Name: Opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Poznaj udoskonaloną technikę przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów. Metoda zapewnia precyzyjne dostarczenie komórek z minimalnym ryzykiem uszkodzenia siatkówki i samoczynnym zamykaniem się rany.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Pragniemy podziękować Patty Lederman za pomoc przy operacji oraz Susan Borden za przygotowanie komórek RPE. Dziękujemy również NYSTEM C028504 za finansowanie tego projektu. Justine D. Miller jest wspierana przez NIH grant F32EY025931.

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Stanowym Nowego Jorku w Albany.
1. Przygotowanie przed wstrzyknięciem
<ol>
	<li>Przygotowanie zawiesiny komórek hRPESC-RPE 
	UWAGA: Wszystkie poniższe kroki są wykonywane w sterylnym kapturze do hodowli tkanek i wymagana jest znajomość podstawowej techniki sterylnej.
	<ol>
		<li>Wyizoluj pierwotne komórki hRPE z ludzkich oczu dawcy w wieku 50-90 lat i hoduj komórki na płytkach 24-dołkowych12. Kriokonserwuj komórki w pasażu 1, rozmrażaj w razie potrzeby i hoduj komórki pasażowe 2 (P2) przez 4-5 tygodni (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A) do wstrzyknięcia.</li>
		<li>Usuń pożywkę hodowlaną12 i delikatnie przepłucz studzienki dwukrotnie 500 μL wstępnie podgrzanej soli fizjologicznej 1X Dulbecco's Phosphate Buffered Salt bez Wapnia i Magnezu (1x DPBS-CMF), dodając 1X DPBS-CMF do studzienek za pomocą pipety 1,000 μL i usuwając ją za pomocą próżni</li>.
		<li>Dodaj 300 μl trypsyny/DNAzy do każdego dołka. Inkubować komórki hRPESC-RPE w trypszynie/DNAzie (4 kU DNazy na 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA) przez 4 minuty w temperaturze 37 °C w celu dysocjacji komórek.</li>
		<li>Sprawdź komórki pod mikroskopem, aby zobaczyć, czy są zaokrąglone w górę. Kontynuuj inkubację komórek w trypszynie/DNazie przez dodatkowe 2 minuty, jeśli jeszcze nie zostały zaokrąglone.</li>
		<li>Po zaokrągleniu komórek w górę, użyj pipety o pojemności 1 000 μl, aby rozdzielić oderwane komórki z dołka i przenieść trypsynę/DNazę zawierającą oderwane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml z równą objętością wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej, aby dezaktywować trypsynę/DNazę.</li>
		<li>Przepłukać studzienki wstępnie podgrzanym 1X DPBS-CMF, delikatnie pipetując w górę iw dół, szczególnie wokół krawędzi studzienki; następnie dodaj te komórki do poprzedniej stożkowej probówki.</li>
		<li>Odwirować stożkową probówkę o masie 286 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml pożywki hodowlanej.</li>
		<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Wirować przy 286 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.</li>
		<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w sterylnym zrównoważonym roztworze soli (BSS) w stężeniu 50 000 komórek/μl (aby dostarczyć 50 000 komórek w objętości 1 μl podczas wstrzyknięcia podsiatkówkowego).</li>
		<li>Przenieść końcową zawiesinę komórek (CS) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml i przechowywać w mieszaninie lodowatej wody do momentu użycia we wstrzyknięciu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie iniektora komórkowego
	<ol>
		<li>Włożyć sterylną igłę ze skosem w rozmiarze 33 do strzykawki iniekcyjnej i mocno przykręcić, aby zmontować wstrzykiwacz.</li>
		<li>Przepłucz wtryskiwacz 100% etanolem 5-6 razy.</li>
		<li>Przepłucz wtryskiwacz 70% etanolem 5-6 razy.</li>
		<li>Przepłucz wtryskiwacz BSS 5-6 razy.</li>
		<li>Oznacz igłę iniektora sterylnym czarnym markerem w odległości 600 μm od końcówki igły pod mikroskopem preparacyjnym (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B).</li>
		<li>Umieścić wtryskiwacz na mikromanipulatorze w celu wstrzyknięcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wstrzyknięcie podsiatkówkowe
<ol>
	<li>Pole operacyjne i przygotowanie zwierząt
	<ol>
		<li>Zważ 4-5 tygodniowego szczura RCS (60-100 g) i znieczul go za pomocą systemu dostarczania oparów izofluranu. 
		nuta: Aby wywołać znieczulenie, należy utrzymać szybkość przepływu izofluranu na poziomie 5%. Potwierdź głębokość znieczulenia, naciskając łapy, a następnie zmniejsz natężenie przepływu do 2-3% w celu utrzymania znieczulenia podczas operacji.</li>
		<li>Umieść sterylną zasłonę chirurgiczną z poduszką grzewczą pod spodem na stoliku mikroskopu preparacyjnego, aby ustawić sterylne pole operacyjne.</li>
		<li>Przenieś szczura na obszar operacyjny i umieść szczura w stożku nosowym połączonym z systemem izofluranu w celu utrzymania znieczulenia.</li>
		<li>Przykryj ciało szczura gazą. Uszczypnij palec u nogi szczura, aby potwierdzić pełne znieczulenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja przeztwardówkowa podsiatkówkowa pod mikroskopem
	<ol>
		<li>Nałóż kroplę lubrykantu do oczu na nieoperowane oko szczura.</li>
		<li>Ułóż szczura na prawym boku z lewym okiem skierowanym w stronę sufitu do wstrzyknięcia, głową skierowaną w stronę prawej ręki chirurga i plecami w kierunku chirurga.</li>
		<li>Przytnij wszelkie wąsy zakrywające oko małymi nożyczkami.</li>
		<li>Wlej niewielką ilość płynu do płukania oczu od skroniowej strony lewego oka i zbierz nadmiar po stronie nosa za pomocą bawełnianego aplikatora, aby przepłukać oko.</li>
		<li>Rozszerz źrenicę 1% tropikamidem i 2,5% fenylefryną (świeżo wyprodukowaną z 10% fenylefryny przez rozcieńczenie jej w sterylnym 0,9% soli fizjologicznej w dniu zabiegu) do badania OCT po wstrzyknięciu, nakładając po jednej kropli każdego z nich.</li>
