Name: Opracowanie ekonomicznego systemu dostarczania DNA przez Acufection i jego zastosowanie w badaniach nad skórą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-19T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj ekonomiczną metodę dostarczania DNA do skóry myszy za pomocą acufection. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów odpornościowych w zapaleniu skóry i rozwój terapii chorób takich jak łuszczyca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta grantem z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Dziękujemy dr Betty Wu-Hsieh i Chien-Kuo Lee z NTU, Leigh Zerboni z Uniwersytetu Stanforda i dr Peterowi Hoffmannowi z Uniwersytetu Hawajskiego za przeczytanie manuskryptu, Yun Chien z NTU za pomoc techniczną oraz dr Wen-Chi Wei z Centrum Badań Biotechnologii Rolnictwa w Academia Sinica za porady techniczne.

Samice myszy w wieku 8 - 12 tygodni zostały wykorzystane do tego badania. Myszy typu dzikiego C57 / BL6 (WT) i z niedoborem IL-15 (Il15-/-) zakupiono odpowiednio z National Laboratory Animal Center (NLAC), Taiwan i Taconic Farm. Niedobór IL-15 (Il15-/-) idominacja IL-15 (Il15+/- i Il15+/+) wykazały stosunek 1:3 w drugim pokoleniu ze skrzyżowania heterozygot Il15+/-. Genotyp myszy Il15-/- został potwierdzony analizą PCR. Myszy utrzymywano w ośrodku wolnym od specyficznych patogenów (SPF) w Laboratory Animal Center (LAC), National Taiwan University (NTU) College of Medicine. Wszystkie procedury na zwierzętach, w tym materiały i metody znieczulające, zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez National Taiwan University College of Medicine i College of Public Health Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Affidavit of Approval of Animal Protocol 20130225).
1. Przygotowanie igieł do akupunktury
UWAGA: Igły do akupunktury to urządzenia medyczne składające się z uchwytu i końcówki igły (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Średnice igły do akupunktury wahały się od 0,2 mm (36 G) do 0,35 mm (28 G). Wybieramy najdelikatniejszy punkt igły, aby uniknąć potencjalnego nadmiernego uszkodzenia komórek podczas nakłuwania skóry. Igła 0,2 mm ma 4 różne długości, w tym 13 mm (0,5 cala), 25 mm (1,0 cala), 40 mm (1,5 cala) i 50 mm (2,0 cala). Zestaw 10 igieł o długości 13 mm zapewniał najlepszy komfort chwytu podczas oscylacji igły na skórze myszy C57BL/6. Parametry mogą być modyfikowane, jeśli metoda zostanie zastosowana do skóry większych zwierząt lub wykonana przez badaczy o większych dłoniach.
<ol>
	<li>Wyjmij igły do akupunktury ze sterylnego, niepirogennego opakowania. Umieść igły na sterylnym serwecie.</li>
	<li>Użyj samoprzylepnej taśmy do etykietowania, aby związać 10 igieł w wiązkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
	UWAGA: 10 igieł jest ułożonych geometrycznie, tworząc kształt walca. Dla wygody użyj kawałka folii parafinowej, aby ustabilizować układ przed nałożeniem taśmy klejącej. Upewnij się, że wszystkie punkty igły znajdują się na tej samej płaszczyźnie. Użycie wiązki zamiast pojedynczej igły ułatwia maksymalną infuzję DNA poprzez zwiększenie powierzchni kontaktu między igłami a skórą.</li>
</ol>
2. Przygotowanie dużej ilości plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn
<ol>
	<li>Przekształć chemicznie kompetentne komórki bakteryjne za pomocą plazmidowego DNA.</li>
	<li>Wybrać i zaszczepić pojedynczą kolonię bakteryjną w 3 ml pożywki LB zawierającej antybiotyki i inkubować w temperaturze 37 °C w wytrząsarce przez noc.</li>
	<li>Zwiększyć skalę hodowli, rozcieńczając kulturę bakteryjną w stosunku 1:100 w 250 ml pożywki LB antybiotykami i wstrząsając przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotuj dużą ilość DNA, używając wysokiej jakości zestawu do przygotowania plazmidu wolnego od endotoksyn, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Protokół Acufection wymaga wysokiej czystości i dużej ilości plazmidowego DNA. Zaleca się stosowanie wysokiej jakości, wolnego od endotoksyn i oczyszczonego kolumnowo plazmidowego DNA.</li>
	<li>Eluować DNA w sterylnej wodzie. Przechowywać DNA w małych porcjach w temperaturze -20 °C, aż będzie gotowe do koncentracji. 
	UWAGA: Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania DNA, aby zapewnić stałą ekspresję plazmidowego DNA.</li>
	<li>Rozcieńczyć plazmidowe DNA do 1 mg/ml w sterylnym PBS w celu uzyskania akufekcji.</li>
</ol>
3. Procedura dla Acufection
UWAGA: Optymalna ilość DNA i obszar docelowej powierzchni skóry mogą się różnić dla różnych genów i wymagają dalszej optymalizacji. Siła nakłucia i liczba nakłuć zrogowaciałej warstwy skóry również mogą się różnić w zależności od grubości skóry. Warunki te muszą być dokładnie określone po ocenie poziomu ekspresji acufekcyjnych transkryptów genowych za pomocą qRT-PCR.
<ol>
	<li>Zważyć myszy i podać tribromoetanol (400 μg na g masy ciała) we wstrzyknięciu otrzewnowym. 
	UWAGA: 2,2,2-tribromoetanol jest środkiem znieczulającym do wstrzykiwań, który był powszechnie stosowany u myszy. Roztwory sporządza się przez rozpuszczenie niefarmaceutycznego 2,2,2-tribromoetanolu (2,5 g) w wodzie destylowanej (200 ml) zawierającej 2,5% 2-metylo-2-butanolu.</li>
	<li>Stosuj maść okulistyczną weterynarza na oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu. 
	UWAGA: Efekt znieczulenia zostanie wywołany w ciągu 1 - 2 minut. Sprawdź odruch szczypania palca u nogi, aby zapewnić wystarczającą głębokość znieczulenia przed operacją.</li>
	<li>Ogolić skórę grzbietu i nałożyć krem do depilacji, aby rozpuścić białka keratynowe w łodydze włosa. 
	UWAGA: Stosowanie kremu do depilacji do usuwania włosów ułatwi infuzję DNA do skóry.</li>
	<li>Użyj wacików nasączonych wodą, aby zetrzeć krem do depilacji. 
	UWAGA: Krem do depilacji jest rozpuszczalny w wodzie. Całkowite usunięcie kremu zapobiegnie przetłuszczaniu się powierzchni i zapewni lepszy efekt nakłuwania.</li>
	<li>Użyj sterylnego bawełnianego wacika nasączonego 70% etanolem, aby zdezynfekować powierzchnię skóry.</li>
	<li>Zaznacz obszar docelowy (1 cm x 1 cm) na depilowanej skórze za pomocą wcześniej odmierzonego szablonu. UWAGA: Oznaczenie miejsca docelowego pomoże w nałożeniu wiązki igieł w górę iw dół w określonym obszarze. Jest to ważne, aby zapewnić dostarczenie tej samej ilości DNA do określonej powierzchni, aby zminimalizować różnice między eksperymentami.</li>
	<li>Umieść 10 μl kropli plazmidowego DNA (10 μg) na zaznaczonej skórze. 
	UWAGA: Ilość DNA do akutekcji różni się w zależności od różnych genów i rodzaju wektora ekspresji. Ilość użytego DNA powinna być dokładnie miareczkowana przed przeprowadzeniem interesującego eksperymentu. 10 μl to mała kropla płynu, która dobrze przylega do ogolonej i wydepilowanej skóry, nie zwijając się podczas nakłuwania. Uwzględnij grupę kontrolną myszy leczonych 10 μl pustego wektora DNA w celu porównania z myszami, u których zdiagnozowano badany gen.</li>
	<li>Przytrzymaj wiązkę igieł do akupunktury (<silna klasa = "xfig" >Ryc. 1B) i nakłuj zaznaczoną powierzchnię ruchem góra-dół przez 100 razy lub do momentu, gdy wilgoć z DNA w PBS zniknie na skórze. UWAGA: Może wystąpić pewne zaczerwienienie powierzchni skóry. Unikaj wykonywania głębokich nacięć, które krwawią. Liczba ruchów nakłuwania w górę iw dół na powierzchni skóry jest funkcjonalnie określana, gdy wilgoć z DNA w PBS (10 μl) znika ze skóry. Zdecydowaliśmy się 100 razy w ciągu 30 sekund, ponieważ dało to najbardziej spójne wyniki z genów dostarczanych przez akufekcję. W razie potrzeby igły mogą być ponownie użyte do maksymalnie 6 docelowych nakłuć skóry (1 cm x 1 cm każde). Opłucz igły w 70% etanolu i PBS między ćwiczeniami. Zmień igły na nowe, gdy są lub dla innego plazmidowego DNA, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.</li>
