Name: Metoda ex vivo do obrazowania poklatkowego sieci mikronaczyniowych krezki szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Poznaj metodę eksplantacji krezki szczura do obrazowania poklatkowego sieci mikronaczyniowych ex vivo. Technika umożliwia badanie interakcji komórek śródbłonka i wpływu leków przeciwnaczyniorobotwórczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grant 5-P20GM103629 dla WLM i Tulane Center for Aging. Chcielibyśmy podziękować Matthew Nice'owi za pomoc w redagowaniu tekstu protokołu.

Wszystkie eksperymenty i procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tulane (IACUC).
1. Konfiguracja procedury chirurgicznej
<ol>
	<li>Instrumenty autoklawowe, materiały chirurgiczne i materiały do hodowli przed operacją. Materiały chirurgiczne dla każdego szczura obejmują: 1 serwetę, 1 serwetkę z wyciętym otworem (0,5 cala x 1,5 cala) pośrodku, gaziki i 1 chłonny podkład. Narzędzia chirurgiczne obejmują: 1 skalpel z ostrzem numer 10, 2 pary pęset i parę cienkich nożyczek. Materiały do hodowli obejmują: 1 serwetkę, 1 parę pęsety oraz przygotowane wkłady 6-dołkowe z filtrami poliwęglanowymi.</li>
	<li>Wysterylizuj platformę z pleksi, scenę chirurgiczną i stół chirurgiczny za pomocą 70% etanolu. Etap chirurgiczny należy przechowywać w sterylnej misce do czasu użycia.
	<ol>
		<li>Utwórz etap chirurgiczny, wiercąc otwór o wymiarach około 2 na 1 cal w środku naczynia hodowlanego o średnicy 100 mm. Następnie użyj papieru ściernego, aby wygładzić ostre krawędzie i dodaj warstwę kleju silikonowego do krawędzi otworu, aby stworzyć podniesioną powierzchnię dla tkanek.</li>
		<li>Alternatywnie, zaprojektuj etap chirurgiczny za pomocą oprogramowania CAD i wykonaj go za pomocą druku 3D (rysunek 1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść sterylny chłonny podkład i połóż na nim platformę z pleksiglasu. Umieść serwetę, bez wstępnie wyciętego otworu, na podgrzewanej podkładce obok chłonnego podkładu.</li>
	<li>Wstępnie podgrzać sterylną sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), pożywkę i sól fizjologiczną do temperatury 37 °C. Umieścić pożywkę i PBS w oddzielnych naczyniach hodowlanych na poduszce grzewczej i umieścić sól fizjologiczną w stożkowej probówce o pojemności 50 ml obok zestawu chirurgicznego.</li>
	<li>Upewnij się, że wszystkie opakowania zostały otwarte przed rozpoczęciem zabiegu, aby zapewnić sterylne obchodzenie się ze wszystkimi materiałami. Pełna lista popularnych narzędzi używanych w tej procedurze znajduje się w Tabeli określonych materiałów i narzędzi chirurgicznych.</li>
</ol>
2. Pobieranie tkanek krezki
<ol>
	<li>Stosować dorosłe samce szczurów rasy Wistar (350 ± 25 g; w wieku 6-8 tygodni). Można zastąpić inne szczepy i wiek szczurów.</li>
	<li>Znieczulić szczura poprzez domięśniowe wstrzyknięcie ketaminy (80 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (8 mg/kg masy ciała). Upewnij się, że szczur jest pod narkozą, ściskając między palcami, aby sprawdzić, czy nie ma reakcji odruchowej; Nie powinno być żadnego. Analgezja prewencyjna w przypadku tej procedury terminalnej nie jest konieczna.</li>
	<li>Ogol okolice brzucha i usuń pozostałe włosy za pomocą kremu do depilacji. Przetrzyj skórę brzucha dwukrotnie 70% alkoholem izopropylowym, a następnie jodowidonem. W przypadku chusteczek chirurg powinien zacząć od środka pola operacyjnego i przesuwać się na zewnątrz przygotowanego obszaru w sposób okrężny, aby nie nachodzić na obszary, które zostały wcześniej wyszorowane tym samym kawałkiem sterylnej gazy lub sterylnego wacika. Następnie przenieś zwierzę do sterylnego zestawu chirurgicznego i umieść na platformie z pleksiglasu.</li>
	<li>Za pomocą ostrza skalpela wykonaj nacięcie o nacięciu 0,75 cala - 1,25 cala w jelitie, zaczynając 1 cal poniżej mostka. Uważaj, aby nie przebić jelita lub krezki (1 warstwa skóry, 1 warstwa tkanki łącznej i 1 warstwa mięśni).</li>
	<li>Umieść serwetę z wyciętym otworem nad nacięciem i umieść sterylną stację chirurgiczną na wierzchu serwety. Upewnij się, że otwór jest wyrównany z nacięciem. Użyj sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką, aby zlokalizować i wyciągnąć jelito kręte przez otwór etapu chirurgicznego.</li>
	<li>Przeciągnij 6-8 okien krezkowych przez scenę za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką i uważaj, aby nie dotknąć okien (Rysunek 1). Tkanki są zwykle pobierane z okolicy jelita krętego jelita cienkiego, zaczynając w pobliżu jelita ślepego. W razie potrzeby utrzymuj odsłonięte tkanki wilgotne podgrzaną sterylną solą fizjologiczną, używając sterylnej strzykawki do ociekania roztworu.</li>
	<li>Poddaj szczura eutanazji poprzez dosercowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (0,2 ml na szczura). Przed usunięciem okien krezkowych upewnij się, że szczur został poddany eutanazji poprzez badanie palpacyjne serca; Nie powinno być pulsu.</li>
	<li>Usuń pożądane tkanki krezki za pomocą pęsety, aby chwycić poduszeczkę tłuszczową i cienkich nożyczek, aby przeciąć okno. Zostaw obwódkę tłuszczu (2 mm) wokół okna. Umyj chusteczki raz w podgrzanym sterylnym PBS, a raz w pożywce.</li>
	<li>Zwróć zewnętrzną część jelita krętego do jamy brzusznej i zutylizuj zwierzę zgodnie z wytycznymi instytucji.</li>
</ol>
3. Hodowla tkanki krezki do badań poklatkowych
<ol>
	<li>Przenieść autoklawowane materiały do hodowli (patrz sekcja 1.1) i tkanki do sterylnego okapu z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Użyj pęsety, aby przenieść każdą tkankę na poliwęglanową membranę filtracyjną. Chwyć tkanki za poduszkę tłuszczową, aby uniknąć uszkodzenia układu krwionośnego.</li>
	<li>Szybko rozprowadź tkankę za pomocą poduszki tłuszczowej, uważając, aby nie dotknąć okienka. Odwróć wkładkę z tkanką na dno płytki 6-dołkowej i przykryj 3 ml pożywki (ryc. 1). Typowe podłoża stosowane w tej procedurze obejmują minimalną ilość pożywek niezbędnych (MEM) z 1% penicyliną, streptomycyną (PenStrep) i 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS). Pożywki mogą być uzupełniane innymi surowicami i/lub czynnikami wzrostu w celu stymulacji angiogenezy.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.2 - 3.3 dla każdej tkanki i kultury w standardowych warunkach inkubatora (5% CO2, 37 °C) przez okres do 5 dni.</li>
</ol>
4. Obrazowanie poklatkowe tkanki krezki
<ol>
	<li>W dniu obrazowania uzupełnić pożywkę w każdym dołku sprzężoną lektyną BSI i inkubować w standardowych warunkach hodowli przez 30 minut. Umyć tkanki dwukrotnie pożywką bez lektyn. Barwienie BSI-Lektyna pozostanie widoczne na tkance krezki przez okres do 3 dni w hodowli.</li>