		<li>Delikatnie pociągnij skórę otaczającą oko 4-6 razy, aby otworzyć powiekę tak, aby oko było lekko podparte, co ułatwiło dostęp do obszarów znajdujących się za rąbkiem.</li>
		<li>Nałóż kroplę płynu do płukania oczu i utrzymuj oko wilgotne.</li>
		<li>Delikatnie rozetrzeć CS (przygotowany w kroku 1.1.12) i naładować wtryskiwacz 1,2 μl CS. Dodatkowe 0,2 μl służy do kompensacji przepływu zwrotnego we wtryskiwaniu. 
		nuta: Na podstawie naszych pomiarów około 5 000-8 000 komórek jest traconych w przepływie zwrotnym przy wstrzyknięciu 50 000 komórek/μl, co odpowiada około 10-16% utraty komórek, a dodatkowe 0,2 μl CS zostało wstrzyknięte, aby skompensować tę utratę komórek.</li>
		<li>Umieść wtryskiwacz wypełniony CS na mikromanipulatorze (lub poproś asystenta, aby trzymał go) pionowo, ponieważ komórki RPE mają tendencję do łatwego zapadania się w zawiesinie.</li>
		<li>Nanieś kroplę 0,5% proparakainy (miejscowy środek znieczulający) na oko i usuń nadmiar za pomocą bawełnianego aplikatora. 
		nuta: Ten krok powinien stłumić odruch rogówkowy i zapobiec mruganiu oka podczas kolejnych kroków.</li>
		<li>Użyj kleszczy, aby chwycić spojówkę z tyłu rąbka, obróć oko nosowo i podnieś spojówkę, aby zrobić "namiot".</li>
		<li>Użyj nożyczek, aby odciąć górną część "namiotu", aby zrobić mały otwór w spojówce i odsłonić leżącą pod spodem twardówkę.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy chwyć krawędź pozostałego brzegu spojówki obok rąbka i obróć oko nosowo tak, aby oś źrenicy znajdowała się pod kątem około 30 stopni w stosunku do blatu stołu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Ciągłe chwytanie brzegu spojówki jest konieczne, aby zapewnić przeciwwagę podczas wbijania igły i utrzymać oko pod optymalnym kątem.</li>
		<li>Aby wykonać otwór pilotowy do wstrzykiwania komórek, umieść koniec sterylnej, skośnej igły insuliny o rozmiarze 31 w odległości 1,200-1,500 μm za rąbkiem z otworem końcówki skierowanym do góry.</li>
		<li>Dostosuj kąt igły insuliny tak, aby znajdował się 10-15 stopni powyżej twardówki (styczny do wyimaginowanej płaszczyzny w zamierzonym miejscu wstrzyknięcia). Powoli penetrować kompleks twardówkowo-naczyniówkowy do głębokości igły około 500 μm. U pigmentowanego szczura koniec igły "zniknie" pod pigmentowanym naczyniówką. W przypadku zastosowanej tutaj marki igły insulinowej odległość od końcówki igły do skosu wynosi 500 μm.</li>
		<li>Ostrożnie wyjąć igłę z insuliny (może być widoczny bardzo mały wysięk krwi).</li>
		<li>Jeśli zauważysz nadmierne krwawienie, w razie potrzeby można zastosować włócznię do oczu, aby oczyścić otwór. Ciągłe krwawienie po zastosowaniu włóczni wskazuje, że naczynie mogło zostać uszkodzone.</li>
		<li>Wprowadzić igłę wtryskiwacza załadowaną komórkami RPE do otworu prowadzącego, otworem skierowanym w dół i pod kątem około 10-15 stopni w stosunku do lokalnej powierzchni twardówki.</li>
		<li>Delikatnie włóż igłę wtryskiwacza do otworu prowadzącego na głębokość około 500 μm, aby uzyskać dostęp do przestrzeni podsiatkówkowej. Powinien być margines około 100 μm między krawędzią czarnego śladu pisaka a punktem, w którym igła jest pokryta pigmentowanym naczyniówką (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C i 1D).</li>
		<li>Poproś asystenta, aby delikatnie wcisnął tłok strzykawki z wstrzykiwaczem w celu wstrzyknięcia odpowiedniej objętości komórek (około 1,2 μl). Bądź gotów do zapewnienia pewnej siły przeciwnej, gdy asystent naciska na tłok. 
		nuta: Wcześniejsza próbna praktyka z asystentem może zapewnić zarówno chirurgowi, jak i asystentce niezbędne doświadczenie na tym etapie.</li>
		<li>Skupiając się wizualnie na krawędzi śladu pióra, przytrzymaj wtryskiwacz w miejscu przez 25-30 s, a następnie powoli wycofaj wtryskiwacz. Często obserwuje się niewielki przepływ zwrotny. 
		nuta: Jeśli nie obserwuje się przepływu wstecznego, mogło dojść do wstrzyknięcia do ciała szklistego. Jeśli zauważysz przepływ wsteczny przez uszczelkę lub komórki wypełniające się pod twardówką, wstrzyknięcie było zbyt płytkie.</li>
		<li>Przepłukać wypływ komórek z miejsca wstrzyknięcia sterylnym płynem do płukania oczu 3 razy i zebrać nadmiar bawełnianym aplikatorem.</li>
		<li>Nałóż kroplę lubrykantu do oczu na operowane oko i przenieś szczura do stacji OCT w celu zbadania lokalizacji przeszczepionych komórek i wielkości pęcherzyka podsiatkówkowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Leczenie po wstrzyknięciu
<ol>
	<li>Leczenie przeciwzapalne i przeciwbólowe
	<ol>
		<li>Buprenorfinę należy wstrzykiwać podskórnie w stężeniu 0,1 mg/kg masy ciała w roztworze soli fizjologicznej w celu zmniejszenia bólu.</li>
		<li>Wstrzyknąć deksametazon w dawce 1,6 mg/kg masy ciała w soli fizjologicznej we wstrzyknięciu dootrzewnowym (I.P.) w celu kontroli stanu zapalnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odzyskiwanie zwierząt
	<ol>
		<li>Umieść szczura z powrotem w klatce regeneracyjnej pod lampą grzewczą, aby utrzymać temperaturę ciała.</li>
		<li>Obserwuj operowane oko pod kątem oznak krwotoku.</li>
		<li>Obserwuj szczura, aby upewnić się, że wychodzi z narkozy.</li>
