Name: Biofizyczna charakterystyka funkcji motorycznych wici (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj techniki śledzenia koralików przytwierdzonych do silników wiciowych w żywych komórkach bakteryjnych E. coli w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia badanie mechanobiologii i zachowań molekularnych silników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Howardowi Bergowi za dar mikroskopu śledzącego koraliki/fotopowielacze oraz Texas A&M Engineering Experiment Station za fundusze.

1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Przygotować nocne hodowle pożądanego szczepu niosącego lepki allel fliC 15,22 w bulionie tryptonowym (TB, 1% peptony, 0,5% NaCl), a następnie zaszczepić je w rozcieńczeniu 1:100 w 10 mL świeżego TB. Hodować kulturę w temperaturze 33 °C w inkubatorze z wytrząsaniem do osiągnięcia OD600 = 0,5.</li>
	<li>Osadzić komórki przez wirowanie przy 1 500 x g przez 5–7 min i energicznie resuspender osad w 10 mL filtrowanego, sterylnego buforu do ruchliwości (MB; 10 mM bufor fosforanowy: 0,05-0,06 M NaCl, 10-4 M EDTA, 1 µM metioniny, pH 7,0).</li>
	<li>Powtórzyć krok 1.2 jeszcze dwa razy i resuspender końcowy osad w 1 mL MB.</li>
	<li>Poddać zawiesinę ścinaniu, przepuszczając ją około 75 razy tam i z powrotem między dwiema strzykawkami z adapterami o rozmiarze od 21 do 23 G, połączonymi rurką polietylenową (długość 7–12 cm, średnica wewnętrzna 0,58 mm). Całkowity czas ścinania ograniczyć do 30–45 s.</li>
	<li>Odwirować ścięte komórki przy 1 500 x g przez 5–7 min i resuspender osad w 100–500 µL MB.</li>
</ol>
2. Przygotowanie preparatów
<ol>
	<li>Przygotuj komorę obrazowania, umieszczając dwie taśmy dwustronne między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywnym. W przypadku testów chemotaksji zastosuj dowolną komorę mikrofluidyczną umożliwiającą wymianę MB i stymulantów chemicznych.</li>
	<li>Do komory dodaj 0,01% roztwór poli-L-lizyny, a po 5 min delikatnie przepłucz powierzchnie za pomocą MB (80 - 100 µL).</li>
	<li>Do komory dodaj 40 µL zawiesiny komórkowej i odczekaj czas wystarczający do przytwierdzenia komórek do powierzchni szkła (7 - 8 min). Usuń nieprzytwierdzone komórki, dodając 100 µL MB z jednej strony komory i odciągając roztwór papierem filtracyjnym z drugiej strony.</li>
	<li>Do komory dodaj 10 - 15 µL kulek lateksowych i odczekaj czas odpowiedni dla osiadania i przytwierdzania kulek do komórek (7 - 8 min). Delikatnie przepłucz 100 µL MB, zgodnie z opisem w kroku 2.3, aby usunąć nieprzytwierdzone kulki. W eksperymentach stosuj różne rozmiary kulek, o ile zapewnia to odpowiedni kontrast.</li>
</ol>
3. Śledzenie kulek
<ol>
	<li>Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i przeskanuj powierzchnię w poszukiwaniu kulek przyczepionych do silników. Do obserwacji użyj obiektywu fazowego 40X, choć mikroskopia fazowa nie jest niezbędna. Alternatywnie można zastosować obrazowanie w polu jasnym, pod warunkiem zachowania wystarczającego kontrastu, aby wyraźnie odróżnić jasną kulkę na ciemnym tle.</li>
	<li>Po wybraniu kulki przesuń stolik bocznie, aby umieścić ją w określonym narożniku, jak pokazano na Rysunku 1B. Umieszczaj kulki w tym samym narożniku, aby mieć pewność co do kierunku ich obrotu. Idealna trajektoria kulki jest w przybliżeniu kołowa, jednak dopuszczalne są również trajektorie eliptyczne.</li>
	<li>Utrzymuj częstotliwość próbkowania wyższą niż dwukrotność częstotliwości obrotowej silnika, aby uniknąć błędów związanych z aliasingiem. W niniejszej pracy wykorzystano silnik obracający się z częstotliwością 50 Hz i próbkowano z częstotliwościami 10-krotnie wyższymi (500 Hz), aby uzyskać gładki sygnał.</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>W razie potrzeby wycentrować i przeskalować napięcia wyjściowe PMT oraz skorygować eliptyczność trajektorii za pomocą przekształceń afinicznych 23. Do wyznaczenia prędkości rotacji należy wykorzystać analizę widma mocy 17.</li>
	<li>Wyznaczyć kąty polarne, θ(t) = atan (y(t)/x(t)). Zmiany prędkości silników oraz przełączenia w czasie należy określić poprzez obliczenie ω <img alt="Równanie prędkości kątowej, dθ/dt, odnoszące się do analizy ruchu obrotowego, formuła." src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie 1"> 14.</li>
	<li>Zastosować filtr medianowy w celu wygładzenia danych dotyczących prędkości silników. Zalecane jest zastosowanie okna filtra obejmującego dwa pełne obroty 23,24.</li>
</ol>