	<li>Przenieś płytkę do stolika mikroskopowego. Zidentyfikuj naczynia krwionośne i limfatyczne na podstawie ich morfologii i struktury sieci.</li>
	<li>Zlokalizuj żądany obszar sieci na każdej tkance i zrób zdjęcia. Zanotuj lokalizację obrazowania, aby upewnić się, że ten sam obszar zostanie uchwycony dla kolejnych obrazów. Jeśli używasz zmotoryzowanego stolika, udokumentuj współrzędne.</li>
	<li>Zwróć tkanki do inkubatora i kontynuuj hodowlę do pożądanego punktu końcowego. W razie potrzeby powtórz kroki 4.1 - 4.3 w zależności od żądanych punktów czasowych eksperymentu.</li>
</ol>
5. Znakowanie immunologiczne tkanek
<ol>
	<li>Oznakowanie BSI-Lektyna
	<ol>
		<li>Inkubować tkanki przez 30 minut w temperaturze 37 °C z lektyną sprzężoną z FITC w stosunku 1:40 w pożywce (2,5 ml roztworu przeciwciała na basenie na płytce 6-dołkowej), a następnie dwukrotnie płukać pożywką. W przypadku płukania dodaj pożywkę, a następnie natychmiast wymień.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Etykietowanie żywych/martwych
	<ol>
		<li>Inkubować tkanki przez 10 minut w temperaturze 37 °C z 1:500 2 mM homodimeru etydyny-1 i 1:500 1 mM kalceiny AM w pożywce (2,5 ml roztworu przeciwciała na basenie na płytce 6-dołkowej), a następnie dwukrotnie przepłukać pożywką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznakowanie BSI-Lectin/NG2
	<ol>
		<li>Rozprowadź chusteczki na szkiełku mikroskopowym (1 - 2 chusteczki/szkiełko) i pozostaw do wyschnięcia. Usuń nadmiar tłuszczu skalpelem, mocno dociskając, aby wyciąć tłuszcz.</li>
		<li>Utrwalić chusteczki w zimnym metanolu na 30 minut w temperaturze -20 °C. Umyć chusteczki PBS (3 x 10 min).</li>
		<li>W celu znakowania przeciwciał pierwotnych inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z poliklonalnym przeciwciałem NG2 w skali 1:100 królika i 5% normalną surowicą kozią (NGS). Umyj chusteczki PBS (3 x 10 min).</li>
		<li>W celu znakowania przeciwciałami wtórnymi inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 1:100 koziego przeciwciała anty-króliczego CY2 sprzężonego (GAR-CY2) i 5% NGS. Umyj chusteczki PBS (3 x 10 min).</li>
		<li>Inkubować tkanki przez 30 minut w temperaturze pokojowej z lektyną sprzężoną z FITC w stosunku 1:40 w PBS, a następnie dwukrotnie płukać PBS. W przypadku płukania dodaj PBS, a następnie natychmiast wymień.</li>
		<li>Aby zamontować szkiełka, przykryj chusteczki higieniczne roztworem glicerolu w proporcji 50:50 PBS, a na wierzchu umieść szkiełko nakrywkowe. Uszczelnij krawędzie prowadnicy za pomocą lakieru do paznokci.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznakowanie LYVE-1/PECAM
	<ol>
		<li>Rozprowadź chusteczki na szkiełku mikroskopowym (1 - 2 chusteczki/szkiełko) i pozostaw do wyschnięcia. Usuń nadmiar tłuszczu skalpelem, mocno dociskając, aby wyciąć tłuszcz.</li>
		<li>Utrwalić tkanki w zimnym metanolu przez 30 minut w temperaturze -20 °C. Umyć chusteczki PBS + 0,1% saponiną (3 x 10 min).</li>
		<li>W celu znakowania przeciwciał pierwotnych inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z mysim monoklonalnym biotynylowanym przeciwciałem CD31 w skali 1:200 i poliklonalnym przeciwciałem LYVE-1 w skali 1:100 królika w PBS + 0,1% saponiny + 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 5% NGS. Umyj tkanki PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).</li>
		<li>W celu wtórnego znakowania przeciwciał inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 1:500 przeciwciałem streptawidyny sprzężonym z CY3 i 1:100 GAR-CY2 w PBS + 0,1% saponiny + 2% BSA + 5% NGS. Umyj tkanki PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).</li>
		<li>Aby zamontować szkiełka, przykryj chusteczki higieniczne roztworem glicerolu w proporcji 50:50 PBS, a na wierzchu umieść szkiełko nakrywkowe. Uszczelnij krawędzie prowadnicy za pomocą lakieru do paznokci.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznakowanie BrdU/BSI-Lectin
	<ol>
		<li>Dodać 1 mg/ml BrdU do pożywki i zastąpić pożywkę tkankową roztworem BrdU. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Rozprowadź chusteczki na szkiełku mikroskopowym (1 - 2 chusteczki/szkiełko) i pozostaw do wyschnięcia. Usuń nadmiar tłuszczu skalpelem, mocno dociskając, aby wyciąć tłuszcz.</li>
		<li>Utrwalić chusteczki w zimnym metanolu na 30 minut w temperaturze -20 °C. Umyć chusteczki PBS (3 x 10 min).</li>
		<li>Denaturować DNA tkankowe w 2 M HCl przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Umyć tkanki w PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).</li>
		<li>W celu znakowania przeciwciał pierwotnych inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z monoklonalnym mysim anty-BrdU w proporcji 1:100 w PBS + 0,1% saponiny + 2% BSA + 5% NGS. Umyj tkanki PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).</li>
		<li>W celu wtórnego znakowania przeciwciał inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 1:100 koziego przeciwciała anty-mysiego Cy3 sprzężonego (GAM-Cy3) w PBS + 0,1% saponiny + 2% BSA + 5% NGS. Umyj tkanki PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).</li>
		<li>Inkubować tkanki przez 30 minut w temperaturze pokojowej z lektyną sprzężoną z FITC w stosunku 1:40 w PBS, a następnie dwukrotnie płukać PBS.</li>
		<li>Aby zamontować szkiełka, przykryj chusteczki higieniczne roztworem glicerolu w proporcji 50:50 PBS, a na wierzchu umieść szkiełko nakrywkowe. Uszczelnij krawędzie prowadnicy za pomocą lakieru do paznokci.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oznakowanie BSI-Lectin/CD11b
	<ol>
		<li>Rozprowadź chusteczki na szkiełku mikroskopowym (1 - 2 chusteczki/szkiełko) i pozostaw do wyschnięcia. Usuń nadmiar tłuszczu skalpelem, mocno dociskając, aby wyciąć tłuszcz.</li>
		<li>Utrwalić tkanki w zimnym metanolu przez 30 minut w temperaturze -20 °C. Umyć chusteczki PBS + 0,1% saponiną (3 x 10 min).</li>
		<li>W celu znakowania przeciwciał pierwotnych inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 1:100 mysim antyszczurem CD11b w PBS + 0,1% saponiny + 2% BSA + 5% NGS. Umyj tkanki PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).</li>
		<li>Do wtórnego znakowania przeciwciał inkubować tkanki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z 1:100 GAM-Cy3 w PBS + 0,1% saponiny + 2% BSA + 5% NGS. Umyj tkanki PBS + 0,1% saponiny (3 x 10 min).</li>
		<li>Inkubować tkanki przez 30 minut w temperaturze pokojowej z lektyną sprzężoną z FITC w stosunku 1:40 w PBS, a następnie dwukrotnie płukać PBS.</li>
