Name: Analiza segregacji chromosomów, acetylacji histonów i morfologii wrzeciona w oocytach koni (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Poznaj metody analizy segregacji chromosomów, acetylacji histonów i morfologii wrzeciona w oocytach koni. Technika OPU umożliwia bezpieczne pobieranie gamet od klaczy do badań płodności.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Fabrice'owi Vincentowi za wsparcie w postaci laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej (LSCM) oraz Philippe'owi Barrière'owi i Thierry'emu Blardowi za codzienne badanie ultrasonograficzne jajników i wstrzyknięcie hCG. Prace te były częściowo wspierane przez projekt "Regione Sardegna and Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (grant nr 26096200 dla A. M. L.); stypendium "L'Oréal Italia per le Donne e la Scienza 2012" (umowa na rok 2012 dla F. F.), FP7-PEOPLE-2011 – CIG, Agencja Wykonawcza ds. Badań Naukowych (REA) "Pro-Ovum" (grant nr 303640 dla V. L.); oraz przez Szkołę Podoktorską Rolnictwa i Weterynarii, współfinansowaną ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego, Sektorowy Program Operacyjny Rozwoju Zasobów Ludzkich 2007-2013 (Umowa nr. POSDRU/89/1.5/S/62371 do I. M.). Kolekcja komórek jajowych in vivo została sfinansowana przez Institut Français du Cheval et de l'Equitation.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania CEEA, Val de Loire, Numer 19 i zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.
1. Pobieranie komórek jajowych i dojrzewanie in vitro 
<ol>
	<li>Pobranie komórki jajowej
	<ol>
		<li>Codziennie oceniaj za pomocą ultradźwięków średnicę pęcherzyków jajnikowych w kohorcie dorosłych klaczy. Po pojawieniu się pęcherzyka ≥33 mm (pęcherzyk dominujący) wstrzyknąć klaczy 1,500 IU ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) w górną część żyły szyjnej (iv).
		<ol>
			<li>Przed wykonaniem wstrzyknięcia należy przetrzeć obszar alkoholem, zlokalizować bruzdę szyjną i umieścić kciuk 2-3 cm pod miejscem wstrzyknięcia, aby skłonić żyłę do podniesienia się. Wbić igłę prawie równolegle do szyjki i zassać, aby upewnić się, że igła znajduje się w żyle (krew dostanie się do strzykawki). W tym momencie należy wstrzyknąć; hCG indukuje dojrzewanie oocytu w pęcherzyku dominującym.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>35 godzin po wstrzyknięciu hCG należy uspokoić klacz detomidyną (15 μg/kg, i.v.), winianem butorfanolu (10 μg/kg, i.v.) i bromem butyloskopolaminy (0,2-0,3 mg/kg, 15 mL/klacz, i.v.).</li>
		<li>Podłącz igłę do sondy ultradźwiękowej. Włóż sondę ultrasonograficzną do pochwy i przytrzymaj jajnik przezodbytniczo, aby skierować się w stronę sondy ultrasonograficznej. Poinstruuj jednego operatora, aby manewrował igłą, a drugi, aby przytrzymał jajnik na miejscu, tak aby pęcherzyk był skierowany w stronę sondy ultradźwiękowej. Zacznij od jajnika z pęcherzykiem dominującym.</li>
		<li>Nakłuć igłą ścianę pochwy i ścianę pęcherzyka dominującego (sondy ultrasonograficzne do OPU są wyposażone w kanał na igłę podłączony do systemu ssącego); igła będzie widoczna na obrazie echograficznym.</li>
		<li>Odessać płyn pęcherzykowy do stożkowej rurki o pojemności 50 ml podłączonej do układu ssącego. Wlej zawartość stożkowej rurki do dużej szalki Petriego i poszukaj kompleksu wzgórek-oocytów (COC) za pomocą stereomikroskopu.</li>
		<li>Ponieważ COC nie zawsze jest pobierany z płynem pęcherzykowym, należy przepłukać pęcherzyk modyfikowanym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco zawierającym 5 j.m./ml heparynianu o temperaturze 37 °C. Zbadać DPBS pod kątem obecności COC, jak opisano wcześniej dla płynu pęcherzykowego w kroku 1.1.5. Przepłucz kilka razy, aż COC zostanie odzyskany.</li>
		<li>Po pobraniu COC z pęcherzyka dominującego należy nakłuć i przepłukać pęcherzyki ≥5 i ≤25 mm, jak opisano dla pęcherzyka dominującego w krokach 1.1.3-1.1.4; pęcherzyki ≥5 i ≤25 nie wykazują ekspresji hormonu luteinizującego/receptora choriogonadotropiny (LHCGR), a zatem ich oocyty nie dojrzeją w odpowiedzi na hCG i zostaną zebrane w stadium GV (niedojrzałe). Trzymaj COC tylko z kilkoma pełnymi warstwami komórek wzgórka i brązową, drobnoziarnistą ooplazmą. Odrzuć pozostałe.</li>
		<li>Pod koniec OPU wstrzyknąć klaczy penicylinę benzylową 15 000 j.m./zwierzę, aby zapobiec infekcji.</li>
		<li>Trzymaj klacz w cichej, czystej stajni przez co najmniej 2 godziny. Sprawdź oznaki świadomości, określając pozycję uszu, reakcję na bodźce (np. hałas) i chód przed powrotem klaczy do towarzystwa innych zwierząt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dojrzewanie in vitro
	<ol>
		<li>Ciepły buforowany przez HEPS TCM199 (20 mM Hepes) uzupełniony 1 790 IU / L heparyny, 0,4% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), penicyliny i streptomycyny do 37 °C. Przygotuj tę pożywkę z wyprzedzeniem. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
		Przygotuj pożywkę IVM, uzupełniając buforowany 3 TCM199 NaHCO (25 mM NaHCO3) 50 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) i 20% surowicy cielęcej7.<li> Należy zużyć TCM199 z buforem3 NaHCO w ciągu 3 tygodni od otwarcia nowej butelki. Przygotuj EGF z wyprzedzeniem jako zapasy 100x, zamroź go w temperaturze -20 °C i zużyj w ciągu 6 miesięcy. Dozować 500 μl do studzienek 4-dołkowego naczynia i inkubować w wilgotnym powietrzu z 5% CO2 w temperaturze 38,5 °C przez co najmniej 2 godziny.</li>
		<li>Po pobraniu COC z pęcherzyków ≥5 i ≤25 mm umieść je na szalce Petriego (o średnicy 3,5 cm) wypełnionej 2 ml HEPES-TCM199. Przenieś COC w różne miejsca naczynia, aby zmyć zanieczyszczenia komórkowe.</li>
		<li>Przenieść COC na pożywkę IVM i inkubować przez 28 godzin w wilgotnym powietrzu z 5% CO2 w temperaturze 38,5 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Immunofluorescencja i analiza obrazu
<ol>
	<li>Liczba chromosomów
	<ol>
		<li>Po pobraniu z pęcherzyka dominującego lub pod koniec IVM inkubować COC ze 100 μM monoastrolem przez 1 godzinę w wilgotnym powietrzu z 5% CO2 w temperaturze 38,5 °C. Przygotuj monastrol z wyprzedzeniem w postaci 100x wywaru i przechowuj go w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.</li>
		<li>Usunąć komórki wzgórka, traktując je 0,5% hialuronidazą lub delikatnie pipetując; usunąć osłonkę przejrzystą, traktując ją 0,2% pronazą. Przygotuj hialuronidazę i pronazę z wyprzedzeniem jako 10x zapas i przechowuj je w temperaturze -20 °C przez okres do 1 roku.</li>
		<li>Utrwalić oocyty w 4% paraformaldehydzie w DPBS przez 15 minut w temperaturze 38,5 °C, a następnie przez kolejne 45 minut w temperaturze 4 °C. 
		OSTROŻNOŚĆ! Podczas obchodzenia się z paraformaldehydem należy nosić środki ochrony osobistej, a skażone materiały należy utylizować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi usuwania odpadów niebezpiecznych.</li>
		<li>Przemyj oocyty, przenosząc je sekwencyjnie do 3 studzienek wypełnionych 500 μL DPBS uzupełnionego 0,1% alkoholem poliwinylowym (PVA). Przepuszczalność w 0,3% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
		<li>Blokować niespecyficzne wiązanie przez inkubację w DPBS uzupełnionym 1% albuminą surowicy bydlęcej (DPBS-1% BSA) i 10% normalną surowicą osła przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej. Próbki można przechowywać w roztworze blokującym w temperaturze 4 °C przez 3-4 dni.</li>