		<li>Zwróć odzyskane zwierzę do nowej klatki i oznacz klatkę kartą chirurgiczną oraz codziennie monitoruj pod kątem jakichkolwiek oznak niepokoju, krwotoku ocznego lub zmętnienia rogówki. W razie wątpliwości należy natychmiast powiadomić lekarza weterynarii.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>De Jong, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).</li>
<li>Wong, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+prevalence+of+age-related+macular+degeneration+and+disease+burden+projection+for+2020+and+2040%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).</li>
<li>Ambati, J., Fowler, B. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22794258">Mechanisms of agerelated macular degeneration.</a> Neuron. 75, 26-39 (2012).</li>
<li>Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drusen+in+age-related+macular+degeneration%3A+Pathogenesis%2C+natural+course%2C+and+laser+photocoagulation-induced+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Surv+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression.</a> Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).</li>
<li>Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Age-related macular degeneration.</a> N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).</li>
<li>Lund, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cells+rescue+visual+function+in+dystrophic+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Cloning+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats.</a> Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Vugler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+and+retinal+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells and retinal repair.</a> Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).</li>
<li>Schwartz, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+Stargardt%27s+macular+dystrophy%3A+follow-up+of+two+open-label+phase+1%2F2+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies.</a> Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).</li>
<li>Stanzel, B. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RPE+Stem+Cells+Grown+into+Polarized+RPE+Monolayers+on+a+Polyester+Matrix+Are+Maintained+after+Grafting+into+Rabbit+Subretinal+Space%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space.</a> Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).</li>
<li>Blenkinsop, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+adult+retinal+pigment+epithelial+stem+cell-derived+RPE+monolayers+exhibit+key+physiological+characteristics+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).</li>
<li>Salero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+human+RPE+can+be+activated+into+a+multipotent+stem+cell+that+produces+mesenchymal+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives.</a> Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).</li>
<li>Davis, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+RPE+Stem+Cell-Derived+RPE+Preserves+Photoreceptors+in+the+Royal+College+of+Surgeons+Rat%3A+Method+for+Quantifying+the+Area+of+Photoreceptor+Sparing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).</li>
<li>Westenskow, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performing+Subretinal+Injections+in+Rodents+to+Deliver+Retinal+Pigment+Epithelium+Cells+in+Suspension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension.</a> J Vis Exp. (95), e52247(2015).</li>
<li>Lopez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplanted+Retinal+Pigment+Epithelium+Modifies+the+Retinal+Degeneration+in+the+RCS+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).</li>
<li>Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subretinal+Transplantation+of+MACS+Purified+Photoreceptor+Precursor+Cells+into+the+Adult+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina.</a> J Vis Exp. (84), e50932(2014).</li>
<li>Nair, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Common+Anesthetics+on+Eye+Movement+and+Electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Doc+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram.</a> Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).</li>
<li>McGill, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+human+central+nervous+system+stem+cells+-+neuroprotection+in+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration.</a> Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).</li>
<li>Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+retinal+pigment+epithelium+cells+are+retained+in+the+cell+cycle+and+proliferate+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo.</a> Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).</li>
<li>Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grafting+of+ARPE-19+and+Schwann+Cells+to+the+Subretinal+Space+in+RCS+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).</li>
<li>Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+corneal+opacities+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Induced corneal opacities in the rat.</a> Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Technika iniekcji podsiatkówkowej przedstawiona w tym artykule polega na ścieżce przeztwardówkowej, w której igła iniektora przenika do zewnętrznych warstw (kompleks twardówka-naczyniówka-RPE) ściany oka bez uszkadzania siatkówki nerwowej lub naruszania jamy ciała szklistego. Alternatywne podejście przezszklistkowe wiąże się z potencjalnym ryzykiem uszkodzenia soczewki prowadzącego do zaćmy, ponieważ soczewka gryzoni zajmuje większość jamy ciała szklistego. W porównaniu z tą metodą, nasza technika jest mniej ryzykowna i ...