		<li>Aby zamontować szkiełka, przykryj chusteczki higieniczne roztworem glicerolu w proporcji 50:50 PBS, a na wierzchu umieść szkiełko nakrywkowe. Uszczelnij krawędzie prowadnicy za pomocą lakieru do paznokci.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407 (6801), 249-257 (2000).</li>
<li>Carmeliet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+life%2C+disease+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in life, disease and medicine.</a> Nature. 438 (7070), 932-936 (2005).</li>
<li>Kaunas, R., Kang, H., Bayless, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+Regulation+of+Angiogenic+Sprouting+by+Biochemical+Factors+and+Wall+Shear+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Synergistic Regulation of Angiogenic Sprouting by Biochemical Factors and Wall Shear Stress.</a> Cell Mol Bioeng. 4 (4), 547-559 (2011).</li>
<li>Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+the+neonatal+vasculature+and+analysis+of+retinal+angiogenesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1518-1534 (2010).</li>
<li>Song, J. W., Munn, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+forces+control+endothelial+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Fluid forces control endothelial sprouting.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15342-15347 (2011).</li>
<li>Chan, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+in+vitro+3D+capillary+beds+by+self-directed+angiogenic+sprouting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Engineering of in vitro 3D capillary beds by self-directed angiogenic sprouting.</a> PLoS One. 7 (12), e50582(2012).</li>
<li>Peirce, S. M., Mac Gabhann, F., Bautch, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+experimental+and+computational+approaches+to+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">Integration of experimental and computational approaches to sprouting angiogenesis.</a> Curr Opin Hematol. 19 (3), 184-191 (2012).</li>
<li>Stapor, P. C., Azimi, M. S., Ahsan, T., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+angiogenesis+model+for+investigating+multicellular+interactions+across+intact+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">An angiogenesis model for investigating multicellular interactions across intact microvascular networks.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (2), H235-H245 (2013).</li>
<li>Azimi, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+model+for+anti-angiogenic+drug+testing+on+intact+microvascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An ex vivo model for anti-angiogenic drug testing on intact microvascular networks.</a> PLoS One. 10 (3), e0119227(2015).</li>
<li>Nicosia, R. F., Ottinetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+microvessels+in+serum-free+matrix+culture+of+rat+aorta.+A+quantitative+assay+of+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro.</a> Lab Invest. 63 (1), 115-122 (1990).</li>
<li>Hutter-Schmid, B., Kniewallner, K. M., Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures+as+a+model+to+study+angiogenesis+of+brain+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures as a model to study angiogenesis of brain vessels.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 52(2015).</li>
<li>Sawamiphak, S., Ritter, M., Acker-Palmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+retinal+explant+cultures+to+study+ex+vivo+tip+endothelial+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of retinal explant cultures to study ex vivo tip endothelial cell responses.</a> Nat Protoc. 5 (10), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Unoki, N., Murakami, T., Ogino, K., Nukada, M., Yoshimura, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+imaging+of+retinal+angiogenesis+reveals+decreased+development+and+progression+of+neovascular+sprouting+by+anecortave+desacetate%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Time-lapse imaging of retinal angiogenesis reveals decreased development and progression of neovascular sprouting by anecortave desacetate.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2347-2355 (2010).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16989723">In vivo models of angiogenesis.</a> J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).</li>
<li>Kelly-Goss, M. R., Sweat, R. S., Azimi, M. S., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+islands+during+microvascular+regression+and+regrowth+in+adult+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vascular islands during microvascular regression and regrowth in adult networks.</a> Front Physiol. 4, 108(2013).</li>
<li>Kelly-Goss, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+along+vascular+islands+during+microvascular+network+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation along vascular islands during microvascular network growth.</a> BMC Physiol. 12, 7(2012).</li>
<li>Skalak, T. C., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mechanical+stresses+in+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">The role of mechanical stresses in microvascular remodeling.</a> Microcirculation. 3 (2), 143-165 (1996).</li>
<li>Kadohama, T., Nishimura, K., Hoshino, Y., Sasajima, T., Sumpio, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+types+of+fluid+shear+stress+on+endothelial+cell+proliferation+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of different types of fluid shear stress on endothelial cell proliferation and survival.</a> J Cell Physiol. 212 (1), 244-251 (2007).</li>
<li>Milkiewicz, M., Brown, M. D., Egginton, S., Hudlicka, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+shear+stress%2C+angiogenesis%2C+and+VEGF+in+skeletal+muscles+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Association between shear stress, angiogenesis, and VEGF in skeletal muscles in vivo.</a> Microcirculation. 8 (4), 229-241 (2001).</li>
<li>Corliss, B. A., Azimi, M. S., Munson, J. M., Peirce, S. M., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages%3A+An+Inflammatory+Link+Between+Angiogenesis+and+Lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Macrophages: An Inflammatory Link Between Angiogenesis and Lymphangiogenesis.</a> Microcirculation. 23 (2), 95-121 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Protokół ten dokumentuje metodę wykorzystania modelu hodowli krezki szczura jako narzędzia ex vivo do obrazowania poklatkowego wzrostu sieci mikronaczyniowej. Wcześniejsze prace w naszym laboratorium ustaliły zastosowanie naszego modelu do 1) angiogenezy8, 2) limfangiogenezy8, 3) interakcji komórek perycyta-śródbłonka8 i 4) antyangiogennych testów leków9. Możliwość obrazowania hodowanych tkanek krezki szczura w wielu ...

