Name: Hydrauliczne wytłaczanie rdzenia kręgowego i izolacja zwojów korzenia grzbietowego u gryzoni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj metodę hydraulicznego wytłaczania rdzenia kręgowego i izolacji zwojów korzenia grzbietowego u myszy i szczurów. Technika ta jest szybsza od tradycyjnych metod i minimalizuje uszkodzenie tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Davidowi Kielowi, z Uniwersytetu w Aarhus, za filmowanie i montaż. Do przetwarzania sekwencji wideo z mikroskopu wykorzystano oprogramowanie VirtualDub. Dziękujemy Duńskiemu Instytutowi Badawczemu Neurologii Translacyjnej - DANDRITE, Nordic EMBL Partnership za dostęp do sprzętu oraz Fundacji Badawczej Uniwersytetu w Aarhus, projektowi EU 7FP PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) i Fundacji Lundbeck za dofinansowanie.

Wszystkie zwierzęta były traktowane w pełnej zgodności z przepisami duńskimi i europejskimi. Numer zezwolenia: 2012-15-2934.
1. Przygotowanie strzykawki do hydraulicznej ekstruzji rdzenia kręgowego
<ol>
	<li>W przypadku dorosłego szczura należy użyć strzykawki 10 mL. W przypadku dorosłej myszy należy użyć strzykawki 5 mL. W przypadku młodych osobników należy użyć strzykawki 2,5 mL.</li>
	<li>Dostosować końcówkę do pipety bez filtra, uniwersalnie pasującą do pipet 2-200 µL, przycinając jej szerszy koniec, aż będzie ściśle przylegać do strzykawki. Następnie założyć tak przygotowaną końcówkę na strzykawkę. W przypadku młodych osobników zamiast dostosowanej końcówki do pipety należy użyć igły 23 G lub podobnej.</li>
	<li>Naspisać lodowaty sterylny PBS i pozostawić strzykawkę w lodzie do czasu dalszego użycia.</li>
</ol>
2. Eutanazja
<ol>
	<li>Nie należy przeprowadzać zwichnięcia szyi, ponieważ spowoduje to przemieszczenie kręgów kręgosłupa, co uniemożliwi ekstruzję.</li>
	<li>W przypadku dorosłych szczurów/myszy przeprowadź eutanazję za pomocą gazu, takiego jak CO2 lub izofluran. Substancje te są szkodliwe. Eutanazję należy przeprowadzić w dygestorium, a substancjami należy posługiwać się zgodnie z wytycznymi instytucji. (UWAGA: CO2: H280, P410, P403; izofluran: H361d, P260, P281, P280)
	<ol>
		<li>Aby upewnić się, że gryzoń nie żyje, należy sprawdzić brak odruchu, uciskając łapę pęsetą. Następnie należy przeprowadzić dekapitację gryzonia za pomocą dużych nożyczek. W przypadku młodych osobników eutanazję przeprowadza się poprzez dekapitację.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Izolacja kolumny kręgosłupa
<ol>
	<li>Zrosić futro wodą, aby ułatwić kontrolę nad włosami.</li>
	<li>Za pomocą nożyczek rozciąć futro wzdłuż kręgosłupa w kierunku dystalnym i wyizolować kręgosłup, wykonując cięcia po obu stronach wzdłuż kręgosłupa, poza kością miednicy. Przeciąć rdzeń kręgowy dystalnie względem kości miednicy za pomocą nożyczek. 
	UWAGA: Oś rostralno-kaudalna jest w całym protokole określana jako oś proksymalno-dystalna.
	<ol>
		<li>Przyciąć kręgosłup nożyczkami, omijając obszary najbardziej proksymalne i najbardziej dystalne, ponieważ mogą one nadać kręgosłupowi zbyt silny kształt litery S, co utrudni pomyślne wydobycie rdzenia kręgowego. Upewnić się, że rdzeń kręgowy jest widoczny na obu końcach. Jeśli rdzeń kręgowy nie jest widoczny, przycinać kręgosłup nożyczkami do momentu, aż rdzeń kręgowy stanie się widoczny.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Hydrauliczne wyciskanie rdzenia kręgowego
<ol>
	<li>Umieścić szalkę Petriego (o średnicy 100 mm) wypełnioną sterylnym PBS na lodzie.</li>
	<li>Wyprostować kolumnę kręgosłupa, opierając palec wskazujący na zgiętej części (najbardziej proksymalnym końcu) kręgosłupa, aby wyprostować go w jak największym stopniu.
	<ol>
		<li>W przypadku szczeniąt należy unikać zginania kręgosłupa, ponieważ może to doprowadzić do uszkodzenia kręgów, co uniemożliwi wysunięcie rdzenia kręgowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadzić końcówkę pipety (igłę 23 G dla szczeniąt, alternatywnie igłę 18 G dla dorosłych myszy) w najbardziej dystalny koniec kolumny kręgosłupa. Jeśli końcówka została wprowadzona prawidłowo, zostanie ustabilizowana w kanale kręgowym.</li>
	<li>Upewnić się, że kolumna kręgosłupa jest maksymalnie wyprostowana. Wywierając stały nacisk, wysunąć rdzeń kręgowy do szalki Petriego na lodzie. Należy zadbać o to, aby rdzeń kręgowy pozostał wilgotny na lodzie, utrzymując go w PBS do czasu dalszej obróbki.</li>
</ol>
<img alt="Schemat porównawczy zgrubienia lędźwiowego w rdzeniach kręgowych: dorosły szczur, dorosła mysz, młode myszy." src="/files/ftp_upload/55226/55226fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne rdzenie kręgowe. Rdzenie kręgowe usunięte metodą hydrauliczną. Od lewej do prawej: dorosły szczur, dorosła mysz, młode myszy. Zgrubienia lędźwiowe zaznaczone ramką. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
5. Identyfikacja zwojów korzeni grzbietowych (DRGs)
<ol>
	<li>Podziel kolumnę kręgosłupa nożyczkami na dwie równe części wzdłuż i umieść podzielony kręgosłup pod mikroskopem.</li>
	<li>Zidentyfikuj segment kręgu T13, lokalizując miejsce przyczepu najbardziej dystalnych żeber do kolumny kręgosłupa, dbając o to, aby nie pomylić żeber z pobliskimi nerwami międzyżebrowymi. Najbardziej dystalne żebra są przyczepione do proksymalnej części segmentu kręgu T13, a zwoje korzeni grzbietowych (DRG) T13 znajdują się dystalnie względem kręgu T13 i proksymalnie względem kręgu L1.</li>
	<li>Zidentyfikuj sąsiednie DRG w kierunku dystalnym. U dorosłego szczura sąsiednie DRG są białe z wyraźnie widocznymi korzeniami grzbietowymi i brzusznymi. U dorosłej myszy sąsiednie DRG są białe z wyraźnie widocznymi korzeniami grzbietowymi i brzusznymi. U młodych osobników sąsiednie DRG przypominają przeźroczyste sfery.</li>
</ol>
<img alt="Disekcja DRG z młodego szczura i dorosłego szczura; schemat z opisem; neurobiologia, porównanie rozwojowe." src="/files/ftp_upload/55226/55226fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Identyfikacja DRG w kolumnie kręgowej po usunięciu rdzenia kręgowego. Kolumna kręgowa została rozdzielona, co umożliwia wizualizację DRG wskazanych strzałkami. Przykład przedstawiono na dorosłym szczurze oraz młodym szczurze. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
6. Izolacja zwojów korzeni grzbietowych (DRG)
<ol>
	<li>Ponumeruj szalki Petriego (o średnicy 30 mm) zgodnie z konkretnymi zwojami korzeni grzbietowych (DRG), które mają zostać wyizolowane, np. L3, L4, L5. Napełnij szalki Petriego lodowatym, sterylnym roztworem PBS i umieść je w lodzie.</li>
	<li>Za pomocą mikronożyczek przetnij korzenie grzbietowe i brzuszne jak najbliżej DRG, aby je uwolnić, unikając przy tym uszkodzenia zwojów.</li>
	<li>Za pomocą zamkniętej pęsety delikatnie wybierz DRG i przenieś je do odpowiednio ponumerowanych szalek Petriego.</li>
