Name: Oparty na aptamierze czujnik do wykrywania niechelatowanego gadolinu(III) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Poznaj metodę fluorescencyjną wykrywania toksycznego niechelatowanego gadolinu(III) w roztworach wodnych z użyciem aptamerów. Technika ta umożliwia detekcję submikromolarnych stężeń z wysoką selektywnością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować dr Milanowi N Stojanovicowi z Columbia University, New York, NY za cenny wkład naukowy. Prace te są wspierane przez fundusze z California State University East Bay (CSUEB) oraz CSUEB Faculty Support Grant-Individual Researcher. O.E., T.C. i A.L. byli wspierani przez stypendium CSUEB Center for Student Research (CSR) Fellowship.

UWAGA: Woda klasy biologii molekularnej jest używana we wszystkich preparatach buforowych i roztworowych. Wszystkie jednorazowe probówki (do mikrowirówek i PCR) oraz końcówki do pipet są wolne od DNaz i RNaz. Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS) dla wszystkich chemikaliów. Zdecydowanie zaleca się stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE).
1. Przygotowanie roztworów podstawowych aptameru
<ol>
	<li>Kup komercyjnie 2 nici polideoksynukleotydu. Zamów oba pasma z oczyszczaniem za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). 
	Pasmo 1 (Gd-aptamer): 
	5'-/56-FAM/AGGCTCTCGGGACGACCAGAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3' 
	Pasmo 2 (QS): 
	5'-GTCCCGAGAGCCT/3Dab/-3'</li>
	<li>Rozpuścić każdą nić w wodzie, aby uzyskać 100 μM indywidualnych roztworów podstawowych aptamera Gd i QS.</li>
	<li>Roztwory te należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozwiązania są stabilne do tej pory, przez 3 lata.</li>
	<li>Aby zminimalizować cykle zamrażania i rozmrażania, roztwory podstawowe należy przechowywać w podwielokrotnościach o pojemności 10 μl.</li>
</ol>
2. Przygotowanie 2x Gd-sensor Solution
<ol>
	<li>Przygotować bufor do oznaczania (20 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 150 mM NaCl, 5 mM KCl). Dostosuj pH do ~7,4 za pomocą NaOH i HCl i przefiltruj przez sterylne jednorazowe filtry butelkowe z membraną PES 0,2 μm. Przechowywać w sterylnych butelkach. Przy odpowiednim filtrowaniu i przechowywaniu (w temperaturze pokojowej) bufor jest stabilny do tej pory, przez 2 lata.</li>
	<li>Rozcieńczyć 1 μl roztworu podstawowego aptamera Gd (od etapu 1.2) i 2 μl roztworu podstawowego QS (od etapu 1.2) w 497 μl buforu do oznaczania. Dobrze wymieszaj za pomocą wiru. Ich stężenia w roztworze 2x Gd-sensor wynoszą odpowiednio 200 nM i 400 nM. 
	UWAGA: Objętość roztworu 2x Gd-sensor przygotowanego na tym etapie wynosi 500 μL, co wystarcza do przetestowania 6 - 7 różnych stężeń Gd3+ dla krzywej kalibracyjnej i roztworów środków kontrastowych (krok 3). Każda próbka da zduplikowane dołki w 384-dołkowej płytce.
	<ol>
		<li>Dostosuj objętość roztworu 2x Gd-sensor zgodnie z liczbą roztworów Gd3+, które należy przetestować.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieś roztwór 2x Gd-sensor do 9 probówek PCR, po 50 μl do każdej probówki. Umieść probówki w termocyklerze.</li>
	<li>Ustaw program w termocyklerze na podgrzanie roztworu w probówkach do 95 °C, przytrzymaj przez 5 minut, a następnie powoli schładzaj roztwory do 25 °C przez ~15 min (z szybkością ~0,05 - 0,1 °C/s). Cykl ogrzewania i chłodzenia ma zapewnić optymalną hybrydyzację między aptamerem Gd a QS. Częściowa hybrydyzacja powoduje niepełne wygaszenie i wyższą fluorescencję tła czujnika. Jeśli termocykler nie jest dostępny, przeprowadź ten proces za pomocą gorącej kąpieli wodnej.</li>