<ol><li>Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+of+uropathogenic+Echerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob.+Ag%22%5BJournal%5D)">Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli.</a> Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).</li>
<li>Lane, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+motility+in+the+colonization+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract.</a> Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).</li>
<li>Kao, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+interplay+among+bacterial+motility+and+virulence+factors+in+different+Escherichia+coli+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).</li>
<li>Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rotary+motor+of+bacterial+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The rotary motor of bacterial flagella.</a> Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).</li>
<li>McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+Dynamometer+Controls+Swarmer+Cell+Differentiation+of+V.+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus.</a> Cell. 54 (3), 345-351 (1988).</li>
<li>Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mechanosensing+in+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).</li>
<li>Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+sensing+in+Vibrio+parahaemolyticus+triggers+a+programme+of+gene+expression+that+promotes+colonization+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence.</a> Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Belas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%2C+flagella%2C+and+mechanosensing+of+surfaces+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria.</a> Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).</li>
<li>Silverman, M., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+rotation+and+the+mechanism+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility.</a> Nature. 249, 73-74 (1974).</li>
<li>Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+Kinetics+in+Bacterial+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis.</a> J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).</li>
<li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).</li>
<li>Blair, D. F., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+torque+in+defective+flagellar+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Restoration of torque in defective flagellar motors.</a> Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).</li>
<li>Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-generating+units+of+the+flagellar+motor+of+Escherchia+coli+have+a+high+duty+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio.</a> Nature. 403, 444-447 (2000).</li>
<li>Yuan, J., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resurrection+of+the+flagellar+rotary+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).</li>
<li>Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+of+the+bacterial+flagellar+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Switching of the bacterial flagellar motor near zero load.</a> J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).</li>
<li>Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+Relationship+of+the+Na%2B-driven+Flagellar+Motor+of+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus.</a> J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).</li>
<li>Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+relationship+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).</li>
<li>Meacci, G., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+bacterial+flagellar+motor+with+multiple+stators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).</li>
<li>Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellar+motor+of+Caulobacter+crescentus+generates+more+torque+when+a+cell+swims+backwards%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards.</a> Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).</li>
<li>Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Response thresholds in bacterial chemotaxis.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).</li>
<li>Berg, H. C., Turner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+Generated+by+the+Flagellar+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).</li>
<li>Bai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Spread+as+a+Mechanism+for+Cooperativity+in+the+Bacterial+Flagellar+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch.</a> Science. 327, 685-689 (2010).</li>
<li>Reid, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maximum+number+of+torque-generating+units+in+the+flagellar+motor+of+Escherichia+coli+is+at+least+11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).</li>
<li>Chen, X., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-Speed+Relationship+of+the+Flagellar+Rotary+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).</li>
<li>Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W celu ułatwienia śledzenia stopki na uwięzi i prawidłowego oszacowania momentów obrotowych silnika, należy zapoznać się z poniższymi informacjami. Podczas wykonywania tych pomiarów na komórkach wiciowców ścinanie jest krytycznym krokiem. Ścinanie redukuje włókno wiciowe do zwykłego kikuta, zapewniając w ten sposób, że obciążenie lepkości silnika jest głównie spowodowane stopką i można je oszacować z dokładnością do 10% błędu 16. Ścinanie zwiększa również szanse na znalezienie trajektorii kołowych o ciasno roz...

