Opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych terapii zastępczej komórkami macierzystymi w przypadku zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. W tym zwizualizowanym artykule opisujemy mniej ryzykowną, powtarzalną i precyzyjnie zmodyfikowaną technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego za pomocą podejścia przeztwardówkowego w celu dostarczenia komórek do oczu szczura.

Ogólnym celem tego filmu jest wprowadzenie powtarzalnej techniki przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego w celu dostarczenia ludzkiego nabłonka barwnikowego siatkówki lub komórek RPE do przestrzeni podsiatkówkowej oczu gryzoni przy minimalnym ryzyku uszkodzenia siatkówki. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw małego nacięcia w spojówce skroniowej za rąbkiem, aby odsłonić leżącą poniżej twardówkę. Następnie do penetracji kompleksu rdzenia twardówki używa się skośnej igły insuliny o rozmiarze 31 poprzez włożenie igły o wielkości 500 mikronów lub około połowy końcówki do tkanki ze skośną stroną skierowaną do góry, aby utworzyć otwór pilotowy.

Następnie skośna igła iniekcyjna o rozmiarze 33 przymocowana do strzykawki jest wprowadzana do otworu prowadzącego i wkładana pod określonym kątem i na określoną głębokość, otwór iniekcyjny zamyka się samoczynnie po wsunięciu igły i nie jest potrzebny ścieg ani klej tkankowy. Retinopatie zwyrodnieniowe obejmują szerokie spektrum chorób obejmujących różne typy komórek siatkówki. Na całym świecie najczęstsza choroba, zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem lub AMD, występuje wśród osób starszych i prowadzi do trwałej ślepoty.

Zmiany patologiczne zachodzące w AMD polegają na początkowym zwyrodnieniu komórek nabłonka barwnikowego siatkówki, czyli RPE. Utrata RPE prowadzi do dysfunkcji fluororeceptorów siatkówki lub śmierci. Obecne leczenie farmakologiczne wczesnego stadium AMD ogranicza się do spowolnienia postępu lub złagodzenia objawów.

To w połączeniu z ograniczonym potencjałem regeneracyjnym siatkówki oznacza, że nie ma skutecznego leczenia przywracającego wzrok. Instytut Neuroral Stem Cell zidentyfikował niedawno populację dorosłych komórek macierzystych w populacji komórek RPE. Komórki te mogą być wykorzystywane jako źródło terapii zastępczej komórkami macierzystymi.

Obecnie nasz instytut prowadzi badania przedkliniczne mające na celu zbadanie skuteczności i bezpieczeństwa terapii przeszczepem komórek macierzystych RPE w zwyrodnieniowym modelu szczura RPE. W tym badaniu wykorzystujemy technikę iniekcji przeztwardówkowej, podsiatkówkowej, aby dostarczyć komórki macierzyste RPE do oczu szczura, między warstwami siatkówki i RPE. Nasza metoda jest łatwym i niezawodnym sposobem na skuteczne dostarczenie komórek do przestrzeni podsiatkówkowej.

Potrzebne będą następujące odczynniki i sprzęt. 1% tropikamidu i 2,5% fenylefryny, świeżo wytworzone z 10% fenylefryny, poprzez rozcieńczenie jej w sterylnym 0,9% soli fizjologicznej w dniu operacji, są używane do rozszerzenia źrenicy. Płyn do płukania oczu służy do płukania oka i utrzymywania wilgoci w nieoperowanym oku.

Smar do oczu służy do utrzymywania wilgoci w nieoperowanym prawym oku podczas operacji. 0,5% proparakainy stosuje się jako środek znieczulający miejscowo. Smar do oczu jest stosowany na operowane lewe oko podczas skanowania OCT.

Do tej techniki potrzebna jest minimalna ilość materiału i sprzętu. Szczegółowe informacje o sprzęcie i odczynnikach stosowanych w tej technice znajdują się w protokole. Do wstrzykiwania komórek służy strzykawka o pojemności 10 mikrolitrów.