Wzrost i przebudowa sieci mikronaczyniowej są wspólnymi mianownikami dla funkcji tkanek, gojenia się ran i wielu patologii, a kluczowym procesem jest angiogeneza, zdefiniowana jako wzrost nowych naczyń krwionośnych z istniejących1,2. W przypadku inżynierii tkankowej nowych naczyń krwionośnych lub projektowania terapii opartych na angiogenezie zrozumienie znaczenia dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę ma kluczowe znaczenie. Proces ten jest jednak złożony. Może zmieniać się w określonych miejscach w sieci mikronaczyniowej i obejmuje wiele typów komórek (tj. komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich, perycyty, makrofagi, komórki macierzyste) i wiele układów (sieci limfatyczne i sieci neuronowe). Chociaż modele in vitro w ogromnym stopniu przyczyniły się do zbadania relacji między różnymi komórkami zaangażowanymi w angiogenezę3, ich znaczenie fizjologiczne może być podważone ze względu na ich ograniczoną złożoność i fakt, że nie odzwierciedlają one dokładnie scenariusza in vivo. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, w ostatnich latach opracowano i wprowadzono trójwymiarowe systemy hodowli3, modele tkanek ex vivo4, systemy mikroprzepływowe5,6 oraz modele obliczeniowe7. Jednak nadal istnieje zapotrzebowanie na model z funkcją poklatkową do badania angiogenezy w nienaruszonych sieciach mikronaczyniowych ex vivo. Ustanowienie nowych modeli poklatkowych do badań angiogenezy o takim poziomie złożoności będzie stanowić nieocenione narzędzie do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw angiogenezy i udoskonalenia terapii.
Potencjalnym modelem, który umożliwia badanie ex vivo angiogenezy w nienaruszonej sieci mikronaczyniowej, jest model hodowli krezki szczura8. W ostatnich pracach wykazaliśmy, że sieci mikronaczyniowe krwi i limfy pozostają żywotne po hodowli. Co ważniejsze, model hodowli krezki szczurów może być wykorzystany do badania funkcjonalnych interakcji między komórkami perycytów i śródbłonka, połączeń komórek śródbłonka krwi i limfy oraz obrazowania poklatkowego. Celem tego artykułu jest przedstawienie naszego protokołu dla metody obrazowania poklatkowego. Nasze reprezentatywne wyniki dokumentują wiele typów komórek, które pozostają żywotne po stymulacji angiogenezy surowicą i oferują przykłady zastosowania tej metody do ilościowego określania specyficznych dla tkanek odpowiedzi angiogennych, a także badań śledzenia komórek śródbłonka.