		<li>W celu barwienia pierwotnego inkubować oocyty w króliczym fosfo-Thr232 anty-Aurora B w DPBS uzupełnionym 1% BSA (rozcieńczenie 1:50) w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Umyj oocyty zgodnie z opisem w kroku 2.1.4. Inkubować oocyty w roztworze izotiocyjanianu tetra-metylorodaminy (TRITC) sprzężonego z anty-króliczymi osłem IgG (1:100 w DPBS-1% BSA) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
		<li>Umyj oocyty zgodnie z opisem w kroku 2.1.4, a następnie umieść 3-4 oocyty w kropli nietwardniejącego, zapobiegającego blaknięciu podłoża mocującego uzupełnionego 20 μM YOPRO1 na szkiełku podstawowym. Powtarzaj procedurę, aż wszystkie oocyty zostaną zamontowane (3-4 oocyty na szkiełko).</li>
		<li>Pozostaw oocyty na około 10 minut w podłożu montażowym, a następnie przykryj je szkiełkiem nakrywkowym. Aby uniknąć zgniecenia oocytów, przed ułożeniem szkiełka nakrywkowego na szkiełku nakrywkowym należy nałożyć dwa paski taśmy dwustronnej. 
		UWAGA: Ten środek ostrożności zapewni również, że wszystkie próbki zostaną równomiernie ściśnięte między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym. Szkiełka podstawowe można zamrażać w temperaturze -20 °C i obrazować w ciągu kolejnych 2-3 dni.</li>
		<li>Zobrazuj próbki na konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym z obiektywem 60X, używając kanałów czerwonego (centromery) i zielonego (chromosomy)7,13,14,20,21. Skanuj próbki obejmujące całą płytkę metafazową na osi z, z krokami co 0,35 μm. Zapisz zdigitalizowane obrazy każdego planu.</li>
		<li>Policz centromery w szeregowych sekcjach konfokalnych za pomocą funkcji zliczania komórek w oprogramowaniu NIH ImageJ (dostępnym pod adresem: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). 
		UWAGA: Unikaj wielokrotnego liczenia centromerów, które pojawiają się na sąsiednich sekcjach, identyfikując centromery, które pojawiają się, pozostają i znikają w kolejnych sekcjach, za pomocą kodu numerycznego.</li>
		<li>Powtórz zliczanie chromosomów w kroku 2.1.11 z niezależnym operatorem. 
		UWAGA: Klasyfikuj oocyty jako euploidalne (32 chromosomy), hiperploidalne (>32) lub hipoploidalne (<32).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Morfologia wrzeciona i acetylacja histonów
	<ol>
		<li>Po pobraniu z pęcherzyka dominującego lub na końcu IVM usunąć komórki wzgórka poprzez traktowanie 0,5% hialuronidazą lub delikatne pipetowanie, jak opisano w kroku 2.1.2.</li>
		<li>Umyć oocyty w DPBS-PVA, jak w kroku 2.1.4, i utrwalić je w 2,5% paraformaldehydzie przez 20 minut w temperaturze 38 °C. Dokładnie przemyć, jak opisano w kroku 2.1.4, i przepuścić w 0,1% Triton X-100 przez 5 minut w temperaturze RT. 
		UWAGA: Podczas obchodzenia się z paraformaldehydem należy nosić środki ochrony osobistej i utylizować skażone materiały zgodnie z wytycznymi dotyczącymi usuwania odpadów niebezpiecznych.</li>
		<li>Blokuj nieswoiste wiązanie przez inkubację w DPBS uzupełnionym 2% albuminą surowicy bydlęcej (DPBS - 2% BSA), 0,05% saponiną i 10% normalną surowicą osła przez 2 godziny w RT. 
		UWAGA: Próbki można przechowywać w roztworze blokującym w temperaturze 4 °C przez 3 - 4 dni.</li>
		<li>W celu barwienia pierwotnego inkubować oocyty w mysiej anty-alfa-tubulinie (1:150) i króliczym anty-acH4K16 (1:250) w DPBS-2% BSA z 0,05% saponiną w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
		<li>Umyj oocyty jak w kroku 2.1.4. Inkubować oocyty w roztworze zielonofluorescencyjnej IgG anty-mysiej osła sprzężonej z barwnikiem (1:500) i anty-króliczej IgG osła (1:100) sprzężonej z TRITC w DPBS-2% BSA z 0,05% saponiną przez 1 godzinę w RT w ciemności.</li>
		<li>Umyć oocyty jak w kroku 2.1.4, a następnie umieścić 3-4 oocyty w kropli nietwardniejącego, zapobiegającego blaknięciu podłoża mocującego uzupełnionego 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) na szkiełku podstawowym.</li>
		<li>Zamontuj oocyty na szkiełkach podstawowych zgodnie z opisem w kroku 2.1.8.</li>
		<li>Zobrazuj próbki w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym z obiektywem 60x, używając kanałów czerwonego (acH4K16), zielonego (alfa-tubulina) i niebieskiego (DNA). 
		UWAGA: Utrzymuj stałe ustawienia lasera dla kanałów czerwonego i niebieskiego przez cały czas pobierania wszystkich próbek. Skanuj próbki obejmujące całe wrzeciono mejotyczne i płytkę metafazową na osi z, z krokami co 0,35 μm. Zapisz zdigitalizowane obrazy (pojedyncze plany i rzutowany obraz 3D).</li>
		<li>Zmierz długość wrzeciona od bieguna do bieguna i średnicę wrzeciona przy maksymalnej szerokości na wyświetlanym obrazie za pomocą funkcji pomiaru oprogramowania NIH ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Powtórz każde 3 razy i oblicz średnią.</li>
		<li>Określ ilościowo względną fluorescencję acH4K16 za pomocą zintegrowanej funkcji gęstości oprogramowania NIH ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Znormalizuj go, aby uzyskać zintegrowaną gęstość barwienia DAPI.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza ekspresji mRNA
<ol>
	<li>Po pobraniu COC z pęcherzyków o średnicy od 5 do 25 mm należy zebrać zawiesinę komórek ziarnistych, która pozostała na szalce Petriego, i umyć ją dwukrotnie w zimnym DPBS, wirując przy 10 600 x g przez 2 minuty. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy; Komórki będą służyć do krzywej standardowej.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć wszystkie komórki wzgórka, jak opisano w kroku 2.1.2, z niedojrzałych (GV), dojrzałych in vitro i dojrzałych in vivo oocytów.</li>
	<li>Umyć oocyty, jak opisano w ppkt 2.1.4, w DPBS-PVA, zebrać je pojedynczo w objętości 1 μl i położyć na wierzchu 2 μl RNALater. Szybkie zamrażanie w ciekłym azocie. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	<li>Dodaj 2 pg RNA lucyferazy do każdej próbki jako impuls. Połączyć oocyty 2 x 2 i wyekstrahować całkowite RNA za pomocą zestawu opartego na filtrze z membraną krzemionkową, odpowiedniego do odzyskiwania RNA z małych próbek.</li>
	<li>Odwrotną transkrypcję RNA w 10 μl za pomocą losowych heksamerów 0,25 μg i mysiej odwrotnej transkryptazy wirusa białaczki Moloneya przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.</li>
	<li>Rozcieńczyć cDNA z komórek ziarnistych w wodzie wolnej od RNAzy do 50 ng/μL. Seryjnie rozcieńczyć ten roztwór w stosunku 1:10, aby uzyskać roztwory 5 ng/μL, 0,5 ng/μL, 0,05 ng/μL i 0,005 ng/μL.</li>
	<li>Zebrać reakcje w trzech egzemplarzach w całkowitej objętości 20 μl na reakcję, używając cDNA odpowiadającego 0,05 oocytom jako substratowi lub 5 μl seryjnych rozcieńczeń cDNA komórek ziarnistych, 10 μl zielonego supermiksu SYBR i 0,3 μM każdego specyficznego startera (Tabela 1).</li>
	<li>Przeprowadź reakcję w termocyklerze przy użyciu 3-etapowego protokołu: 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 20 s, powtórzone 40 razy. Na koniec należy wyznaczyć krzywą topnienia, zaczynając od 60 °C, i zwiększać temperaturę o 0,5 °C co 20 s aż do 95 °C.</li>
	<li>Oceń początkową ilość (SQ) specyficznego mRNA w próbkach oocytów za pomocą krzywej standardowej15 obliczonej na podstawie próbki komórek ziarnistych. Wyraź dane jako stosunek między SQ genu będącego przedmiotem zainteresowania a SQ genów porządkowania.</li>
</ol>

