Name: Ludzkie komórki dendrytyczne płuc: dystrybucja przestrzenna i identyfikacja fenotypowa w biopsjach wewnątrzoskrzelowych z wykorzystaniem immunohistochemii i cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: Poznaj metody identyfikacji ludzkich komórek dendrytycznych płuc w biopsjach wewnątrzoskrzelowych przy użyciu immunohistochemii i cytometrii przepływowej. Protokoły te umożliwiają badanie odpowiedzi immunologicznej w drogach oddechowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować ochotnikom, którzy dostarczyli materiał kliniczny do tego badania. Jesteśmy również wdzięczni personelowi Departamentu Zdrowia Publicznego i Medycyny Klinicznej, Oddziału Medycyny/Medycyny Układu Oddechowego, Szpitala Uniwersyteckiego, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) za zebranie całego materiału klinicznego.
Ta praca była wspierana przez granty dla AS-S od Szwedzkiej Rady ds. Badań, Szwedzkiej Fundacji Heart-Lung, Szwedzkiej Fundacji Badań Strategicznych i Karolinska Institutet.

UWAGA: To badanie zostało zatwierdzone przez regionalną Komisję Oceny Etyki w Umeå, Szwecja.
1. Bronchoskopia do pobierania próbek biopsji wewnątrzoskrzelowych od ludzi
<ol>
	<li>Uzyskaj świadomą zgodę od wszystkich uczestników.</li>
	<li>Pacjentów należy leczyć doustnym midazolamem (4-8 mg) i dożylnie glikopironium (0,2-04 mg) 30 minut przed bronchoskopią. Zastosuj znieczulenie miejscowe z lidokainą w krtań i oskrzelach. Pozwól pacjentowi przepłukać gardło ~ 3 ml lidokainy 4% i nałóż 3 ml na podstawę języka i do krtani za pomocą strzykawki do krtani. Zoptymalizuj znieczulenie miejscowe za pomocą 8-10 dawek lidokainy w sprayu. Wykonaj ten krok, gdy obiekt siedzi.</li>
	<li>Wprowadzić elastyczny wideobronchoskop przez usta przez plastikowy ustnik z pacjentem w pozycji leżącej. Użyj specjalnie przygotowanego cewnika w sprayu, aby zakończyć znieczulenie miejscowe dystalnej tchawicy i oskrzeli za pomocą bronchoskopu. Tutaj użyj dawki około 5-10 ml lidokainy 2%.</li>
	<li>Wykonaj 6-9 biopsji błony śluzowej oskrzeli z głównej cariny i głównych podziałów oskrzeli za pomocą kleszczy fenestrowanych (ryc. 1). Po bronchoskopii, a przed opuszczeniem szpitala, pozwól pacjentowi odpocząć przez 2-4 godziny i zapewnij mu lekki posiłek.</li>
</ol>
2. Osadzanie biopsji w żywicy glikolu metyloakrylanu (GMA)
UWAGA: Protokół barwienia immunologicznego GMA został pierwotnie opracowany na Uniwersytecie w Southampton, Histochemistry Research Unit17.
<ol>
	<li>Utrwalenie: Do celów immunohistochemicznych należy usunąć biopsje z kleszczy i umieścić je bezpośrednio w szklanych fiolkach zawierających 3 ml lodowato odwodnionego acetonu i inhibitorów proteazy (fluorek fenylometylosulfonylu (35 mg/100 ml acetonu) i jodoacetamid (370 mg/100 ml acetonu)). Utrwalić tkankę przez noc w temperaturze -20 °C (ryc. 2). 
	UWAGA: Poniższe czynności należy wykonywać w dygestorium w odpowiednich rękawicach nitrylowych. Zestaw do zatapiania zawiera składniki, które mogą powodować uczulenie, podrażnienie i/lub alergiczne reakcje skórne. Wszystkie odpady należy utylizować jako odpady niebezpieczne.</li>
	<li>Odwodnienie: Usuń aceton z inhibitorami i zastąp go świeżym odwodnionym acetonem (bez inhibitorów) na 15 minut w temperaturze pokojowej (RT). Usuń aceton i zastąp go benzoesanem metylu na 15 minut.</li>
	<li>Infiltracja: Przygotować roztwór do przetwarzania 5% roztworu benzoesanu metylu w monomerze metakrylanu glikolu; 10 ml wystarcza na jedną fiolkę. Za pomocą plastikowych pipet Pasteura odessać roztwór benzoesanu metylu i zastąpić go 3 ml roztworu do przetwórstwa. Inkubować biopsje i nadmiar roztworu do przetwarzania w temperaturze 4 °C przez 2 godziny; Pipety Pasteura mogą być używane do wszystkich kolejnych zmian roztworu, w tym do zatapiania roztworu.</li>
	<li>Roztwór do przetwarzania należy wymieniać co 2 godziny (inkubacje 3 x 2 godziny), tak aby całkowity czas infiltracji biopsji w roztworze do przetwarzania wynosił co najmniej 6 godzin. Włóż papierowe etykiety do górnego końca kapsułek do zatapiania, aby zidentyfikować biopsje.</li>
	<li>Przygotować roztwór do zatapiania 75 mg nadtlenku benzoilu w 10 ml monomeru metakrylanu glikolu. Dodać 0,25 ml poli(tlenku etylenu) N,N-dimetyloaniliny (akceleratora) do roztworu do zatapiania, aby rozpocząć reakcję polimeryzacji. Usunąć roztwór do przetwarzania i umieścić jedną biopsję w odpowiedniej kapsułce do osadzania za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Powoli napełnić kapsułkę do osadzania do góry roztworem do zatapiania i zamknąć nakrętkę. Unikaj zakłócania biopsji i tworzenia dużych pęcherzyków powietrza. Inkubować kapsułki w temperaturze 4 °C aż do całkowitej polimeryzacji żywicy.</li>
	<li>Osadzone biopsje należy przechowywać w temperaturze -20 °C w probówce o pojemności 50 ml zawierającej około 5 g żelu krzemionkowego.</li>
</ol>
3. Sekcja biopsji wewnątrzoskrzelowych osadzonych w GMA
<ol>
	<li>Powłoka szkiełek mikroskopowych: Umyj szkiełka mikroskopowe w zmywarce w normalnym cyklu. Przykryj szkiełka i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Przygotować roztwór powlekający z 10% roztworu poli-L-lizyny (PLL) w wodzie destylowanej. Zanurz szkiełka w roztworze powłokowym na 5 minut, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Suche szkiełka z powłoką PLL należy przechowywać w oryginalnych pudełkach.</li>