Ludzka siatkówka znajdująca się w tylnej części oka funkcjonuje jako lekka tkanka czuciowa i odgrywa kluczową rolę w percepcji wzroku. Dysfunkcja komórek siatkówki lub śmierć komórki powoduje zatem problemy ze wzrokiem lub trwałą ślepotę. Zaburzenia polegające na zwyrodnieniu lub dysfunkcji komórek w różnych warstwach siatkówki są znane jako choroby zwyrodnieniowe siatkówki, wśród których AMD jest najczęstszym typem i główną przyczyną nieodwracalnej ślepoty u osób starszych w krajach rozwiniętych1,2. Proces patologiczny AMD jest związany z akumulacją "druz" między warstwą RPE a leżącą poniżej błoną Brucha, co z kolei upośledza wsparcie RPE dla fizjologii fotoreceptorów, prowadząc do zaniku siatkówki nerwowej i utraty wzroku3,4,5. Jak dotąd nie ma lekarstwa na zaawansowaną suchą (nieneowaskularną) AMD. Pojawienie się terapii komórkami macierzystymi jako nowego paradygmatu w medycynie regeneracyjnej daje nadzieję na zastąpienie dysfunkcyjnych lub martwych komórek RPE zdrowymi komórkami pochodzącymi z komórek macierzystych. Rzeczywiście, przeprowadzono szeroko zakrojone badania przedkliniczne nad przeszczepianiem komórek macierzystych pochodzących z komórek macierzystych (np. ludzkich embrionalnych komórek macierzystych) do modeli zwierzęcych zdegenerowanych przez RPE6,7, z których niektóre przeszły do badań klinicznych8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Niedawno nasze laboratorium zidentyfikowało alternatywne źródło komórek macierzystych rezydujących w ludzkiej warstwie RPE, ludzkie komórki macierzyste RPE (hRPESCs), które są obecnie wykorzystywane w badaniach przedklinicznych nad terapią transplantacyjną komórek pochodnych RPE hRPESC (hRPESC-RPE) w AMD10,11,12,13.
Technika iniekcji podsiatkówkowej jest stosowana w badaniach przedklinicznych wymienionych powyżej przez wiele grup, w tym naszą grupę. Istnieją dwa ogólne podejścia do wstrzykiwania podsiatkówkowego u zwierząt: przezszkliste i przeztwardówkowe. Podejście przezszklistkowe ma tę zaletę, że chirurg jest w stanie bezpośrednio obserwować koniec igły, gdy penetruje ona przednie oko, przecina całą jamę ciała szklistego przylegającą do soczewki i przenika przez siatkówkę z tyłu do oka, aby dotrzeć do przestrzeni podsiatkówkowej14,15,16. Wymaga jednak przerwania siatkówki w dwóch miejscach (przedniej i tylnej), niesie ze sobą ryzyko uszkodzenia soczewki i może spowodować cofanie się komórek do ciała szklistego po cofnięciu igły. W przeciwieństwie do tego, podejście przeztwardówkowe w zasadzie pozwala uniknąć zajęcia siatkówki i ciała szklistego, a przepływ zwrotny opuszcza oko. U gryzoni barwnikowych chirurg może początkowo zaobserwować penetrację twardówki, ale po przejściu do pigmentowanego naczyniówki koniec igły nie jest już widoczny. Bez bezpośredniej obserwacji uszkodzenie siatkówki jest powszechne i może prowadzić do rozwarstwienia siatkówki i dostarczenia komórek i/lub krwi do ciała szklistego. Ponadto, ponieważ powierzchnia oka jest zakrzywiona, bardzo trudno jest określić, które kąty i głębokości igły są najskuteczniejsze w przypadku wstrzyknięć przeztwardówkowych.
W tym wizualizacjonalnym artykule wprowadzamy metodę przeztwardówkowej iniekcji podsiatkówkowej opartą na wykorzystaniu oceny pooperacyjnej za pomocą optycznej koherentnej tomografii (OCT), która pozwala na szczegółowe badanie miejsca wstrzyknięcia. Nasza technika iniekcji przeztwardówkowej wykorzystuje określone lokalizacje, kąty i głębokości igieł iniekcyjnych, aby zapewnić bardzo niski uraz chirurgiczny i wysoką niezawodność. Tutaj w szczególności demonstrujemy wstrzyknięcie komórek hRPESC-RPE do przestrzeni podsiatkówkowej szczura RCS, przedklinicznego modelu ludzkiego AMD. Dzięki tej metodzie iniekcji z powodzeniem i konsekwentnie dostarczaliśmy komórki hRPESC-RPE do przestrzeni podsiatkówkowej oczu szczurów RCS z bardzo wysokim wskaźnikiem sukcesu. Wcześniej stwierdzono, że wstrzykiwanie komórek powoduje zachowanie fotoreceptorów RCS przez co najmniej 2 miesiące po wstrzyknięciu13. Ta procedura jest wykonywana pod mikroskopem preparacyjnym i jest łatwa do nauczenia. Do wykonania wstrzyknięcia potrzebne są dwie osoby (chirurg i asystent), a średni czas wstrzyknięcia dla każdego zwierzęcia wynosi mniej niż 5 minut. Zdefiniowane kąty i głębokości igieł iniekcyjnych umożliwiają laboratoriom, w których OCT jest niedostępny, osiągnięcie udanego wstrzyknięcia podsiatkówkowego. Pozwala na wysoce powtarzalny dostęp podsiatkówkowy i może być stosowany nie tylko do przeszczepu komórek, ale także do dostarczania leków i terapii genowych.