Silniki wiciowe umożliwiają komórkom pływanie poprzez obracanie spiralnych włókien zewnątrzkomórkowych. Wielkość momentu obrotowego, jaki silnik może wygenerować dla danej długości wici (tj. obciążenie lepkie) określa prędkość pływania. Z drugiej strony, jego zdolność do zmiany kierunku rotacji kontroluje migrację komórek w odpowiedzi na chemikalia, proces znany jako chemotaksja. Chemotaksja i ruchliwość są czynnikami wirulencji 1-3, silniki wiciowe zostały dobrze scharakteryzowane na przestrzeni lat 4. Coraz więcej dowodów sugeruje, że silnik działa jak mechanoczujnik - mechanicznie wykrywa obecność stałych substratów 5,6. Ta zdolność prawdopodobnie pomaga w wywoływaniu kolonizacji powierzchni i infekcji 5,7. W związku z tym istotne są mechanizmy, za pomocą których zmysły motoryczne uwidaczniają się i inicjują sygnalizację 8,9.
Silnik wiciowy można łatwo zbadać, przywiązując wić do podłoża i obserwując rotację komórek. Takie wiązanie zostało po raz pierwszy osiągnięte przez Silvermana i Simona, którzy pracowali z mutantem polyhook w E. coli i z powodzeniem przymocowali haki do szklanych podłoży z przeciwciałami anty-hook 10. Test na komórkach uwięzi umożliwił naukowcom zbadanie reakcji przełącznika motorycznego na różne bodźce chemiczne. Na przykład Segall i jego współpracownicy chemicznie stymulowali komórki na uwięzi za pomocą pipet jonoforetycznych. Odpowiednie zmianyw odchyleniu CW (ułamek czasu, w którym silniki obracają się zgodnie z ruchem wskazówek zegara, CW) umożliwiły im zmierzenie kinetyki adaptacji w sieci chemotaksji 11,12. Chociaż test komórek na uwięzi był skuteczny w badaniu reakcji przełączających, był w stanie zapewnić wgląd w mechanikę motoryczną tylko w ograniczonym zakresie obciążeń lepkich13. Aby przezwyciężyć ten problem, Ryu i jego współpracownicy umieścili kuliste, lateksowe koraliki do włókien na komórkach przyklejonych do powierzchni. Koraliki były następnie śledzone za pomocą interferometrii ogniskowej wstecznej ze słabymi pułapkami optycznymi 14. Pracując z koralikami o różnych rozmiarach, naukowcy mogli badać silnik w znacznie szerszym zakresie obciążeń. Test ten został później ulepszony przez Yuana i Berga, którzy opracowali technikę śledzenia koralików opartą na fotopowielaczu w połączeniu z laserowym oświetleniem ciemnego pola. Opracowana przez nich metoda umożliwiła śledzenie złotych nanokulek na uwięzi, które były tak małe (~ 60 nm), że zewnętrzne opory lepkości były niższe w porównaniu z wewnętrznymi oporami lepkości do obrotu 15,16. Doprowadziło to do pomiarów maksymalnych osiągalnych prędkości u E. coli (~ 300 Hz). U V. alginolyticus podobne testy perełkowe umożliwiły pomiary szybkości wirowania przy średnich obciążeniach lepkości (~ 700 Hz) 17. Umożliwiając pomiary reakcji motorycznych w całym możliwym zakresie obciążeń lepkich (od obciążenia zerowego do prawie przeciągnięcia), testy perełkowe dostarczyły ważnego narzędzia biofizycznego do zrozumienia procesu generowania momentu obrotowego 18,19.
Niedawno zmodyfikowaliśmy test Yuana-Berga, aby zawierał pęsety optyczne, które umożliwiły nam zastosowanie precyzyjnych bodźców mechanicznych do poszczególnych silników 6. Korzystając z tej techniki, wykazaliśmy, że generatory siły, które obracają silnik, są dynamicznymi mechanoczujnikami - przemodelowują się w odpowiedzi na zmiany obciążeń lepkich. Możliwe, że takie wykrywanie obciążenia wyzwala różnicowanie komórek w rojące się bakterie, chociaż mechanizmy pozostają niejasne. Jest również prawdopodobne, że silniki wiciowe u innych gatunków są również mechanowrażliwe 20, chociaż brakuje bezpośrednich dowodów. W tym miejscu omówiono podejście oparte na fotopowielaczu (PMT) do śledzenia rotacji kulek lateksowych przywiązanych do włókien wiciowych 15. W porównaniu ze śledzeniem za pomocą ultraszybkich kamer, konfiguracja fotopowielacza jest korzystna, ponieważ śledzenie pojedynczych kulek w czasie rzeczywistym i przez długi czas jest stosunkowo proste. Jest to szczególnie przydatne podczas badania długotrwałej przebudowy kompleksów motorycznych wici pod wpływem bodźców środowiskowych 21. Chociaż szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie dla E. coli, można je łatwo dostosować do badania silników wiciowych u innych gatunków.