<table><tbody><tr><td>Serweta</td><td>Cardinal Health</td><td>4012</td><td>12" x 12" Bio-Shield Regularne owijki sterylizacyjne</td></tr><tr><td>Uchwyt skalpela</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS-9843</td><td>Uchwyt skalpela, #3; Bryła; </td></tr><tr><td>Sterylne ostrze chirurgiczne</td> o długości 4 cali <td>Cincinnati Surgical</td><td>0110</td><td>ze stali nierdzewnej; Rozmiar 10</td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane (60 mm)</td><td>Thermo Scientific</td><td>130181</td><td>10/rękaw</td></tr><tr><td>Graefe Forcep (zakrzywiona pęseta)</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td><td>Roboz RS-5135</td><td>Mikrokleszcze preparacyjne; Ząbkowane; Niewielka krzywa; 0.8 mm Szerokość końcówki; Kleszcz</td></tr> Graefe o długości 4 "<tr><td>(pęseta prosta)</td><td>Narzędzie chirurgiczne Roboz RS-5130</td><td></td><td>Mikrokleszcze preparacyjne; Ząbkowane, proste; 0.8 mm Szerokość końcówki; Długość 4 "</td></tr><tr><td>Noyes Micro Scissor</td><td>Roboz Instrument chirurgiczny</td><td>RS-5677</td><td>Noyes Micro Nożyczki sprężynowe do preparowania; Proste, ostro-końcówki; 13 mm Krawędź tnąca; 0,25 mm Szerokość końcówki, 4 1/2" Długość całkowita</td></tr><tr><td>Gaziki</td><td>FisherBrand</td><td>13-761-52</td><td>Niesterylne bawełniane gąbki z gazy; 4" x 4" 12-warstwowe</td></tr><tr><td>aplikatory z końcówką bawełnianą</td><td>FisherBrand</td><td>23-400-124</td><td>6" Długość; Drewniany wał; Jednorazowa</td></tr><tr><td>płytka 6-dołkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-49</td><td>Płaskie dno z pokrywką o niskim parowaniu; Polistyren; Niepirogenna</td></tr><tr><td>sterylna strzykawka 5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td> Sterylna miska <td>Luer-Lok Tip</td></tr><tr><td></td><td>Medical Action Industries Inc.</td><td>01232</td><td>32 uncje woreczek na skórkę; Niebieski; Sterylne</td></tr><tr><td>jednorazowe wkładki do płytek 6-dołkowych (wkładki CellCrown)</td>Wkładki do płytek <td>6-dołkowych SIGMA</td><td>Z681792-3EA</td><td>; Niesterylna</td></tr><tr><td>membrana filtracyjna z poliwęglanu</td><td>SIGMA</td><td>TMTP04700</td><td>Filtr membranowy izoporowy; Poliwęglan; Hydrofilowy; 5.0&nbsp; &mikro; m, 47&nbsp; mm, White Plain</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze/Opis</td></tr><tr><td>Beuthanasia</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp. Union (zamówione w MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 011168</td><td>Składnik aktywny: na 100 ml, 390 mg pentobarbitalu sodu, 50 mg fenytoiny sodu&nbsp;</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Fort Dodge Animal Health (zamówiona w MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 mg / ml</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD. Inc. (Zamówione w MWI Veterinary Supply)</td><td>MWI #: 000680</td><td>Anased 100 mg / ml</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Baxter</td><td>2F7122</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Saponina&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>S7900-100G</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol izopropylowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25372</td><td></td></tr><tr><td>Operand</td><td>powidonowo-jodowy</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>SIGMA</td><td>320331</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>Sprzężony z FITC Lektyna</td><td>SIGMA</td><td>L9381-2MG</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-NG2 Siarczan chondroityny Przeciwciało proteoglikanu</td><td>SIGMA</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31) Przeciwciało</td><td>BD Biosciences</td><td>555026</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało LYVE-1</td><td>AngioBio Co.</td><td>11-034</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-królicze Cy2-sprzężone</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-585-144</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie Cy3-sprzężone</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-227-003</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna Cy3-sprzężone przeciwciało</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw żywy/martwy żywotność/cytotoksyczność</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-2'-deoksyurydyna</td><td>SIGMA</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalna mysia anty-bromodeoksyurydyna&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Klon Bu20a</td><td>Dako</td><td>M074401-8</td><td></td></tr><tr><td>Mysz Anty-Szczur CD11b&nbsp;</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA275R</td><td></td></tr></tbody></table>