<ol><li>Dellenbach, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transvaginal%2C+sonographically+controlled+ovarian+follicle+puncture+for+egg+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval.</a> Lancet. 1 (8392), 1467(1984).</li>
<li>Humaidan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+hyperstimulation+syndrome%3A+review+and+new+classification+criteria+for+reporting+in+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials.</a> Hum Reprod. , (2016).</li>
<li>Pincus, G., Enzmann, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Comparative+Behavior+of+Mammalian+Eggs+in+Vivo+and+in+Vitro+%3A+I.+The+Activation+of+Ovarian+Eggs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs.</a> J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).</li>
<li>Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oocyte+maturation+and+subsequent+delayed+fertilization+is+associated+with+increased+embryo+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy.</a> Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).</li>
<li>Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vitro+maturation+and+age+on+oocyte+quality+in+the+rhesus+macaque+Macaca+mulatta%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta.</a> Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).</li>
<li>Requena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+in-vitro+maturation+of+oocytes+on+aneuploidy+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Biomed+Online%22%5BJournal%5D)">The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate.</a> Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).</li>
<li>Franciosi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+affects+chromosome+segregation%2C+spindle+morphology+and+acetylation+of+lysine+16+on+histone+H4+in+horse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes.</a> Reprod Fertil Dev. , (2015).</li>
<li>Franciosi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+histone+H4+acetylation+during+in+vivo+versus+in+vitro+maturation+of+equine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes.</a> Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).</li>
<li>Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+medium+variations+%28zinc+supplementation+during+oocyte+maturation%2C+perifertilization+pH%2C+and+embryo+culture+protein+source%29+on+equine+embryo+development+after+intracytoplasmic+sperm+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection.</a> Theriogenology. , (2016).</li>
<li>Hendriks, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+age+and+in+vitro+culture+affect+mitochondrial+number+and+function+in+equine+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).</li>
<li>Carnevale, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mare+model+for+follicular+maturation+and+reproductive+aging+in+the+woman%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman.</a> Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).</li>
<li>Ginther, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mare%3A+a+1000-pound+guinea+pig+for+study+of+the+ovulatory+follicular+wave+in+women%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women.</a> Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).</li>
<li>Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+weakened+centromere+cohesion+is+a+leading+cause+of+age-related+aneuploidy+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes.</a> Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).</li>
<li>Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+a+defective+spindle+assembly+checkpoint+is+not+the+primary+cause+of+maternal+age-associated+aneuploidy+in+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs.</a> Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).</li>
<li>Larionov, A., Krause, A., Miller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standard+curve+based+method+for+relative+real+time+PCR+data+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A standard curve based method for relative real time PCR data processing.</a> BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).</li>
<li>Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+of+equine+oocytes+collected+by+follicle+aspiration+and+by+the+slicing+of+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries.</a> Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inadequate+histone+deacetylation+during+oocyte+meiosis+causes+aneuploidy+and+embryo+death+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).</li>
<li>Homer, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad2+prevents+aneuploidy+and+premature+proteolysis+of+cyclin+B+and+securin+during+meiosis+I+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes.</a> Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).</li>
<li>Rambags, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Numerical+chromosomal+abnormalities+in+equine+embryos+produced+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro.</a> Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).</li>
<li>Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-mode+regulation+of+the+APC%2FC+by+CDK1+and+MAPK+controls+meiosis+I+progression+and+fidelity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity.</a> J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).</li>
<li>Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetochore+microtubule+establishment+is+defective+in+oocytes+from+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice.</a> Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).</li>
<li>Luzzo, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+diet+induced+developmental+defects+in+the+mouse%3A+oocyte+meiotic+aneuploidy+and+fetal+growth+retardation%2Fbrain+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects.</a> PLoS One. 7 (11), e49217(2012).</li>
<li>Ma, P., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+2+%28HDAC2%29+regulates+chromosome+segregation+and+kinetochore+function+via+H4K16+deacetylation+during+oocyte+maturation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003377(2013).</li>
<li>Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+hyperacetylation+during+meiosis+interferes+with+large-scale+chromatin+remodeling%2C+axial+chromatid+condensation+and+sister+chromatid+separation+in+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte.</a> Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).</li>
<li>Luciano, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocytes+isolated+from+dairy+cows+with+reduced+ovarian+reserve+have+a+high+frequency+of+aneuploidy+and+alterations+in+the+localization+of+progesterone+receptor+membrane+component+1+and+aurora+kinase+B%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B.</a> Biol Reprod. 88 (3), 58(2013).</li>
<li>Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone+receptor+membrane+component+1+expression+and+putative+function+in+bovine+oocyte+maturation%2C+fertilization%2C+and+early+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development.</a> Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).</li>
<li>Terzaghi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGRMC1+participates+in+late+events+of+bovine+granulosa+cells+mitosis+and+oocyte+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis.</a> Cell Cycle. , 1-14 (2016).</li>
<li>Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+in+the+mammalian+oocyte+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Translation in the mammalian oocyte in space and time.</a> Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).</li>
<li>Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+translation+reveals+a+critical+role+for+deleted+in+azoospermia-like+%28Dazl%29+at+the+oocyte-to-zygote+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition.</a> Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).</li>
<li>Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternally+recruited+DCP1A+and+DCP2+contribute+to+messenger+RNA+degradation+during+oocyte+maturation+and+genome+activation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse.</a> Biol Reprod. 88 (1), 11(2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Mimo że IVM jest wykonywany u koni od ponad 20lat16, nie wiemy jeszcze, czy oocyt może być źródłem aneuploidii embrionalnej, jak zaproponowano w przypadkuludzi17. Powodem jest prawdopodobnie to, że przygotowanie rozprzestrzeniania się oocytów do zliczania chromosomów powoduje znaczną utratę próbki. Mając to na uwadze, przeprowadzono przegląd metod stosowanych do badania błędów w segregacji chromosomów w celu znalezienia najodpowiedniejszej techniki do zastosowania w oocytac...