	<li>Umieść zainfekowane myszy na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała do momentu przebudzenia.</li>
	<li>Wróć myszy do klatki, gdy odzyskają wystarczającą przytomność. Uwaga: Myszy z akufekcją należy przechowywać w oddzielnej klatce (mniej niż 5 zwierząt na klatkę) od klatki myszy bez zachorowań.</li>
	<li>Umieść butelkę z wodą na miejscu i umieść klatkę z powrotem w stojaku IVC (indywidualnie wentylowana klatka).</li>
</ol>
4. Opieka pooperacyjna
<ol>
	<li>Przez pierwsze 48 godzin po zabiegu należy ściśle monitorować myszy pod kątem dyskomfortu, w tym zmian w zachowaniu (niepokój, pobudzenie lub zaburzenia odżywiania) lub nieprawidłowego wyglądu (szorstka sierść lub zgarbiona postawa).</li>
</ol>
5. Imikwimod (IMQ) Leczenie skóry z infekcją IL-15ΔE7
UWAGA: Ekspresja transkrypcyjna i produkcja białka genu akufekcyjnego są wykrywalne w dniu 3. Myszy z plazmidem będącym przedmiotem zainteresowania mogą być leczone różnymi rodzajami stymulantów 3 dni po transfekcji. Ilustrujemy to tutaj, traktując skórę myszy z zakwasem IL-15ΔE7 kremem IMQ. IMQ to amina imidazinoliny zatwierdzona do leczenia brodawek zewnętrznych narządów płciowych i okołoporodowych13. Wykazano, że miejscowe leczenie IMQ wywołuje u myszy zaburzenia skóry podobne do łuszczycy u myszy objawiające się łuszczącą się skórą, proliferacją naskórka i naciekiem neutrofili przez skórę12,14,15 .
UWAGA: Wektor plazmidowy zawierał pełnowymiarowe mysie cDNA IL-15, pod regulacją czynnika elongacyjnego α czynnika wydłużenia 1 (pEF), otoczone peptydem sygnałowym IL-2 i znacznikiem FLAG na końcu C (pEF-IL-15, 5859 par zasad), który został skonstruowany zgodnie z opisem Bamforda i wsp.16. Plazmid jest używany jako matryca IL-15 do usuwania pierwszych 16 aminokwasów w resztach 33 - 48 w eksonie 7 genu IL-15 dla IL-15ΔE7 (pEF-IL-15ΔE7, 5,811 par zasad) metodą SOE (synteza przez rozszerzenie na zakładkę) metodą PCR17. Kolonie bakteryjne, które zostały pomyślnie przekształcone za pomocą IL-15ΔE7, zostały zweryfikowane przez trawienie enzymem restrykcyjnym, a następnie sekwencjonowanie DNA12,18. Przygotowano dużą ilość plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn zgodnie z opisem w kroku 2 protokołu.
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy przez dootrzewnowe wstrzyknięcie tribromoetanolu (400 μg na g masy ciała) i nałożenie maści okulistycznej weterynarza na oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu. Sprawdź odruch szczypania palca u nogi, aby zapewnić wystarczającą głębokość znieczulenia przed rozpoczęciem zabiegów operacyjnych. UWAGA: Ponieważ skóra o wymiarach 2 cm x 2 cm będzie leczona z powodu IMQ, 2 dawki plazmidowego DNA pIL-15ΔE7 (10 μg w 10 μl PBS na dawkę) są umieszczane w 2 miejscach docelowych (1 cm x 1 cm każde).</li>
	<li>Zaznaczyć skórę boku (2 cm x 2 cm) pokrywającą obszar dotknięty chorobą.</li>
	<li>Użyj aplikatora z końcówką higieniczną, aby miejscowo nałożyć krem IMQ na zaznaczoną powierzchnię. Uwaga: krok 5.1 przeprowadza się tylko dla pierwszej dawki (60 mg/dawkę). Kolejne kolejne dawki stosuje się u myszy nieznieczulonych.</li>
	<li>Codziennie dokumentuj zmiany na skórze grzbietowej poddanej działaniu IMQ za pomocą kamery o wysokiej rozdzielczości. Uwaga: Jedna osoba trzyma mysz, podczas gdy druga nagrywa. Zdjęcia są robione i edytowane w późniejszym czasie.</li>
	<li>Poddaj myszy eutanazji poprzez wstrzyknięcie przedawkowania tribromoetanolu (800 μg na g masy ciała), a następnie zwichnięcie szyjki macicy w 4. lub 7. dniu po leczeniu IMQ. Skóra jest wycinana i przetwarzana (kroki 4.1 - 4.5).</li>
</ol>
6. Homogenat skóry myszy
<ol>
	<li>Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać poziome cięcie od podstawy ogona. Przejdź obustronnie do podstawy kończyny tylnej i kontynuuj cięcie pionowo wzdłuż boku do podstawy kończyny przedniej.</li>
	<li>Ostrożnie oderwij skórę od leżącej pod spodem tkanki od tyłu do przodu. Użyj nożyczek, aby odciąć skórę grzbietową. Ułóż skórę na sterylnej szalce Petriego.</li>
	<li>Użyj skalpela, aby wyciąć docelową skórę i natychmiast zamroź ją w ciekłym azocie. Uwaga: Ten sam rozmiar skóry bez (1 cm x 1 cm) lub z zabiegiem IMQ (2 cm x 2 cm) jest ustalany dla każdej myszy, aby zminimalizować różnice między eksperymentami.</li>
	<li>Umieść zamrożoną tkankę skórną na środku wstępnie schłodzonego 2-komorowego moździerza z uchwytami i tłuczkiem. Użyj ołowianego młotka na moździerzu, aby sproszkować tkankę.</li>
	<li>Szybko umieść sproszkowaną tkankę w nowej probówce zawierającej 500 μl odczynnika do lizy komórek do ekstrakcji RNA lub w probówce zawierającej 50 μl PBS i 1x koktajl inhibitorów proteazy w celu uzyskania lizatu białkowego.</li>
</ol>
7. H&E i immunohistochemiczne barwienie sekcji skóry
<ol>
	<li>Umieść tkankę skórną w kasecie i zanurz ją na noc w 4% paraformaldehydzie.</li>
	<li>Osadzanie i wycinanie tkanki, które w naszym przypadku zostało wykonane przez Pracownię Patologii w LAC, NTU. Uwaga: Przekrój jest cięty na grubość 5 μm. Umieść skrawki tkanki na dodatnio naładowanych szkiełkach.</li>
	<li>Podgrzewać szkiełka w temperaturze 65 °C przez 15 min.</li>
	<li>Umieść szkiełka w stojaku do barwienia. Zanurz stojak w odpowiednim zbiorniku zawierającym substytut ksylenu na 5 minut dwukrotnie, a następnie sekwencyjnie zanurz w 100%, 95%, 80%, 75%, 60% i 50% etanolu (po 5 minut) w celu ponownego nawodnienia. Zanurz szkiełka w wodzie z kranu na 3 minuty przed barwieniem.</li>
	<li>Wykonaj barwienie hematoksyliną i eozyną. Uwaga: Barwienie H & E zostało wykonane na życzenie w Laboratorium Patologii w LAC, NTU.</li>
	<li>W przypadku barwienia immunohistochemicznego należy zablokować skrawek roztworem blokowym w temperaturze pokojowej na 5 minut, aby zmniejszyć niespecyficzne barwienie tła. Uwaga: Roztwór blokowy został opracowany komercyjnie przy użyciu technik barwienia immunologicznego. Ten produkt nie zawiera surowicy zwierzęcej.</li>
	<li>Zanurz szkiełko w PBS, aby wypłukać roztwór blokowy.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór blokowy w PBS w stosunku 1:10 i dodać 2% płodową surowicę bydlęcą (FBS) (roztwór rozcieńczalnika).</li>
	<li>Odpowiednio rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe należy odpipetować na sekcję i inkubować przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Uwaga: Przeciwciała rozcieńcza się w roztworze rozcieńczalnika. Stężenia przeciwciał dla tego barwienia zostały zoptymalizowane na poziomie 1:800 i 1:200 odpowiednio dla Ki67 (klon SolA15) i Ly6G (klon 1A8). Stwierdzono, że te stężenia wykazują wyraźną plamę bez barwienia tła.
	<ol>
		<li>Wybarwić jeden odcinek szeregowy w tym samym przebiegu tym samym roztworem, pomijając przeciwciało pierwszorzędowe w celu kontroli nieswoistego wiązania przeciwciała drugorzędowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj szkiełka trzy razy w TBS plus 0,1% Tween-20 (roztwór TBST) przez 5 minut każda. Zmieniaj roztwór między praniami.</li>