metoda ex vivo do obrazowania poklatkowego sieci mikronaczyniowych krezki szczura

An Ex Vivo Method for Time-Lapse Imaging of Cultured Rat Mesenteric Microvascular Networks

Angiogeneza, definiowana jako wzrost nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń, obejmuje komórki śródbłonka, perycyty, komórki mięśni gładkich, komórki odpornościowe oraz koordynację z naczyniami limfatycznymi i nerwami. Wielokomórkowe, wieloukładowe interakcje wymagają badania angiogenezy w fizjologicznie odpowiednim środowisku. Tak więc, chociaż zastosowanie modeli hodowli komórkowych in vitro dostarczyło mechanistycznych spostrzeżeń, powszechną krytyką jest to, że nie podsumowują one złożoności związanej z siecią mikronaczyniową. Celem tego protokołu jest wykazanie zdolności do dokonywania porównań poklatkowych nienaruszonych sieci mikronaczyniowych przed i po stymulacji angiogenezy w hodowanych tkankach krezki szczurów. Hodowane tkanki zawierają sieci mikronaczyniowe, które utrzymują swoją hierarchię. Znakowanie immunohistochemiczne potwierdza obecność komórek śródbłonka, komórek mięśni gładkich, perycytów, naczyń krwionośnych i naczyń limfatycznych. Ponadto znakowanie tkanek za pomocą BSI-lektyny umożliwia poklatkowe porównanie lokalnych regionów sieci przed i po stymulacji surowicy lub czynnika wzrostu, charakteryzujących się zwiększonym kiełkowaniem naczyń włosowatych i gęstością naczyń. W porównaniu z popularnymi modelami hodowli komórkowych, metoda ta stanowi narzędzie do badań linii komórek śródbłonka i oceny specyficznych dla tkanek leków angiogennych w fizjologicznie istotnych sieciach mikronaczyniowych.

Po 3 dniach hodowli tkanki zostały oznakowane zestawem do oceny żywotności/cytotoksyczności (live/dead), aby wykazać żywotność mikronaczyniowości w modelu hodowli krezu szczura (Rysunek 2A). Większość komórek obecnych w krezie pozostała żywotna w hodowli, przy czym komórki śródbłonkowe zidentyfikowano na podstawie ich lokalizacji w segmentach mikronaczyniowych. Proliferację komórek śródbłonka potwierdzono również za pomocą znakowania lektyną/BrdU (Rysunek 2D</stro...

Angiogeneza obejmuje interakcje wielokomórkowe, wielosystemowe, które muszą być badane w fizjologicznie odpowiednim środowisku. Celem tego badania jest wykazanie zdolności modelu hodowli krezki szczurów do dokonywania poklatkowych porównań nienaruszonych sieci mikronaczyniowych podczas angiogenezy.