Do leczenia niepłodności u kobiet, zwierząt towarzyszących i gatunków zagrożonych opracowano szeroki wachlarz technik wspomaganego rozrodu. Jedną z najczęstszych procedur w warunkach klinicznych jest pobieranie oocytów w fazie metafazy II (MII) z pęcherzyków jajnikowych za pomocą aspiracji przezpochwowej pod kontrolą USG, pick-up komórek jajowych (OPU)1. Oocyty te są następnie zapładniane in vitro (IVF), a powstały zarodek (zarodki) zagnieżdża się w macicy biorcy. Oocyty w stadium MII (dojrzałe) są pobierane po podaniu egzogennych gonadotropin. Jednak u niektórych pacjentek leczenie to wiąże się z rozwojem zespołu hiperstymulacji jajników (OHSS)2.
Korzystając z wewnętrznej zdolności w pełni rozwiniętych, niedojrzałych oocytów (stadium GV) do spontanicznego wznowienia mejozy po wyizolowaniu z ich pęcherzyków, możliwe jest uzyskanie dojrzałych oocytów bez podawania gonadotropiny3. Procedura ta nazywa się dojrzewaniem komórek jajowych in vitro (IVM) i stanowi mniej zorientowane na leki, tańsze i bardziej przyjazne dla pacjenta podejście do technologii wspomaganego rozrodu. Jednak powodzenie rozwoju zarodka z oocytami dojrzałymi in vitro jest na ogół niższe niż z oocytami dojrzałymi in vivo4,5. Możliwym wyjaśnieniem jest to, że oocyty dojrzałe in vitro są bardziej podatne na błędy w segregacji chromosomów, a wynikająca z tego aneuploidia upośledza normalny rozwój embrionalny6.
Zrozumienie molekularnych podstaw błędnej segregacji chromosomów podczas IVM ostatecznie ujawniłoby pełny potencjał tej techniki. W tym duchu opisano tutaj eksperymentalne podejście stosowane do badania cech morfologicznych i biochemicznych oocytów dojrzałych in vitro, w porównaniu z oocytami dojrzałymi in vivo7,8. W szczególności przedstawiono procedury OPU niedojrzałych i dojrzałych oocytów oraz IVM niedojrzałych oocytów na przykładzie dorosłych i naturalnie jeżdżących koni jako modelu eksperymentalnego. Następnie wykorzystuje się immunofluorescencję i analizę obrazu do zbadania segregacji chromosomów, morfologii wrzeciona i globalnego wzorca acetylacji histonów na tych gametach. Na koniec opisano protokół odwrotnej transkrypcji i ilościowego PCR do analizy ekspresji mRNA.
W porównaniu z modelami zwierzęcymi gryzoni, konie nie pozwalają na manipulację genetyczną, są łatwiejsze do manipulowania i wymagają kosztownej konserwacji. Jednak model ten zyskuje duże zainteresowanie w badaniach nad dojrzewaniem oocytów9,10 ze względu na podobieństwo do fizjologii jajników u człowieka11,12. Co więcej, opracowanie wiarygodnych protokołów IVM-IVF u koni ma istotny interes ekonomiczny, ponieważ pozwoliłoby na zwiększenie liczby źrebiąt od klaczy o wysokiej wartości genetycznej.
Jednym z ograniczeń przeprowadzania eksperymentów na oocytach, zwłaszcza u gatunków jednoowulacyjnych, jest ograniczona dostępność próbek. Ograniczenie to zostało tutaj przezwyciężone poprzez dostosowanie podejścia, wcześniej opracowanego u myszy, do oocytów koni 13,14 w celu przeprowadzenia zliczania chromosomów, które minimalizuje utratę próbki (zobacz dyskusję w celu porównania z innymi dostępnymi technikami). Co więcej, protokół barwienia potrójnej fluorescencji został zoptymalizowany do przeprowadzania wielu analiz na tej samej próbce, a analizy q-PCR przeprowadzono tylko na pulach 2 oocytów.
Ogólnie rzecz biorąc, niniejsze badanie opisuje eksperymentalne podejście mające na celu morfologiczne i biochemiczne scharakteryzowanie oocytu konia, typu komórki, który jest niezwykle trudny do zbadania ze względu na niską dostępność próbek. Może jednak poszerzyć naszą wiedzę na temat biologii rozrodu i niepłodności gatunków jednoowulacyjnych.

