Name: Metoda pobierania wymazów w celu wykrycia ludzkiego norowirusa na powierzchniach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-06T10:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj metodę pobierania wymazów z makropianki do wykrywania norowirusa na powierzchniach. Ta technika poprawia identyfikację źródeł zakażeń i ocenę skuteczności dezynfekcji w badaniach epidemiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

1. Pobieranie wymazów w terenie
<ol>
	<li>Załóż czystą parę rękawiczek.</li>
	<li>Zmierz wielkość obszaru pobierania próbek bez dotykania powierzchni za pomocą taśmy mierniczej lub linijki. Postaraj się jak najdokładniej oszacować powierzchnię i wypełnij formularz raportu (Tabela uzupełniająca 1).</li>
	<li>Sprawdź zestaw wacików pod kątem ewentualnych wycieków i oznacz torby transportowe na próbki i zestawy wacików.</li>
	<li>Przesuń wacik po obszarze pobierania próbek w następujący sposób: jedno pociągnięcie w kierunku poziomym, jedno pociągnięcie w kierunku pionowym i jedno pociągnięcie w kierunku ukośnym. Nie pobieraj wymazów z powierzchni większej niż 700 cm2.</li>
	<li>Umieść każdy wacik w tubce i mocno dokręć nakrętkę.</li>
</ol>
2. Przechowywanie i transport wymazów do laboratorium
<ol>
	<li>Waciki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 48 godzin. Jeśli wymagane jest przechowywanie przez dłuższy czas, należy przechowywać waciki w temperaturze -20 °C (lub -70 °C).</li>
	<li>Probówki należy przechowywać w temperaturze 0-4 °C (tj. używać zimnych wkładów) w izolowanym pojemniku podczas transportu do laboratorium i wysłać w ciągu 24-48 godzin od pobrania.</li>
</ol>
3. Koncentracja wirusa, ekstrakcja i oczyszczanie wirusowego RNA
UWAGA: Wszystkie etapy wirowania używają wirówki stołowej o stężeniu 5 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej. Zachowaj szczególną ostrożność podczas pracy z uniwersalnym buforem do ekstrakcji kwasów nukleinowych (UNEX). Nosić okulary lub osłonę twarzy.
<ol>
	<li>Oznaczyć jedną probówkę o pojemności 15 ml i jedną kolumnę Midi RNA dla każdej próbki. W każdym eksperymencie należy uwzględnić negatywną kontrolę ekstrakcji.</li>
	<li>Aby przygotować roztwór do lizy na 10 wymazów, wymieszaj 25 ml buforu UNEX z 25 ml PBST (PBS pH 7,2 zawierające 0,02% Tween-80).</li>
	<li>Dodać 50 μl zawiesiny colifag MS2 (106 PFU/μl) do 50 ml roztworu do lizy.</li>
	<li>Umieść wacik w probówce o pojemności 15 ml i dodaj 5 ml roztworu do lizy. Mieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 5 ml 100% etanolu do każdej probówki i wiruj przez 10 sekund.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij wacik z probówki o pojemności 15 ml (zawiera bufor UNEX), delikatnie dociskając go do boku probówki, aby usunąć nadmiar płynu, a następnie wyrzuć wacik. Pozostałe objętości powinny wynosić od 9 do 10 ml.</li>
</ol>
4. Ekstrakcja wirusowych kwasów nukleinowych w kolumnie Midi
<ol>
	<li>Ostrożnie przenieść 4,5 ml mieszaniny UNEX/etanolu z kroku 3.6 na kolumnę midi, odwirować i wyrzucić filtrat.</li>
	<li>Załaduj kolejne 4,5 ml z tej samej mieszaniny do tej samej kolumny, odwiruj i wyrzuć filtrat.</li>
	<li>Do pierwszego płukania dodać 3,5 ml 70% etanolu do kolumny Midi, odwirować i wyrzucić filtrat.</li>
	<li>Do drugiego prania dodaj kolejne 3,5 ml 70% etanolu na kolumnę Midi. Odwirować i wyrzucić filtrat.</li>
	<li>W celu wirowania na sucho odwiruj kolumny Midi, aby usunąć wszelkie ślady etanolu (który może negatywnie wpłynąć na odzysk wirusowego RNA).</li>
	<li>Umieść kolumnę Midi w nowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 250 μl buforu elucyjnego do kolumny Midi; Odczekaj 1 minutę przed odwirowaniem, aby uzyskać najwyższy odzysk wirusowego RNA.</li>