Metoda ex vivo do obrazowania poklatkowego sieci mikronaczyniowych krezki szczura

Angiogenesis, defined as the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, involves endothelial cells, pericytes, smooth muscle cells, immune ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zademonstrowanie zastosowania modelu hodowli krezki szczura do badań time-lapse nad przebudową sieci mikro naczyniowej ex vivo w celu oceny interakcji komórek śródbłonka z pasożytami, połączeń między komórkami śródbłonka krwi i limfy lub efektów działania leków antyangiogennych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny przebudowy mikro naczyniowej, w tym m.in. w jaki sposób naczynia mikro naczyniowe „wiedzą”, w którym kierunku rosnąć oraz jaki jest los segmentów komórek śródbłonka. Główną zaletą tej techniki jest możliwość obrazowania rzeczywistych, nienaruszonych sieci mikro naczyniowych przed i po wzroście ex vivo.Procedurę zaprezentuje Sadegh Azimi, doktorant w naszym laboratorium, który opracował tę metodę. Należy rozpocząć od umieszczenia sterylizowanej etanolem platformy z pleksiglasu na sterylnym, chłonnym podkładzie, a następnie położenia znieczulonego dorosłego samca szczura na platformie. Oczyszczony z sierści obszar brzucha szczura należy zdezynfekować dwiema chusteczkami nasączonymi 70% isopropyl alcohol, a następnie povidone-iodine.Zaczynając jeden cal poniżej mostka, za pomocą skalpela wykonaj nacięcie w obrębie jelit o długości od trzech czwartych do jednego i jednej czwartej cala, przechodząc przez skórę, tkankę łączną i mięśnie. Następnie nałóż na zwierzę pole operacyjne z gotowym otworem, a na nie platformę chirurgiczną, dbając o to, aby otwory w obu materiałach pokrywały się z nacięciem. Używając sterylnych aplikatorów z bawełnianym końcem, wyciągnij jelito cienkie (ileum) przez otwór w platformie chirurgicznej wraz z sześcioma do ośmiu okien krezowych.Za pomocą sterylnej strzykawki zakraplaj w razie potrzeby sterylny roztwór soli fizjologicznej o temperaturze 37 °C na odsłonięte tkanki. Po wyeksponowaniu wszystkich okien, chwyć pęcherzyk tłuszczowy pęsetą i za pomocą nożyczek wytnij okna, pozostawiając dwumilimetrowy margines tłuszczowy wokół każdej tkanki krezkowej. Należy uważać, aby pęseta nie dotykała okien krezkowych, chwytając wyłącznie otaczające je brzegi tłuszczowe.Każde okno należy przemyć raz w PBS o temperaturze 37°C i raz w pożywce o temperaturze 37°C, którą pobrano podczas procedury. Po wyizolowaniu wszystkich okien należy przenieść jelito cienkie (ileum) z powrotem do jamy brzusznej. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, przy użyciu pęsety, należy przenieść każdy fragment tkanki krezkowej, chwytając go za brzeg tłuszczowy, na poliwęglanową membranę filtrującą wkładki płytki do hodowli komórkowej.Użyj podkładki tłuszczowej, aby szybko rozłożyć próbki tkanek, dbając o to, by nie dotykać okienek. Następnie odwróć wkładkę i umieść ją w jednym dołku płytki sześcio-dołkowej w taki sposób, aby tkanka spoczywała płasko na dnie dołka. Przykryj tkankę trzema milimetrami pożywki, a pozostałe okienka przenieś na płytkę w ten sam sposób.Następnie hodować okna krezkowe w standardowych warunkach inkubatora do hodowli tkanek przez maksymalnie pięć dni. W dniu obrazowania uzupełnić hodowle o koniugowaną lektynę BSI i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze. Po 30 minutach dwukrotnie przemyć próbki pożywką wolną od lektyny i przenieść płytkę na stolik mikroskopu fluorescencyjnego.Zidentyfikuj naczynia krwionośne i limfatyczne na podstawie ich morfologii oraz struktur sieciowych. Następnie wyznacz w każdej tkance obszar sieci będący przedmiotem zainteresowania w celu wykonania obrazowania, odnotowując jego położenie, aby zapewnić przejęcie tego samego regionu na kolejnych obrazach. Po uzyskaniu wszystkich obrazów przenieś próbki z powrotem do inkubatora aż do następnej sesji obrazowania lub osiągnięcia odpowiedniego punktu końcowego eksperymentu.Po trzech dniach hodowli większość komórek obecnych w krezce pozostaje żywa, a obecność komórek śródbłonka potwierdzono na podstawie ich lokalizacji w segmentach mikronaczyniowych. Proliferację komórek śródbłonka można również potwierdzić za pomocą znakowania lektyną/BrdU, natomiast obecność komórek mięśni gładkich i pasożytów wzdłuż naczyń można potwierdzić znakowaniem NG2. Znakowanie rozgałęzionej sieci mikro-naczyń krwionośnych i limfatycznych dodatkowo potwierdza zachowanie fenotypu komórek limfatycznych w hodowanej tkance.Uzupełnienie pożywki do hodowli tkankowej okna krezowego o 10% serum przez trzy dni indukuje silną odpowiedź angiogenną, przy czym nowe segmenty naczyń i pąki kapilarne są identyfikowalne po pięciu dniach stymulacji. Obrazowanie poklatkowe umożliwia ilościowe określenie liczby naczyń na obszar naczyniowy oraz liczby pąków kapilarnych na obszar naczyniowy na podstawie jednego obrazu tkanki w powiększeniu 4x. Porównania poklatkowe regionów sieci umożliwiają również śledzenie segmentów komórek śródbłonka oraz identyfikację błędów w rozmieszczeniu naczyń krwionośnych i limfatycznych.Ponadto znakowanie lektynami i przeciwciałami anty-Cd11b dodatkowo potwierdza obecność rezydentnych makrofagów śródmiąższowych w sieciach przebudowy. Po opanowaniu techniki ta powinna być możliwa do wykonania w czasie poniżej czterech godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak pobierać, hodować i obrazować w trybie time-lapse tkanki krezki szczura.