	<li>Po schłodzeniu do temperatury 25 °C należy natychmiast użyć roztworu lub przechowywać w termocyklerze (do około 2 godzin) do momentu, gdy będzie gotowy do użycia. Gdy do ogrzewania używana jest łaźnia wodna, pozostaw rurki w wannie, ponieważ woda powoli schładza się do temperatury pokojowej.</li>
</ol>
3. Konstruowanie krzywej kalibracji fluorescencji i wykrywanie obecności niechelatowanego Gd3+ w roztworze środka kontrastowego Gd
<ol>
	<li>Rozpuścić GdCl3 w postaci stałej w buforze do oznaczania (tym samym buforze, co w kroku 2.1).</li>
	<li>Poprzez seryjne rozcieńczanie przygotować po 100 μl każdego z 6 różnych roztworów Gd3+ w probówkach do mikrowirówek o podwójnym stężeniu końcowym pożądanym dla krzywej kalibracyjnej (2x roztwory).
	<ol>
		<li>Na przykład, aby skonstruować kalibrację dla 0 (tylko bufor bez GdCl3), 50, 100, 200, 400 i 800 nM Gd3+, przygotuj roztwory zawierające 0, 100, 200, 400, 800 i 1,600 nM jonu. Należy upewnić się, że jako kontrolę ujemną należy zawsze uwzględnić "ślepą próbę" z 0 nM Gd3+</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Rozpuścić badany środek kontrastowy w buforze do oznaczania. Przygotować 2 lub 3 różne stężenia roztworów środka kontrastowego za pomocą seryjnego rozcieńczania. 
	UWAGA: Zaleca się przetestowanie 3 różnych stężeń roztworu środka kontrastowego. Ma to na celu zapewnienie, że stężenia te mieszczą się w zakresie liniowym. Jeżeli badane próbki nie wykazują zależności liniowej, należy zmniejszyć stężenia zastosowanego środka kontrastowego.</li>
	<li>Wyjmij z termocyklera probówki PCR zawierające roztwór 2x czujnika Gd z kroku 2.5.</li>
	<li>Dodaj 50 μl każdego roztworu Gd3+ z kroku 3.2 do 6 z 9 probówek PCR zawierających 2x roztwór czujnika Gd. Mieszać, pipetując w górę i w dół. Każda probówka PCR zawiera teraz pożądane stężenie Gd3+ do testowania, 100 nM Gd-aptameru i 200 nM QS.</li>
	<li>Do pozostałych probówek PCR zawierających 2x roztwór czujnika Gd, dodaj 50 μl roztworów środka kontrastowego z kroku 3.3. Dobrze wymieszaj, pipetując kilka razy w górę i w dół.</li>
	<li>Roztwory należy inkubować w probówkach do PCR przez około 5 minut w temperaturze pokojowej. Można je odstawić na maksymalnie 30 minut.</li>
	<li>Przenieść 45 μl każdej probówki do płytki 384-dołkowej. Każda probówka PCR da zduplikowane dołki.</li>
	<li>Zapisać fluorescencję każdej studzienki na czytniku płytek. Fluorofor (FAM) zastosowany w konstrukcji czujnika Gd ma maksima wzbudzenia i emisji odpowiednio 495 i 520 nm, zgodnie z podaniem na stronie internetowej dostawcy. Wybierz odpowiednie długości fal wzbudzenia i emisji lub filtry w zależności od tego, czy czytnik płytek jest oparty na monochromatorze czy filtrze.</li>
	<li>Wykreśl wykres fluorescencji w dowolnych jednostkach fluorescencji (AFU) w stosunku do stężenia Gd3+.</li>
	<li>Wykreśl wykres jako zmianę fałdowania fluorescencji w stosunku do stężenia Gd3+. Obliczyć zmianę krotności fluorescencji, dzieląc jednostkę AFU każdego stężenia przez jednostkę AFU roztworu "ślepej" próby ślepej (przy 0 nM Gd3+). Zmiana fałdu fluorescencji pozwoli na normalizację wyników, jeśli AFU wykazuje pewne okresowe (różne dni itp.) zmiany.</li>
	<li>Porównać emisję fluorescencji roztworu zawierającego środek kontrastowy i "ślepej próby", która jest roztworem zawierającym 0 nM GdCl3 (tylko bufor). 
	UWAGA: Wyższa fluorescencja roztworu GBCA implikuje obecność niechelatowanego Gd3+, co może wymagać dalszego oczyszczania środka kontrastowego. Ilość obecnego niechelatowanego Gd3+ można oszacować za pomocą krzywej kalibracyjnej skonstruowanej w kroku 3.10 lub 3.11.</li>
</ol>