<table><tbody><tr><td>sonda ultradźwiękowa</td><td>Aloka</td><td>UST-5820-7,5</td><td></td></tr><tr><td>ludzka gonadotropina kosmówkowa</td><td>centravet</td><td>CHO004</td><td>1,500 jednostka/zwierzę IV</td></tr><tr><td>detomidine</td><td>centravet</td><td>MED010</td><td>9 - 15 &mikro; g/kg IV</td></tr><tr><td>butylskopolamina bromure</td><td>centravet</td><td>EST001</td><td>0,2 mg/kg IV</td></tr><tr><td>stereoskop</td><td>NIKON</td><td>SMZ-2B</td><td></td></tr><tr><td>butorfanol</td><td>centravet</td><td>DOL003</td><td>10&micro; g/kg IV</td></tr><tr><td>centravet</td><td>benzylowo-penicylinowy</td><td>DEP203 IM</td><td>15 000 UI/zwierzę</td></tr><tr><td>TCM199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3769 10X1L</td><td>proszek do buforowania hepes TCM199</td></tr><tr><td>Hepes sól sodowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784-100G</td><td></td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>heparyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3-buforowany TCM199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2154-500ML</td><td>płyn do średniego</td></tr><tr><td>naskórkowego czynnika wzrostu</td> IVM <td>Sigma-Aldrich</td><td>E4127</td><td></td></tr><tr><td>surowica dla nowonarodzonych cieląt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4762-500ML</td><td></td></tr><tr><td>4-dołkowe naczynia</td><td>Inkubator 144444</td><td></td><td></td>NUNCLON</tr><tr><td></td><td>Heraeus</td><td>BB6060</td><td></td></tr><tr><td>monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td></td></tr><tr><td>hialuronidaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>pronaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>alkohol poliwinylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>normalna surowica osła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>królik anty-Aurora B fosfo-Thr232</td><td>BioLegend</td><td>636102</td><td></td></tr><tr><td>TRITC-sprzężony z osłem anty-króliczym IgG</td><td>Vector Laboratories</td><td>711-025-152</td><td></td></tr><tr><td>Vecta-Shield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>YOPRO1</td><td>Thermofisher Naukowy</td> konfokalny laserowy mikroskop skaningowy <td>Y3603</td><td></td></tr><tr><td></td><td>LSM 780</td> Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy <td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td></td><td>LSM 700</td> oprogramowanie <td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>rsb.info. nih.gov/ij/download.html</td><td>darmowy zasób</td><td></td></tr><tr><td>mysz anty-alfa-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8203</td><td></td></tr><tr><td>królik anty-acH4K16</td><td>Upstate Biotechnologia</td><td>07-329</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 488-konimugowany osł anty-mysi IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenyloindol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Wirówka DAPI</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNALater</td><td>Invitrogen</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>Lucyferazy RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji RNA PicoPure</td><td>Applied Biosystems</td><td>12204-01</td><td></td></tr><tr><td>heksamery losowe</td><td>Thermofisher Scientific N8080127</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mysi Wirus białaczki Moloneya odwrotna transkryptaza</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28025013</td><td></td></tr><tr><td>SYBR zielony supermix</td><td>Startery specyficzne dla 1708880</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BioRad Sigma-Aldrich</td><td></td><td>specyficzne startery zostały zaprojektowane przy użyciu oprogramowania Primer3Plus (darmowy zasób)</td></tr><tr><td>cykler termiczny</td><td>Mysz</td>, mysz BioRad <td>MyiQ</td><td></td></tr>, <tr><td>monoklonalna anty-CENPA</td><td>Abcam</td><td>ab13939</td><td></td></tr>, <tr><td>mysi monoklonalny anty-Aurora B</td><td>Abcam</td><td>ab3609</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza segregacji chromosomów, acetylacji histonów i morfologii wrzeciona w oocytach koni