	<li>Przechowywać wyekstrahowany kwas nukleinowy w temperaturze -70 °C lub natychmiast przejść do kroku 5.</li>
</ol>
5. Koncentracja wirusowego kwasu nukleinowego za pomocą zestawów do czyszczenia i koncentratora RNA
<ol>
	<li>Dodaj 500 μl buforu wiążącego RNA do 250 μl RNA eluowanego w kroku 4.7 powyżej i wiruj przez 10 s.</li>
	<li>Dodaj 750 μl 100% etanolu i wiruj przez 10 sekund.</li>
	<li>Oznacz kolumnę wirowania dla każdej próbki. Załadować próbkę o objętości 750 μl na kolumnę wirową.</li>
	<li>Odwirować kolumny wirowe przy 12 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.</li>
	<li>Załaduj pozostałe 750 μl na kolumnę wirową i odwiruj przy 12 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Do mycia wstępnego dodać 400 μl buforu przygotowawczego RNA do każdej kolumny wirowej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę. Wyrzuć przepływ.</li>
	<li>Do pierwszego płukania dodać 800 μl buforu płuczącego RNA do każdej kolumny wirowej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.</li>
	<li>Do drugiego płukania dodać 400 μl buforu do płukania RNA do kolumny wirowej i odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę. Wyrzucić przepływ.</li>
	<li>W przypadku wirowania na sucho odwirować kolumnę wirową, aby usunąć wszelkie ślady buforu płuczącego o stężeniu 12 000 x g przez 2 minuty.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś kolumnę wirową do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 25 μl buforu elucyjnego do kolumny wirowej i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Zwiększy to odzyskiwanie wirusowego RNA z kolumny.</li>
	<li>Zebrać RNA, odwirowując kolumnę wirową przy 10 000 x g przez 1 minutę.</li>
	<li>Przejdź bezpośrednio do RT-qPCR (krok 6) lub przechowuj RNA w temperaturze -70 °C.</li>
</ol>
6. Mutiplex RT-qPCR Wykrywanie norowirusów Genogrupy I i II oraz Coliphage MS 2 (Tabela uzupełniająca 2)
<ol>
	<li>Oczyść powierzchnie robocze, pipety i wirówki roztworem do odkażania RNazy, aby zmniejszyć możliwe zanieczyszczenie.</li>
	<li>Rozmrozić odczynniki RT-qPCR na lodzie. Rozmrozić RNA na lodzie (w oddzielnym obszarze/pomieszczeniu).</li>
	<li>Określ liczbę reakcji i dodaj ich o co najmniej 10% więcej (np. jeśli potrzebnych jest 10 reakcji, przygotuj mieszankę wzorcową dla 11).</li>
	<li>Wiruj poszczególne składniki mieszanki wzorcowej, z wyjątkiem 25x enzymu RT-qPCR, przez 5 sekund. Ostrożnie wymieszaj enzym, przesuwając probówkę palcem.</li>
	<li>Krótko odwirować składniki mieszanki głównej przez 5 sekund.</li>
	<li>Przygotować mieszankę wzorcową do wykrywania NOROVIRUS GI i GII za pomocą testu RT-PCR w czasie rzeczywistym zgodnie z instrukcjami dołączonymi do zestawu, a następnie dodać specyficzne dla norowirusa startery i sondy oligonukleotydowe do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml (tabela uzupełniająca 3).</li>
	<li>Wymieszaj mieszankę główną, pipetując 5-10 razy w górę i w dół (nie zaleca się wirowania). Podwielokrotność 22 μl mieszanki wzorcowej w każdym dołku 96-dołkowej płytki do PCR w czasie rzeczywistym.</li>
	<li>Wirować próbkę RNA przez 5 sekund i zbierać przez krótkie (5 s) wirowanie.</li>
	<li>Dodać 3 μl próbki RNA oraz kontroli dodatniej GI i GII do płytki RT-qPCR (postępuj zgodnie z szablonem z tabeli 2). Dodaj 3 μl wody wolnej od nukleaz do studzienek bez kontroli matrycy (NTC).</li>
	<li>Uszczelnij płytkę w czasie rzeczywistym za pomocą optycznej folii samoprzylepnej.</li>
	<li>Ostrożnie odwirować płytkę w czasie rzeczywistym o sile 1 300 x g przez 1 minutę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza lub krople cieczy, które mogą być obecne w studzienkach.</li>