Przed wstrzyknięciem najpierw montujemy wtryskiwacz i sterylizujemy go etanolem. Włożyć sterylną igłę ze skosem w rozmiarze 33 do strzykawki i mocno przykręć, aby zmontować wstrzykiwacz. Przepłucz wtryskiwacz 100% etanolem, następnie 70% etanolem, a następnie dejonizowaną wodą destylowaną, kolejno od pięciu do sześciu razy każdy.

Oznacz igłę wstrzykiwacza sterylnym czarnym markerem w odległości 600 mikronów od końcówki igły. Umieścić wtryskiwacz na mikromanipulatorze do wstrzykiwań. Ludzkie komórki RPE są przygotowywane w dniu operacji i przechowywane w mieszaninie lodowatej wody.

Delikatnie rozetrzeć zawiesinę ogniw i obciążyć wtryskiwacz 1,2 mikrolitra, dodatkowe 0,2 mikrolitra służy do kompensacji przepływu wstecznego wtrysku, aby zagwarantować objętość jednego mikrolitra wtrysku. Wymień wtryskiwacz wypełniony zawiesiną komórek na mikromanipulatorze lub poproś asystenta, aby trzymał go pionowo, ponieważ ogniwa RPE mają tendencję do łatwego zapadania się w roztworach. Przygotuj sterylne pole operacyjne, umieszczając sterylną podkładkę chirurgiczną z poduszką grzewczą pod spodem na stoliku mikroskopu preparacyjnego.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Nowego Jorku w Albany. Zważ zwierzę i znieczul je za pomocą systemu dostarczania oparów izofluranu, jak pokazano tutaj. Po znieczuleniu przenieś szczura na obszar chirurgiczny i umieść go w stożku nosowym połączonym z systemem izofluranu, aby utrzymać znieczulenie.

Przykryj ciało szczura gazą i uszczypnij palec u nogi szczura, aby potwierdzić pełne znieczulenie. Nałóż kroplę lubrykantu do oczu na prawe oko szczura, ustaw szczura na prawym boku, z lewym okiem skierowanym do sufitu w celu wstrzyknięcia, głową w kierunku prawej ręki chirurga i z powrotem w kierunku chirurga. Przytnij wszelkie wąsy, które zakrywają oko.

Wlej niewielką ilość płynu do płukania oczu na skroniową stronę lewego oka, a nadmiar zbierz po stronie nosa za pomocą bawełnianego aplikatora, aby przepłukać oko. Rozszerz źrenicę za pomocą 1% tropikamidu, 2,5% fenylefryny, do optycznej koherentnej tomografii po wstrzyknięciu lub badania OCT, nakładając po jednej kropli każdego z nich. Nałóż kroplę płynu do płukania oczu, aby oko było wilgotne.

Nanieś kroplę Proparacainy na oko i usuń nadmiar bawełnianym aplikatorem. Delikatnie masuj skórę otaczającą oko cztery do sześciu razy, aby otworzyć powiekę, tak aby oko chwilowo i lekko wyskoczyło z oczodołu, aby umożliwić łatwy dostęp do igły iniektora. Użyj siły, aby chwycić spojówkę z tyłu rąbka i obróć oko, aby znaleźć lepsze miejsce do operacji bez uszkadzania mięśni oka.

Delikatnie unieś spojówkę, aby zrobić namiot i obróć oko nosowo. Następnie za pomocą nożyczek odetnij górną część namiotu, aby zrobić mały otwór w spojówce i odsłonić twardówkę. Następnie za pomocą kleszczy chwyć krawędź otworu spojówki obok rąbka i obróć oko nosowo, tak aby oś źrenicy znajdowała się pod kątem około 30 stopni w stosunku do podłoża.

Sterylna, skośna igła insuliny o rozmiarze 31 służy do penetracji kompleksu rdzenia twardówki ze skosem skierowanym do góry i połową końcówki lub około 500 mikronów wprowadzanymi do tkanki, aby utworzyć otwór pilotowy do wstrzyknięcia. Ostrożnie wyjmij igłę insuliny i może być widoczny niewielki wysięk krwi. Można zastosować włócznię do oczu, aby oczyścić dziurę i w razie potrzeby zatrzymać krwawienie.