Analysis of Chromosome Segregation, Histone Acetylation, and Spindle Morphology in Horse Oocytes

Dziedzina wspomaganego rozrodu została opracowana w celu leczenia niepłodności u kobiet, zwierząt towarzyszących i zagrożonych gatunków. U koni rozród wspomagany pozwala również na produkcję zarodków od klaczy o wysokich osiągach bez przerywania ich kariery sportowej i przyczynia się do wzrostu liczby źrebiąt od klaczy o wysokiej wartości genetycznej. W niniejszej pracy opisano procedury stosowane do pobierania niedojrzałych i dojrzałych komórek jajowych z jajników koni za pomocą pobierania komórek jajowych (OPU). Oocyty te wykorzystano następnie do zbadania częstości występowania aneuploidii poprzez dostosowanie protokołu opracowanego wcześniej u myszy. W szczególności chromosomy i centromery oocytów metafazy II (MII) znakowano fluorescencyjnie i zliczono na sekwencyjnych planach ogniskowych po skanowaniu konfokalnym mikroskopem laserowym. Analiza ta wykazała większą częstość występowania aneuploidii, gdy niedojrzałe oocyty zostały pobrane z pęcherzyków i dojrzewały in vitro w porównaniu z in vivo. Barwienie immunologiczne tubuliny i acetylowanej formy histonu czwartego przy specyficznych resztach lizyny ujawniło również różnice w morfologii wrzeciona mejotycznego i w globalnym wzorcu acetylacji histonów. Wreszcie, ekspresję mRNA kodujących deacetylazy histonowe (HDAC) i acetylotransferazy (HAT) badano za pomocą odwrotnej transkrypcji i ilościowego PCR (q-PCR). Nie zaobserwowano różnic we względnej ekspresji transkryptów między oocytami dojrzałymi in vitro i in vivo. Zgodnie z ogólnym wyciszeniem aktywności transkrypcyjnej podczas dojrzewania oocytów, analiza całkowitej ilości transkryptu może ujawnić jedynie stabilność lub degradację mRNA. W związku z tym wyniki te wskazują, że może to mieć wpływ na inne regulacje translacyjne i potranslacyjne.
Ogólnie rzecz biorąc, niniejsze badanie opisuje eksperymentalne podejście do morfologicznego i biochemicznego charakterystyki oocytu konia, typu komórki, który jest niezwykle trudny do zbadania ze względu na niską dostępność próbek. Może jednak poszerzyć naszą wiedzę na temat biologii rozrodu i niepłodności u gatunków jednoowulacyjnych.

Pierwotne wyniki tych eksperymentów zostały wcześniej szczegółowo opisane7 i są tutaj przedstawione jako przykład rezultatów, jakie można uzyskać przy zastosowaniu opisanych protokołów.
Szybkość dojrzewania
Z 32 kompleksów cumulus-oocyta (COC) pobranych podczas OPU z pęcherzyków dominujących, 28 (88%) znajdowało się w stadium MII. Czternaście z 58 ...

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalne podejście do morfologicznego i biochemicznego charakterystyki oocytów koni. W szczególności niniejsza praca ilustruje, w jaki sposób zbierać niedojrzałe i dojrzałe oocyty koni za pomocą ultrasonograficznego pobierania komórek jajowych (OPU) oraz jak badać segregację chromosomów, morfologię wrzeciona, globalną acetylację histonów i ekspresję mRNA.