	<li>Skonfiguruj przyrząd do PCR w czasie rzeczywistym i ustaw następujące warunki termocyklingu: 1) krok RT przez 10 minut w temperaturze 45 °C, (2) aktywacja polimerazy Taq, 10 minut w temperaturze 95 °C i (3) 45 cykli po 15 s w temperaturze 95 °C i 60 s w temperaturze 60 °C.</li>
</ol>
7. Kwantyfikacja norowirusa w próbkach wymazów
<ol>
	<li>Należy sprawdzić wyniki kontroli dodatnich i ujemnych w celu walidacji wyników RT-qPCR (tabela uzupełniająca 3).</li>
	<li>Określić, czy każda krzywa standardowa spełnia dopuszczalne wartości podane w tabeli uzupełniającej 2 i obliczyć całkowite odchylenie standardowe dla krzywej standardowej, stosując równanie 1. 
	(Równanie 1) % wydajności = 100 x 10 (średnie wartości Ct-punkt przecięcia)/Nachylenie.</li>
	<li>Jeśli oprogramowanie termocyklera PCR nie oblicza nachylenia dla każdej krzywej standardowej, należy określić wartości nachylenia i R2przez regresję za pomocą oprogramowania statystycznego (np. Excel, SPSS lub SAS). Ponadto należy obliczyć sprawność procentową dla krzywych standardowych zgodnie z równaniem I</li>
	<li>Zapisać liczbę kopii RNA obliczoną przez oprogramowanie termocyklera dla wszystkich badanych próbek w oparciu o krzywe wzorcowe, które spełniają kryteria określone w tabeli uzupełniającej 4. Ponownie uruchom wszystkie próbki o krzywych standardowych, którenie spełniają kryteriów lub mają fałszywie dodatnie wyniki kontroli. Sprawdź wartości Ct colifaga MS2, który został dodany jako kontrola wewnętrzna w celu monitorowania hamowania PCR.</li>
	<li>Oznaczyć całkowitą liczbę kopii RNA w próbce, mnożąc liczbę kopii RNA obliczoną w kroku 7.2 przez stosunek objętości (25 do 50 μl) całkowitego eluentu RNA do objętości RNA (3 do 5 μl) użytego w reakcji RT-qPCR. Alternatywnie oblicz gęstość RNA, dzieląc całkowitą liczbę kopii RNA przez analizowaną powierzchnię obiektu (cm 2).</li>
</ol>
8. Genotypowanie próbek dodatnich RT-PCR w czasie rzeczywistym za pomocą zagnieżdżonej konwencjonalnej amplifikacji PCR Hemi
<ol>
	<li>Przygotować pierwszą rundę mieszanki wzorcowej dla każdego zestawu starterów testu RT-PCR (tabele uzupełniające 2 i 5).</li>
	<li>Dodać 5 μl norowirusowego dodatniego RNA do 20 μl mieszanki wzorcowej.</li>
	<li>Uruchom RT-PCR w następujących warunkach: (1) krok RT przez 30 minut w 42 °C, (2) aktywacja polimerazy Taq, 15 minut w 95 °C i (3) 40 cykli po 30 s w 95 °C, 30 s w 50 °C i 60 s w 72 °C. Po 40 cyklach inkubować przez dodatkowe 10 minut w temperaturze 72 °C.</li>
	<li>Przygotować drugą rundę mieszanki mater dla każdego zestawu starterów testu RT-PCR (tabele uzupełniające 2 i 5).</li>
	<li>Dodać 23 μl mieszanki wzorcowej i dodać 2 μl produktów RT-PCR pierwszej rundy (z pierwszej rundy) do każdej probówki (najlepiej produkt pierwszej rundy należy rozcieńczyć w stosunku 1:10 w wodzie wolnej od RNaz).</li>
	<li>Powtórz krok 8.3.</li>
	<li>Przygotuj 2% żel agarozowy w 100 ml 1x Tris-acetate EDTA (40 mM Tris, 20 mM kwas octowy i 1 mM EDTA, przy pH 8,3). Po rozpuszczeniu agarozy przez podgrzanie mieszaniny w kuchence mikrofalowej dodać 10 μl barwnika kwasu nukleinowego na 100 ml przygotowanego żelu po schłodzeniu mieszaniny do 60-70 °C, wlać żel i włożyć grzebienie. Pozostaw żel na co najmniej 30 minut.</li>
	<li>Wymieszaj 15 μl każdego produktu RT-PCR z 3 μl 6-krotnego barwnika ładującego. Załadować 15 μl każdej próbki i poddać żelowi agarozowemu elektroforezę pod napięciem 100 V przez 1 godzinę.</li>
	<li>Wyciąć docelowe fragmenty RT-PCR o odpowiedniej wielkości (330 pz dla GI i 341 pz dla GII) z żelu i oczyścić RNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji żelu. Oczyszczony produkt PCR może być teraz używany do sekwencjonowania Sangera.</li>
</ol>