</ol>
<img alt="Wyizolowane zwoje korzeni grzbietowych (DRG) od dorosłego szczura, dorosłej myszy oraz młodej myszy; porównanie w eksperymencie neurobiologicznym." src="/files/ftp_upload/55226/55226fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne wyizolowane DRG. Od lewej do prawej: dorosły szczur, dorosła mysz, młoda mysz. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
7. Obróbka tkanek do dalszych analiz
<ol>
	<li>Western blotting
	<ol>
		<li>Wyizoluj interesujący obszar tkanki, np. zgrubienie lędźwiowe rdzenia kręgowego. W razie potrzeby podziel rdzeń kręgowy na strony ipsilateralną i kontralateralną, a następnie na rogi tylne i przednie.</li>
		<li>Umieść tkankę w lodzie w buforze do lizy, takim jak bufor lizy TNE (10 mM Tris-base, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP40 w podwójnie destylowanej H2O) zawierającym odpowiednie inhibitory enzymów.</li>
		<li>Homogenizuj tkankę przez około 30 s w lodzie, używając mechanicznego tłuczka do rozcierania.</li>
		<li>Wirowkuj przez 15 min przy 16 000 x g w 4 °C i wykorzystaj supernatant do dalszej obróbki zgodnie ze standardowymi protokołami5,6 lub przechowuj supernatant w -20 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza RNA
	<ol>
		<li>Wyizoluj interesującą tkankę.</li>
		<li>Natychmiast umieść tkankę w roztworze stabilizującym RNA, aby ustabilizować RNA do przechowywania.</li>
		<li>Wyizoluj RNA zgodnie ze standardowymi protokołami7.</li>
		<li>Przeprowadź konwersję RNA do cDNA i wykonaj qPCR zgodnie ze standardowymi protokołami7.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunohistochemia
	<ol>
		<li>Dla tkanki świeżo zamrożonej (dotyczy rdzenia kręgowego):
		<ol>
			<li>Przygotuj proszek z suchego lodu, rozdrabniając kostki suchego lodu do ilości odpowiadającej dwóm łyżkom proszku. Owiń kostki suchego lodu szmatką i rozbij je młotkiem. Połóż folię aluminiową (około 5 cm x 5 cm) na warstwie kostek suchego lodu i pokryj folię proszkiem z suchego lodu.</li>
			<li>Za pomocą pęsety połóż wybrany do dalszych analiz obszar rdzenia kręgowego na proszku z suchego lodu, pozwól mu gwałtownie zamarznąć, a następnie przenieś rdzeń kręgowy do probówki kriogenicznej. Przechowuj go przez cały czas na suchym lodzie lub przechowuj w -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
			<li>Przenieś rdzeń kręgowy do kriotomu (-20 °C). W razie potrzeby przytnij rdzeń kręgowy wewnątrz kriotomu. Umieść rdzeń kręgowy w materiale zatapiającym wewnątrz kriotomu, aby przymocować go do dysku na próbki.</li>
			<li>Wycinaj przekroje rdzenia kręgowego o pożądanej grubości, np. 5 µm, i zbieraj je na szkiełka. Tuż przed pobraniem tkanki ogrzej szkiełka palcem, aby zapewnić lepsze przyleganie. Pozostałą tkankę przechowuj w probówkach kriogenicznych w -80 °C do czasu dalszego użycia.</li>
			<li>Pozostaw skrawki na szkiełkach wewnątrz kriotomu do czasu rozpoczęcia postfiksacji.</li>
			<li>Przeprowadź postfiksację skrawków poprzez zanurzenie w 4% PFA na 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Wykonaj barwienie zgodnie ze standardowymi protokołami8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tkanka utrwalona do kriosekcjonowania (dotyczy rdzenia kręgowego i zwojów rdzeniowych DRG)
		<ol>
			<li>Utrwal rdzeń kręgowy i DRG w 4% PFA (2 h dla rdzenia kręgowego, 1,5 h dla mysich DRG i 4 h dla szczurzych DRG) w 4 °C (umieść rdzeń kręgowy w pozycji poziomej, aby zapobiec jego utrwaleniu w pozycji zgiętej).</li>
			<li>Przenieś tkankę do 25% w/v sacharozy na noc w 4 °C. Tkankę można przechowywać w 25% w/v sacharozie uzupełnionej kilkoma kroplami 10% azotku sodu w celu zapobiegania kontaminacji mikrobiologicznej w 4 °C do czasu dalszego użycia. W razie potrzeby przytnij rdzeń kręgowy, aby wyodrębnić tylko zgrubienie lędźwiowe, wykonując to na podkładce silikonowej lub podobnej.</li>
			<li>Za pomocą końcówki ręcznika papierowego odessij nadmiar roztworu sacharozy z tkanki.</li>
			<li>Wypełnij formę kriogeniczną w połowie materiałem zatapiającym. Wypchnij pęcherzyki powietrza na boki formy za pomocą narzędzi, takich jak zamknięta pęseta.</li>
			<li>Za pomocą pęsety umieść tkankę w materiale zatapiającym, dbając o pożądanie orientację tkanki.</li>
			<li>Wypełnij formę kriogeniczną całkowicie materiałem zatapiającym i odsuń pęcherzyki powietrza jak najdalej od tkanki (np. za pomocą zamkniętej pęsety).</li>
			<li>Wypełnij szalkę Petriego (100 mm średnicy) 2-metylobutanem. Substancja ta jest szkodliwa. Wykonaj ten krok w dygestorium i obchodź się z substancją zgodnie z wytycznymi instytucji (UWAGA: H224, H304, H336, H411, P210, P280, P273, P301, P331, P304/P340, P309/P310).</li>
			<li>Połóż szalkę Petriego na warstwie suchego lodu i dodaj do niej dwie kostki suchego lodu. Umieść formę kriogeniczną w szalce Petriego i pozwól materiałowi zatapiającemu całkowicie zamarznąć.</li>
			<li>Przechowuj zatopioną tkankę przez cały czas na suchym lodzie lub w -80 °C owiniętą w Parafilm do czasu dalszej obróbki.</li>
			<li>Wycinaj tkankę w kriotomie (-20 °C) o pożądanej grubości, np. 5 µm.</li>
			<li>Wykonaj barwienie zgodnie ze standardowymi protokołami8.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Tkanka utrwalona do zatapiania w parafini (dotyczy rdzenia kręgowego i zwojów rdzeniowych DRG)
		<ol>
			<li>Utrwal rdzeń kręgowy i DRG w 4% PFA (2 h dla rdzenia kręgowego, 1,5 h dla mysich DRG i 4 h dla szczurzych DRG) w 4 °C (umieść rdzeń kręgowy w pozycji poziomej, aby zapobiec jego utrwaleniu w pozycji zgiętej).</li>
			<li>Przenieś tkankę do 25% w/v sacharozy na noc w 4 °C. Tkankę można przechowywać w 25% w/v sacharozie uzupełnionej kilkoma kroplami 10% azotku sodu w celu zapobiegania kontaminacji mikrobiologicznej w 4 °C do czasu dalszego użycia.</li>
			<li>Wyizoluj interesujący obszar tkanki, np. zgrubienie lędźwiowe rdzenia kręgowego.</li>
			<li>Wypełnij formę do zatapiania w połowie parafiną.</li>
			<li>Krótko ochłodź formę do zatapiania, kładąc ją na powierzchni chłodzącej urządzenia do zatapiania, aby lekko utwardzić parafinę. Pozwala to na lepsze ustawienie tkanki.</li>
			<li>Umieść tkankę w pożądanej orientacji w formie do zatapiania. Wypełnij formę parafiną i natychmiast ochłodź.</li>
			<li>Przechowuj formę do zatapiania z parafiną w 4 °C przez noc, aby całkowicie stwardniała, a następnie wyjmij blok parafiny zawierający tkankę z formy.</li>
			<li>Wycinaj skrawki w mikrotomie o pożądanej grubości, np. 5 µm.</li>
			<li>Wykonaj barwienie zgodnie ze standardowymi protokołami8.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+dissociated+sensory+neuron+cultures+and+considerations+for+their+use+in+studying+neuronal+function+and+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity.</a> Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).</li>