Analiza segregacji chromosomów, acetylacji histonów i morfologii wrzeciona w oocytach koni

The field of assisted reproduction has been developed to treat infertility in women, companion animals, and endangered species. In the horse, assisted ...

Ogólnymi celami tego podejścia eksperymentalnego są, po pierwsze, morfologiczna i biochemiczna charakterystyka oocytów konia, a po drugie, porównanie gamet pochodzących od tego samego zwierzęcia, które były przetwarzane in vitro lub in vivo. To podejście eksperymentalne może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii oocytów i płodności u gatunków monovulacyjnych. Może ono również poprawić bezpieczeństwo procedur manipulacji gametami.Podejście to opracowano, aby przezwyciężyć ograniczoną dostępność próbek oocytów, szczególnie u gatunków monowulacyjnych. Procedury OPU zaprezentują profesor Stefan Deleuze z Uniwersytetu w Liège, Cecile Douet, kierownik mojego laboratorium oraz Fabrice Reigner, kierownik jednostki koni w centrum INRA Val de Loire. Codziennie oceniaj średnicę pęcherzyków jajnikowych w kohorcie dorosłych klaczy za pomocą badania ultrasonograficznego.Wyszukaj duży pęcherzyk o średnicy przekraczającej 33 mm. Po jego odnalezieniu przygotuj dawkę 1 500 jednostek gonadotropiny kosmórkowej człowieka w celu indukcji dojrzewania oocytu w pęcherzyku dominującym. Następnie zlokalizuj bruzdę szyjną i przemyj miejsce wstrzyknięcia alkoholem.Następnie, aby uwypuklić żyłę, wywrzyj lekki nacisk dwa lub trzy centymetry poniżej miejsca wstrzyknięcia. Wprowadź igłę niemal równolegle do szyi, wykonaj lekką aspirację, aby upewnić się, że igła znajduje się w żyle, a następnie wstrzyknij hormon. Przygotuj głowicę ultradźwiękową do dostępu dopochwowego.Następnie podłącz igłę do systemu ssącego. 35 godzin po wstrzyknięciu hCG przygotuj instrumentarium do OPU i podaj klaczy środek uspokajający. Odpowiednia analgezja jest niezwykle ważna dla bezpieczeństwa zwierzęcia i operatora.Zwierzę, które nie odczuwa bólu ani dyskomfortu, pozwoli na manipulację jajnikiem, co ułatwi wykonywanie nakłuć i płukań. Po wprowadzeniu igły badawczej jeden operator musi manipulować jajnikiem tak, aby był on skierowany w stronę sondy, podczas gdy drugi operator operuje igłą. Zlokalizuj pęcherzyk dominujący na obrazie echograficznym.Następnie za pomocą igły przebij ścianę pochwy oraz ścianę pęcherzyka dominującego. Po uzyskaniu dostępu do wnętrza pęcherzyka, odessać płyn pęcherzykowy. Obracać igłą, aby zeskrobać ścianę pęcherzyka i pobrać kompleks cumulus-oocyt.Następnie przelej ciecz do dużej szalki Petriego. Pod stereoskopem wyszukaj kompleks oocyt-cumulus (COC). W międzyczasie przepłucz pęcherzyk ciepłym roztworem PBS modyfikowanym przez Dulbecco zawierającym heparynę.Zebranie COC może wymagać kilkukrotnego przepłukania. Po odnalezieniu COC należy zmienić igłę na igłę dwulumenową i pobrać niedojrzałe COC ze wszystkich pęcherzyków o średnicy od 5 do 25 mm. Zostaną one wykorzystane do dojrzewania in vitro.Po aspiracji wszystkich pęcherzyków z jednego jajnika, powtórz te same procedury w celu zebrania niedojrzałych kompleksów oocyt-cumulus (COC) z drugiego jajnika. Następnie dokonaj selekcji COC. Zachowaj tylko te kompleksy, które posiadają kilka pełnych warstw komórek cumulus oraz brązową, drobnoziarnistą ooplasmę.Pozostałe należy odrzucić. Na koniec procedury wstrzyknąć klaczy 15 000 jednostek benzylpenicyliny w celu zapobiegania infekcji. Następnie umieścić klacz w cichej, czystej stajni na co najmniej dwie godziny, aby mogła dojść do siebie.Przed rozpoczęciem OPU należy ogrzać butelkę uzupełnionego TCM-199 buforowanego HEPES do 37°C. Następnie należy przygotować medium do IVM. Do dołków płytki czterodołkowej należy nalać po 500 µL uzupełnionego TCM-199 buforowanego wodorowęglanem sodu.Następnie inkubuj szalkę w temperaturze 38,5 °C przez co najmniej dwie godziny. Przenieś odzyskane niedojrzałe kompleksy cumulus-oocyt (COCs) do szalki o średnicy 3,5 cm wypełnionej 2 ml podgrzanego medium HEPES TCM-199. Przesuwaj COCs po różnych obszarach szalki, aby delikatnie wypłukać otaczające je zanieczyszczenia.Następnie przenieś COC do medium do IVM i inkubuj je przez 28 godzin w temperaturze 38,5 °C. Aby przeprowadzić liczenie chromosomów w dojrzałych COC, inkubuj je w 100 µM monastrolu przez godzinę w temperaturze 38,5 °C. Następnie usuń komórki cumulus poprzez potraktowanie COC 0,5% hialuronidazy w TCM-199 buforowanym HEPES.Monitoruj tę reakcję na podgrzewanym stoliku ustawionym na 38 °C. Po około pięciu minutach usuń wszystkie komórki. Użyj delikatnego pipetowania, aby usunąć ostatnie, trudne do usunięcia komórki.Następnie usuń błonę przejrzystą (zona pellucida), stosując 0,2% pronazy w TCM-199 buforowanym HEPES. Tę reakcję należy również monitorować na podgrzewanym stoliku. Powinna ona trwać około pięciu minut.Następnie utrwal oocyty w 4%paraformaldehydzie w DPBS przez 15 minut w temperaturze 38,5 °C, a następnie przez kolejne 45 minut w temperaturze 4 °C. Po utrwaleniu przemyj oocyty, przenosząc je sekwencyjnie między trzema dołkami zawierającymi 0,1%alkoholu poliwinylowego w DPBS. Użyj około 0,5 ml roztworu na każdy dołek.Następnie przenieś oocyty do dołka wypełnionego 0,3% Triton X-100 w PBS i inkubuj je przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby zablokować nieswoiste sygnały, zanurz komórki w DPBS z 1% BSA i 10% normalnym surowicą osła. Inkubuj komórki przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.Po 30 minutach należy nanieść przeciwciało pierwszorzędowe, a następnie inkubować komórki w temperaturze 4°C przez noc. Następnego dnia należy przemyć oocyty i nanieść przeciwciało drugorzędowe na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, chroniąc próbki przed światłem. Po naniesieniu przeciwciała drugorzędowego oocyty należy ponownie przemyć.Następnie, przed montowaniem, przykleić do szkiełek paski dwustronnej taśmy, które będą służyć jako podpory dla szkiełek nakrywek. Teraz zamontować oocyty, po trzy do czterech na szkiełko, w kropli nieutwardzającego medium montażowego z dodatkiem środka zapobiegającego blaknięciu (antifade), uzupełnionego o 20 $\mu$M YO-PRO-1. Pozostawić oocyty na około 10 minut, a następnie nałożyć szkiełka nakrywkowe.Z 32 kompleksów cumulus-oocyt (COC) pobranych metodą OPU z mieszków dominujących, 28 znajdowało się w metafazie II. Dzięki dojrzewaniu in vitro, 37 z 44 kompleksów COC pobranych z mieszków niedominujących dojrzało do metafazy II. Następnie porównano chromosomy obu grup. Oocyty dojrzałe in vitro często wykazywały aneuploidię, najczęściej hiperploidię. Zjawisko to nie zaobserwowano w przypadku oocytów dojrzałych in vivo.Następnie zmierzono długość wrzeciona od bieguna do bieguna oraz jego maksymalną średnicę. Oocyty dojrzewające in vitro były istotnie dłuższe i szersze niż oocyty dojrzewające in vivo. W tych samych próbkach zmierzono ogólny poziom acetylacji H4K16.Wyniki były zgodne z oczekiwaniami. Acetylacja H4K16 była znacznie niższa w oocytach dojrzewających in vitro niż w oocytach dojrzewających in vivo. Dobrze przeszkolony zespół jest w stanie opracować pięć klaczy podczas porannego zabiegu OPU, osiągając 80% wskaźnik pozyskiwania oocytów przedowulacyjnych oraz od 50 do 60% pozyskiwania oocytów niedojrzałych.Podczas zabiegu OPU należy stale monitorować stan i dobrostan zwierzęcia oraz być przygotowanym do zapewnienia odpowiedniej opieki weterynaryjnej w razie potrzeby. Podejście eksperymentalne można zastosować również do oocytów innych gatunków i jest ono szczególnie przydatne w przypadkach ograniczonej dostępności próbek, na przykład u ludzi. W oparciu o nasze wyniki należy przeprowadzić badania w celu lepszego zrozumienia warunków hodowli niezbędnych do prawidłowej segregacji chromosomów i zmian epigenetycznych.Nadrzędnym celem jest zwiększenie wydajności dojrzewania in vitro zarówno w medycynie weterynaryjnej, jak i w leczeniu niepłodności u ludzi.