<ol><li>Isakbaeva, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+transmission+on+cruise+ship%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Norovirus transmission on cruise ship.</a> Emerg. Infect. Dis. 11, 154-158 (2005).</li>
<li>Lopman, B. A., Gastañaduy, P., Park, G. W., Hall, A. J., Parashar, U. D., Vinjé, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22440972">Environmental transmission of norovirus gastroenteritis.</a> Curr. Opin. Virol. 2 (1), 1-7 (2011).</li>
<li>Malek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreak+of+norovirus+infection+among+river+rafters+associated+with+packaged+delicatessen+meat%2C+Grand+Canyon%2C+2005%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Outbreak of norovirus infection among river rafters associated with packaged delicatessen meat, Grand Canyon, 2005.</a> Clin Infect Dis. 48 (1), 31-37 (2009).</li>
<li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus+shedding+after+experimental+human+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus shedding after experimental human infection.</a> Emerg. Infect. Dis. 14 (10), 1553-1557 (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3880795/">Norovirus gastroenteritis.</a> N. Engl. J. Med. Glass, R. I., Parashar, U. D., Estes, M. K. 361 (18), 1776-1785 (2009).</li>
<li>Park, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+New+Environmental+Sampling+Protocol+for+Detection+of+Human+Norovirus+on+Inanimate+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a New Environmental Sampling Protocol for Detection of Human Norovirus on Inanimate Surfaces.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (17), 5987-5992 (2015).</li>
<li>Barker, J., Jones, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+spread+of+infection+caused+by+aerosol+contamination+of+surfaces+after+flushing+a+domestic+toilet%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The potential spread of infection caused by aerosol contamination of surfaces after flushing a domestic toilet.</a> J. Appl. Microbiol. 99, 339-347 (2005).</li>
<li>Tung-Thompson, G., Libera, D. A., Koch, K. L., de Los Reyes, F. L., Jaykus, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosolization+of+a+Human+Norovirus+Surrogate%2C+Bacteriophage+MS2%2C+during+Simulated+Vomiting%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Aerosolization of a Human Norovirus Surrogate, Bacteriophage MS2, during Simulated Vomiting.</a> PloS one. 10, 0134277(2015).</li>
<li>Atmar, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+50%25+human+infectious+dose+for+Norwalk+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Determination of the 50% human infectious dose for Norwalk virus.</a> J. Infect. Dis. 209 (7), 1016-1022 (2014).</li>
<li>Petrignani, M., van Beek, J., Borsboom, G., Richardus, J. H., Koopmans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+introduction+routes+into+nursing+homes+and+risk+factors+for+spread%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hosp.+Infect%22%5BJournal%5D)">Norovirus introduction routes into nursing homes and risk factors for spread: a systematic review and meta-analysis of observational studies.</a> J. Hosp. Infect. 89 (3), 163-178 (2015).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm5651a2.htm">Centers for Disease Control Prevention. Norovirus outbreak in an elementary school--District of Columbia, February 2007.</a> MMWR. Morb. Mortal. Wkly. Rep. 56 (51-52), 1340-1343 (2008).</li>
<li>Cheesbrough, J. S., Barkess-Jones, L., Brown, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+prolonged+environmental+survival+of+small+round+structured+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hosp.+Infect%22%5BJournal%5D)">Possible prolonged environmental survival of small round structured viruses.</a> J. Hosp. Infect. 35, 325-326 (1997).</li>
<li>Julian, T. R., Tamayo, F. J., Leckie, J. O., Boehm, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+surface+sampling+methods+for+virus+recovery+from+fomites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of surface sampling methods for virus recovery from fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 6918-6925 (2011).</li>
<li>Taku, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+detection+of+caliciviruses+from+food+contact+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food.+Prot%22%5BJournal%5D)">Concentration and detection of caliciviruses from food contact surfaces.</a> J. Food. Prot. 65, 999-1004 (2002).</li>
<li>Scherer, K., Ellerbroek, L., Schulenburg, J., Johne, R., Klein, G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s12560-008-9007-0">Application of a swab sampling method for the detection of norovirus and rotavirus on artifically contaminated food and environmental surfaces.</a> Food. Environ. Virol. 1 (42), 42-49 (2009).</li>
<li>Herzog, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+sample+recovery+efficiency+for+bacteriophage+P22+on+fomites%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of sample recovery efficiency for bacteriophage P22 on fomites.</a> Appl. Environ. Microbiol. 78, 7915-7922 (2012).</li>
<li>Vega, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaliciNet%3A+A+Novel+Surveillance+Network+for+Norovirus+Gastroenteritis+Outbreaks+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">CaliciNet: A Novel Surveillance Network for Norovirus Gastroenteritis Outbreaks in the United States.</a> Emerging Infectious Diseases. 17 (8), 1389-1395 (2011).</li>
<li>Rolfe, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+internally+controlled%2C+one-step%2C+real-time+RT-PCR+assay+for+norovirus+detection+and+genogrouping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Virol%22%5BJournal%5D)">An internally controlled, one-step, real-time RT-PCR assay for norovirus detection and genogrouping.</a> J Clin Virol. 39 (4), 318-321 (2007).</li>
<li>Kittigul, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+GII-4+2006b+variant+circulating+in+patients+with+acute+Thailand+during+a+2006-2007+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Norovirus GII-4 2006b variant circulating in patients with acute Thailand during a 2006-2007 study.</a> J. Med. Virol. 82 (5), 854-860 (2010).</li>
<li>Teunis, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norwalk+virus%3A+how+infectious+is+it%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Norwalk virus: how infectious is it.</a> J. Med. Virol. 80 (8), 1468-1476 (2008).</li>
<li>Wollants, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+norovirus+sampling+method+using+sodium+dodecyl+sulfate%2FEDTA-pretreated+chromatography+paper+strips%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a norovirus sampling method using sodium dodecyl sulfate/EDTA-pretreated chromatography paper strips.</a> J. Virol. Methods. 122, 45-48 (2004).</li>
<li>Weir, M. H., Shibata, T., Masago, Y., Cologgi, D., Rose, J. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27154208">The Effect of Surface Sampling and Recovery of Viruses and Non-Spore Forming Bacteria on a QMRA Model for Fomites.</a> Environ. Sci. Technol. 50 (11), 5945-5952 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.iso.org/iso/catalogue_detail.htm?csnumber=55382">Microbiology of food and animal feed-Horizontal method for determination of hepatitis A virus and norovirus in food using real-time RT-PCR.</a> International Organization for Standardization (ISO). , Report No. ISO/TS 15216-1:2013(E) (2013).</li>
<li>Huslage, K., Rutala, W. A., Sickbert-Bennett, E., Weber, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+approach+to+defining+%22high-touch%22+surfaces+in+hospitals%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Control.+Hosp.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A quantitative approach to defining "high-touch" surfaces in hospitals.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 31 (8), 850-853 (2010).</li>
<li>Wu, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+norovirus+outbreak+at+a+long-term-care+facility%3A+the+role+of+environmental+surface+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Control.+Hosp.+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">A norovirus outbreak at a long-term-care facility: the role of environmental surface contamination.</a> Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 26 (10), 802-810 (2005).</li>
<li>Ikner, L. A., Gerba, C. P., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+and+recovery+of+viruses+from+water%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Environ.+Virol%22%5BJournal%5D)">Concentration and recovery of viruses from water: a comprehensive review.</a> Food Environ. Virol. 4 (2), 41-67 (2012).</li>
<li>Gallimore, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+monitoring+for+gastroenteric+viruses+in+a+pediatric+primary+immunodeficiency+unit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Environmental monitoring for gastroenteric viruses in a pediatric primary immunodeficiency unit.</a> J. Clin. Microbiol. 44 (2), 395-399 (2006).</li>
<li>Ganime, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+human+adenoviruses+and+rotavirus+species+A+on+fomites+of+hospital+pediatric+units%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Dissemination of human adenoviruses and rotavirus species A on fomites of hospital pediatric units.</a> Am J Infect Control. , (2016).</li>
<li>Verani, M., Bigazzi, R., Carducci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+contamination+of+aerosol+and+surfaces+through+toilet+use+in+health+care+and+other+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Infect+Control%22%5BJournal%5D)">Viral contamination of aerosol and surfaces through toilet use in health care and other settings.</a> Am J Infect Control. 42 (7), 758-762 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają sprzecznych interesów. Ustalenia i wnioski zawarte w tym raporcie są ustaleniami i wnioskami autorów i niekoniecznie reprezentują oficjalne stanowisko Centrów Kontroli i Prewencji Chorób.