<table><tbody><tr><td>Roztwór poli-L-lizyny (0,1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Polybead</td><td>Microspheres Polysciences, Inc.</td><td>7307</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1 ml strzykawka z końcówką Luer Slip Tip</td><td>Exel Int.</td><td>26048</td><td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td></tr><tr><td>Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter</td><td>Rurki polietylenowe Becton, Dickinson and Company o rozmiarze 23 Becton, Dickinson and Company</td><td></td><td>427565 http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp</td></tr><tr><td></td><td>Aparat Harvard</td><td>59-8325</td><td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html</td></tr><tr><td>Fotopowielacz Lampy</td><td>Hamamatsu</td><td>R7400U-20</td><td>Zakres odpowiedzi spektralnej od 300 do 920 nm, Szczytowa długość fali 630 nm,&nbsp; Czas odpowiedzi 0,78 ns&nbsp; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td></tr><tr><td>3 x 1 mm precyzyjne szczeliny</td><td>Edmund Optics</td><td>NT39-908</td><td>2 szczeliny zamontowane pod kątem prostym do siebie na lampach fotopowielacza</td></tr><tr><td>Oscyloskop</td><td>Tektronix</td><td>TBS 1032B</td><td>Dopuszczalne są alternatywne marki. Oscyloskop cyfrowy, Seria TBS 1000B, 2 analogowe, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts&nbsp; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td></tr><tr><td>8-biegunowy filtr LP/HP</td><td>Krohn-Hite</td><td>3384</td><td>Dopuszczalne są alternatywne marki. Zalecany jest zakres częstotliwości od 0,1 Hz do 200 kHz. &nbsp; &nbsp; Mikroskop http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td></tr><tr><td>Optiphot</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>Można użyć dowolnego mikroskopu pionowego lub odwróconego mikroskopu fazowego. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td></tr><tr><td>50:50 (R:T) Rozdzielacz wiązki sześcienny</td><td>ThorLabs</td><td>BS013</td><td></td></tr></tbody></table>

biofizyczna charakterystyka funkcji motorycznych wici

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

Rola silników wiciowych w ruchliwości bakterii i chemotaksji jest dobrze poznana. Ostatnie odkrycia sugerują, że silniki wiciowe są w stanie przebudować się w odpowiedzi na różne bodźce środowiskowe i są jednym z wyzwalaczy kolonizacji powierzchni i infekcji. Dokładne mechanizmy, za pomocą których silniki przebudowują się i promują adaptację komórkową, prawdopodobnie zależą od kluczowych atrybutów motorycznych. Zaprezentowana tu technika śledzenia koralików oparta na fotopowielaczu umożliwia dokładną biofizyczną charakterystykę funkcji motorycznych, w tym adaptacji prędkości motorycznych i dynamiki przełączania. Takie podejście ma tę zaletę, że umożliwia śledzenie w czasie rzeczywistym i możliwość badania zachowań motorycznych przez dłuższy czas. Omówione protokoły można łatwo rozszerzyć o badania silników wiciowych u różnych gatunków bakterii.