	<li>Umyj paski szkła z 0,1% Tween 20 w wodzie destylowanej. Opłucz szklankę 70% etanolem i osusz ręcznikami papierowymi. Wytnij szklane ostrza z paska szkła za pomocą noża. Przechowuj ostrza w pojemniku, który zapobiega ruchomości, aby krawędź tnąca nie została uszkodzona ani wyszczerbiona.</li>
	<li>Przycinanie biopsji: Umieść kapsułkę do biopsji w rozdzielaczu kapsułek i odetnij każdą stronę za pomocą ostrza o pojedynczej krawędzi ze stali węglowej. Wyjmij biopsję wbudowaną w GMA i umieść ją mocno w imadle. Odetnij nadmiar GMA z okolic biopsji za pomocą stalowego ostrza.</li>
	<li>Podział na sekcje GMA.
	<ol>
		<li>Przygotuj 0,05% roztwór amoniaku z wodą destylowaną. Umieść szklany nóż i biopsję w mikrotomie. Ostrożnie wyrównaj blok biopsyjny z ostrzem, regulując uchwyt noża i kąt bloku biopsyjnego tak, aby ostrze spoczywało płasko na powierzchni bloku.</li>
		<li>Wytnij odcinki o grubości 2 μm za pomocą mikrotomu z małą prędkością cięcia i użyj kleszczy do przenoszenia i wypływu sekcji na wodzie amoniakalnej. Unosić sekcje przez 45-90 sekund, umożliwiając delikatne pobranie antygenu i rozwinięcie sekcji.</li>
		<li>Podnieś sekcje za pomocą szkiełka mikroskopowego. Sprawdź histologię biopsji, szybko barwiąc błękitem toluidyny.</li>
		<li>Wysuszyć szkiełka na płycie grzejnej ustawionej na 50 °C i nanieść 500 μl przefiltrowanego barwnika toluidynowego na wycinek za pomocą plastikowej pipety Pasteura. Ogrzej część na płycie grzejnej, aż na krawędzi plamy zacznie pojawiać się zielony pierścień, a następnie zmyj go wodą.</li>
		<li>Za pomocą mikroskopu świetlnego sprawdź histologię biopsji. Skrawki stosowane do immunohistochemii powinny zawierać dobre obszary nieuszkodzonej blaszki właściwej i nabłonka, z jak najmniejszą liczbą gruczołów i jak najmniejszą ilością mięśni gładkich.</li>
		<li>Podobnie jak w sekcji 3.4.2, należy wyciąć odcinki o dobrej histologii i zebrać je za pomocą szkiełek mikroskopowych pokrytych PLL w celu barwienia immunohistochemicznego. Wytnij co najmniej dwa skrawki z każdej biopsji do analizy. Suszyć szkiełka przez co najmniej 1 godzinę. Po wyschnięciu skrawki można zawinąć w folię aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C do 2 tygodni lub można je natychmiast wybarwić immunologicznie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Barwienie immunohistochemiczne biopsji wewnątrzoskrzelowych wbudowanych w GMA
UWAGA: Azydek sodu jest toksyczny. Przygotować 0,1% roztwór azydku sodu w dygestoriach, z dala od kwasów. Kontakt z kwasami uwalnia toksyczne gazy.
<ol>
	<li>Narysuj sekcje za pomocą pisaka z diamentową końcówką i ułóż slajdy na stojaku do barwienia.</li>
	<li>Wykonaj blok peroksydazy. Przygotować roztwór blokowy peroksydazy składający się z 0,3% nadtlenku wodoru w 0,1% roztworze azydku sodu. Nanieść 1 ml bloku peroksydazy na skrawki i inkubować przez 30 minut.</li>
	<li>Przygotować roztwór płuczący z 0,05 M soli fizjologicznej buforowanej trisem (TBS), pH 7,6. Umyj szkiełka w TBS, 3x 5 min.</li>
	<li>Przygotować 1% roztwór blokowy BSA w DMEM. Zrób to z wyprzedzeniem i w dużych ilościach, podwielokrotn i zamroź do czasu, aż będzie potrzebny. Opróżnić szkiełka i inkubować skrawki w roztworze blokowym przez 30 minut, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał. Jeśli nadal występuje niespecyficzne wiązanie, należy przeprowadzić 30-minutowy etap inkubacji z 5% blokiem surowicy tego samego gatunku co przeciwciało drugorzędowe.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe (CD45 lub CD1a) w TBS do pożądanego stężenia (CD45 rozcieńczone w stosunku 1:1,000; CD1a rozcieńczony w stosunku 1:1,00) i nakładać na szkiełka podstawowe. Szkiełko nakrywkowe należy nakryć skrawki i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj slajdy w TBS trzy razy. Rozcieńczyć biotynylowane przeciwciało drugorzędowe (skierowane przeciwko pierwszorzędowemu gatunkowi przeciwciała gospodarza, w tym przypadku króliczemu przeciwciału anty-myszemu F(ab'2)) w TBS do pożądanego stężenia (rozcieńczenie 1:300) i nałożyć na szkiełka. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować kompleks biotyny i peroksydazy streptawidyny co najmniej 30 minut przed użyciem. Upewnij się, że jest wystarczająco dużo, aby zakryć wszystkie slajdy. Umyj szkiełka w TBS trzy razy. Nanieść roztwór na szkiełka i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umyj szkiełka w TBS trzy razy. Przygotować roztwór substratu peroksydazy 3-amino-9-etylokarbazolu (AEC) (wykonany zgodnie z instrukcjami producenta). Nałóż go na szkiełka i inkubuj przez 20-30 minut lub do momentu uzyskania pożądanej intensywności plamy.</li>
	<li>Opłucz szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut. Przeciwbarwić skrawki przefiltrowanym roztworem hematoksyliny Mayera przez 2 minuty. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut.</li>
	<li>Opróżnij szkiełka i przykryj sekcje trwałym wodnym medium montażowym. Wysuszyć szkiełka w temperaturze 80 °C w suszarce. Poczekaj, aż szkiełka ostygną, a następnie zamontuj je za pomocą DPX i umieść szkiełko nakrywkowe.</li>