<ol><li>Shen, C., New, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promising+strategies+for+Gd-based+responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).</li>
<li>Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrogenic+systemic+fibrosis%3A+a+concise+review+for+cardiologists%5BTitle%5D)+AND+%22Tex.+Heart+Inst.+J%22%5BJournal%5D)">Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists.</a> Tex. Heart Inst. J. 37 (5), 508-515 (2010).</li>
<li>Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+contrast+agents%3A+basic+chemistry+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">MRI contrast agents: basic chemistry and safety.</a> J Magn. Reson. Imaging. 36 (5), 1060-1071 (2012).</li>
<li>Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+gadolinium-based+MRI+contrast+agents+in+biological+and+environmental+samples%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).</li>
<li>Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+gadolinium-based+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+in+human+serum+at+37+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C.</a> Invest. Radiol. 43 (12), 817-828 (2008).</li>
<li>Loreti, V., Bettmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+MRI+contrast+agent+Gd-DTPA+by+SEC-ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 1050-1054 (2004).</li>
<li>Telgmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+and+isotope+dilution+analysis+of+gadolinium-based+contrast+agents+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (21), 11929-11936 (2012).</li>
<li>Cleveland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+methods+for+the+quantification+of+free+and+chelated+gadolinium+species+in+MRI+contrast+agent+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations.</a> Anal. Bioanal. Chem. 398 (7), 2987-2995 (2010).</li>
<li>Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+single-stranded+DNA-based+assay+for+detecting+unchelated+gadolinium%28III%29+ions+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution.</a> Anal. Bioanal. Chem. 408 (15), 4121-4131 (2016).</li>
<li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).</li>
<li>Johansson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+reporter-quencher+pairs+for+efficient+quenching+through+formation+of+intramolecular+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers.</a> Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).</li>
<li>Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+gadolinium+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">A primer on gadolinium chemistry.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).</li>
<li>Shakhverdov, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-relaxation+mechanism+of+fluorescence+quenching+in+complexes+of+lanthanide+ions+with+organic+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands.</a> Opt. Spectrosc. 95 (4), 571-580 (2003).</li>
<li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicrogram+determination+of+lanthanides+through+quenching+of+calcein+blue+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence.</a> Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Za pomocą czujnika Gd opartego na aptamierze obserwuje się wzrost emisji fluorescencji, który jest proporcjonalny do stężenia niechelatowanego Gd3+ . Aby zminimalizować ilość użytej próbki, test można przeprowadzić na 384-dołkowej mikropłytce o całkowitej objętości próbki 45 μl na studzienkę. W tym projekcie wybór fluoresceiny (FAM) i dabcylu (Dab) opierał się przede wszystkim na koszcie odczynników; Aby zmodyfikować długość fali emisji, można zastosować inną parę fluoroforu i wygaszacza11.
<p c...