<li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9, 82(2016).</li>
<li>Kennedy, H. S., Jones, C. 3rd, Caplazi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+laminectomy+with+an+optimized+ejection+method+for+the+removal+of+spinal+cords+from+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histotechnol%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice.</a> J Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).</li>
<li>Meikle, A. D., Martin, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+removal+of+the+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">A rapid method for removal of the spinal cord.</a> Stain Technol. 56 (4), 235-237 (1981).</li>
<li>JoVE Science Education Database. The Western Blot. , JoVE. Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot ">http://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot </a> (2016).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2583035/">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Ogrean, C., Jackson, B., Covino, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+using+the+thermo+scientific+Solaris+qPCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR using the thermo scientific Solaris qPCR assay.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li>
<li>Crosby, K., et al. Immunohistochemistry Protocol for Parraffin-embedded Tissue Sections - ADVERTISEMENT. , JoVE. Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections">https://www.jove.com/video/5064/immunohistochemistry-protocol-for-paraffin-embedded-tissue-sections</a> (2014).</li>
<li>Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWatson%2C+C+%22The+Mouse+Nervous+System%22">The Mouse Nervous System</a>. , 1st edition, Academic Press, Elsevier. 424-426 (2012).</li>
<li>Rigaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species+and+strain+differences+in+rodent+sciatic+nerve+anatomy%3A+implications+for+studies+of+neuropathic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain.</a> Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).</li>
<li>Green, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+non-genetic+factors+which+influence+the+type+of+the+skeleton+in+an+inbred+strain+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic and non-genetic factors which influence the type of the skeleton in an inbred strain of mice.</a> Genetics. 26 (2), 192-222 (1941).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20084054">Spinal cord electrophysiology.</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li>
<li>Ciglieri, E., Ferrini, F., Boggio, E., Salio, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+in+vitro+morphofunctional+analysis+of+mouse+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">An improved method for in vitro morphofunctional analysis of mouse dorsal root ganglia.</a> Ann Anat. , 62-67 (2016).</li>
<li>Peeraer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+evaluation+of+rat+dorsal+root+ganglion+neurons+as+an+in+vitro+model+for+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pain+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacological evaluation of rat dorsal root ganglion neurons as an in vitro model for diabetic neuropathy.</a> J Pain Res. 4, 55-65 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jeśli kręgosłup jest uszkodzony, np. przez zwichnięcie szyjki macicy, rdzeń kręgowy pęknie podczas wytłaczania. Jeśli rdzeń kręgowy nie może być wytłoczony, kręgosłup można lekko przyciąć na obu końcach i próbę wytłaczania można powtórzyć. W przypadku, gdy do dalszej analizy potrzebny jest cały rdzeń kręgowy, tj. składający się z powiększenia odcinka szyjnego oraz powiększenia odcinka lędźwiowego, kręgosłup należy tylko nieznacznie przyciąć. Jeśli do dalszej analizy potrzebne jest tylko powiększenie odcinka lędźwiowego, rdzeń kręgowy powinien zostać przycięty zgodnie z niniejszym protokołem. Kręgosłup należy wyprostować opuszkami palców, aby ułatwić wytłaczanie.
Protokół ma zastosowanie do gryzoni w każdym wieku i jest tutaj zilustrowany przez dorosłą mysz (8 tygodni), młode myszy (5 dni) i dorosłego szczura (10 tygodni). W zależności od typu zwierzęcia i szczepu liczba odcinków piersiowych i lędźwiowych może się różnić 9,10,11. W zależności od białek, które mają być analizowane, dorosłe gryzonie mogą być poddawane perfuzji roztworami hamującymi enzymy przed eutanazją. W przypadku przeprowadzania eksperymentu obejmującego jednostronne uszkodzenie nerwów, rdzeń kręgowy można podzielić na stronę ipsilateralną i przeciwległą za pomocą ultracienkiej pęsety natychmiast po wytłoczeniu. Ponadto każdy bok można podzielić na stronę grzbietową i brzuszną. Tkanka może być następnie przetworzona do dalszych analiz, np. Western blot.
Należy unikać przezsercowego zespolenia perfuzyjnego za pomocą PFA przed wyciskaniem rdzenia kręgowego, ponieważ powoduje to, że rdzeń kręgowy staje się nieelastyczny i zapobiega hydraulicznemu wytłaczaniu rdzenia kręgowego. Hydrauliczne wytłaczanie rdzenia kręgowego oderwie korzenie grzbietowe. W przypadku eksperymentów, w których konieczne są przyczepione korzenie grzbietowe, zaleca się laminektomię. Ponadto opony mózgowo-rdzeniowe są tracone w wyniku wytłaczania hydraulicznego, czego można uniknąć za pomocą standardowej laminektomii3.
Hydrauliczna ekstruzja rdzenia kręgowego i izolacja DRG mogą być również wykonane przy użyciu natlenionego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) zamiast lodowatego PBS. Zastosowanie ACSF pozwala na zachowanie wyizolowanej tkanki w lepszym środowisku fizjologicznym, co jest szczególnie ważne w przypadku kolejnych zapisów elektrofizjologicznych12,13. Alternatywą dla ACSF może być PBS zawierający 1 g/l glukozy do wytwarzania pierwotnych kultur DRG14.
Hydrauliczna ekstruzja rdzenia kręgowego jest znacznie szybszą metodą niż tradycyjny sposób izolacji rdzenia kręgowego przez laminektomię, skracając czas obsługi tkanki, a tym samym zmniejszając ryzyko uszkodzenia białka. Perfuzja z utrwalaczem przed wyizolowaniem rdzenia kręgowego przez laminektomię może zmniejszyć ryzyko uszkodzenia tkanki podczas sekcji i podczas ostatecznego usunięcia rdzenia kręgowego z kręgosłupa. Jednak utrwalenie tkanek wyklucza jego zastosowanie w analizach takich jak Western blot. Wytłaczanie hydrauliczne pozwala uzyskać strukturalnie nieuszkodzoną tkankę3 odpowiednią do szerszego zakresu analiz.
Konsekwentna identyfikacja DRG może być trudna. Jest to jednak niezbędne do analizy tkanek, np. po uszkodzeniu nerwu kulszowego. Numerując DRG zgodnie z ich lokalizacją w stosunku do costae, DRG można konsekwentnie identyfikować. Barwienie tkanki rdzenia kręgowego, jak również DRG, można zoptymalizować, wykonując ilustrowane warianty leczenia tkanek opisane w kroku 7 protokołu.