an-ex-vivo-method-for-time-lapse-imaging-cultured-rat-mesenteric

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiono nową, wszechstronną metodę obserwacji mikrokrążenia. Jest ona uważana za odpowiednią do długotrwałej obserwacji oraz do łączenia z interwencjami farmakofizjologicznymi lub biologii molekularnej.

Pomiar mikrokrążenia in vivo w mięśniach szkieletowych za pomocą mikroskopii intravitalnej

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Test angiogenezy w krezoni szczura

Niniejszy artykuł opisuje prosty model stymulacji angiogenezy w krezce szczura. Model ten powoduje gwałtowny wzrost pączkowania naczyń włosowatych, powierzchni naczyniowej oraz gęstości naczyń w stosunkowo krótkim czasie, w tkance umożliwiającej wizualizację en face całych sieci mikronaczyniowych aż do poziomu pojedynczej komórki.

Eksterioryzacja krezki szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę

Funkcja komórek naczyniowych zależy od aktywności przekaźników wewnątrzkomórkowych.  Opisana jest metoda obrazowania dwufotonowego ex vivo, która umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia i tlenku azotu w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne i farmakologiczne w poszczególnych komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty.

Obrazowanie dwufotonowe wewnątrzkomórkowego obchodzenia się z Ca2+ i produkcji tlenku azotu w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty szczurzej

Zmodyfikowana technika Landisa umożliwia sparowany pomiar przewodnictwa hydraulicznego poszczególnych mikronaczyń w krezce normalnych i genetycznie zmodyfikowanych szczurów w warunkach kontrolnych i testowych przy użyciu technik mikroperfuzji. Stanowi wygodną metodę oceny mechanizmów regulujących przepuszczalność mikronaczyń i wymianę transnaczyniową w warunkach fizjologicznych.

Technika mikroperfuzji do badania regulacji przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura

Szczegółowo opisujemy protokół monitorowania zachowania neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych w stanie stacjonarnym i stanach zapalnych za pomocą mikroskopii konfokalnej przyżyciowej na znieczulonych myszach.

Obrazowanie neutrofili i monocytów w żyłach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej na znieczulonych myszach w czasie rzeczywistym

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Ten manuskrypt opisuje protokoły mikroskopii wideo in vitro do oceny funkcji naczyniowej w tętnicach oporowych mózgu szczurów. W manuskrypcie opisano również techniki oceny gęstości mikronaczyń za pomocą znakowanej fluorescencyjnie lektyny i perfuzji tkanek za pomocą laserowej przepływometrii dopplerowskiej.

Ocena mechanizmów kontroli naczyniowej z wykorzystaniem wideomikroskopii izolowanych tętnic opornych szczurów

Prezentowany tutaj jest protokół do badania mikrokrążenia wieńcowego w żywej tkance serca mysiego poprzez monitorowanie ex vivo ciśnienia perfuzji tętniczej i przepływu, który utrzymuje ciśnienie, a także składników drzewa naczyniowego, w tym łożysk naczyń włosowatych i perycytów, gdy tętnica przegrody jest kaniulowana i poddawana ciśnieniu.

Dynamiczny pomiar i obrazowanie naczyń włosowatych, tętniczek i perycytów w sercu myszy

W obecnym protokole, funkcja bariery śródbłonkowej gruczołu podżuchwowego (SMG) została oceniona poprzez wstrzyknięcie różnych molekularnych znaczników fluorescencyjnych do żył kątowych badanych modeli zwierzęcych in vivo pod dwufotonowym laserowym mikroskopem skaningowym.

In vivo (in vivo) Wykrywanie przepuszczalności naczyń krwionośnych w mysim gruczole podżuchwowym

Ten protokół przedstawia metodę wywoływania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego krezki i wizualizacji pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET) w żyłkach krezkowych za pomocą mikroskopii przyżyciowej. Przepływ krwi w tętnicy krezkowej górnej był ograniczony przez 1 godzinę, po czym nastąpiła reperfuzja, co umożliwiło bezpośrednie ilościowe określenie adhezji leukocytów i NETozy.

Wizualizacja pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili w żyłkach krezkowych po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym krezki za pomocą mikroskopii przyżyciowej

Poznaj metodę eksplantacji krezki szczura do obrazowania poklatkowego sieci mikronaczyniowych ex vivo. Technika umożliwia badanie interakcji komórek śródbłonka i wpływu leków przeciwnaczyniorobotwórczych.

Metoda ex vivo do obrazowania poklatkowego sieci mikronaczyniowych krezki szczura

Przeglądaj więcej filmów