Rosnące znaczenie obrazowania rezonansem magnetycznym (MRI) w diagnostyce klinicznej, ograniczone naturalną czułością tej techniki, doprowadziło do gwałtownego wzrostu badań nad opracowaniem nowych środków kontrastowych opartych na gadolinie (GBCAs)1. GBCAs to cząsteczki podawane w celu poprawy jakości obrazu, które zazwyczaj mają strukturę chemiczną składającą się z trójwartościowej jonu gadolinu (Gd3+) skoordynowanego z ligandem polidentatowym. Kompleksowanie to ma krytyczne znaczenie, ponieważ nieschelatowany Gd3+ jest toksyczny; powiązano go z rozwojem nefrogiennej włóknicy systemowej u niektórych pacjentów z chorobą lub niewydolnością nerek2. W związku z tym wykrywanie wolnych jonów w roztworze wodnym jest kluczowe dla zapewnienia bezpieczeństwa GBCAs. Obecność nieschelatowanego Gd3+ w roztworach GBCAs często jest wynikiem niepełnej reakcji między ligandem a jonem, dysocjacji kompleksu lub wyparcia przez inne biologiczne kationy metali3.
Wśród wielu technik stosowanych obecnie do oznaczania obecności Gd3+, najwyższy stopień wszechstronności i zastosowalności wykazują metody oparte na chromatografii i/lub spektrometrii4. Do ich zalet należą wysoka czułość i dokładność, możliwość analizy różnych matryc próbek (w tym surowicy ludzkiej5, moczu i włosów6, ścieków7 oraz formulacji środków kontrastowych8) oraz jednoczesne oznaczanie ilościowe wielu kompleksów Gd3+ (wykaz badań przeprowadzonych przed 2013 rokiem opisano w kompleksowym przeglądzie autorstwa Telgmanna et al.)4. Jedyną wadą jest fakt, że kilka z tych metod wymaga aparatury (takiej jak spektrometria mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie)4, do której niektóre laboratoria mogą nie mieć dostępu. W kontekście odkrywania nowych GBCA na poziomie badań i dowodów koncepcji (proof-of-concept), wartościową alternatywą może być stosunkowo wygodniejsza, szybsza i bardziej kosztowo efektywna metoda spektroskopowa (taka jak absorpcja UV-Vis lub fluorescencja). Mając na uwadze te zastosowania, opracowano fluorescencyjny sensor oparty na aptamerach do oznaczania Gd3+ w roztworach wodnych9.
Aptamer (Gd-aptamer) jest jednoniciową cząsteczką DNA o długości 44 zasad i specyficznej sekwencji zasad, która została wyizolowana w procesie systematycznej ewolucji ligandów poprzez wykładnicze wzbogacenie (SELEX)9. Aby przekształcić aptamer w sensor fluorescencyjny, do końca 5' nici przyłączany jest fluorofor, który następnie ulega hybrydyzacji z nicią wygaszającą (QS) poprzez 13 zasad komplementarnych (Rysunek 1). Nić QS jest znakowana cząsteczką ciemnego wygaszacza na końcu 3'. W obecności Gd3+, sensor (Gd-sensor), składający się z Gd-aptameru i QS w stosunku molowym odpowiednio 1:2, będzie wykazywał minimalną emisję fluorescencji ze względu na przekazywanie energii z fluoroforu do wygaszacza. Dodanie wodnego roztworu Gd3+ spowoduje wyparcie nici QS z Gd-aptameru, co doprowadzi do wzrostu emisji fluorescencji.
<img alt="Schemat sensora Gd pokazujący gaszenie fluoresceiny przez dabcyl i wyparcie go przez Gd3+ w celu emisji." src="/files/ftp_upload/55216/55216fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Sensor (Gd-sensor), który składa się z 44-nukleotydowego aptameru (Gd-aptamer) znakowanego fluoresceiną (fluoroforem) oraz 13-nukleotydowej nici gaszącej (QS) znakowanej dabcylem (ciemnym gaszaczem). W przypadku braku niechelatowanego Gd3+ fluorescencja sensora jest minimalna. Po dodaniu Gd3+ dochodzi do wyparcia nici QS, co skutkuje wzrostem emisji fluorescencji. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Obecnie istnieje jedna powszechnie stosowana metoda spektroskopowa służąca do wykrywania wodnych roztworów Gd3+. Analiza ta wykorzystuje cząsteczkę pomarańczowego ksylenolu, która po chelatacji z jonem ulega przesunięciu maksymalnej długości fali absorpcji z 433 do 573 nm10. Stosunek tych dwóch maksimów absorbancji może być wykorzystany do ilościowego oznaczenia niechelatowanego Gd3+. Sensor aptamerowy stanowi alternatywę (może być również uzupełnieniem) dla analizy z użyciem pomarańczowego ksylenolu, ponieważ obie metody charakteryzują się różnymi warunkami reakcji (takimi jak pH i skład stosowanych roztworów buforowych), różną selektywnością wobec celu, różnymi zakresami liniowości oznaczania oraz różnymi sposobami detekcji9.