Ogólnym celem tej metody jest wyizolowanie rdzenia kręgowego, jak również zidentyfikowanie i wyizolowanie DRGs1,2. Hydrauliczne wytłaczanie rdzenia kręgowego jest znacznie szybszą metodą niż tradycyjny sposób izolacji rdzenia kręgowego poprzez laminektomię, czyli poprzez łamanie kręgów rdzeniowych pojedynczo, a metoda ta zmniejsza ryzyko uszkodzenia tkanek spowodowanego procesem rozwarstwienia3,4. DRG mogą być trudne do zidentyfikowania. Prawidłowa identyfikacja jest bardzo ważna w przypadku analizy tkanek, np. po uszkodzeniu nerwu kulszowego. Numerując DRG zgodnie z ich lokalizacją w stosunku do costae, DRG można konsekwentnie identyfikować.
Tkanka wyizolowana za pomocą technik zademonstrowanych tutaj może być zastosowana do szerokiego zakresu analiz, w tym Western blotting5,6, qPCR7 i barwienie immunohistochemiczne8.
Podczas identyfikacji DRG ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że liczba segmentów rdzenia kręgowego różni się w zależności od typu zwierzęcia i szczepu9,10,11. Zaletą stosowania tej metody na myszach jest duża liczba dostępnych wariantów modyfikowanych genetycznie oraz stosunkowo niskie koszty utrzymania. Zaletą korzystania ze szczurów jest stosunkowo wysoka wydajność tkanek, a jeśli chodzi o uszkodzenia nerwów, procedura zostanie ułatwiona dzięki rozmiarowi.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki Bonn, bardzo cienkie, proste, 8,5 cm</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 14084-08</td><td>Do rozcinania rdzenia kręgowego przed izolacją DRG (dorosła mysz, dorosły szczur); Może być używany inny producent</td></tr><tr><td>: Wirówka</td>: <td>Eppendorf</td><td># 5427 R</td>: <td>Do wirowania homogenizowanej tkanki,</td></tr><tr><td>Mikrotom kriostatu</td>, <td>Leica Biosystems</td><td># CM 3050 S,</td><td>Do cięcia osadzonej tkanki przed barwieniem; Inny model i producent mogą być używane</td></tr><tr><td>Kleszcze, Dumont, # 3</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td> <td># 11231-30</td><td>Do obsługi rdzenia kręgowego po wytłoczeniu; Inny producent/typ może być używany</td></tr><tr><td>Kleszcze, Dumont, # 5</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td> <td># 11252-20</td><td>Do izolacji DRG (dorosła mysz, dorosły szczur, szczenię); Inny producent może być stosowany</td></tr><tr><td>Isoflurane (furan) IsoFlo Vet 100%</td><td>Abbott</td><td># 002185</td><td>Do eutanazji; Można użyć innego producenta; UWAGA: toksyczne</td></tr><tr><td>chemikalia Iso-pentan GPR rectapur</td><td>VWR</td># <td>24872.298</td><td>Do szybkiego zamrażania tkanek; Można użyć innego producenta; UWAGA: toksyczny</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems</td><td># RM 2155</td><td>Do cięcia tkanek osadzonych w parafinie; Inny model i producent może być używany</td></tr><tr><td>Granulki wosku parafinowego</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># 76243</td><td>Do zatapiania parafiny; Inny producent może być używany</td></tr><tr><td>Stacja do zatapiania tkanek parafinowych</td><td>Leica Biosystems</td><td># EG1160</td><td>Do zatapiania parafiny w tkankach do późniejszego cięcia; Można użyć innego modelu i producenta</td></tr><tr><td>Pelet, bezprzewodowy silnik</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># Z359971-1EA</td><td>Do mechanicznej homogenizacji izolowanej tkanki przed Western blotting; Innego producenta może być używana</td></tr><tr><td>szalka Petriego, 35 mm</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td># 121V</td><td>Do przechowywania izolowanych DRG; Inny producent i rozmiar mogą być używane</td></tr><tr><td>szalki Petriego, 100 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># P7741</td><td>Do wytłaczania rdzenia kręgowego; Można użyć</td></tr><tr><td>inhibitora fosfatazy innego producenta i rozmiaru, koktajlu inhibitora fosfatazy Phosstop</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># 04906845001</td><td>do dodania do buforu do lizy TNE, jeśli zajdzie taka potrzeba; Może być używany inny producent</td></tr><tr><td>Końcówka do pipety, 1-200 i mu; L, brak filtra</td><td>Sarstedt</td><td># 70.1189.105</td><td>Do wytłaczania hydraulicznego; Inny producent może być stosowany</td></tr><tr><td>inhibitor proteazy, kompletny koktajl inhibitora proteazy</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># 05892791001</td><td>do dodania do buforu TNE-lizy w razie potrzeby; Inny producent może być używany</td></tr><tr><td>roztwór RNAlater</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td># R0901</td><td>Do stabilizacji RNA do przechowywania; Może być używany inny producent</td></tr><tr><td>Rneasy Protect Mini KiT</td><td>Qiagen</td> <td># 74124</td><td>Do izolacji RNA; Inny producent może być używany</td></tr><tr><td>Skalpel; Ostrze chirurgiczne Swann-Morton nr 11</td><td>Swann-Morton</td><td># REF0203</td><td>Do izolacji odcinka lędźwiowego rdzenia kręgowego; Może być stosowany inny producent/typ</td></tr><tr><td>Nożyczki, proste, typ 3, krawędź tnąca 25 mm</td><td>Bochem</td><td># 4070</td><td>Do izolacji kręgosłupa; Może być używany inny producent/typ</td></tr><tr><td>Nożyczki, krawędź tnąca 130 mm</td><td>Hounisen</td><td># 1902.0130</td><td>Do izolacji rdzenia kręgowego (dorosły szczur)</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe, proste, krawędź tnąca 8 mm</td><td>F.S.C. (Fine Science Tools)</td><td># 15009-08</td><td>Do rozcinania kręgosłupa przed izolacją DRG (pup) oraz do izolacji DRG (dorosła mysz, dorosła szczur, szczenię); Inny producent może być używany</td></tr><tr><td>Standardowe strzykawki, 2,5 mL, 5 mL, 10 ml</td><td>Terumo</td><td># SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 Do</td><td>wytłaczania hydraulicznego; Może być używany inny producent</td></tr>: <tr><td>Stereoskop MZ12.5 z obiektywem 1X i okularem 10X</td><td>Leica</td><td># 10446370</td><td>Inny producent/typ może być używany</td></tr><tr><td>Sterylny PBS</td><td>GIBCO</td><td># 10010-015</td><td>Do wytłaczania hydraulicznego; Może być również wykonany zgodnie ze standardowymi protokołami Igła</td></tr><tr><td>strzykawkowa 23 G x 1", 0,6 x 25 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-2325R</td><td>Do wytłaczania hydraulicznego u szczeniąt; Może być używany inny producent/typ</td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa 18 G x 1 1/2, 1,2 x 40 mm</td><td>Terumo Neolus</td><td># NN-1838S</td><td>Alternatywa dla końcówki pipety do wytłaczania hydraulicznego u dorosłych myszy; Inny producent może być używany</td></tr><tr><td>Tissue-Tek</td><td>Sakura</td><td># 4583</td><td>Materiał do zatapiania Tssue do późniejszej kriosekcji</td></tr>, <tr><td>bufor do lizy TNE,</td><td>chemikalia VWR</td># <td>10128-582</td><td>Do lizy tkanek przed Western blot; Można użyć innego producenta; Może być również wykonany zgodnie ze standardowymi protokołami</td></tr></tbody></table>