</ol>
5. Analiza barwienia
<ol>
	<li>Analizuj przekroje przy 40-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu świetlnego z zamontowaną kamerą podłączoną do komputera. 
	UWAGA: W celu analizy komórkowej policz dodatnio wybarwione, jądrzaste komórki w blaszce właściwej oskrzeli i nienaruszonym nabłonku, z wyłączeniem obszarów mięśni gładkich, gruczołów, dużych naczyń krwionośnych oraz niedopasowanych lub uszkodzonych tkanek.</li>
	<li>Uśrednić liczbę komórek i skorygować średnią liczbę komórek dla obszaru blaszki właściwej i długości nabłonka. Powierzchnię blaszki właściwej i długość nabłonka można obliczyć za pomocą programu do analizy obrazu.</li>
</ol>
6. Trawienie enzymatyczne biopsji wewnątrzoskrzelowych
<ol>
	<li>Biopsje myjące: Za pomocą sterylnych kleszczy umieść nienaruszone biopsje w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml buforowanego roztworu soli fizjologicznej Hanka (HBSS) (ryc. 3). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej z prędkością 30 obr./min. Przenieść biopsje do sterylnego naczynia, dekantując zawartość probówki o pojemności 15 ml za pomocą HBSS.</li>
	<li>Zakłócanie wydzielania śluzu za pomocą DTT: Zastąp HBSS w probówce 10 ml HBSS zawierającym 5 mM 1,4-ditiotreitolu (DTT). Przenieś biopsje z powrotem do probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnych kleszczy. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej z prędkością 30 obr./min.</li>
	<li>Delikatnie obracać probówkę przez 15 sekund. Przenieść biopsje na sterylne naczynie, dekantując zawartość probówki o pojemności 15 ml za pomocą HBSS i DTT.</li>
	<li>Przenoszenie biopsji do pożywki hodowlanej: Zastąp HBSS i DTT w probówce 10 ml pożywki hodowlanej RPMI 1640. Przenieś biopsje z powrotem do probówki o pojemności 15 ml za pomocą sterylnych kleszczy. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej z prędkością 30 obr./min.</li>
	<li>Biopsje trawienne z kolagenazą i DNazą.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór trawiący kolagenazy II (0,25 mg/ml) i DNazy (0,2 mg/ml) we wstępnie podgrzanym RPMI zawierającym 1 M roztwór HEPES. Dodać 500 μl roztworu trawiącego do każdego dołka na 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.</li>
		<li>Umieścić 1 biopsję na studzienkę w roztworze trawiącym. Inkubować płytkę na platformie wytrząsającej przez 60 minut w temperaturze 37 °C przy 220 obr./min. Po 30 minutach pipetować w górę i w dół, aby ponownie rozproszyć biopsje, a po 60 minutach, aby całkowicie zdezagregować tkankę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych.
	<ol>
		<li>Zebrać strawione biopsje ze studzienek w probówce o pojemności 50 ml, przepuszczając ją przez sitko do komórek o wielkości 40 μm. Zebrać pozostałe komórki, przemywając studzienki lodowatym buforem FACS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) zawierająca 2% płodowej surowicy bydlęcej).</li>
		<li>Wycisnąć pozostałą tkankę na sitko do komórek za pomocą tylnej części tłoka strzykawki. Odwirować strawione komórki w temperaturze 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml lodowatego buforu FACS. Policz komórki ręcznie za pomocą hemocytometru i niebieskiego barwnika Trypana, aby ocenić żywotność komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Analiza cytometryczna przepływowa pojedynczych komórek biopsji wewnątrzoskrzelowej po trawieniu enzymatycznym
<ol>
	<li>Zawiesić osad komórkowy na około 1 x 106 komórek w 200 μl buforu FACS.</li>
	<li>Dodaj barwnik żywotności komórek w celu wykluczenia martwych komórek zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Dodać 5 μl odczynnika blokującego FcR i inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać przeciwciała powierzchniowe przeciwko CD45 (2 μl), linii (CD3, CD20, CD56, CD66abce i CD14; po 2 μl), CD16 (0,5 μl), HLA-DR (3 μl), CD11c (5 μl), CD123 (5 μl), CD1c (3 μl) i CD103 (2 μl) i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Szczegóły dotyczące przeciwciał można znaleźć w sekcji dotyczącej metod, ale miareczkować i optymalizować przeciwciała do używanego precyzyjnego cytometru przepływowego. Nadmiar przeciwciał zmyć PBS przez 5 minut przy 400 x g. Próbki należy pobrać świeżo za pomocą cytometru przepływowego lub utrwalić komórki w 1% paraformaldehydzie przed późniejszym pobraniem.</li>
	<li>Zidentyfikuj ludzkie DC w biopsjach płuc za pomocą testu cytometrii przepływowej18 (Rysunek 4). 
	UWAGA: Korzystając z oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej, komórki odpornościowe odróżnia się od innych komórek płuc poprzez bramkowanie na CD45. Martwe komórki można wykluczyć jako komórki, które są dodatnie dla barwnika ALIVE/DEAD. Spośród wszystkich żywych komórek CD45 + komórki liniowe (limfocyty B, limfocyty T, komórki NK, neutrofile i monocyty) można wykluczyć za pomocą koktajlu przeciwciał przeciwko CD20, CD3, CD56, CD66abce, CD14 i CD16 w jednym kanale. Następnie komórki HLA-DR+ pozwolą na identyfikację wszystkich ludzkich DC. MDC można odróżnić od PDC na podstawie odpowiednio ekspresji CD11c lub braku CD11c. MDC można dalej podzielić na CD1c+ MDC lub CD141+.</li>
</ol>