	<li>Odpipetować jedną kroplę znakowanych polimerów do każdej sekcji i inkubować w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Uwaga: Znakowany polimer jest komercyjnie przygotowywany przez połączenie polimerów aminokwasowych z peroksydazą i przeciwciałem drugorzędowym, które jest redukowane do fragmentu Fab'. Odczynnik jest gotowy do użycia do barwienia immunohistochemicznego wycinków tkanek myszy.</li>
	<li>Umyj szkiełka trzy razy w TBST przez 5 minut każda. Zmieniaj roztwór między praniami.</li>
	<li>Odpipetować roztwór tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzindyny (DAB) na wycinek tkanki i odstawić w temperaturze pokojowej do momentu, gdy w jasnym polu mikroskopowym pojawi się brązowy osad. Uwaga: Czas wytrącania się DAB w obecności peroksydazy wynosi około 30 minut.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w wodzie, aby zatrzymać aktywność peroksydazy. Zanurz szkiełka w roztworze zieleni metylowej do barwienia jądrowego. Umyj szkiełka trzy razy w PBS przez 5 minut każda.</li>
	<li>Umieść szkiełko nakrywkowe na poplamionej sekcji, która jest pokryta trwałym medium montażowym (8 μl na sekcję).</li>
</ol>
8. Fotografia i analiza wycinka barwionej tkanki
<ol>
	<li>Wizualizacja wybarwionych H &E i skrawków tkanek IHC pod mikroskopem jasnego pola. Rejestruj obrazy za pomocą kamery ze sprzężeniem ładunkowym (CCD) podłączonej do mikroskopu. Do analizy ilościowej można użyć oprogramowania do obrazowania
	<ol>
		<li>Zeskanuj całe poplamione fragmenty za pomocą skanoskopu z obiektywem 20X.</li>
		<li>Zmierz grubość naskórka w obrębie 1-milimetrowego segmentu naskórka i policz liczbę komórek immunoreaktywnych Ki67 w tym segmencie. 
		UWAGA: Analiza ilościowa jest wykonywana przy użyciu oprogramowania do automatyzacji mikroskopii i analizy obrazu. Grubość naskórka określa się na podstawie odległości między warstwą podstawną a najbardziej zewnętrzną warstwą naskórka.</li>
		<li>Policz liczbę komórek immunoreaktywnych Ly6G w obszarze skóry właściwej (prostokąt 230 x 270μm2) bezpośrednio pod skórą poddawaną miejscowemu działaniu IMQ.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cytokines+in+murine+cutaneous+irritant+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+applied+toxicology+%3A+JAT%22%5BJournal%5D)">Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses.</a> Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).</li>
<li>Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+immune+sentinels+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">Skin immune sentinels in health and disease.</a> Nature reviews. 9, 679-691 (2009).</li>
<li>Liu, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+application+of+HIV+DNA+vaccine+with+cytokine-expression+plasmids+induces+strong+antigen-specific+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses.</a> Vaccine. 20, 42-48 (2001).</li>
<li>Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+application+of+viral+vectors+for+epidermal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer.</a> J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).</li>
<li>Partidos, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+vaccines+into+the+skin+without+needles+and+syringes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Delivering vaccines into the skin without needles and syringes.</a> Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).</li>
<li>Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+DNA+through+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Immunization with DNA through the skin.</a> Methods. 31, 232-242 (2003).</li>
<li>Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+and+in+vitro+gene+transfer+to+mammalian+somatic+cells+by+particle+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).</li>
<li>Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+immunization+is+a+simple+method+for+eliciting+an+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response.</a> Nature. 356, 152-154 (1992).</li>
<li>Haynes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-mediated+DNA+vaccine+delivery+to+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin.</a> Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).</li>
<li>Tuomela, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+and+general+safety+of+a+naked+DNA+plasmid%2C+GTU-MultiHIV%2C+in+a+rat%2C+using+a+quantitative+PCR+method%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method.</a> Vaccine. 23, 890-896 (2005).</li>
<li>Eriksson, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+to+skin+and+wound+by+microseeding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding.</a> J Surg Res. 78, 85-91 (1998).</li>
<li>Lee, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternatively+spliced+IL-15+isoform+modulates+abrasion-induced+keratinocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation.</a> J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).</li>
<li>Rudy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imiquimod+%28Aldara%29%3A+modifying+the+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatol+Nurs%22%5BJournal%5D)">Imiquimod (Aldara): modifying the immune response.</a> Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).</li>
<li>van der Fits, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imiquimod-induced+psoriasis-like+skin+inflammation+in+mice+is+mediated+via+the+IL-23%2FIL-17+axis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis.</a> J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).</li>
<li>Sumida, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+CXCR2+and+BLT1+facilitates+neutrophil+infiltration+and+resultant+keratinocyte+activation+in+a+murine+model+of+imiquimod-induced+psoriasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis.</a> J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).</li>
<li>Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+untranslated+region%2C+signal+peptide%2C+and+the+coding+sequence+of+the+carboxyl+terminus+of+IL-15+participate+in+its+multifaceted+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The 5' untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control.</a> J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).</li>
<li>Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+hybrid+genes+without+the+use+of+restriction+enzymes%3A+gene+splicing+by+overlap+extension%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension.</a> Gene. 77, 61-68 (1989).</li>
<li>Tan, X., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+IL-15+isoforms+generated+by+alternative+splicing+are+expressed+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Immun%22%5BJournal%5D)">Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium.</a> Genes Immun. 7, 407-416 (2006).</li>
<li>Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+trafficking+of+DNA+in+keratinocytes%3A+evidence+for+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins.</a> Gene Ther. 11, 765-774 (2004).</li>
<li>Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+via+hair+follicles+by+topical+application+of+naked+DNA+to+normal+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin.</a> Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).</li>
<li>Kennedy-Crispin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes%27+response+to+injury+upregulates+CCL20+and+other+genes+linking+innate+and+adaptive+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity.</a> J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych interesów finansowych do ujawnienia.