hydrauliczne wytłaczanie rdzenia kręgowego i izolacja zwojów korzenia grzbietowego u gryzoni

Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents

Tradycyjnie, rdzeń kręgowy jest izolowany przez laminektomię, tj. przez rozłupywanie kręgów rdzeniowych pojedynczo. Jest to zarówno czasochłonne, jak i może skutkować uszkodzeniem rdzenia kręgowego spowodowanym procesem rozwarstwienia. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób rdzeń kręgowy może być wytłaczany za pomocą ciśnienia hydraulicznego. Czas obsługi jest znacznie skrócony do zaledwie kilku minut, co prawdopodobnie zmniejsza uszkodzenia białek. Niskie ryzyko uszkodzenia tkanki rdzenia kręgowego usprawnia późniejszą analizę immunohistochemiczną. Wykonując hydrauliczną ekstruzję rdzenia kręgowego zamiast tradycyjnej laminektomii, gryzonie mogą być dalej wykorzystywane do izolacji DRG, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt i umożliwiając analizę tkanek tego samego gryzonia. Demonstrujemy spójną metodę identyfikacji i izolowania DRG zgodnie z ich lokalizacją względem kost. Ważne jest jednak, aby dostosować tę metodę do konkretnego wykorzystywanego zwierzęcia, ponieważ liczba segmentów rdzenia kręgowego, zarówno piersiowego, jak i lędźwiowego, może się różnić w zależności od typu zwierzęcia i szczepu. Ponadto ilustrujemy dalsze przykłady przetwarzania wyizolowanych tkanek.