<ol><li>Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+function+of+lung-resident+macrophages+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells.</a> Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).</li>
<li>Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+dendritic+cells+at+the+innate-adaptive+immune+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface.</a> J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).</li>
<li>Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+lung+dendritic+cells+at+the+origin+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma.</a> Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).</li>
<li>Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+monocyte-derived+cells%3A+Two+complementary+and+integrated+functional+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems.</a> Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomenclature+of+monocytes+and+dendritic+cells+in+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood.</a> Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).</li>
<li>Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+human+pulmonary+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).</li>
<li>Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+rare-event+detection+and+analysis+of+dendritic+cell+subsets+in+broncho-alveolar+lavage+fluid+and+peripheral+blood+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry.</a> Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).</li>
<li>Masten, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+myeloid+and+plasmacytoid+dendritic+cells+in+human+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung.</a> J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).</li>
<li>Ten Berge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+isolating+dendritic+cells+from+human+bronchoalveolar+lavage+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid.</a> J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).</li>
<li>Yu, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD1c%2B+dendritic+cells+drive+the+differentiation+of+CD103%2B+CD8%2B+mucosal+effector+T+cells+via+the+cytokine+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta.</a> Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).</li>
<li>Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+potent+and+poorly+functional+human+lung+accessory+cells+based+on+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence.</a> J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).</li>
<li>Sertl, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+with+antigen-presenting+capability+reside+in+airway+epithelium%2C+lung+parenchyma%2C+and+visceral+pleura%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura.</a> J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).</li>
<li>van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+immunophenotype+of+mononuclear+phagocytes+and+dendritic+cells+in+the+human+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).</li>
<li>Schlitzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF4+transcription+factor-dependent+CD11b%2B+dendritic+cells+in+human+and+mouse+control+mucosal+IL-17+cytokine+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses.</a> Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).</li>
<li>Yu, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Analysis+of+Myeloid+Cells+in+Human+Blood%2C+Bronchoalveolar+Lavage%2C+and+Lung+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).</li>
<li>Haniffa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tissues+contain+CD141hi+cross-presenting+dendritic+cells+with+functional+homology+to+mouse+CD103%2B+nonlymphoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells.</a> Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).</li>
<li>Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemistry+on+resin+sections%3A+a+comparison+of+resin+embedding+techniques+for+small+mucosal+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech+Histochem%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies.</a> Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).</li>
<li>Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seventeen-colour+flow+cytometry%3A+unravelling+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system.</a> Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).</li>
<li>Baharom, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+Cells+and+Monocytes+with+Distinct+Inflammatory+Responses+Reside+in+Lung+Mucosa+of+Healthy+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans.</a> J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+inflammatory+responses+in+the+airways+and+peripheral+blood+after+short-term+exposure+to+diesel+exhaust+in+healthy+human+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers.</a> Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).</li>
<li>Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+density%2C+distribution%2C+and+surface+phenotype+of+intraepithelial+class+II+major+histocompatibility+complex+antigen+%28Ia%29-bearing+dendritic+cells+%28DC%29+in+the+conducting+airways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways.</a> J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).</li>
<li>Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+flow+cytometry%3A+helping+to+make+sense+of+high-dimensional+immunology+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data.</a> Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W artykule opisano, jak uzyskać szczegółową charakterystykę przestrzenną i fenotypową DC rezydujących w tkance płucnej u zdrowych ludzi przy użyciu immunohistochemii i cytometrii przepływowej w biopsjach błony śluzowej wewnątrzoskrzelowej pobranych podczas bronchoskopii. W poniższych punktach szczegółowo omówiono kluczowe etapy protokołu.
Krytyczne kroki z protokołem
Sekcja i immunohistochemia: Bardzo ważne jest, aby utrzymać bloki biopsji w temperaturze -20 °C, gdy ic...