Układ fotopowielaczy przedstawiono na Rysunku 1A. Istotne jest, aby fotopowielacze (PMT) charakteryzowały się wysoką czułością w zakresie długości fal rozpraszanych przez analizowane kuleczki. Zastosowane tutaj PMT pracują w zakresach widzialnym i bliskiej podczerwieni i były w stanie wykryć światło rozproszone przez kuleczki oświetlone halogenowym źródłem światła. Optymalne warunki oświetlenia i napięcia zasilania będą się różnić w zależności od konkretnego układu. Dla k...

Ostatnie odkrycia sugerują, że bakteryjne silniki wiciowe wyczuwają różne sygnały środowiskowe i w odpowiedzi na nie przebudowują się. Oczekuje się, że omówione tutaj testy perełkowe pomogą wyjaśnić rolę przebudowy w adaptacji komórek do stresorów środowiskowych.

Biofizyczna charakterystyka funkcji motorycznych wici

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest pomiar rotacji koralików sondy przytwierdzonych do pojedynczych silników flagellarnych w żywych komórkach bakteryjnych. Opisywana technika oferuje zaletę śledzenia odpowiedzi silników w czasie rzeczywistym oraz możliwość odróżniania danych dopuszczalnych od niedopuszczalnych w czasie rzeczywistym. Podejście to pomaga nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mechanobiologii i odkryć fizykę leżącą u podstaw działania silników molekularnych.Chociaż techniki te stosujemy głównie do badania silników wiciowych w E.coli, protokoły te można łatwo dostosować do badania silników u innych gatunków bakterii uwieczonych. Przez noc hodować kultury wybranego szczepu niosącego allel sticky fliC w pożywce TB. Następnego dnia zaszczepić 10 ml świeżej pożywki TB w rozcieńczeniu 1:100. Hodować kulturę w temperaturze 33 °C w inkubatorze wytrząsowym, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość 0,5.Odwiruj komórki przy 1500 ×g przez pięć do siedmiu minut. Następnie energicznie resuspenduj osad w 10 ml filtrowanego, sterylnego buforu do badania motylości. Powtórz wirowanie i resuspensję jeszcze dwa razy.Resuspender końcowy osad w jednym mililitrze MB. Poddać zawiesinę ścinaniu, przenosząc ją w przód i w tył około 75 razy między dwiema strzykawkami z adapterami o rozmiarze od 21 do 23 G, połączonymi rurką polietylenową. Ograniczyć całkowity czas ścinania do 30–45 sekund. Po odwirowaniu ściętych komórek, resuspender osad w 100–500 mikrolitrach MB. Przygotować komorę obrazowania, umieszczając dwie dwustronne taśmy klejące pomiędzy szkiełkiem nakrywnym a szkiełkiem przedmiotowym.Do komory należy dodać 0,01% roztwór poli-L-lizyny, a po pięciu minutach delikatnie wypłukać powierzchnie za pomocą MB. Następnie do komory dodaje się 40 µL zawiesiny komórkowej i odczekuje odpowiedni czas do ich przytwierdzenia do powierzchni szklanej. Niezwiązane komórki usuwa się poprzez dodanie 100 µL MB po jednej stronie komory, jednocześnie odsączając roztwór papierem filtracyjnym z drugiej strony. Następnie do komory dodaje się od 10 do 15 µL kulek lateksowych.W eksperymentach należy zastosować zakres rozmiarów kulek, który zapewni dobry kontrast. Należy odczekać odpowiedni czas, aby kulki osiadły i przytwierdziły się do komórek. Delikatnie przepłucz kulki 100 µL MB w celu usunięcia kulek, które nie przywarły.Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i przeskanuj powierzchnię w poszukiwaniu kulek przytwierdzonych do silniczków. Stosuj obrazowanie w polu jasnym z obiektywem 60X, o ile zachowany zostanie wystarczający kontrast, aby wyraźnie odróżnić jasną kulkę na ciemnym tle. Po wybraniu kulki przesuń stolik bocznie, aby ustawić ją w wcześniej wyznaczonym narożniku.Umieść kuleczki w tym samym rogu, aby zapewnić prawidłową orientację kierunku ich obrotu. Utrzymuj częstotliwość próbkowania wyższą niż dwukrotność częstotliwości obrotowej silnika, aby uniknąć błędów związanych z aliasingiem. W niniejszej pracy wykorzystano częstotliwości próbkowania 10-krotnie wyższe w celu obserwacji silnika obracającego się z częstotliwością 50 hertz.Jeśli po przywiązaniu kuleczki wydają się drgać z ekscentrycznością większą niż jeden lub dwa razy promień kuleczki, zaleca się przeprowadzenie większej liczby cykli ścinania komórek. Przedstawiono tutaj porównanie wizualne między odpowiednio przywiązaną kuleczką a kuleczką nieprzywiązaną. Sygnały z dwóch fotopowielaczy, próbkowane z częstotliwością 500 hertz, zostały przedstawione dla krótkiego przedziału czasu pomiaru.Przefiltrowane sygnały wyjściowe z PMT, po wycentrowaniu i przeskalowaniu, zostały wykorzystane do rekonstrukcji kolistych trajektorii rotującej kuleczki, jak pokazano tutaj. Idealna trajektoria kuleczki jest w przybliżeniu kolista, jednak dopuszczalne są trajektorie eliptyczne. Prędkości kątowe obliczone z trajektorii kuleczki dla pojedynczego silnika zostały przedstawione w oknie czasowym trwającym trzy sekundy.Powtarzające się zmiany kierunku obrotu silnika między przeciwnym a zgodnym z ruchem wskazówek zegara są sygnalizowane przejściami między wartościami dodatnimi a ujemnymi. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać biegłą wiedzę na temat śledzenia kulek przytwierdzonych do pojedynczych silników flagelarnych z wysoką dokładnością, przy użyciu zaprezentowanych tutaj technik opartych na fotopowielaczach. Bakteryjny silnik flagelarny stanowi wyjątkowe wyzwanie, ponieważ jest zdolny do obrotów z częstotliwością rzędu kilkuset herców.Wysokoprecyzyjne śledzenie koralików sondy przywiązanych do motorów molekularnych ułatwiło charakterystykę kilku typów motorów, w tym kinezyn, miozyn i F1-ATPase. Rozszerzenie techniki przywiązania koralików na motor flagellarne umożliwiło badaczom analizę mechaniki motorów z niespotykaną dotąd dokładnością. Wizualna demonstracja tej metody pomoże badaczom chcącym wykorzystać tę technikę w przezwyciężeniu takich trudności, jak odpowiednie zlokalizowanie koralików przywiązanych do poszczególnych motorów.Przewiduje się, że zaprezentowane tutaj metody umożliwią uzyskanie nowej wiedzy na temat przystosowalności tych nanomaszyn w różnych gatunkach bakterii.

biophysical-characterization-of-flagellar-motor-functions

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wewnątrzkomórkowy transport ładunków, takich jak pęcherzyki czy organelle, odbywa się za pomocą molekularnych białek motorycznych, które śledzą na spolaryzowanych mikrotubulach. Protokół ten opisuje korelację kierunkowości transportu pojedynczych cząstek ładunku poruszających się wewnątrz neuronów, do względnej ilości i rodzaju związanych z nimi białek motorycznych.

Charakterystyka składu silników molekularnych na ruchomym ładunku aksonalnym za pomocą analizy "mapowania ładunku"

Celem tego protokołu jest tworzenie zespołów silników molekularnych na nanostrukturach origami DNA i obserwowanie ruchliwości zespołu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem.