Hydraulicznie ekstrudowane rdzenie kręgowe wykazują gładką, nieuszkodzoną powierzchnię, co przedstawiono na Rysunku 1. Powiększenie lędźwiowe można łatwo zidentyfikować jako pogrubiony obszar rdzenia kręgowego, zaznaczony ramką na Rysunku 1. Strony grzbietową i brzuszną rdzenia kręgowego można rozpoznać wzrokowo na podstawie morfologii. Na Rysunku 1 strona brzuszna jest skierowana w stronę obserwatora, co można rozpoznać po jednej wyraźnej linii środkowej biegnącej wzdłuż całego rdzenia kręgowego. Dwie szersze linie wzdłuż rdzenia kręgowego pozwalają na identyfikację strony grzbietowej. Na najbardziej dystalnym końcu u dorosłych szczurów i myszy czasami może pozostać przytwierdzona cauda equina.
Poszczególne zwoje korzeni grzbietowych (DRG) można zidentyfikować jedynie, gdy znajdują się w kanale kręgowym, Rysunek 2. Po izolacji, Rysunek 3, poszczególne DRG nie są rozróżnialne na podstawie wyglądu. W związku z tym, jeśli jest to konieczne, ważne jest, aby utrzymać je w wyraźnej separacji po izolacji. Po izolacji rdzeń kręgowy oraz DRG mogą zostać przetworzone i zabarwione zgodnie z opisem w kroku 7.3, co przedstawiono na Rysunku 4. Rysunek 4a przedstawia barwienie immunohistochemiczne przekroju DRG, na którym wyraźnie widoczne są neurony oraz otaczające je satelitarne komórki glejowe. Dzięki prawidłowej identyfikacji DRG możliwe jest przeanalizowanie wpływu uszkodzeń nerwu kulszowego na somę uszkodzonego neuronu, a także na otaczające go satelitarne komórki glejowe. Rysunek 4b pokazuje barwienie Nissla hydraulicznie wyciśniętego rdzenia kręgowego, w którym tkanka jest nienaruszona, co odzwierciedlają gładkie krawędzie przekroju.
<img alt="Przekroje tkanek zwojów korzeni grzbietowych (DRG) i rdzenia kręgowego, immunohistochemia, aksony z komórkami Schwanna, fluorescencja." src="/files/ftp_upload/55226/55226fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne przekroje tkanek. A. Barwienie immunohistochemiczne przekroju DRG. B. Przekrój rdzenia kręgowego wypchniętego hydraulicznie, barwienie Nissla. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół hydraulicznego wytłaczania rdzenia kręgowego, jak również identyfikacji i izolacji specyficznych zwojów korzenia grzbietowego (DRG) u tego samego gryzonia. W porównaniu ze standardowymi metodami izolacji rdzenia kręgowego, metoda ta jest znacznie szybsza i zmniejsza ryzyko uszkodzenia tkanek.

Hydrauliczne wytłaczanie rdzenia kręgowego i izolacja zwojów korzenia grzbietowego u gryzoni

Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may ...