Płuca są w ciągłym kontakcie ze środowiskiem zewnętrznym i są bardzo narażone zarówno na nieszkodliwe cząsteczki, jak i mikroby, które mogą powodować choroby. Dlatego tak ważne jest, aby układ odpornościowy wytworzył silną odpowiedź immunologiczną przeciwko atakującym patogenom, ale równie ważne jest utrzymanie tolerancji na wdychane antygeny, które nie powodują choroby. Aby zapewnić silny nadzór immunologiczny, układ oddechowy jest wyłożony siecią komórek odpornościowych, w tym komórek dendrytycznych (DC). DC to profesjonalne komórki prezentujące antygen z unikalną zdolnością do aktywacji naiwnych limfocytów T. W ludzkich płucach rezydentne DC napotykają antygen, a następnie przetwarzają go i transportują do węzłów chłonnych drenujących płuca w celu prezentacji i aktywacji limfocytów T1,2,3.
W ludzkim układzie odpornościowym DC można podzielić na kilka podzbiorów, z różnymi, ale nakładającymi się na siebie funkcjami: CD1c+ i CD141+ mieloidalne DC (MDC) oraz CD123+ plazmocytoidalne DC (PDC)4,5. Podczas gdy najbardziej szczegółowa wiedza na temat ludzkich DC pochodzi z badań na krwi, obecnie jest oczywiste, że ludzkie płuca zawierają również rzadkie populacje podzbiorów DC o zdolności stymulacyjnej komórek T6,7,8,9. Jednak coraz więcej danych pokazuje, że komórki odpornościowe, w tym DC, różnią się częstotliwością, fenotypem i funkcją w zależności od ich anatomicznej lokalizacji10. Dlatego ważne jest, aby zbadać komórki odpornościowe z odpowiedniej tkanki, aby zrozumieć ich wkład w lokalną odporność i tolerancję. Podsumowując, podkreśla to potrzebę badania DC rezydentów płuc w przypadku chorób płuc, mimo że DC krwi są łatwiej dostępne i dostępne u ludzi.
Pierwsze badania, które badały DC rezydujące w płucach u ludzi, opierały się głównie na morfologii i ekspresji pojedynczych markerów, takich jak HLA-DR i CD11c, w skrawkach tkanek za pomocą immunohistochemii11,12,13. W przeciwieństwie do tego, nowsze badania zazwyczaj opierały się na analizach cytometrii przepływowej w celu zbadania różnych podzbiorów komórek odpornościowych. Ponieważ jednak trudno jest znaleźć pojedynczy marker powierzchni komórki, który jednoznacznie identyfikuje określony podzbiór DC, potencjalnym ograniczeniem badań z zastosowaniem tylko czterokolorowej cytometrii przepływowej jest ryzyko włączenia populacji komórek o podobnych markerach fenotypowych jak DC. Na przykład CD11c ulega ekspresji we wszystkich szpikowych DC i zdecydowanej większości monocytów. Z drugiej strony, w badaniach wykorzystujących bardziej zaawansowane panele cytometrii przepływowej, zwykle wykorzystywano nienowotworową tkankę płucną z chirurgicznych resekcji pacjentów10,14,15,16, chociaż nie jest jasne, czy te rzadkie populacje są naprawdę reprezentatywne dla DC obecnych u zdrowych osób. Ogólnie rzecz biorąc, badania są ograniczone, głównie ze względu na fakt, że chirurgicznie usunięta lub cała ludzka tkanka płucna jest rzadkością.
Aby przezwyciężyć niektóre z tych ograniczeń, ta praca opisuje, jak przeprowadzić szczegółową analizę rozkładu przestrzennego i fenotypową identyfikację DC w biopsjach wewnątrzoskrzelowych błony śluzowej uzyskanych od zdrowych ochotników, którzy przeszli bronchoskopię. Od każdej osoby można pobrać kilka małych biopsji, które następnie można umieścić w celu przekroju i analizy przy użyciu immunohistochemii lub trawić enzymatycznie w celu zaawansowanej analizy cytometrycznej przepływowej. Wykorzystanie tkanki płucnej w postaci biopsji wewnątrzoskrzelowej uzyskanej z bronchoskopii ma tę zaletę, że umożliwia przeprowadzenie badania na zdrowych ochotnikach, w przeciwieństwie do otwartej chirurgii płuc, która z oczywistych względów jest ograniczona do pacjentów wymagających operacji klatki piersiowej. Co więcej, tkanka, która jest pobierana podczas bronchoskopii od zdrowych ochotników, jest fizjologicznie normalna, w przeciwieństwie do niedotkniętego obszaru tkanki płucnej u pacjentów z chorobą płuc. Z drugiej strony, biopsje są małe, a liczba pobranych komórek, nawet przy łączeniu kilku biopsji, ogranicza rodzaj analiz, które można wykonać.
Chociaż obecna praca skupia się na DCs, opisane metody mogą być bezpośrednio rozszerzone o inne (immunologiczne) komórki będące przedmiotem zainteresowania, które znajdują się w ludzkiej błonie śluzowej płuc. Ponadto protokoły mają również bezpośrednie zastosowanie do próbek uzyskanych od pacjentów cierpiących na choroby płuc, w których bronchoskopia jest częścią ustalenia diagnozy, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), sarkoidoza lub rak płuc.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Bronchoskopia</td></tr><tr><td>Bronchoskop BF1T160</td><td>Olympus</td><td>BF1T160</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>Exera CV-160</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze z otworem</td><td>Olympus</td><td>FB21C</td><td>Służy do wykonywania biopsji</td></tr><tr><td>Blok zgryzowy</td><td>Conmed</td><td>1429</td><td>20 mm x 27 mm</td></tr><tr><td>Glukoza 25%&nbsp;</td><td></td><td></td><td>500 ml dożylnie</td></tr><tr><td>bromek glikopironium 0,2 mg/ml</td><td></td><td></td><td>dożylnie. Zapobiega wydzielaniu śluzu/śliny</td></tr><tr><td>Mixt. Midazolam 1 mg/ml p.o</td><td></td><td></td><td>Może być stosowany dla dodatkowego relaksu</td></tr><tr><td>Lidokaina, 40 mg/ml</td><td></td><td></td><td>Podawanie do ust i gardła / Płukanie gardła</td></tr><tr><td>Lidokaina 100 mg/ml spray</td><td></td><td></td><td>Podawany na tylną część gardła</td></tr><tr><td>Lidokaina 20 mg/ml spray</td><td></td><td></td><td>Podawany za pomocą bronchoskopu do dróg oddechowych</td></tr><tr><td colspan="4">GMA przetwarzanie i osadzanie </td></tr><tr><td>Fiolki szklane</td><td></td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>Sita molekularne, 4 &#197;</td><td>Alfa Aesar</td><td>88120</td><td>Granulki o średnicy 3-4 mm