Produkcja zespołów motorycznych dyneiny i kinezyny na nanostrukturach DNA origami do obserwacji pojedynczych cząsteczek

Wiele bakterii wykorzystuje ruchliwość sterowaną wiciami do poruszania się po swoim środowisku i kolonizowania korzystnego otoczenia, zarówno indywidualnie, jak i zbiorowo. Zademonstrowano tutaj zastosowanie trzech uznanych metod, które wykorzystują ruchliwość jako narzędzie selekcyjne do identyfikacji składników/ścieżek przyczyniających się do pływania i ruchliwości roju.

Badanie ruchliwości sterowanej wiciami u Escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii

Przedstawiono tutaj procedurę ekspresji i oczyszczania miozyny 5a, po której następuje dyskusja na temat jej charakterystyki, przy użyciu testów opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro zarówno zespołowych, jak i pojedynczych, oraz jak te metody mogą być modyfikowane do charakterystyki niemięśniowej miozyny 2b.

Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro

Prezentowany tutaj jest obszerny protokół do przeprowadzania ultraszybkich eksperymentów z zaciskiem siły na procesyjnych silnikach miozyny-5, który można łatwo rozszerzyć do badania innych klas silników procesowych. Protokół wyszczególnia wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, gromadzenie danych i analizę.

Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej

Tutaj opisujemy budowę mutantów zerowych Aeromonas w określonych glikozylotransferazach lub regionach zawierających glikozylotransferazy, testy ruchliwości i oczyszczanie wici przeprowadzone w celu ustalenia udziału i funkcji kodowanych przez nie enzymów w biosyntezie glikanu, a także rolę tego glikanu w patogenezie bakterii.

Generowanie mutantów zerowych w celu wyjaśnienia roli glikozylotransferaz bakteryjnych w ruchliwości bakterii

Dwukierunkowa mitoza kinezyna-5 Cin8 gromadzi się w klastrach, które rozdzielają się i łączą podczas swojej ruchliwości. Akumulacja w gromadach zmienia również prędkość i kierunkowość Cin8. W tym miejscu opisano protokół oznaczania ruchliwości z oczyszczonym Cin8-GFP oraz analizy właściwości ruchliwych pojedynczych cząsteczek i klastrów Cin8.

Ruchliwość pojedynczych cząsteczek i klastrów dwukierunkowej kinezyny-5 Cin8 oczyszczonej z komórek S. cerevisiae

Przedstawiono i omówiono tworzenie wiązek aktomiozyny in vitro oraz pomiar siły generowania zespołu miozyny za pomocą pęsety optycznej.

Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

To badanie szczegółowo opisuje oczyszczanie KIF1A(1-393LZ), członka rodziny kinezyny-3, przy użyciu systemu ekspresji Sf9-bakulowirusa. Analiza in vitro pojedynczych cząsteczek i wielu silników ślizgowych tych oczyszczonych silników wykazała silne właściwości ruchliwości porównywalne z silnikami z lizatu komórkowego ssaków. W ten sposób system Sf9-bakulowirusa jest podatny na ekspresję i oczyszczanie białka motorycznego będącego przedmiotem zainteresowania.

Analiza pojedynczych cząsteczek oczyszczonych superprocesyjnych silników z rodziny Kinesin-3 Sf9

Ten protokół szczegółowo opisuje procedury rekombinacyjnego wytwarzania ludzkiego holoenzymu miozyny-7a za pomocą systemu MultiBac Baculovirus oraz badania jego ruchliwości za pomocą dostosowanego testu ślizgowego in vitro.

Oczyszczanie oparte na systemie MultiBac i biofizyczna charakterystyka ludzkiej miozyny-7a

Poznaj techniki śledzenia koralików przytwierdzonych do silników wiciowych w żywych komórkach bakteryjnych E. coli w czasie rzeczywistym. Ta metoda umożliwia badanie mechanobiologii i zachowań molekularnych silników.

Biofizyczna charakterystyka funkcji motorycznych wici

Przeglądaj więcej filmów