Najważniejszym krokiem zapewniającym ekspresję akufektycznego plazmidowego DNA jest równomierne oscylowanie i rozluźnienie zrogowaciałej warstwy skóry. Delikatnie popychając igły bez przecinania skóry, siła powinna być wystarczająco duża, aby wcisnąć powierzchnię. Aby ułatwić wchłanianie DNA w 10 μl roztworu na powierzchni 1 cm x 1 cm, igły powinny oscylować w górę iw dół około 100 razy w ciągu 30 s. Można określić siłę, która jest potrzebna do nakłucia skóry i odnotowując, ile razy jest to potrzebne, aby uzyskać najleps...

Skóra to pierwsza linia obrony gospodarza. Keratynocyty (KC) są głównym typem komórek w skórze ludzi i myszy. W odpowiedzi na bodźce środowiskowe (np. światło słoneczne, tlen, chemikalia i inwazja patogenów), KC są aktywowane i wytwarzają szeroki wachlarz prozapalnych cytokin i chemokin, takich jak IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF-α i GM-CSF1. Razem wyzwalają rekrutację komórek odpornościowych do skóry. Zaostrzone zapalenie skóry jest często związane z wieloma chorobami u ludzi, w tym ostrym ektopowym kontaktowym zapaleniem skóry i przewlekłym zapaleniem zależnym od limfocytów T (np. alergicznym kontaktowym zapaleniem skóry i łuszczycą)2. Modulowanie odpowiedzi prozapalnych w skórze poprzez hamowanie aktywacji KC jest prawdopodobnym podejściem do leczenia zapalenia skóry. Protokół ten opisuje nowe podejście do przejściowej ekspresji genu cytokin w naskórku w celu zbadania odpowiedzi immunologicznej wynikającej z takiego leczenia w skórze.
Naskórek tworzy najbardziej powierzchowną warstwę skóry. Służy jako fizyczna bariera powstrzymująca substancje zewnętrzne, takie jak kwasy nukleinowe i patogeny, przed przedostaniem się do głębszych warstw skóry. Opracowano kilka bezigłowych technik transferu DNA naskórka3,4. DNA w roztworze lub związane z liposomami kationowymi lub wektorami adenowirusowymi zostało bezpośrednio nałożone na naskórek zmodyfikowany technikami takimi jak usunięcie warstwy rogowej naskórka lub leczenie odczynnikiem do depilacji. Usunięcie zrogowaciałego nabłonka ułatwia przenikanie DNA przez barierę naskórkową i interakcję z keratynocytami i komórkami Langerhansa w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej5. Chociaż do transferu DNA dostępna jest duża powierzchnia i podejście to nie wymaga igieł, istnieją wady, w tym wymóg dużych ilości DNA (10 - 100 μg), surowe traktowanie skóry przez stripping oraz niespójne wyniki w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej u uodpornionych zwierząt bez wzmacniacza dostarczania DNA6. Wykazano, że wewnątrzkomórkowe dostarczanie nagiego DNA do skóry za pośrednictwem mikrocząsteczek jest wysoce skuteczne i powtarzalne w indukowaniu odpowiedzi immunologicznej7,8. Ręczny pistolet genowy został użyty do bombardowania miejsca docelowego skóry plazmidowymi cząstkami złota pokrytymi DNA o średnicy 2 μm za pomocą przepływu powietrza pod ciśnieniem helu9. Plazmidowe DNA jest przypuszczalnie pobierane przez KC i komórki dendrytyczne (DC) w skórze, a białko ulega lokalnej ekspresji lub jest transportowane do drenujących węzłów chłonnych przez DCs10. Chociaż system pistoletów genowych jest prosty i wymaga ograniczonego doświadczenia technicznego, koszt przygotowania i dostarczenia "pocisku DNA" (tj. proszków złota, helu) oraz samego pistoletu genowego ograniczył jego ogólne zastosowanie. Ponadto wymóg stosowania systemu dostarczania helu ogranicza łatwość transportu pistoletu genowego, gdy eksperymenty są przeprowadzane w różnych miejscach. Wykazano, że mikrosiew osiąga wyższą efektywność transferu genów niż pojedyncze wstrzyknięcie i bombardowanie cząstkami11. Mikrosiew wykorzystuje pistolet do tatuażu do dostarczania DNA do skóry bez użycia kulek cząsteczkowych11. Oscylowanie mikroigłami na skórze przy użyciu tego podejścia prawdopodobnie bezpośrednio zeskrobać błonę komórkową, a tym samym przenieść DNA do wielu komórek w tym samym czasie. Wadą jest jednak ból związany z dużą liczbą wstrzyknięć igłami o średnicy 0,254 mm.
Tutaj oferujemy alternatywne podejście do dostarczania DNA in vivo. Protokół "akufekcjonacji", który tutaj opisaliśmy, zapewnia ekonomiczny i wydajny sposób dostarczania plazmidowego DNA do skóry myszy. Krótko mówiąc, dziesięć igieł do akupunktury (0,2 mm średnicy x 13 mm długości) było związanych w wiązkę taśmą klejącą. Objętość 10 μl PBS z 10 μg plazmidowego DNA zawierającego interesujący nas transgen umieszczono na ogolonej, potraktowanej kremem do depilacji skórze boku. Za pomocą wiązki igieł do akupunktury do oscylacji powierzchni (1 cm x 1 cm) skóry, keratyny w warstwie rogowej zostały rozluźnione, a plazmidowe DNA nałożone na powierzchnię zostało wchłonięte przez naskórek. Uszkodzenia skóry były monitorowane i stwierdzono, że są minimalne. Ekspresja transfekowanego genu w skórze po zakażeniu została potwierdzona zarówno ilościowym testem real-time PCR (qRT-PCR), jak i testem ELISA. Immunomodulacyjne działanie IL-15ΔE7 dostarczanej przez ACUFECTION na stan zapalny skóry wykazano przy użyciu mysiego modelu traktowanego IMQ12. Podczas gdy akcecja okazuje się łatwą i mniej wymagającą metodą dostarczania DNA in vivo, optymalna ilość DNA dla różnych genów i czas nakłuwania skóry muszą być starannie zoptymalizowane, aby uzyskać powtarzalne wyniki.

<table><tbody><tr><td>Accu Handy Needle</td><td>Accu</td><td>36Gx0,5</td><td>Wyrób medyczny</td></tr><tr><td>NairTM Balsam</td><td>Kościół & Dwight</td><td>N/A</td><td>Służy do usuwania włosów</td></tr><tr><td>Substytut Shandon Xyline</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6764506</td><td>Deparunizacja</td></tr><tr><td>Avertin (2,2,2-Tribrometanol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4,840-2</td><td>Znieczulenie</td></tr><tr><td>2-metylo-2-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>152463</td><td>Rozpuszczalnik do rozpuszczania avertyny</td></tr><tr><td>DifcoTM bulion LB, Miller</td><td>BD</td><td>244620</td><td>Rozmnażanie i utrzymanie E. coli dla biologii molekularnej</td></tr><tr><td>Mysz IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go zestaw</td><td>eBioscience</td><td>88-7215</td><td>Pomiar białka IL-15</td></tr> Przeciwciało <tr><td>przeciw myszom Ly6G</td><td>BioLegend</td><td>127601</td><td>stosowane do immunohistochemicznego barwienia</td></tr><tr><td>anty-mysiego Ki-67</td><td>eBioscience</td><td>14-5698-80</td><td>Przeciwciało stosowane do barwienie immunohistochemiczne</td></tr><tr><td>Prosta plama Mysz MAXPO (Szczur)</td><td>Nichirei Biosciences</td><td>414341F</td><td>Odczynnik do blokowania sygnału tła w barwieniu myszy na myszy</td></tr><tr><td>Zestaw substratów peroksydazy DAB (HRP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Podłoże nadtlenkowe do barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Ultra V block</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-060-UB</td><td>Redukcja niespecyficznych barwień tła</td></tr><tr><td>Zieleń metylowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8884</td><td>Barwienie jądrowe</td></tr><tr><td>Vecta MountTM</td><td>Vector Laboratories</td><td>M-5000</td><td>Trwale zachowujące plamy histochemiczne Inhibitor</td></tr><tr><td>proteazy w tabletkach koktajlowych</td><td>Roche</td><td>04-693-116-001</td><td>Hamuje aktywność proteazy w lizacie komórkowym</td></tr><tr><td>Aldara krem 3M</td><td>Parmaceuticals</td><td>N/A</td><td>5% imikwimod krem</td></tr><tr><td>Bessman Tissue Pulverizer</td><td>Spectrum Labs</td><td>189475</td><td>Służy do sproszkowania tkanki skórnej</td></tr><tr><td>ABI7900HT cykler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td>ilościowy test PCR w czasie rzeczywistym</td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Panasonic</td><td>HDC-SD60</td><td>Dokumentacja obrazu</td></tr><tr><td>Axio Scope.A1</td><td>ZEISS</td><td>N/A</td><td>Mikroskopia jasnego pola</td></tr></tbody></table>

opracowanie ekonomicznego systemu dostarczania dna przez "acufection" i jego zastosowanie w badaniach nad skórą

Development of an Economical DNA Delivery System by "Acufection" and its Application to Skin Research

Dysregulacja odpowiedzi immunologicznej w skórze jest związana z licznymi chorobami skóry u ludzi. Bezpośredni transfer genów związanych z odpornością do tkanki skórnej jest fascynującym podejściem do badania immunologicznej modulacji zapalenia skóry w mysich modelach chorób ludzkich. Poniżej przedstawiamy opłacalny protokół, który dostarczył nagie DNA do skóry myszy i doprowadził do ekspresji transgenu. Metoda ta została ukuta pod nazwą "acufection", oznaczającątransfekcję DNA za pośrednictwem nakłucia aku. Aby wykonać akufekcję, skórę myszy najpierw nastrzyknięto DNA w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie lekko nakłuwano wiązką igieł akupunkturowych, aby ułatwić wchłanianie DNA i transfekcję do komórek. Plazmidowe DNA jest przypuszczalnie wychwytywane przez keratynocyty i komórki dendrytyczne (DC) w skórze i wyrażane w białko. Mechaniczne nakłucie igłami samo w sobie nie spowodowało uszkodzenia skóry ani nie wywołało aktywacji keratynocytów. Ekspresję transfekowanych genów wykryto w skórze zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i translacyjnym po zaostrzeniu przez 2 dni i utrzymała się do 7 dni. Głównym celem opracowania tej metody akutekcji było zbadanie wcześniej niezdefiniowanej izoformy IL-15. Stosując tę metodę, alternatywnie splicowaną izoformę IL-15 z częściowo usuniętym eksonem 7 (IL-15ΔE7) poddano ekspresji w skórze, a następnie potraktowano agonistą receptora Toll-podobnego 7 (TLR7), imikwimodem (IMQ), w celu wywołania stanu zapalnego. IL-15ΔE7 dostarczana przez ACUFECTION w hamowaniu przez skórę proliferacji keratynocytów, grubości naskórka i rekrutacji neutrofili w zapaleniu skóry wywołanym IMQ. Wraz z rosnącym zainteresowaniem identyfikacją mechanizmów regulacyjnych zapalenia skóry, opisany tutaj protokół stanowi opłacalną i wszechstronną alternatywę dla systemu pistoletów genowych lub mikrosiewu w celu dostarczania DNA in vivo. Może to potencjalnie pozwolić na odkrycie funkcji nowego genu w skórze lub na zbadanie nowych metod leczenia chorób skóry.

Choć w ciągu pierwszej godziny po nakłuciu igłami do akupunktury zaobserwowano pewne zaczerwienienie, skóra oczyściła się w 2. dniu, a do 7. dnia po nakłuciu nie stwierdzono żadnych niepożądanych reakcji skórnych (Rysunek 2A). Analiza H&amp;E wykazała, że nakłuwanie igłami indukuje bardzo niski poziom ortokerozy naskórka oraz minimalną infiltrację skóry właściwej w porównaniu z nieleczoną skórą (Rysunek 2B). Grubość naskórka (<st...

Ten protokół jest opłacalną alternatywą dla ekspresji nagiego plazmidowego DNA w skórze myszy. Ogólnym celem protokołu jest dostarczenie genów związanych z odpornością do tkanki skórnej w celu określenia funkcjonalnej roli określonego genu w zapaleniu skóry.

Opracowanie ekonomicznego systemu dostarczania DNA przez "Acufection" i jego zastosowanie w badaniach nad skórą

Dysregulation of immune response in skin is associated with numerous human skin disorders. Direct transfer of immune-related genes into skin tissue is a ...

Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie genów związanych z odpornością do tkanki skóry w celu określenia funkcjonalnej roli konkretnego genu w zapaleniu skóry. Metoda ta może pomóc w odkryciu funkcji nowego genu w skórze, co przyczyni się do opracowania nowych terapii chorób skóry, takich jak łuszczyca.Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona kosztowo efektywny sposób ekspresji plazmidowego DNA w skórze myszy. Aby przygotować plazmidowe DNA, należy zaszczepić trzy mililitry podłoża LB z dodatkiem antybiotyku wcześniej transformowaną i wyselekcjonowaną kolonią bakterii. Hodowlę należy inkubować przez noc na wytrząsarce w temperaturze 37 °C.Po inkubacji nocnej rozcieńczyć kulturę bakterii w 250 mililitrach pożywki LB, uzupełnionej o antybiotyki, w celu zwiększenia skali hodowli. Inkubować kulturę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wstrząsaniem. Użyć wysokiej jakości zestawu do izolacji plazmidów wolnych od endotoksyn, aby przygotować dużą ilość DNA.Rozcieńczyć otrzymane plazmidowe DNA w sterylnym PBS do końcowego stężenia 1 mg/ml. Po znieczuleniu myszy nałożyć do oczu weterynaryjną maść okulistyczną, aby zapobiec ich wysychaniu. Następnie ogolić skórę na grzbiecie zwierzęcia.Następnie należy nanieść krem depilacyjny, aby rozpuścić białka keratyny w pozostałych łodygach włosów. Po depilacji krem należy usunąć za pomocą nasączonego wodą wacika bawełnianego. Używając sterylnego patyczka bawełnianego nasączonego 70% etanolem, należy zdezynfekować powierzchnię skóry i wyznaczyć docelowy obszar skóry za pomocą wcześniej przygotowanego szablonu. Na wybrany obszar skóry należy nanieść 10 µL roztworu DNA zawierającego 10 µg plazmidowego DNA.Aby wykonać akupunkturę u myszy, należy trzymać urządzenie do akupunktury prostopadle do skóry i wielokrotnie nakłuwać wyznaczoną powierzchnię. Procedurę tę powtarza się 100 razy w ciągu 30 sekund lub do momentu wchłonięcia naniesionego na skórę roztworu. Aby uzyskać skuteczną ekspresję plazmidowego DNA w tkance skóry, ważne jest unikanie zbyt głębokich nacięć skóry oraz upewnienie się, że roztwór DNA został całkowicie wchłonięty.Po zakończeniu procedury umieść mysz w miejsce zabiegu na podgrzewanej podkładce, aby utrzymać temperaturę jej ciała do czasu wybudzenia z narkozy. Gdy mysz odzyska wystarczającą świadomość, przenieś ją z powrotem do klatki i zapewnij dostęp do wody oraz pokarmu. Przez pierwsze 48 godzin po zabiegu uważnie monitoruj mysz pod kątem wszelkich objawów dyskomfortu, w tym zmian behawioralnych oraz nieprawidłowości w wyglądzie.Zaznacz skórę na boku w obszarze dwóch centymetrów na dwa centymetry, który był wcześniej traktowany IL-15deltaE7. Następnie, używając aplikatora bawełnianego, nanieś miejscowo krem z imikimodem na wyznaczoną powierzchnię. Aby monitorować codzienne zmiany skóry grzbietowej leczonej imikimodem, jeden badacz powinien rejestrować obraz, podczas gdy drugi bezpiecznie trzyma mysz i wystawia leczony obszar w pole widzenia kamery wysokiej rozdzielczości.Obserwuj skórę w miejscu zabiegu pod kątem wystąpienia takich zmian jak srebrzysta łuska, blaszka lub rumień. Po uśmierceniu myszy zgodnie z opisem, wykonaj poziome nacięcie u podstawy ogona za pomocą nożyczek serologicznych i rozszerz nacięcie obustronnie w kierunku podstawy każdej z kończyn tylnych. Następnie wykonaj nacięcia pionowe, równolegle do boków ciała, sięgające podstawy każdej z czterech kończyn.Ostrożnie oddziel skórę od tkanki podścielnej, zaczynając od ogona w kierunku głowy zwierzęcia. Za pomocą nożyczek wyciąć skórę grzbietową i przenieść uzyskaną próbkę do sterylnej szalki Petriego. Za pomocą skalpela wyciąć odpowiednią próbkę skóry docelowej.Następnie natychmiast zamrozić próbkę w ciekłym azocie. Aby sproszkować tkankę skóry, umieścić zamrożoną próbkę w centrum uprzednio schłodzonego dwukomorowego moździerza do rozdrabniania tkanek, wyposażonego w uchwyty i tłuczek, a następnie użyć młotka do rozcierania w moździerzu. Natychmiast przenieść sproszkowaną tkankę do nowych probówek zawierających odczynniki odpowiednie dla każdej z kolejnych analiz.Procedurę barwienia należy rozpocząć od podgrzania preparatów skóry utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, przygotowanych zgodnie z opisem w protokole tekstowym, w temperaturze 65 °C przez 15 minut. Następnie należy dwukrotnie zanurzyć preparaty w ksylenie na pięć minut. Po tym etapie preparaty należy rehydratyzować, przepuszczając je przez gradient etanolu.Na koniec, przed barwieniem, przemyj preparaty wodą z kranu przez trzy minuty. W przypadku barwienia immunohistochemicznego najpierw obrysuj tkankę wodoodpornym pisakiem, a następnie inkubuj skrawki w roztworze blokującym, aby wyeliminować niespecyficzne barwienie tła. Po blokowaniu przemyj preparat w PBS.Następnie nanieś pipetą rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe na przekrój i inkubuj przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj preparaty trzykrotnie w buforze TBST przez pięć minut. Następnie nanieś jedną kroplę znakowanego polimeru na przekrój i inkubuj preparat w temperaturze pokojowej przez 40 minut.Następnie przemyj preparat trzykrotnie w TBST przez pięć minut, wymieniając roztwór pomiędzy kolejnymi płukaniami. Potem nanieś 100 µL roztworu DAB na przekroje tkanek i pozostaw do reakcji w temperaturze pokojowej, aż pod mikroskopem pojawi się brązowy produkt.Następnie przemyj preparaty wodą, aby zatrzymać aktywność peroksydazy. Wykonaj przeciwbarwienie preparatu w roztworze zieleni metylowej, która specyficznie wiąże się z DNA, przez pięć sekund. Przemyj preparaty trzy razy w PBS, po pięć minut każdego mycia.Na zabarwiony przekrój nanieś 8 µL trwałego medium montażowego i przykryj go szkiełkiem nakrywką. Na koniec wykonaj obrazowanie preparatów zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawiono tutaj mysz kontrolną oraz mysz, u której zastosowano akupunkturę na jedną godzinę, dwa dni, pięć dni lub siedem dni przed wykonaniem fotografii.Jak pokazano tutaj, procedura akufeckcji nie spowodowała zauważalnych uszkodzeń skóry. Ponadto akufeckcja nie wpłynęła ani na grubość skóry, ani na liczbę komórek wykazujących pozytywną ekspresję Ki67. Potwierdza to dodatkowo, że procedura nie powoduje rozrywania tkanek ani proliferacji komórek naskórka.Ekspresja CXCL-1 i IL-6 zmierzona za pomocą qRT-PCR. Potwierdza ona minimalną aktywację keratynocytów zaobserwowaną podczas acufection. Z drugiej strony, qRT-PCR i ELISA wykazały wyraźną ekspresję IL-15 w skórze myszy poddanych acufection z genem IL-15.Ostatecznie, dostarczanie genu IL-15deltaE7 do tkanki skóry za pomocą akufekcji zapobiega rozwojowi łuszczącej się skóry i infiltracji neutrofili u myszy traktowanych imikimodem. Po opanowaniu techniki procedura ta może zostać wykonana w 12 minut, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przygotowaniu nowego zestawu igieł do każdej akufekcji oraz partii wysokiej jakości plazmidowego DNA.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak infekcja wirusowa, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. dotyczące funkcji nowego genu w modulowaniu odpowiedzi immunologicznej przeciwwirusowej. Po dopracowaniu ta metoda utoruje drogę badaczom z dziedziny immunologii do eksploracji odpowiedzi immunologicznej w skórze. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak w kosztowo efektywny sposób indukować ekspresję plazmidowego DNA w skórze myszy.