Ogólnym celem tej metody jest wyizolowanie rdzenia kręgowego poprzez ekstruzję hydrauliczną, a także zidentyfikowanie i wyizolowanie zwojów rdzeniowych tylnych u myszy i szczurów. Jest to osiągane poprzez uprzednią eutanazję gryzonia, a następnie dekapitację. Skórę nacinamy wzdłuż kręgosłupa i oddzielamy od leżącej pod nią tkanki.Następnie kręgosłup zostaje oddzielony od otaczających go tkanek poprzez nacięcie wzdłuż obu stron kręgosłupa w kierunku dystalnym, poza kością miednicy. Następnie kręgosłup zostaje przecięty dystalnie względem kości miednicy. Strzykawka z dopasowaną końcówką pipety zostaje wprowadzona do najbardziej dystalnego końca rdzenia kręgowego.Poprzez wywieranie stałego nacisku, rdzeń kręgowy zostaje wypchnięty do szalki Petriego umieszczonej na lodzie przy użyciu lodowatego, sterylnego PBS. Za pomocą nożyczek sprężynowych kolumna kręgowa zostaje rozdzielona wzdłużnie. Następnie lokalizuje się miejsca przyczepu najbardziej dystalnego żebra.Pozwala to na identyfikację najbardziej dystalnych piersiowych zwojów rdzenia grzbietowego (DRG) po każdej stronie, oznaczonych jako T13. Teraz można zidentyfikować kolejne DRG. Zwoje DRG odpowiadające lędźwiowemu zgrubieniu rdzenia znajdują się bardziej dystalnie.Za pomocą nożyczek sprężynowych przecina się korzenie grzbietowe i brzuszne, a następnie ostrożnie wyjmuje się z otworu zwoje rdzenia grzbietowego (DRG) i przenosi je do oznakowanych szalek Petri zawierających sterylny PBS w lodzie. Hydrauliczne usuwanie rdzenia kręgowego jest metodą znacznie szybszą niż tradycyjna laminektomia, podczas której kręgi kręgosłupa są łamane pojedynczo. Metoda ta zmniejsza ryzyko uszkodzenia tkanek spowodowanego procesem sekcji i pozwala na uzyskanie materiału tkankowego nadającego się do szerokiego zakresu analiz.Zwoje korzeni grzbietowych mogą być zazwyczaj trudne do zidentyfikowania. Prawidłowa identyfikacja jest jednak niezwykle istotna dla dalszej analizy tkanki, na przykład po uszkodzeniu nerwu kulszowego. Dlatego poprzez numerowanie zwojów korzeni grzbietowych zgodnie z ich lokalizacją względem żeber, można je identyfikować w sposób spójny.Przygotuj strzykawkę do ekstruzji rdzenia kręgowego, odcinając szeroki koniec niefiltrowanego końcówki do pipety. Po odpowiednim dopasowaniu końcówka powinna ściśle przylegać. Pobierz lodowaty, sterylny PBS i pozostaw strzykawkę w lodzie do czasu dalszego użycia.W przypadku dorosłych gryzoni przeprowadź eutanazję za pomocą gazu, takiego jak CO2 lub izofluran, a następnie wykonaj dekapitację. Nie stosuj zwichnięcia stawu obręczy karkowej, ponieważ spowoduje to uszkodzenie kręgów i uniemożliwi ekstrazję rdzenia kręgowego. Szczenięta można uśmiercać poprzez bezpośrednią dekapitację.Zwilż futro wodą, aby ułatwić manipulację włosiami. Następnie rozetnij futro wzdłuż kręgosłupa w kierunku dystalnym. Wyizoluj kręgosłup, wykonując cięcia po obu stronach wzdłuż kręgosłupa, przechodząc poza kość miednicy, a następnie przetnij kręgosłup proksymalnie względem miednicy.Przytnij kolumnę kręgową, unikając obszarów najbardziej proksymalnych i dystalnych, ponieważ mogą one nadać kolumnie zbyt wyraźny kształt litery S, co utrudni pomyślne wydobycie rdzenia kręgowego. Upewnij się, że rdzeń kręgowy jest widoczny na obu końcach. Jeśli rdzeń kręgowy nie jest widoczny, przycinaj kolumnę kręgową do momentu, aż rdzeń stanie się widoczny.Umieścić szalkę Petriego zawierającą PBS w lodzie. Wyprostować kolumnę kręgosłupa, kładąc palec wskazujący na zgięciu w bliższym końcu kolumny kręgosłupa. Wprowadzić końcówkę pipety do dystalnego końca rdzenia kręgowego.Wywierając stały nacisk, wyciśnij rdzeń kręgowy do szalki Petriego. Rozetnij kolumnę kręgową. Przetnij kilka kręgów po stronie brzusznej kolumny, a następnie przejdź do przecięcia kilku kręgów po stronie grzbietowej.Kontynuuj naprzemienne nacinanie wzdłuż całej kolumny kręgosłupa. Umieść otwarty rdzeń kręgowy pod mikroskopem. Zidentyfikuj segment kręgu T13, lokalizując miejsce przyczepu najbardziej dystalnego żebra w kolumnie kręgosłupa.Należy uważać, aby nie pomylić najbardziej dystalnego żebra z pobliskimi nerwami międzyżebrowymi. Najbardziej dystalne żebra są przyczepione do proksymalnej części segmentu kręgu T13, a zwoje rdzeniowe (DRG) T13 znajdują się dystalnie względem kręgu T13 i proksymalnie względem kręgu L1. Zidentyfikuj towarzyszące zwoje DRG w kierunku dystalnym. Przygotuj ponumerowane szalki Petriego zawierające sterylny, lodowaty PBS, umieszczone w lodzie.Aby uniknąć uszkodzenia zwoju korzeni grzbietowych (DRG) podczas usuwania, należy chwytać za korzenie grzbietowe i brzuszne, a nie za sam zwoj DRG, używając pęsety 5. Za pomocą mikronożyczek należy najpierw przeciąć nerw obwodowy, a następnie korzenie grzbietowe i brzuszne. U szczeniąt nerwy te nie są tak wyraźnie widoczne jak u dorosłych gryzoni.Aby przeciąć nerwy jak najbliżej zwojów rdzeniowych (DRG), należy delikatnie przesunąć końcówkę nożyczek wzdłuż DRG, aby odpowiednio je ustawić przed wykonaniem cięcia. Używając końcówki zamkniętej pęsety, należy delikatnie wybrać zwoje DRG i przenieść je do odpowiedniej szalki Petriego. U dorosłych szczurów i myszy zwoje DRG są białe z wyraźnie widocznymi korzeniami grzbietowymi i brzusznymi, natomiast u młodych osobników DRG wyglądają jak przezroczyste sfery.W celu przeprowadzenia analizy western blotting należy wyizolować interesującą tkankę i umieścić ją w buforze do lizy. Następnie tkankę należy zhomogenizować, odwirować, zebrać nadsącz i wykonać western blotting zgodnie ze standardowymi protokołami. W przypadku analizy RNA należy wyizolować interesującą tkankę i niezwłocznie umieścić ją w roztworze do stabilizacji RNA.Następnie przeprowadź qPCR zgodnie ze standardowymi protokołami. W przypadku immunohistochemii tkanek gwałtownie zamrożonych, przygotuj proszek z suchego lodu na kawałku folii aluminiowej. Umieść tkankę na proszku z suchego lodu, aby gwałtownie ją zamrozić.Następnie przenieś tkankę do kriostatu i zatop ją w celu przygotowania przekrojów. Przeprowadź postfiksację tkanki w 4% PFA przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj barwienie immunohistochemiczne zgodnie ze standardowymi protokołami. W przypadku immunohistochemii na skrawkach mrożonych, utrwal tkankę w 4% PFA w temperaturze czterech stopni, a następnie przenieś ją do 25% (w/v) sacharozy na noc w temperaturze czterech stopni.Umieść tkankę w materiale do zatapiania i zamroź ją, używając schłodzonego 2-metylobutanul. Wykonaj cięcia tkanki w kriotomie i przeprowadź barwienie immunohistochemiczne zgodnie ze standardowymi protokołami. W przypadku immunohistochemii na skrawkach parafinowych, utrwal tkankę w 4% PFA w temperaturze czterech stopni, a następnie przenieś ją do 25% w/v sacharozy na noc w temperaturze czterech stopni.Zatop tkankę w parafinie, wykonaj skrawki na mikrotomie i przeprowadź barwienie immunohistochemiczne zgodnie ze standardowymi protokołami. W zależności od przeciwciał użytych do barwienia immunohistochemicznego, możliwe może być zastosowanie którejkolwiek z przykładowych metod obróbki tkanki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak izolować rdzeń kręgowy metodą ekstruzji hydraulicznej oraz jak w sposób spójny identyfikować i izolować zwoje korzeni grzbietowych.Metody przedstawione w niniejszym materiale mają zastosowanie do myszy i szczurów w każdym wieku, a wyizolowaną tkankę można wykorzystać do szerokiego zakresu analiz, w tym metod wymagających szybkiej izolacji tkanki nieutrwalonej.

hydraulic-extrusion-spinal-cord-isolation-dorsal-root-ganglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano model in vitro do badań genetycznych nad regeneracją aksonów z wykorzystaniem hodowli neuronów z zwojów korzeni grzbietowych dorosłych myszy. Metoda obejmuje etap resuspensji i ponownego wysiewu, aby umożliwić ponowny wzrost aksonów z neuronów poddanych manipulacjom genetycznym. Podejście to jest szczególnie przydatne w badaniach nad utratą funkcji w procesie regeneracji aksonów z wykorzystaniem wyciszania ekspresji białek opartego na RNAi.

Genetyczne badanie regeneracji aksonów w hodowlach neuronów z dorosłych zwojów korzeni grzbietowych

W tym filmie pokazujemy ekstrakcję zwoju korzenia grzbietowego lub DRG z pobranego kręgosłupa szczura do dalszych zastosowań.

Zbieranie DRG z kręgosłupa szczura: procedura ekstrakcji zwoju korzenia grzbietowego z kręgosłupa modelu szczura

W tym filmie opisujemy krok po kroku protokół izolacji rdzenia kręgowego od modelu mysiego do badań in vitro.

Ekstrakcja rdzenia kręgowego: protokół izolacji mysiego rdzenia kręgowego do badań in vitro

Ten film demonstruje procedurę izolowania neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) od zarodków szczurów i współhodowli ich z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia dojrzałych komórek Schwanna. Wyizolowane DRG są przetwarzane w celu wyizolowania neuronów i komórek glejowych. Wyizolowane komórki są hodowane w celu oczyszczenia neuronów, które są następnie hodowane wspólnie z komórkami podobnymi do komórek Schwanna (SCLC) w pożywce do wspólnej hodowli. Interakcja z neuronami DRG...

Izolacja neuronów DRG i kokultura z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia komórek Schwanna

Ten film przedstawia metodę izolowania nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z tkanki okołokomorowej rdzenia kręgowego u dorosłych szczurów. Technika ta obejmuje inkubację fragmentów tkanek w roztworze zawierającym enzymy proteolityczne w celu zakłócenia macierzy zewnątrzkomórkowej i uwolnienia komórek. Następnie uwolnione komórki są siane w pożywce zawierającej specyficzne czynniki wzrostu, które zwiększają proliferację neuronalnych komórek macierzystych / progenitorowych i promują...

Izolacja nerwowych komórek progenitorowych łodygi z obszaru okołokomorowego rdzenia kręgowego dorosłego szczura

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli komórek zwojów korzenia grzbietowego (DRG) z kręgosłupa szczura. DRG wycięte z kręgosłupa są traktowane enzymami i mechanicznie dysocjowane w celu uzyskania zawiesiny jednokomórkowej. Komórki są hodowane w pożywce zawierającej inhibitory i czynniki wzrostu, które odpowiednio ograniczają proliferację komórek glejowych i promują wzrost neuronów.

Ustanowienie pierwotnej hodowli komórek zwojów korzenia grzbietowego z kręgosłupa szczura

Rdzeń kręgowy dorosłego ssaka zawiera nerwowe komórki macierzyste/progenitorowe (NSPC), które mogą być izolowane i rozwijane w hodowli. Protokół ten opisuje pobieranie, izolację, hodowlę i pasażowanie NSPC generowanych z obszaru okołokomorowego dorosłego rdzenia kręgowego od szczura i od dawców narządów po przeszczepie.

Izolacja nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych z obszaru okołokomorowego dorosłego szczura i ludzkiego rdzenia kręgowego

Ten protokół opisuje izolację neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) izolowanych od szczurów oraz hodowlę neuronów DRG na statycznym, wstępnie rozciągniętym systemie hodowli komórek w celu poprawy wyrównania aksonów, z późniejszą kokulturą komórek Schwanna (SC) w celu promowania mielinizacji.

Podejście do poprawy wyrównania i mielinizacji neuronów zwoju korzenia grzbietowego

Ten protokół przedstawia użycie iniekcji do zwoju korzenia grzbietowego (DRG) z wektorem wirusowym i równoczesnym uszkodzeniem zmiażdżenia korzenia grzbietowego u dorosłego szczura jako model do badania regeneracji aksonów czuciowych. Model ten nadaje się do badania zastosowania terapii genowej w celu promowania regeneracji aksonów czuciowych.

Iniekcja zwoju korzenia grzbietowego i uraz zmiażdżenia korzenia grzbietowego jako model regeneracji aksonów czuciowych

Ten protokół dostarcza techniki do zbierania i hodowli eksplantowanego zwoju korzenia grzbietowego (DRG) od dorosłych szczurów Sprague Dawley w urządzeniu wielokomorowym (MC).

Zbieranie, osadzanie i hodowla zwojów korzeni grzbietowych w urządzeniach wielokompartmentowych w celu zbadania cech neuronów obwodowych

Czubki korzeniowe grzbietowe (DRG) zawierają pierwotne ciała komórkowe neuronów czuciowych i przekazują obwodowe sygnały czuciowe do rdzenia kręgowego. Niniejszy protokół opisuje metodę rozpinania czupczyków korzeniowych grzbietowych u myszy, która wspiera standaryzowaną izolację strukturalnie nietkniętych czupczyków, identyfikację anatomiczną segmentów, intuicyjną instrukcję dla początkujących użytkowników oraz zmniejszone uszkodzenie tkanki podczas procedury.

Sekcja i odizolowanie klastrów czuciowych rdzenia kręgowego myszy

Poznaj metodę hydraulicznego wytłaczania rdzenia kręgowego i izolacji zwojów korzenia grzbietowego u myszy i szczurów. Technika ta jest szybsza od tradycyjnych metod i minimalizuje uszkodzenie tkanek.

Hydrauliczne wytłaczanie rdzenia kręgowego i izolacja zwojów korzenia grzbietowego u gryzoni

Przeglądaj więcej filmów