Norowirusy mają 50% dawkę zakaźną dla ludzi między 18 a 103 cząsteczkami wirusa20. Dlatego nawet niewielkie zanieczyszczenie powierzchni może stanowić zagrożenie dla zdrowia publicznego. Oceniono kilka aspektów protokołu pobierania próbek wymazów, w tym: 1) różne materiały wymazowe, 2) wymazy w warunkach przechowywania podczas transportu, 3) stężenie wirusowego RNA oraz 4) colifag MS2 jako wewnętrzna kontrola ekstrakcji.
Do niedawna oceniano i proponowano do ...

Ludzkie norowirusy są główną przyczyną epidemicznego i sporadycznego ostrego zapalenia żołądka i jelit na całym świecie 1,2,3. Wirus jest niezwykle zaraźliwy, a jego przenoszenie następuje poprzez bezpośrednią interakcję międzyludzką lub pośrednio poprzez kontakt ze skażoną żywnością, wodą lub powierzchniami środowiskowymi. Norowirusy mogą być wydalane przez dłuższy czas, a przedłużone przetrwanie wirusa na powierzchniach środowiskowych zostało udokumentowane 1,2,3. Podczas szczytowego wydalania na gram kału uwalniane są miliardy cząsteczek wirusa, a wymiociny zawierają również wystarczającą liczbę cząsteczek wirusa, aby spowodować infekcję 4,5,6,7,8,9,10. Ponadto przenoszenie wirusa między powierzchniami nieożywionymi a ludzką skórą może być łatwe 2,11,12. W związku z tym monitorowanie skażenia środowiska może pomóc w dochodzeniu w sprawie wystąpienia epidemii oraz w ocenie skuteczności procedur oczyszczania i dezynfekcji.
Opisano kilka protokołów pobierania próbek środowiskowych do wykrywania rotawirusa, kolifaga MS2, kaliciwirusa kotów (FCV) i bakteriofaga P22 13,14,15,16. Jednak warunki walidacji opisane w tych badaniach, w tym szybkie wysychanie (<1 godz.) i małe powierzchnie (25 x 100 cm2), mogą nie odzwierciedlać odpowiednio ustawień polowych. Ponadto spodziewane niskie poziomy zanieczyszczenia powierzchni środowiskowych wymagają protokołów, które są w stanie wykryć bardzo niewiele cząstek wirusa.
Opracowaliśmy metodę próbkowania powierzchni opartą na makropianie do wykrywania i typowania norowirusa. Metoda ta została zwalidowana podczas kilku epidemii norowirusa. Protokół obejmuje 1) sposób pobierania próbek wymazów z powierzchni środowiskowych, (2) jak najlepiej zachować integralność próbek podczas pobierania i wysyłki do laboratorium oraz 3) badania laboratoryjne i typowanie norowirusa.