analysis-chromosome-segregation-histone-acetylation-spindle

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Tutaj prezentujemy protokół specyficznego zubożenia mRNA za pośrednictwem siRNA, a następnie analizę immunofluorescencyjną w celu oceny montażu i organizacji wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy. Protokół ten jest odpowiedni do in vitro zubożenia transkryptów i oceny funkcjonalnej różnych czynników wrzecionowych i/lub MTOC w oocytach.

Ocena wrzeciona mejotycznego w oocytach myszy za pomocą wyciszania za pośrednictwem siRNA

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki oocytów antralnych myszy na podstawie organizacji jąder.

Izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

Ten manuskrypt przedstawia szczegółową metodę generowania sond ramienia chromosomu X i przeprowadzania fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu zbadania stanu kohezji chromatydy siostrzanej w oocytach Drosophila zatrzymanych w prometafazie i metafazie I. Protokół ten jest odpowiedni do określenia, czy spójność ramienia mejotycznego jest nienaruszona, czy zakłócona w różnych genotypach.

Wykorzystanie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) do monitorowania stanu kohezji ramienia w oocytach prometafazy i metafazy I drosophila

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Przedstawiamy zarys protokołu klinicznego do nieinwazyjnej oceny dojrzałości ludzkiego jaja za pomocą mikroskopii światła spolaryzowanego.

Ocena dojrzałości ludzkich komórek jajowych i jej zastosowanie kliniczne

Przedstawiono zoptymalizowany protokół, który umożliwia wyczerpanie cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy podczas metafazy I za pomocą lasera femtosekundowego bliskiej podczerwieni.

Wielofotonowa ablacja laserowa cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

Poznaj metody analizy segregacji chromosomów, acetylacji histonów i morfologii wrzeciona w oocytach koni. Technika OPU umożliwia bezpieczne pobieranie gamet od klaczy do badań płodności.

Analiza segregacji chromosomów, acetylacji histonów i morfologii wrzeciona w oocytach koni

Przeglądaj więcej filmów