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>DNAzy I</td><td>Sigma</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>1xDulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami bez wapnia i Magnez (1xDPBS-CMF)</td><td>Corning Cellgro</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny zrównoważony roztwór soli (BSS)</td><td>Alcon</td><td>00065079550</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny płyn do płukania oczu</td><td>Moore Medical</td><td>75519</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny 0,9% roztwór soli</td><td>fizjologicznej Hospira</td><td>488810</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek proparakainy Roztwór okulistyczny (0,5%)</td><td>Akorn</td><td>17478026312</td><td></td></tr><tr><td>Tropicamidowy roztwór okulistyczny, USP (1%)</td><td>Bausch & Lomb</td><td>24208058559</td><td></td></tr><tr><td>Phenylepherine Roztwór oftalmiczny, USP (10%) zapas</td><td>Bausch & Lomb</td><td>42702010305</td><td>Jest używany do produkcji 2,5% Phenylepherine</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Patterson</td><td>433502</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>63323051610</td><td></td></tr><tr><td>100% etanolu</td><td>Thermo Scientific 615090040</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>2546.70-5</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny żel do oczu GenTeal Lubricant</td><td>Novartis</td><td>78042947</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne krople do oczu Systane Ultra Lubricant</td><td>Alcon</td><td>00065143105</td><td></td></tr><tr><td>ogniwa hRPESC-RPE</td><td>Niedostępne w sprzedaży</td><td></td><td>Proszę zapoznać się z "Odniesieniem #12" w celu izolacji i konserwacji komórek.</td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe (15 ml)</td><td>Sarstedt</td><td>62554002</td><td></td></tr><tr><td>Nasadka do mikrowirówki z o-ringiem</td><td>LPS z</td><td>L233126</td><td></td></tr><tr><td>probówkami do mikrowirówek bez nakrętki (1,7 ml)</td><td>LPS z</td><td>L233041</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna chusteczka nasączona alkoholem</td><td>McKesson</td><td>58-204</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne aplikatory z końcówką bawełnianą</td><td>McKesson</td><td>24-106-2S</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne włócznie Weck-Cel</td><td>Beaver-Visitec International&nbsp;</td><td></td><td></td>0008680</tr><tr><td>Sterylne obłożenia chirurgiczne&nbsp;</td><td>McKesson</td><td>25-515</td><td></td></tr><tr><td>Gaza</td><td>McKesson</td><td>16-4242</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Nanofil (10 ul)</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanofil</td><td></td></tr><tr><td>Igła skośna Nanofil o rozmiarze 33 Świat</td><td>Precision Instruments</td><td>NF33BV-2</td><td></td></tr><tr><td>Igły do strzykawek insulinowych o rozmiarze 31</td><td>Becton Dickinson</td><td>328418</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze zębate dla szczurów</td><td>Świat Instrumenty precyzyjne</td><td>555041FT</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Micro Nożyczki sprężynowe do preparowania</td><td>Roboz</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Pompa T do wody obiegowej&nbsp;</td>Poduszka grzewcza <td>Stryker</td><td>TP700</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kent Scientific</td><td>TPZ-814</td><td></td></tr><tr><td>System znieczulenia zwierząt</td><td>World Precision Instruments</td><td>EZ-7000</td><td></td></tr><tr><td>Balance</td><td>Ohaus</td><td>PA1502</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Seria</td><td>Schott</td><td>ACE</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania okulistycznego Bioptigen Envisu Spectral Domain</td><td>Bioptigen</td><td>R2210</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny marker</td><td>Viscot Industries</td><td>1416S-100</td><td></td></tr><tr><td>Miniaturowa skala</td><td>pomiarowa Ted Pella Inc</td><td>13623</td><td></td></tr><tr><td>Lampa punktowa do ogrzewania na podczerwień&nbsp;</td><td>EXO-TERRA</td><td>PT2144</td><td>Służy jako lampa grzewcza dla zwierząt podczas fazy rekonwalescencji pooperacyjnej&nbsp;</td></tr></tbody></table>

opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Choroby zwyrodnieniowe siatkówki, takie jak zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD), są główną przyczyną nieodwracalnej utraty wzroku na całym świecie. AMD charakteryzuje się zwyrodnieniem komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE), które są monowarstwą komórek funkcjonalnie wspierających i anatomicznie owijających się wokół siatkówki nerwowej. Obecne leczenie farmakologiczne nieneowaskularnego AMD (suchego AMD) jedynie spowalnia postęp choroby, ale nie może przywrócić wzroku, co wymaga badań mających na celu zidentyfikowanie nowych strategii terapeutycznych. Zastąpienie zwyrodnieniowych komórek RPE zdrowymi komórkami daje nadzieję na leczenie suchego AMD w przyszłości. Szeroko zakrojone badania przedkliniczne nad terapiami zastępczymi komórek macierzystych w AMD obejmują przeszczepienie komórek RPE pochodzących z komórek macierzystych do przestrzeni podsiatkówkowej modeli zwierzęcych, w której stosuje się technikę iniekcji podsiatkówkowej. Podejściem najczęściej stosowanym w tych przedklinicznych badaniach na zwierzętach jest droga przeztwardówkowa, która jest utrudniona ze względu na brak bezpośredniej wizualizacji końca igły i często może prowadzić do uszkodzenia siatkówki. Alternatywne podejście przez ciało szkliste pozwala na bezpośrednią obserwację położenia końca igły, ale niesie ze sobą wysokie ryzyko urazów chirurgicznych, ponieważ więcej tkanek oka jest zaburzonych. Opracowaliśmy mniej ryzykowną i powtarzalną zmodyfikowaną metodę wstrzykiwania przeztwardówkowego, która wykorzystuje określone kąty i głębokości igieł, aby skutecznie i konsekwentnie dostarczać komórki RPE do przestrzeni podsiatkówkowej szczura i uniknąć nadmiernego uszkodzenia siatkówki. Wcześniej wykazano, że komórki dostarczone w ten sposób są skuteczne u szczurów Royal College of Surgeons (RCS) przez co najmniej 2 miesiące. Technika ta może być stosowana nie tylko do przeszczepiania komórek, ale także do dostarczania małych cząsteczek lub terapii genowych.

Stosując technikę opisaną w niniejszym artykule, konsekwentnie wprowadzaliśmy komórki hRPESC-RPE do przestrzeni podsiatkówkowej szczurów RCS poprzez precyzyjną kontrolę lokalizacji, kąta i głębokości wprowadzenia igły wstrzykującej w tkankę (Rycina 1B-D). Bezpośrednio po transplantacji wykonano badanie OCT, aby zaobserwować miejsce wstrzyknięcia oraz pęcherz podsiatkówkowy utworzony przez przeszczepione komórki. Pooperacyjna ocena OCT służy jako narzędzie...

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych terapii zastępczej komórkami macierzystymi w przypadku zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem. W tym zwizualizowanym artykule opisujemy mniej ryzykowną, powtarzalną i precyzyjnie zmodyfikowaną technikę wstrzykiwania podsiatkówkowego za pomocą podejścia przeztwardówkowego w celu dostarczenia komórek do oczu szczura.

Opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Ogólnym celem tego filmu jest przedstawienie powtarzalnej techniki transskleralnej iniekcji podsiatkówkowej w celu wprowadzenia ludzkich komórek nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE) do przestrzeni podsiatkówkowej oczu gryzoni przy minimalnym ryzyku uszkodzenia siatkówki. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw małego nacięcia w spojówce skroniowej za limbusiem w celu odsłonięcia leżącej pod nią twardówki. Następnie, za pomocą ściętej igły do insuliny o rozmiarze 31G, penetruje się kompleks twardówki, wprowadzając igłę na głębokość 500 µm lub około połowy końcówki w tkankę, ze ściętą stroną skierowaną do góry, aby utworzyć otwór prowadzący.Następnie ściętą igłę iniekcyjną o rozmiarze 33G przymocowaną do strzykawki wprowadza się do otworu prowadzącego pod określonym kątem i na określoną głębokość; otwór iniekcyjny uszczelnia się samoistnie po wycofaniu igły, dzięki czemu nie jest wymagany szew ani klej tkankowy. Zwyrodnieniowe retinopatie obejmują szerokie spektrum schorzeń angażujących różne typy komórek siatkówki. Najczęstszą na świecie chorobą tego typu jest związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej (AMD), które występuje u osób starszych i prowadzi do trwałej ślepoty.Zmiany

development-refined-protocol-for-trans-scleral-subretinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przeszczep komórek stanowi strategię leczenia zwyrodnienia siatkówki charakteryzującego się utratą fotoreceptorów. W tym miejscu opisujemy metodę wzbogacania fotoreceptorów do przeszczepiania i ich przeszczepiania podsiatkówkowego dorosłym myszom.