<table><tbody><tr><td>Nazwa ogólna zestawów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>wacik makropiankowy</td><td>Zestaw do nawilżonego wacika EnviroMax&nbsp;</td><td>Puritan</td><td>2588060PFUW</td></tr><<tr><td>strong>RNA bufor do lizy&nbsp; </td><td>CDC UNEX buffer</td><td>Microbiologics</td><td>Nr kat. MR0501</td></tr><tr><td>RNA ekstrakcja wirowa kolumna</td><td>Midi</td><td>Omega Biotek</td><td>Nr kat. R6664-02</td></tr><tr><td>RNA oczyszczanie RNA</td><td>Zymol RNA Zestaw do czyszczenia i koncentratora&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>Cat No R1016</td></tr><tr><td>Zestaw do Real time RT-PCR</td><td>AgPath Jednoetapowy zestaw RT-PCR Life</td><td></td><td>Technologies Nr kat. 4387391</td></tr><tr><td>Konwencjonalny zestaw RT-PCR</td><td>Qiagen jednoetapowy zestaw RT-PCR</td><td>Zestaw Qiagen</td><td>nr kat. 210212</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen QIAquick zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Zestaw Qiagen Kot</td><td> Nr 28704 lub 28706</td></tr><tr><td></td><td>Coliphage MS2</td><td>ATCC</td><td>Nr kat. 15597-B1</td></tr><tr><td></td><td>Transkrypty</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td> spływu RNA <td>Platforma PCR w czasie rzeczywistym</td><td>Biosystems</td><td>Model ABI 7500</td></tr><tr><td></td><td>Optyka 96-dołkowa płytka reakcyjna</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nr kat. 4316813</td></tr><tr><td></td><td><a href="http://www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/%20https:/www.thermofisher.com/order/catalog/en/US/adirect/lt?cmd=catProductDetail&amp; showAddButton=prawda& productID=4306311&_bcs_=H4sIAAAAAAAAAAA1RTWvDMAz9Nb4srDg2yXpNW3rZVyHbuRhHSQx2HWwnJf9%2BUkO6scMYGEmWnqX3%0A5Mec8e0p%2BGbUKWZMlFkNYTIa4h%2F5PqWByYqJI57r9bpJPQTnWxPRb7R3mB4jGrig6b0DdD40WOyT%0As9iBCUmHb1MYge78iYi06ZznPEd0exacFf 6LkD5h%2BNTr4yg1II0DH5C6rmh6imSA7GuuInsIq5TUy%0AjD6Yf%2FKU1Zav3NBrlZT13cr8s0ajGhNAJ4xsYvKoXcPkAYEHEwer5jrNFuWVdF1ieajNpbPwAhPY%0AvUrQ%2BTAjAt88w4zlm8Ly%2FYRha2yiyeUSUJM35ajHt%2BZiUS0KuWNityrHkLSjuyHUDbkgfuxgbfwx% 0AD9Q0vydo9rrs4te675%2FTKhvpd74AhB0C9yUCAAA%3D& returnURL=http%3A%2F%2Fwww.thermofisher.com%3A80%2Forder%2Fcatalog%2Fen%2FUS%2Fadirect%2Flt%3Fcmd%3DcatDisplayStyle%26catKey%3D101%26filterType%3D1%26OP%3Dfilter%26filter%3Dft_1101%252Ff_2005260*">MicroAmp Przezroczysta folia samoprzylepna&nbsp; </a></td><td>Thermo Scientific Nr</td><td>kat. 4306311</td></tr></tbody></table>