<table><tbody><tr><td>Gd-aptamer</td><td>IDTDNA</td><td>Sekwencja wejściowa i modyfikacja fluoroforu w postaci zamówienia</td><td>Można zastosować fluorofor o innej długości fali emisji. Aptamer można również zamówić w innej firmie.</td></tr><tr><td>Nić hartownicza</td><td>IDTDNA</td><td>Sekwencja wejściowa i modyfikacja wygaszacza w formularzu zamówienia</td><td>Można zastosować inny moduł wygaszający w celu optymalnego transferu energii z fluoroforu. Aptamer można również zamówić w innej firmie.</td></tr><tr>Woda <td></td><td></td><td>klasy biologii molekularnej</td><td>Brak konkretnego producenta, zarówno DEPC, jak i bez DEPC działają równie dobrze</td></tr><tr><td>Chlorek gadolinu(III) bezwodny</td><td>Strem</td><td>936416</td><td>Toksyczny</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu bezwodny</td><td>MP Biomedicals</td><td>0520984480 - 100 g</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>327300025</tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu, granulki</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359</td><td></td></tr><tr><td>kwas solny</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA49</td><td>Toksyczne i</td></tr><tr><td>384-dołkowe czarne płaskie płyty polistyrenowe NBS z niskim kołnierzem</td><td>Corning</td><td>3575</td><td>Płytki odpowiednie do fluorescencji czytanie jest wymagane.</td></tr><tr><td>Sterylny jednorazowy filtr do butelki Nalgene Rapid-Flow</td><td>Thermo Scientific</td><td>5680020</td><td>Nakrętka butelki jest wyposażona w membranę PES 0,2 mikrona</td></tr><tr><td>Jednorazowe sterylne butelki 250 ml</td><td>Corning</td><td>430281</td><td>Można użyć większej lub mniejszej butelki</td></tr><tr><td>1,5 ml probówek</td><td></td><td></td> do mikrowirówek <td>Brak konkretnego producenta, o ile są to</td></tr><tr><td>probówki</td><td></td><td></td> <td>0,2 ml PCR wolne od DNAzy i RNAzyBrak konkretnego producenta, o ile są to</td>mikropipety</tr><tr><td></td><td></td><td></td> wolne od DNAzy i RNAzy <td>Brak konkretnego producenta</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet (bez filtra) o odpowiednich rozmiarach</td><td></td><td></td><td>Brak konkretnego producenta, o ile są wolne od DNAzy i RNAzy</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Biotek Synergy H1</td><td></td><td>Równie dobrze sprawdzą się czytniki płytek innych producentów</td></tr></tbody></table>

oparty na aptamierze czujnik do wykrywania niechelatowanego gadolinu(iii)