Podsiatkówkowy przeszczep oczyszczonych komórek prekursorowych fotoreceptorów MACS do siatkówki dorosłej myszy

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) pochodzące z komórek macierzystych mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, w tym do terapii komórkowych w celu zwyrodnienia siatkówki, modelowania chorób i badań nad lekami. Poniżej przedstawiamy prosty protokół umożliwiający powtarzalne pozyskiwanie RPE z komórek macierzystych.

Efektywne pozyskiwanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy akceptowany przez społeczność protokół w formacie multimedialnym do podsiatkówkowego wstrzykiwania bolusa komórek RPE szczurom i myszom. Podejście to można wykorzystać do określenia potencjałów ratunkowych, profili bezpieczeństwa i zdolności przeżycia przeszczepionych komórek RPE po implantacji w zwierzęcych modelach zwyrodnienia siatkówki.

Wykonywanie iniekcji podsiatkówkowych u gryzoni w celu dostarczenia komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w zawiesinie

Strategie wymiany nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE) i terapia oparta na genach są brane pod uwagę w przypadku kilku stanów zwyrodnieniowych siatkówki. Do translacji klinicznej wymagane są modele zwierzęce z dużymi oczami do badania technik chirurgicznych stosowanych u pacjentów. W tym miejscu przedstawiamy model królika do chirurgii podsiatkówkowej ukierunkowany na przeszczep RPE, który jest wszechstronny i opłacalny.

Protokół krok po kroku dla chirurgii podsiatkówkowej u królików

Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki mogłyby służyć jako terapia zastępcza dla zaawansowanej formy suchego, związanego z wiekiem zwyrodnienia plamki żółtej. Protokół ten opisuje generowanie wielkookiego modelu atrofii geograficznej i podsiatkówkowy przeszczep ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych do tego modelu choroby.

Przeszczep podsiatkówkowy ludzkich embrionalnych komórek nabłonka barwnikowego pochodzących z komórek macierzystych siatkówki do wielkookiego modelu atrofii geograficznej

Prezentowana tutaj jest chirurgiczna technika przeszczepiania tkanki siatkówki pochodzącej z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do przestrzeni podsiatkówkowej dużego modelu zwierzęcego.

Podsiatkówkowy przeszczep ludzkiej embrionalnej tkanki siatkówki pochodzącej z komórek macierzystych w modelu dużego zwierzęcia kota

Naczelny (NHP) jest idealnym modelem do badania terapii komórkowej ludzkiej siatkówki ze względu na podobieństwa anatomiczne i genetyczne. W artykule opisano metodę podplamkowego przeszczepu komórek nabłonka barwnikowego siatkówki w oku NHP oraz strategie zapobiegania powikłaniom śródoperacyjnym związanym z manipulacją plamki żółtej.

Przeszczep nabłonka barwnikowego siatkówki w modelu naczelnych innych niż człowiek w chorobach zwyrodnieniowych siatkówki

Implantacja podsiatkówkowa pigmentowego nabłonka siatkówki (RPE) jest jednym z najbardziej obiecujących podejść do leczenia chorób zwyrodnieniowych siatkówki. Jednak wyniki badań przedklinicznych na modelach zwierzęcych z dużymi oczami pozostają wyzwaniem. W niniejszym raporcie przedstawiono wytyczne dotyczące podsiatkówkowego przeszczepiania RPE na nośniku komórkowym do świnek miniaturowych.

Podsiatkówkowa implantacja RPE na nośniku u świnek miniaturowych: wytyczne dotyczące przygotowań przedoperacyjnych, technik chirurgicznych i opieki pooperacyjnej

Ten protokół przedstawia przezźrenicowe, sterowane widzeniem podejście przeztwardówkowe do bezpiecznego i precyzyjnego dostarczania przeszczepów komórkowych podsiatkówkowych, z niskim wskaźnikiem powikłań chirurgicznych, u myszy, biorców ze zwyrodnieniem siatkówki lub bez.

Przezźrenicowe przeszczepienie przeztwardówkowe przeszczepów podsiatkówkowych w mysim modelu zwyrodnienia siatkówki

Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

Poznaj udoskonaloną technikę przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów. Metoda zapewnia precyzyjne dostarczenie komórek z minimalnym ryzykiem uszkodzenia siatkówki i samoczynnym zamykaniem się rany.

Opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie udoskonalonego protokołu przeztwardówkowego przeszczepu podsiatkówkowego ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki do oczu szczurów

Przeglądaj więcej filmów