Wprowadzić igłę iniektora załadowaną komórką RPE do otworu pilotowego pod kątem około 10 do 15 stopni w stosunku do lokalnej powierzchni twardówki, aby dotrzeć do przestrzeni podsiatkówkowej, wprowadzając igłę o długości 500 mikronów całkowicie w tkankę i pozostawiając 100 mikro odległości między punktem na igle, który jest pokryty tkanką, a punktem czarnego markera na igle. Powiedzieć asystentowi, aby wcisnął tłok strzykawki i wstrzyknął odpowiednią objętość komórek. Przytrzymaj wtryskiwacz na miejscu przez 25 do 30 sekund po wstrzyknięciu, a następnie powoli wycofaj wtryskiwacz.

Otwór wtryskowy uszczelnia się automatycznie i powszechnie obserwuje się niewielką ilość około 0,2 mikrolitra przepływu zwrotnego. Trzykrotnie przepłukać miejsce wstrzyknięcia sterylnym płynem do płukania oczu, a nadmiar zebrać bawełnianym aplikatorem. Nałóż kroplę lubrykantu na operowane oko i przenieś szczura do stacji OCT, aby zbadać lokalizację przeszczepionych komórek i rozmiar pęcherzyka podsiatkówkowego.

Wróć szczura do klatki regeneracyjnej pod lampą grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała po zakończeniu OCT. Obserwuj szczura, aby upewnić się, że wychodzi z narkozy i codziennie monitoruj pod kątem jakichkolwiek oznak niepokoju. W razie wątpliwości należy natychmiast powiadomić lekarza weterynarii.

Korzystając z naszej techniki, konsekwentnie i skutecznie dostarczaliśmy ludzkie komórki RPE do przestrzeni podsiatkówkowej. Bezpośrednio po przeszczepieniu wykonaliśmy badanie OCT w celu obserwacji miejsca iniekcji oraz pęcherzyka podsiatkówkowego wytworzonego przez przeszczepione komórki. Służy to jako dobre narzędzie przesiewowe do oceny jakości zastrzyków i stopnia uszkodzenia siatkówki lub krwotoku.

Jasne odbicie światła wokół miejsca wstrzyknięcia i pęcherzyk podsiatkówkowy wypełniony zawiesiną komórkową można było zobaczyć podczas skanowania OCT. W udanym wstrzyknięciu nie obserwuje się krwawienia, wycieku płynu międzygałkowego ani odwarstwienia siatkówki wokół miejsca wstrzyknięcia lub przestrzeni śródszklistkowej, co świadczy o minimalnym urazie spowodowanym wstrzyknięciem. Operowane oczy szczurów zostały zarodkowane, utrwalone i wycięte do analizy immunohistologicznej po siedmiu dniach od przeszczepu.

Ludzki marker jądrowy, Hunu, i marker komórek RPE, OTX2, zostały użyte do wykrycia przeszczepionych komórek. Pozytywne stwierdzenie obu markerów wykazało, że przeszczepione ludzkie komórki RPE znajdowały się w przestrzeni podsiatkówkowej oczu szczura. Ta technika wstrzykiwania podskórnego przez twardówkę jest prosta i łatwa do nauczenia.

Powoduje mniej urazów chirurgicznych i pozostawia siatkówkę nienaruszoną poprzez przepuszczenie igły iniekcyjnej przez zewnętrzne warstwy ściany oka, bez przerywania siatkówki nerwowej. Określone ilościowo krople, które igła pilotująca i igła iniekcyjna wchodzą w tkankę, oraz kąt używany podczas wstrzykiwania pozwalają na niezawodne dostarczanie komórek do przestrzeni podsiatkówkowej ze znacznie większą dokładnością i skutecznością. Dzięki tej metodzie iniekcji konsekwentnie i skutecznie dostarczaliśmy komórki RPE pochodzące z ludzkich komórek macierzystych RPE do przestrzeni podsiatkówkowej szczurów RCS.

Ta procedura może być łatwo powtórzona przez każdego, kto ogląda wideo.