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

Pokazano metodę oznaczania obecności niechelatowanego trójwartościowego jonu gadolinu (Gd3+) w roztworze wodnym. Gd3+ jest często obecny w próbkach środków kontrastowych na bazie gadolinu w wyniku niekompletnych reakcji między ligandem a jonem lub jako produkt dysocjacji. Ponieważ jon jest toksyczny, jego wykrycie ma kluczowe znaczenie. W niniejszym artykule opisano budowę i zastosowanie czujnika opartego na aptamie (Gd-sensor) dla Gd3+. Czujnik wytwarza zmianę fluorescencji w odpowiedzi na rosnące stężenie jonu i ma granicę wykrywalności w zakresie nanomolowym (~100 nM przy stosunku sygnału do szumu wynoszącym 3). Test można przeprowadzić w buforze wodnym o pH otoczenia (~7 - 7,4) na mikropłytce 384-dołkowej. Czujnik jest stosunkowo niereaktywny w stosunku do innych fizjologicznie istotnych jonów metali, takich jak jony sodu, potasu i wapnia, chociaż nie jest specyficzny dla Gd3+ w porównaniu z innymi trójwartościowymi lantanowcami, takimi jak europ(III) i terb(III). Niemniej jednak lantanowce nie są powszechnie spotykane w środkach kontrastowych ani w układach biologicznych, dlatego czujnik może być używany do selektywnego oznaczania niechelatowanego Gd3+ w warunkach wodnych.

Typową zmianę fluorescencji roztworu sensora Gd w obecności niechelatowanego Gd3+ przedstawiono na Rysunku 2. Emisję można przedstawić jako krotność zmiany fluorescencji (Rysunek 2A) lub surowy odczyt fluorescencji (Rysunek 2B) w jednostkach arbitralnych (AFU). Oba wykresy dają bardzo podobne krzywe kalibracyjne z zakresem liniowym dla stężeń Gd3+ poniżej 1 μM i nasyceniem sygnału przy &gt; 3 μM. Granica wykrywalnośc...

Opisano zastosowanie cząsteczek polideoxynukleotydu (44-merowego aptameru) do wykrywania niechelatowanego jonu gadolinu(III) w roztworze wodnym. Obecność jonu jest wykrywana poprzez wzrost emisji fluorescencji czujnika.

Oparty na aptamierze czujnik do wykrywania niechelatowanego gadolinu(III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

Ogólnym celem niniejszego testu opartego na fluorescencji jest wykrycie obecności toksycznych, niechelatowanych jonów gadolinu w roztworach wodnych zawierających środki kontrastowe do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego. Metoda ta może usprawnić proces opracowywania kontrastów MRI opartych na gadolinie, zapewniając sposób weryfikacji wysokiej czystości syntetyzowanych środków. Główną zaletą tej techniki jest zdolność do wykrywania submikromolarnych stężeń niechelatowanego toksycznego gadolinu z relatywnie wysoką selektywnością względem innych biologicznych kationów metali.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować bufor do analizy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Za pomocą wodorotlenku sodu i kwasu solnego należy dostosować pH do wartości 7.4. Następnie bufor należy przefiltrować przez sterylny jednorazowy filtr nakrętkowy z membraną PES o wielkości porów 0.2 micron.Następnie przenieś 497 µL buforu do testu do nowej probówki do mikrocentryfugi. Dodaj 1 µL przygotowanego roztworu zapasowego aptameru gadolinu oraz 2 µL przygotowanego roztworu zapasowego QS. Przenieś 50 µL tego 2X roztworu sensora gadolinu do każdej z dziewięciu probówek PCR.Następnie umieść probówki w termocyklerze. Zaprogramuj termocykler tak, aby podgrzał próbki do 95 °C przez pięć minut, a następnie powoli schłodził roztwory do 25 °C w ciągu 15 minut. Należy pamiętać o podgrzaniu 2X roztworów sensora gadolinu do 95 °C, a następnie ich powolnym schłodzeniu do temperatury pokojowej przed dodaniem roztworu jonów gadolinu.W pierwszej kolejności należy rozpuścić stały trójchlorek gadolinu w buforze do analizy, aby przygotować roztwór zapasowy gadolinu(III) o pożądanym stężeniu. Wykorzystując rozcieńczanie seryjne, należy przygotować sześć 100 µL roztworów gadolinu(III), zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie należy rozpuścić testowany środek kontrastowy w buforze do analizy.Zastosuj rozcieńczanie seryjne w celu przygotowania trzech różnych stężeń. Następnie wyjmij z termocyklera probówki PCR zawierające 2X roztwór sensora gadolinu. Przenieś 50 µL każdego z trzech roztworów gadolinu do osobnych probówek PCR.Każdy roztwór pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby go wymieszać. Następnie przenieś oddzielnie po 50 µL każdego roztworu środka kontrastowego do pozostałych probówek PCR. Wymieszaj, pipetując kilka razy w górę i w dół.Inkubować wszystkie dziewięć roztworów przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieść 45 µL każdego roztworu do płytki 384-dołkowej w dwóch powtórzeniach. Następnie zarejestrować i przeanalizować dane fluorescencji zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W niniejszym badaniu niechelatowany trójwartościowy jon gadolinu jest wykrywany w roztworze wodnym przy użyciu metody fluorescencyjnej. Sensor fluorescencyjny opracowano poprzez przyłączenie fluoroforu do aptameru. Następnie sensor jest hybrydyzowany z nicią wygaszającą, która jest oznakowana cząsteczką ciemnego wygaszacza.Dodanie gadolinu (III) wypiera niemiącą nić z aptameru, co powoduje wzrost emisji fluorescencji. Krzywe kalibracyjne uzyskano przy użyciu 100 nM aptameru gadolinu oraz 200 nM QS, przedstawiając albo surową fluorescencję, albo krotność zmiany fluorescencji. Obie krzywe wykazują zakres liniowy dla stężeń gadolinu (III) poniżej 1 µM oraz nasycenie sygnału przy stężeniach powyżej 3 µM.Następnie dwie różne partie kwasu gadoterykowego są analizowane pod kątem stężeń w zakresie od 0 mM do 20 mM. Podczas gdy emisja fluorescencji próbki o wysokiej czystości nie zwiększa się znacząco w tym zakresie, wyraźna zmiana jest obserwowana w próbce zawierającej niechelatowany gadolin trzy przy stężeniach tak niskich jak 5 mM. Podczas wykonywania tej procedury należy upewnić się, że w dołkach mikropłytki nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ zmieni to odczyt fluorescencji.Stosując tę procedurę, możemy wykryć nawet niewielkie ilości obliczone jonów gadolinu w roztworach zawierających środki kontrastowe. Będzie to skuteczna metoda określania czystości tych środków. Praca z odczynnikami chemicznymi może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie środków ostrożności, takich jak stosowanie osobistych środków ochrony indywidualnej.

