrofagów, podczas gdy barwienie czerwienią olejową O pokazuje wielkość i położenie kropelek lipidów w hepatocytach. Po trzecie, analiza zawartości lipidów za pomocą ekstrakcji chloroformem/metanolem jest dokładnym i ilościowym pomiarem lipidów wątrobowych. Całkowity poziom trójglicerydów i cholesterolu można zmierzyć metodami biochemicznymi. Co ważne, analiza ekstrakcji lipidów i barwienie czerwienią olejową O mogą być również stosowane w hepatocytach modyfikowanych genetycznie lub leczonych farmakologicznie.
Zaletą obecnej metody jest wykorzystanie wielu zoptymalizowanych podejść do generowania modeli stłuszczeniowych wątroby i kompleksowego charakteryzowania fenotypów zarówno in vivo, jak i in vitro. Mysie modele DIO mogą podsumować patologię i fenotypy metaboliczne ludzkiej stłuszczeniowej choroby wątroby. Inne parametry metaboliczne u ludzi również mogą być replikowane w tym modelu8. Generowanie stłuszczeniowego modelu hepatocytów w odpowiedzi na wysoki poziom glukozy i insuliny jest wydajne, użyteczne i przezwycięża ograniczenia związane z kosztowną i czasochłonną pracą myszy. Podsumowując, metody te są wystarczające i niezbędne do badania dysfunkcji lipidów w wątrobie i insulinooporności podczas przeciążenia składnikami odżywczymi.

<table><tbody><tr><td>Związek O.C.T</td><td>SAKURA</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Olej czerwony O</td><td>Sigma</td><td>O0625-25G</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw trójglicerydów nieskończoności</td><td>Fisher&nbsp; Zestaw</td><td>do pomiaru cholesterolu Infinity TR22421</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher&nbsp; Scientific</td><td>TR13421</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu I, ogon szczura</td><td>Milipor</td><td>08-115</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (niski poziom glukozy)</td><td>Invitrogen</td><td>11885-092</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cellgro</td><td>R21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>cellgro</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>TOCRIS Bioscience</td><td>3435</td><td>rozpuszcza się w PBS, 1 mM dla zapasu</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mikroskop Olympus</td><td>BX53</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Longerpump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>10 cm naczynie do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>420167</td><td></td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa</td><td>Test BCA Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny rezonans jądrowy</td><td>Technologia Niumag</td><td>MiniQMR23-060H-I</td><td></td></tr><tr><td>Dieta wysokotłuszczowa i surcosowa (HFHS)</td><td>Diety badawcze</td><td>D12327</td><td></td></tr></tbody></table>

zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Ustanowienie systemu procedur do jakościowego i ilościowego charakteryzowania stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro jest ważne dla badań metabolicznych w wątrobie. W tym miejscu opisano liczne testy w celu kompleksowego pomiaru fenotypu i parametrów stłuszczenia wątroby w modelach mysich i hepatocytów. 
Łącząc metody fizjologiczne, histologiczne i biochemiczne, system ten może być używany do oceny postępu stłuszczenia wątroby. In vivo pomiary masy ciała i magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) zapewniają ogólne zrozumienie myszy w sposób nieinwazyjny. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz czerwoną czerwienią olejową określa morfologię histologiczną i odkładanie się lipidów w tkance wątroby w warunkach przeciążenia składnikami odżywczymi, takich jak karmienie dietą wysokotłuszczową. Następnie całkowita zawartość lipidów jest izolowana przez ekstrakcję chloroformem/metanolem, po której następuje analiza biochemiczna pod kątem trójglicerydów i cholesterolu. Co więcej, pierwotne hepatocyty myszy są traktowane wysokim poziomem glukozy i insuliny w celu stymulacji akumulacji lipidów, co jest skutecznym modelem in vitro do naśladowania hiperglikemii i hiperinsulinemii wywołanej dietą in vivo. Następnie osadzanie lipidów mierzy się za pomocą barwienia czerwienią olejową O i ekstrakcji chloroformem/metanolem. Barwienie czerwienią olejową O określa intuicyjne fenotypy stłuszczeniowe wątroby, podczas gdy analiza ekstrakcji lipidów określa parametry, które można analizować statystycznie. Obecne protokoły są interesujące dla naukowców zajmujących się stłuszczeniem wątroby, insulinoopornością i cukrzycą typu 2.

Jak pokazano na Rysunku 1A, masa ciała myszy wzrosła do 45±1.2 g po 16 tygodniach żywienia dietą HFHS, co stanowi wartość około 1,5-krotnie wyższą niż w grupie karmionej standardową karmą. Analizy składu ciała metodą NMR, obrazujące masę tłuszczową i beztłuszczową myszy, przedstawiono na Rysunku 1B. Rozkład tkanki tłuszczowej w całym organizmie oraz w wątrobie określono za pomocą MRI; reprezentatywne obrazy w pseudokolorach uzyskane u żywych, świadomych m...

Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przedstawienie zoptymalizowanej metody generowania i charakteryzacji stłuszczenia wątroby z wykorzystaniem podejść in vivo i in vitro. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach mechanistycznych nad dereplikacją metabolizmu lipidów i glukozy w wątrobie podczas przeładowania składnikami odżywczymi i otyłości. Jedną z zalet tych technik jest możliwość nieinwazyjnej oceny postępu fizjologicznego stłuszczenia wątroby przed przeprowadzeniem analiz histologicznych i biochemicznych.Metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat stłuszczenia wątroby. Można ją również zastosować w przypadku innych chorób metabolicznych, takich jak insulinooporność, cukrzyca typu II oraz otyłość. Procedurę zaprezentują Zhimin, Yamei i Aoyuan.Wszyscy oni są studentami studiów doktoranckich z mojego laboratorium, którzy zajmują się regulacją transkrypcyjną metabolizmu lipidów i glukozy. Po znieczuleniu myszy dawcy, pobierz próbkę krwi poprzez punkcję serca i zbierz krew do probówki z EDTA. Aby usunąć wątrobę, przetnij przeponę wzdłuż jej długości i ostrożnie oddziel organ od okolic jelit.Z wątroby przygotuj dwa bloki tkankowe do barwienia H&amp;E oraz barwi

optimized-analysis-of-in-vivo-and-in-vitro-hepatic-steatosis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W tym filmie demonstrujemy barwienie in vitro neutralnych lipidów w hepatocytach w celu wykrycia stłuszczenia wątroby lub nadmiernego gromadzenia tłuszczu w wątrobie. Nadmiar tłuszczu gromadzi się w komórkach w postaci kropelek lipidów. Olej Red O jest rozpuszczalnym w tłuszczach barwnikiem, który wiąże się z wewnątrzkomórkowymi obojętnymi lipidami w tych kropelkach lipidów. Obserwowane pod mikroskopem świetlnym te wewnątrzkomórkowe kropelki lipidów wydają się intensywnie czerwone.

Barwienie czerwienią olejową O: technika barwienia obojętnych lipidów w hepatocytach w celu wykrycia stłuszczenia wątroby in vitro

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Niniejszy raport opisuje test enzymatyczny in vitro do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy przy użyciu ekstraktów z komórek Leishmania. Test ten opiera się na przeniesieniu radioaktywnej grupy metylowej z S-[metylo-3] H]adenozylo-L-metioniny do endogennej fosfatydyloetanoloaminy.

In vitro Test do pomiaru aktywności metylotransferazy fosfatydyloetanoloaminy

W tym badaniu opisujemy szczegółowy protokół indukowania stłuszczenia pęcherzyków wątroby w zróżnicowanych komórkach HepaRG za pomocą soli kwasu tłuszczowego oleinianu sodu i stosujemy metody wykrywania i kwantyfikacji akumulacji lipidów, w tym koherentną mikroskopię rozpraszania Ramanowskiego (CARS), analizę cytofluorymetryczną, barwienie czerwienią olejową O i qPCR.

Indukowanie i charakterystyka stłuszczenia pęcherzykowego w zróżnicowanych komórkach HepaRG

Ten protokół ma być narzędziem do badania stłuszczenia i molekularnych, biochemicznych, komórkowych zmian spowodowanych nadmierną ekspozycją hepatocytów na lipidy in vitro.

Model eksperymentalnego stłuszczenia in vitro: hodowla komórek hepatocytów w pożywce kondycjonowanej przeciążeniem lipidów

Utlenianie β kwasów tłuszczowych jest niezbędnym szlakiem metabolicznym odpowiedzialnym za wytwarzanie energii w wielu różnych typach komórek, w tym w hepatocytach. W tym miejscu opisujemy metodę pomiaru β-oksydacji kwasów tłuszczowych w świeżo wyizolowanych hepatocytach pierwotnych przy użyciu 14znakowanych C kwasów palmitynowych.

Pomiar β-oksydacji kwasów tłuszczowych w zawiesinie świeżo wyizolowanych hepatocytów myszy

Korzystając z mysiego modelu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD) wywołanego dietą, opisujemy użycie nowatorskich technik obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo jako nieinwazyjnej metody oceny etapów progresji NAFLD, koncentrując się głównie na sieci naczyniowej wątroby ze względu na jej znaczący udział w dysregulacji wątroby związanej z NAFLD.

Nowatorskie techniki obrazowania mikrotomografii komputerowej in vivo do oceny postępu niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowany protokół oparty na fluorescencji BODIPY 493/503 do charakterystyki kropelek lipidów w tkance wątroby. Dzięki zastosowaniu projekcji ortogonalnych i rekonstrukcji 3D, fluorofor pozwala na skuteczne rozróżnienie stłuszczenia mikropęcherzykowego i makropęcherzykowego i może stanowić podejście uzupełniające do klasycznych protokołów histologicznych do oceny stłuszczenia wątroby.

Analiza fluorescencyjnie barwionych kropelek lipidów z rekonstrukcją 3D w celu oceny stłuszczenia wątroby

Ten artykuł opisuje użycie komórek HepG2 indukowanych kwasem oleinowym jako modelu dla stłuszczeniowej choroby wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną.

Modelowanie in vitro odkładania się tłuszczu w stłuszczeniowej chorobie wątroby związanej z dysfunkcją metaboliczną

Opracowano system optyczny służący do wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego z wykorzystaniem erytrocytów znakowanych FITC oraz do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu w naczyniach mikrokrążenia za pomocą fosforymetrii wspomaganej laserem. Metoda ta może być wykorzystana do badania mechanizmów fizjologicznych i patologicznych poprzez analizę struktury mikrokrążenia, średnicy naczyń, prędkości przepływu krwi oraz napięcia tlenowego.

Wizualizacja i analiza przepływu krwi oraz zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym: zastosowanie w modelu ostrego zapalenia wątroby

Poznaj zoptymalizowane metody analizy stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro. Techniki te umożliwiają nieinwazyjną ocenę postępu choroby metabolicznej oraz badanie mechanizmów lipidów i glukozy.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

Przeglądaj więcej filmów