Fluorek</td></tr><tr><td>fenylometylosulfonylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-7626</td><td>0,035 g/100 ml aceton</td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-6125</td><td>0,37 g/100 ml aceton</td></tr><tr><td>Polietylen-płaski&nbsp; Kapsułki do zatapiania TAAB</td><td>Laboratoria TAAB</td><td>C094</td><td>o średnicy 500 x 8 mm, polietylenowe, kapsułki z płaskim dnem</td></tr><tr><td>Uchwyt na</td><td>kapsułki Laboratoria TAAB</td><td>C054</td><td>Mieści 25 kapsułek 8 mm</td></tr><tr><td>Zestaw do zatapiania JB-4 GMA</td><td>Polysciences</td><td>00226</td><td>Zawiera JB-4 roztwór A (0026A-800), JB-4 roztwór B (0026B-3.8), nadtlenek benzoilu (02618-12)</td></tr><tr><td>Benzoesan metylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27614-1L</td><td></td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy ze wskaźnikiem wilgotności</td><td>Scharlau</td><td>GE0043</td><td>2,5-6 mm&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">GMA sectioning</td></tr><tr><td>Glass Szkiełka mikroskopowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10143562CEF</td><td>Krawędzie cięte, matowy koniec</td></tr><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920-500mL</td><td>1:10 do roztworu roboczego</td></tr><tr><td>Paski szklane do ultramikrotomii</td><td>Alkar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>Wash roztwór (0,1% Tween20)</td></tr><tr><td>LKB 7800B Knifemaker</td><td>LKB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozdzielacz kapsułek</td><td>Laboratoria TAAB</td><td>C065</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza jednoostrzowe ze stali węglowej</td><td>Laboratoria TAAB</td><td>B054</td><td></td></tr><tr><td>Vice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amoniak, 25%</td><td>VWR</td><td>1133.1000</td><td>2 ml w 1 L, 1:500 (0.05%)</td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica RM 2165</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Mikroskop Leica</td><td></td><td>Leica CLS 150 XE</td></tr><tr><td>ze statywem na ramieniu wahadłowym</td><td>Leica</td><td></td><td>Leica MZ6</td></tr><tr><td colspan="4">GMA ImmunohistochemistryPióro</td></tr> <tr><td>z diamentową końcówką</td><td>Histolab</td><td>5218</td><td></td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru 30% roztwór</td><td>AnalaR Normapur</td><td>23619.264</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Chemikalia VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Millipore</td><td>82-045-2</td><td>Probumin BSA klasy diagnostycznej</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane podłoże orła Dulbecco (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD45</td><td>BioLegend</td><td>304002</td><td>Mysz monoklonalna, klon HI30, izotyp IgG1k. Stężenie robocze 500 ng / ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie CD1a</td><td>AbD Serotech</td><td>MCA80GA</td><td>Mysz monoklonalna, klon NA1 / 34-HLK, izotyp IgG2a. Stężenie robocze 10 i mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Mysia kontrola izotypu monoklonalnego IgG1</td><td>Abcam</td><td>ab27479</td><td></td></tr><tr><td>Mysza monoklonalna kontrola izotypu IgG2a</td><td>Dako</td><td>X094301-2</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC Elite standardowy zestaw</td><td>Vector Labs</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Latawiec substratu peroksydazy AEC (3-amino-9-etylokarbazolu)</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4200</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina Mayersa</td><td>HistoLab</td><td>01820</td><td></td></tr><tr><td>Trwały roztwór wodny</td><td>AbD Serotech</td><td>BUF058C</td><td></td></tr><tr><td>Suszarka</td><td></td><td></td><td></td></tr> do <tr><td>suszenia DPX do montażu na stałe&nbsp;</td><td>Mikroskop świetlny VWR</td><td>360292F</td><td></td></tr><tr><td>Aparat mikroskopowy</td><td></td> Leica <td></td>Leica DMLB Oprogramowanie <td></td> analityczne Leica Leica DFC 320</tr><tr><td>Leica</td><td></td><td></td><td>Leica Qwin V3</td></tr><tr><td colspan="4"><silny>Trawienie enzymatyczne<tr><td></td><td></td><td></td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS)Sigma-Aldrich 55021C <td></td></tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DTT-RO</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DNaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001&nbsp; ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platforma kołyskowa</td><td>Instrumenty grantowe</td><td>PMR-30</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurki stożkowe</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m sitko do komórek</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">cytometria przepływowa</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Aqua zestaw do naprawy martwych komórek</td><td>Life Technologies</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD</td><td>555485</td><td></td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>557757</td><td></td></tr><tr><td>CD20</td><td>BD</td><td></td><td></td>335829</tr><tr><td>CD56</td><td>Biolegend</td><td>318332</td><td></td></tr><tr><td>CD66abce</td><td>Miltenyi</td><td>130-101-132</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> 555813 <tr><td>CD14</td><td>BD</td><td>557831</td> CD16 Biolegend 302026 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> CD11c BD 560369 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> CD1c Miltenyi <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>130-098-009</td><td></td></tr><tr><td>CD141</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-514</td><td></td></tr><tr><td>CD103</td><td>Biolegend</td><td>350212</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>LSR II Cytometr przepływowy</td><td>BD</td><td></td><td>Cytometr przepływowy</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy</td></tr></tbody></table>