an-aptamer-based-sensor-for-unchelated-gadolinium-iii

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

Prezentujemy proces metalacji, oczyszczania i charakterystyki kompleksów lantanowców. Opisane tutaj kompleksy mogą być sprzęgane z makrocząsteczkami, co umożliwia śledzenie tych cząsteczek za pomocą obrazowania rezonansem magnetycznym.

Przygotowanie, oczyszczanie i charakterystyka kompleksów lantanowców do zastosowania jako środki kontrastowe w obrazowaniu rezonansem magnetycznym

Aby zademonstrować obrazowanie molekularne raka MR za pomocą środka kontrastowego MRI z małym peptydem specyficznym dla skrzepłych białek osocza w zrębie guza w modelu raka prostaty u myszy.

Obrazowanie molekularne MR raka prostaty z drobnocząsteczkowym środkiem kontrastowym ukierunkowanym na peptyd CLT1

Dostępny jest protokół do wyboru aptamerów przełączających strukturę dla małych cząsteczek w oparciu o przestrajalną metodę selekcji kulek magnetycznych z regulacją. Aptamery wybrane ze względu na właściwości przełączania struktur są korzystne w testach, które wymagają zmiany konformacyjnej w celu zasygnalizowania obecności celu, takich jak opisany test nanocząstek złota.

Metoda wyboru aptamerów przełączających strukturę zastosowana do kolorymetrycznego testu nanocząstek złota

Ten protokół opisuje syntezę biofunkcjonalizowanych pruskich niebieskich nanocząstek i ich zastosowanie jako multimodalnych, molekularnych środków obrazowania. Nanocząstki mają konstrukcję rdzeń-powłoka, w której jony gadolinu lub manganu w rdzeniu nanocząstki generują kontrast MRI. Otoczka biofunkcjonalna zawiera fluorofory do obrazowania fluorescencyjnego i ligandy celujące do celowania molekularnego.