development-an-economical-dna-delivery-system-acufection-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten protokół wideo opisuje technikę hodowli in vitro opartą na kasecie do generowania ludzkiej skóry organotypowej przy użyciu keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej. Naśladują funkcję i fizjologię swoich odpowiedników tkankowych in vivo.

Organotypowa hodowla skóry 3D: kasetowa technika hodowli in vitro do regeneracji ludzkiego naskórka na bezkomórkowej skórze właściwej

Film demonstruje metodę bezpośredniego transferu plazmidowego DNA kodującego interleukinę-15 do tkanki skórnej modelu myszy z niedoborem interleukiny-15 za pomocą akupunktury za pomocą mikroigieł. Te mikroigły generują mikronakłucia w najbardziej zewnętrznej warstwie skóry, ułatwiając wchłanianie i transfekcję plazmidowego DNA do komórek naskórka, w tym keratynocytów, w tkance skórnej.

Dostarczanie genów związanych z odpornością za pośrednictwem akufekcji do tkanek skóry myszy

Tatuowanie skóry to skuteczny i bezpieczny sposób na śródskórne dostarczenie szczepionki DNA. W tym przypadku plazmid DNA kodujący EGFP jest dostarczany przez wytatuowanie na skórę myszy laboratoryjnej, a ekspresja EGFP w komórkach skóry jest następnie sprawdzana za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Tatuowanie skóry jako nowatorskie podejście do dostarczania szczepionek DNA

To badanie pokazuje przeprogramowanie komórek somatycznych w kierunku pluripotencji in vivo bez generowania potworniaków. Zastosowaliśmy hydrodynamiczne wstrzyknięcie do żyły ogonowej plazmidowego DNA kodującego czynniki Yamanka, aby indukować przeprogramowanie in vivo dorosłych hepatocytów na komórki o zwiększonej pluripotencji.

In vivo (in vivo) Przeprogramowanie dorosłych komórek somatycznych na pluripotencję przez nadekspresję czynników Yamanaka

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego i szczegółowego protokołu generowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej organotypowej skóry z keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

W tym artykule pokazujemy, jak przeprowadzana jest technika mikrobiopsji absorpcyjnej i jak próbka może być wykorzystana do ekstrakcji RNA w celu prostego i jednoczesnego pobierania próbek skóry i krwi w minimalnie inwazyjny sposób.

Chłonne pobieranie próbek mikrobiopsji i ekstrakcja RNA do minimalnie inwazyjnej, jednoczesnej analizy krwi i skóry

Tutaj prezentujemy protokół do mikrowzorcowania komórek w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą adhezji programowanej przez DNA. Protokół ten wykorzystuje laboratoryjną platformę fotolitograficzną do tworzenia wzorów oligonukleotydów DNA na szkiełku szkiełkowym, a następnie znakuje błony komórkowe dostępnymi na rynku komplementarnymi oligonukleotydami. Hybrydyzacja oligonukleotydów powoduje zaprogramowaną adhezję komórek.

Proste, niedrogie i modułowe modelowanie komórek za pomocą DNA

Tutaj opisujemy protokoły dla trzech typów hodowli eksplantatów skóry embrionalnej ptaków, które mogą być użyte do badania interakcji tkankowych, obrazowania 4D filmu poklatkowego (3D plus czas), globalnych lub lokalnych zaburzeń funkcji molekularnych oraz charakterystyki biologii systemów.

Wykorzystanie eksplantatów ze skóry ptaków do badania wzorców tkanek i organogenezy

Tutaj opisujemy metody mikrofabrykacji pionowo ustawionych nanowłókien węglowych (VACNF), przenoszenia VACNFów na elastyczne podłoża i stosowania VACNFów zarówno na sztywnych, jak i elastycznych podłożach do roślin w celu dostarczania biomolekuł i barwników.

Stosowanie pionowo ustawionych układów nanowłókien węglowych na sztywnych lub elastycznych podłożach do dostarczania biomolekuł i barwników do roślin

Poznaj ekonomiczną metodę dostarczania DNA do skóry myszy za pomocą acufection. Technika ta umożliwia badanie funkcji genów odpornościowych w zapaleniu skóry i rozwój terapii chorób takich jak łuszczyca.

Opracowanie ekonomicznego systemu dostarczania DNA przez "Acufection" i jego zastosowanie w badaniach nad skórą

Przeglądaj więcej filmów