ludzkie komórki dendrytyczne płuc: dystrybucja przestrzenna i identyfikacja fenotypowa w biopsjach wewnątrzoskrzelowych z wykorzystaniem immunohistochemii i cytometrii przepływowej

Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry

Płuca są stale narażone na działanie środowiska zewnętrznego, które oprócz nieszkodliwych cząsteczek zawiera również patogeny, alergeny i toksyny. Aby utrzymać tolerancję lub wywołać odpowiedź immunologiczną, układ odpornościowy musi odpowiednio radzić sobie z wdychanymi antygenami. Komórki dendrytyczne płuc (DC) są niezbędne do utrzymania delikatnej równowagi, aby w razie potrzeby zainicjować odporność, nie powodując ubocznych uszkodzeń płuc z powodu przesadnej odpowiedzi zapalnej. Chociaż istnieje szczegółowe zrozumienie fenotypu i funkcji komórek odpornościowych, takich jak DC w ludzkiej krwi, wiedza na temat tych komórek w mniej dostępnych tkankach, takich jak płuca, jest znacznie bardziej ograniczona, ponieważ badania próbek ludzkiej tkanki płucnej, zwłaszcza od zdrowych osób, są rzadkie. W niniejszej pracy przedstawiono strategię generowania szczegółowej charakterystyki przestrzennej i fenotypowej DC rezydujących w tkance płucnej u zdrowych ludzi, którzy przechodzą bronchoskopię w celu pobrania próbek biopsji wewnątrzoskrzelowych. Od każdej osoby można pobrać kilka małych biopsji, które można następnie umieścić w celu ultradrobnego przekroju lub trawić enzymatycznie w celu zaawansowanej analizy cytometrii przepływowej. Przedstawione protokoły zostały zoptymalizowane w celu uzyskania maksymalnych informacji z małych próbek tkanek, które w warunkach stanu ustalonego zawierają tylko niską częstotliwość DC. Podczas gdy obecne prace koncentrują się na DC, opisane metody można bezpośrednio rozszerzyć, aby objąć inne (immunologiczne) komórki będące przedmiotem zainteresowania znajdujące się w błonie śluzowej płuc. Ponadto protokoły mają również bezpośrednie zastosowanie do próbek uzyskanych od pacjentów cierpiących na choroby płuc, w których bronchoskopia jest częścią ustalenia diagnozy, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP), sarkoidoza lub rak płuc.