Biofunkcjonalizowane nanocząstki błękitu pruskiego do zastosowań w multimodalnym obrazowaniu molekularnym

AN został opracowany specjalnie zaprojektowany laserowy aparat grzewczy kompatybilny z MRI, aby zapewnić miejscowe ogrzewanie guzów podskórnych w celu aktywacji uwalniania czynników z termoczułych liposomów, szczególnie w obszarze guza.

Specjalnie zaprojektowane laserowe urządzenie grzewcze do wyzwalanego uwalniania cisplatyny z termoczułych liposomów z prowadzeniem obrazu rezonansu magnetycznego

Analizowano projekt i opracowanie kolorymetrycznego testu nanocząsteczkowego aptamera i złota do wykrywania małych cząsteczek do zastosowań terenowych. Dodatkowo zatwierdzono aplikację kolorymetryczną (smart-device) oraz ustalono długoterminowe przechowywanie testu do użytku w terenie.

Projektowanie i rozwój kolorymetrycznych testów kolorymetrycznych opartych na aptamirze–złotych nanocząsteczkach do zastosowań terenowych

Przedstawiono tu procedurę izolacji EOB-DTPA i późniejszej kompleksacji z naturalnym Ga(III) i 68Ga, a także dokładną analizę wszystkich związków i badania nad skutecznością znakowania, stabilnością in vitro i współczynnikiem dystrybucji n-oktanol/woda w radioznakowanym kompleksie.

Badania kompleksu Ga(III) EOB-DTPA i jego analogu znakowanego radioizotopowo o masie 68Ga

Ten protokół opisuje przygotowanie i charakterystykę dendrymerowego środka kontrastowego do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego (MRI), który przenosi makrocykliczne chelaty koordynujące paramagnetyczne jony gadolinu. W serii eksperymentów MRI in vitro środek ten wytwarzał wzmocniony sygnał MRI w porównaniu z dostępnym na rynku analogiem monomerycznym.

Przygotowanie i charakterystyka in vitro środków kontrastowych na bazie dendrymerów do obrazowania metodą rezonansu magnetycznego

Przedstawiono protokół selekcji in vitro i charakterystyki aptamerów DNA wiążących estry kwasu ftalowego specyficznych dla grupy. Uwzględniono również zastosowanie wybranego aptameru w elektrochemicznym czujniku aptasensorycznym.

Wybór aptameru DNA wiążącego estry kwasu ftalowego, charakterystyka i zastosowanie do elektrochemicznego czujnika aptasensora

Tutaj prezentujemy protokół do uzyskania 68Ga domieszkowanych rdzeniem nanocząstek tlenku żelaza poprzez szybką syntezę mikrofalową. Metodologia ta pozwala uzyskać nanocząstki PET/(T1)MRI o skuteczności znakowania radioaktywnego wyższej niż 90% i czystości radiochemicznej 99% w 20-minutowej syntezie.

Synteza nanocząstek tlenku żelaza domieszkowanego rdzeniem 68Ga do podwójnej pozytonowej tomografii emisyjnej /(T1)Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego

To badanie opisuje zautomatyzowany proces produkcji [68Ga]Ga-3BP-3940 za pomocą syntezatora GAIA V2, do obrazowania PET białka aktywującego fibroblasty. Przedstawiono również wyniki badań kontroli jakości przeprowadzonych na trzech seriach testowych.

Automatyczne przygotowanie [68Ga]GA-3BP-3940 na module syntezy do obrazowania PET mikrośrodowiska guza

Poznaj metodę fluorescencyjną wykrywania toksycznego niechelatowanego gadolinu(III) w roztworach wodnych z użyciem aptamerów. Technika ta umożliwia detekcję submikromolarnych stężeń z wysoką selektywnością.

Oparty na aptamierze czujnik do wykrywania niechelatowanego gadolinu(III)

Przeglądaj więcej filmów