metoda pobierania wymazów w celu wykrycia ludzkiego norowirusa na powierzchniach

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Ludzkie norowirusy są główną przyczyną epidemicznego i sporadycznego zapalenia żołądka i jelit na całym świecie. Ponieważ większość zakażeń rozprzestrzenia się bezpośrednio z człowieka na człowieka lub pośrednio przez powierzchnie środowiskowe lub żywność, skażone ogniska i powierzchnie nieożywione są ważnymi nośnikami rozprzestrzeniania się wirusa podczas epidemii norowirusa.
Opracowaliśmy i oceniliśmy protokół wykorzystujący wymazy z makropianki do wykrywania i typowania ludzkich norowirusów z twardych powierzchni. W porównaniu z wacikami z końcówką z włókna lub chusteczkami antystatycznymi, waciki makropiankowe umożliwiają usuwanie wirusów (w zakresie 1,2-33,6%) z powierzchni desek sedesowych o wysokości do 700cm2. Protokół obejmuje etapy ekstrakcji wirusa z wymazów i dalszego zagęszczania wirusowego RNA za pomocą kolumn wirowych. W sumie 127 (58,5%) z 217 próbek wymazów, które zostały pobrane z powierzchni na statkach wycieczkowych i placówkach opieki długoterminowej, w których zgłoszono norowirusowe zapalenie żołądka i jelit, uzyskało pozytywny wynik na obecność norowirusa GII metodą RT-qPCR. Spośród nich 29 (22,8%) można było z powodzeniem zgenotypować. Podsumowując, wykrywanie norowirusa na powierzchniach środowiskowych przy użyciu opracowanego przez nas protokołu może pomóc w określeniu poziomu skażenia środowiska podczas epidemii, a także w wykrywaniu wirusa, gdy próbki kliniczne nie są dostępne; Może to również ułatwić monitorowanie skuteczności strategii remediacji.

Rycina 1 przedstawia schemat blokowy protokołu pobierania wymazów. Protokół ten składa się z czterech głównych etapów: 1) pobranie próbki, 2) przechowywanie i transport próbki, 3) oczyszczanie i stężenie wirusowego RNA oraz 4) test RT-qPCR i genotypowanie.
<img alt="Schemat procesu ekstrakcji kwasów nukleinowych; przygotowanie RT-PCR do wykrywania i typowania norowirusa." src="/files/ftp_upload/55205/55205fig1.j...

Metodologia pobierania próbek oparta na makropianie została opracowana i oceniona pod kątem wykrywania i kwantyfikacji norowirusa na twardych powierzchniach środowiskowych.

Metoda pobierania wymazów w celu wykrycia ludzkiego norowirusa na powierzchniach

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Ogólnym celem naszej metody pobierania próbek z powierzchni w oparciu o makropiankę jest zidentyfikowanie etiologii ogniska choroby, ogólna ocena dynamiki zanieczyszczenia środowiska wirusem oraz skuteczność strategii rekultywacji w przypadku norowirusa. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje sposób pobierania wymazów z powierzchni środowiskowych, zasady ich przechowywania i transportu, a także rekomendowane protokoły laboratoryjne służące do detekcji i typowania norowirusa z tych wymazów. Wyraźną zaletą tego protokołu pobierania wymazów środowiskowych dla norowirusów jest to, że określiliśmy najlepszy rodzaj materiału wymazowego, ustaliliśmy ilość norowirusa, jaką można odzyskać z twardych powierzchni, oraz wykazaliśmy, że protokół ten może być skutecznie stosowany do pobierania próbek z większych obszarów powierzchni.W tym filmie dwoje naukowców z mojego zespołu, Geun Woo Park oraz Preeti Chhabra, zaprezentuje protokół wymazowy służący do wykrywania i typowania norowirusów. Aby rozpocząć pobieranie wymazów, należy przejść do obszaru próbkowania i przesunąć wymaz po powierzchni jednym ruchem w kierunku poziomym, jednym ruchem w kierunku pionowym oraz jednym ruchem w kierunku ukośn

swab-sampling-method-for-the-detection-of-human-norovirus-on-surfaces

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano jednokrokowy test RT-PCR do detekcji i identyfikacji genogrup izolatów norowirusa z kałków dziecięcych, wykorzystujący primery i sondy TaqMan specyficzne dla regionu złącza otwartej ramki odczytu 1 (ORF1)-ORF2, który jest najbardziej konserwatywnym regionem genomu norowirusa. Szczegółowo przedstawiono niekomercyjną, kosztowo efektywną metodę ekstrakcji RNA.

Wykrywanie i genogrupowanie norowirusów z kału dzieci za pomocą jednoetapowej reakcji RT-PCR TaqMan

Ten film demonstruje test do ilościowego oznaczania ludzkich cząsteczek wirusopodobnych do norowirusa (VLP) wiążących się z ludzkimi bakteriami jelitowymi. Zawiesiny bakteryjne miesza się z VLP i inkubuje, aby umożliwić tworzenie kompleksów VLP-bakterii. Kompleksy są następnie znakowane przeciwciałami specyficznymi dla VLP znakowanymi fluoroforem, a następnie wizualizacją i kwantyfikacją opartą na cytometrii przepływowej w celu zidentyfikowania procentu bakterii związanych z VLP.

Test do ilościowego określenia wiązania ludzkich norowirusów VLP z bakteriami jelitowymi

Metoda EPA 1615 wykorzystuje filtr elektrododatni do koncentracji enterowirusów i norowirusów w środowisku i wodach pitnych. Niniejszy manuskrypt opisuje procedurę pobierania próbek do analiz metodą 1615.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. I. Pobieranie próbek wirusów

Tutaj prezentujemy procedurę pomiaru całkowitej liczby wirusów zdolnych do hodowli za pomocą linii komórkowej nerki Buffalo Green Monkey. Procedura zapewnia ustandaryzowane narzędzie do pomiaru występowania zakaźnych wirusów w środowisku i wodach pitnych.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. II. Całkowity test na obecność wirusa hodowlanego

Tutaj prezentujemy procedurę ilościowego oznaczania enterowirusa i norowirusa w wodach środowiskowych i pitnych za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej PCR. Średni odzysk wirusa z wód gruntowych przy użyciu tej znormalizowanej procedury z metody EPA 1615 wynosił 20% dla wirusa polio i 30% dla mysiego norowirusa.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. Część III. Wykrywanie wirusów za pomocą RT-qPCR

Rutynowe metody wykrywania wykorzystujące amplifikację genomu wirusa są ograniczone przez ich niezdolność do odróżnienia cząsteczek zakaźnych od niezakaźnych. Celem tego artykułu jest przedstawienie szczegółowych protokołów alternatywnych metod wspomagających dyskryminację zakaźnych cząstek norowirusa za pomocą wiązania aptamerów, dynamicznego rozpraszania światła i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Alternatywne metody in vitro do oznaczania integralności strukturalnej kapsydu wirusa

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie wiązania eukariotycznego patogenu ludzkiego norowirusa z bakteriami. Po wykonaniu wstępnego testu przyłączenia wirusa-bakterii, cytometria przepływowa jest stosowana do wykrywania bakterii związanych z wirusem w populacji.

Ilościowe określanie cząstek wirusopodobnych do ludzkiego norowirusa wiążących się z bakteriami komensalnymi za pomocą cytometrii przepływowej

Obywatelski projekt naukowy miał na celu rekrutację mieszkańców San Diego do pobierania próbek środowiskowych na obecność SARS-CoV-2. Stworzono wielojęzyczną platformę internetową do przesyłania danych za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu urządzenia mobilnego. System zarządzania informacjami laboratoryjnymi ułatwił gromadzenie tysięcy próbek zróżnicowanych geograficznie dzięki śledzeniu wyników w czasie rzeczywistym.

Wymazy ze środowiska miejskiego - rurociąg do pobierania próbek i wykrywania SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych

Niniejszy protokół opisuje prostą metodę opartą na zastosowaniu taśmy klejącej do pobierania próbek z powierzchni pomidorów oraz innych świeżych produktów rolnych, a następnie szybką detekcję całych komórek Salmonella przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Połączenie pobierania próbek za pomocą taśmy klejącej i fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ w celu szybkiego wykrywania Salmonella na świeżych produktach rolnych

Wysiłek fizyczny może indukować apoptozę w komórkach odpornościowych. Istnieją różne ograniczenia pomiarowe, szczególnie w odniesieniu do czasu wymaganego na izolację i przygotowanie próbki krwi przed przeprowadzeniem oceny. Przedstawiono szybką i małoinwazyjną procedurę analizy apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym.

Metodyka pobierania krwi z palca w celu oznaczenia apoptozy limfocytów indukowanej wysiłkiem fizycznym

Poznaj metodę pobierania wymazów z makropianki do wykrywania norowirusa na powierzchniach. Ta technika poprawia identyfikację źródeł zakażeń i ocenę skuteczności dezynfekcji w badaniach epidemiologicznych.

Metoda pobierania wymazów w celu wykrycia ludzkiego norowirusa na powierzchniach

Przeglądaj więcej filmów