Badania charakteryzujące rezydentne komórki odpornościowe tkanek dróg oddechowych człowieka, w tym komórki DC, są ograniczone, głównie ze względu na rzadką dostępność chirurgicznie usuniętej lub całej tkanki płucnej człowieka. W niniejszym opracowaniu przedstawiono mniej inwazyjną metodę pozyskiwania tkanki płucnej z biopsji endobronchialnych (EBB) zdrowych ochotników oraz opracowano protokoły badania komórek odpornościowych w tkance z wykorzystaniem immunohistochemii lub cytometrii przep...

Komórki odpornościowe rezydujące w płucach, w tym komórki dendrytyczne (DC) u ludzi, są kluczowe dla obrony przed wziewnymi patogenami i alergenami. Jednak ze względu na niedobór ludzkiej tkanki płucnej badania są ograniczone. W pracy przedstawiono protokoły przetwarzania biopsji wewnątrzoskrzelowych błony śluzowej człowieka do badania DC płuc z wykorzystaniem immunohistochemii i cytometrii przepływowej.

Ludzkie komórki dendrytyczne płuc: dystrybucja przestrzenna i identyfikacja fenotypowa w biopsjach wewnątrzoskrzelowych z wykorzystaniem immunohistochemii i cytometrii przepływowej

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In ...

Główną zaletą tej techniki jest możliwość uzyskania dużej ilości informacji z niewielkich fragmentów tkanek pobranych podczas bronchoskopii. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu immunologii błon śluzowych, w przypadkach, gdy bronchoskopia jest elementem diagnostyki schorzeń takich jak POChP, sarkoidoza czy rak płuca. Wizualna prezentacja tej procedury pozwoli osobom rozpoczynającym pracę z tą metodą rozpoznać moment zakończenia trawienia enzymatycznego. Procedurę tę, wraz z Faezzah Baharom, zaprezentuje Greg Rankin, postdoc z laboratorium naszego współpracownika na Ume

human-lung-dendritic-cells-spatial-distribution-phenotypic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Opisujemy strategię monitorowania dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc w odpowiedzi na owalbuminę w warunkach wywołanego owalbuminą alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych. Strategię tę można zmodyfikować w celu oceny migracji komórek dendrytycznych płuc w warunkach infekcji.

Analiza dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych w płucach podczas alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych

Ten film opisuje technikę barwienia immunohistochemicznego w celu identyfikacji komórek dendrytycznych z biopsji wewnątrzoskrzelowych.

Barwienie immunohistochemiczne: metoda uzyskiwania informacji przestrzennych z cienkich skrawków tkanek

Ten film demonstruje użycie cytometrii przepływowej do identyfikacji i liczenia różnych komórek odpornościowych w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego. Początkowo pojedyncze komórki odpornościowe są identyfikowane za pomocą barwnika żywotności, a następnie następuje różnicowe barwienie powierzchniowych białek markerowych, co umożliwia precyzyjne wyliczenie każdego typu komórek.

Identyfikacja i liczenie komórek odpornościowych w płynie płucnym oskrzelowo-pęcherzykowym metodą cytometrii przepływowej

Opisujemy metodę generowania precyzyjnie wycinanych plastrów płuc (PCLS) i ich barwienia immunologicznego, aby zobrazować lokalizację różnych typów komórek odpornościowych w płucach. Nasz protokół można rozszerzyć w celu wizualizacji lokalizacji i funkcji wielu różnych typów komórek w różnych warunkach.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

Opisujemy metodę przetwarzania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi obwodowej od osób przewlekle zakażonych wirusem HIV na terapii antyretrowirusowej w celu oceny rezerwuarów HIV w płucach. Metody te prowadzą do pozyskania wysoce czystych limfocytów T CD4 i makrofagów pęcherzykowych, które można następnie wykorzystać do immunofenotypowania i kwantyfikacji HIV DNA/RNA za pomocą ultraczułej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Haemophilus influenzae wywołuje stan zapalny w drogach oddechowych. W tym artykule skupimy się na zastosowaniu cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej do określenia odpowiedzi immunologicznej fagocytów i limfocytów w odpowiedzi na tę bakterię.

Ocena odpowiedzi immunologicznej układu oddechowego na Haemophilus influenzae

W tym badaniu prezentujemy skuteczny i powtarzalny protokół izolowania populacji immunologicznych mysiego układu oddechowego. Zapewniamy również metodę identyfikacji wszystkich wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które znajdują się w płucach zdrowych myszy, przy użyciu 9-kolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej w celu identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych płuc myszy

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

Poznaj metody identyfikacji ludzkich komórek dendrytycznych płuc w biopsjach wewnątrzoskrzelowych przy użyciu immunohistochemii i cytometrii przepływowej. Protokoły te umożliwiają badanie odpowiedzi immunologicznej w drogach oddechowych.

Ludzkie komórki dendrytyczne płuc: dystrybucja przestrzenna i identyfikacja fenotypowa w biopsjach wewnątrzoskrzelowych z wykorzystaniem immunohistochemii i cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal

Ludzkie komórki dendrytyczne płuc: dystrybucja przestrzenna i identyfikacja fenotypowa w biopsjach wewnątrzoskrzelowych z wykorzystaniem immunohistochemii i cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów