Analiza segregacji chromosomów, acetylacji histonów i morfologii wrzeciona w oocytach koni
11 maja 2017
Ten manuskrypt opisuje eksperymentalne podejście do morfologicznego i biochemicznego charakterystyki oocytów koni. W szczególności niniejsza praca ilustruje, w jaki sposób zbierać niedojrzałe i dojrzałe oocyty koni za pomocą ultrasonograficznego pobierania komórek jajowych (OPU) oraz jak badać segregację chromosomów, morfologię wrzeciona, globalną acetylację histonów i ekspresję mRNA.
Ogólnym celem tego eksperymentalnego podejścia jest, po pierwsze, morfologiczne i biochemiczne scharakteryzowanie oocytów koni, a po drugie, porównanie gamet pochodzących od tego samego zwierzęcia, które były przetwarzane in vitro lub in vivo. To eksperymentalne podejście może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biologii oocytów i płodności u gatunków jednoowulacyjnych. Może również poprawić bezpieczeństwo procedur manipulacji gametami.
Podejście to zostało opracowane w celu przezwyciężenia ograniczonej dostępności próbek oocytów, zwłaszcza z gatunków jednoowulacyjnych. Procedury OPU zademonstrują profesor Stefan Deleuze z Uniwersytetu w Liège, Cecile Douet, kierownik laboratorium w moim laboratorium oraz Fabrice Reigner, kierownik oddziału koni w INRA Centre Val de Loire. Codziennie oceniaj średnicę pęcherzyków jajnikowych w kohorcie dorosłych klaczy za pomocą ultradźwięków.
Poszukaj dużego pęcherzyka o średnicy większej niż 33 milimetry. Po znalezieniu przygotuj się do wstrzyknięcia 1 500 jednostek ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej, aby wywołać dojrzewanie oocytu do pęcherzyka dominującego. Następnie zlokalizuj bruzdę szyjną i przetrzyj miejsce wstrzyknięcia alkoholem.
Następnie, aby żyła się uniosła, przyłóż trochę siły dwa lub trzy centymetry poniżej miejsca wstrzyknięcia. Wbić igłę prawie równolegle do szyi, lekko zassać, aby upewnić się, że igła znajduje się w żyle, i wstrzyknąć hormon. Przygotuj sondę ultradźwiękową do dostępu do pochwy.
Następnie podłącz igłę do systemu ssącego. 35 godzin po wstrzyknięciu hCG ustaw oprzyrządowanie do OPU i uspokaj klacz. Dobra analgezja jest niezwykle ważna dla bezpieczeństwa zwierzęcia i operatora.
Zwierzę, które nie odczuwa bólu ani dyskomfortu, pozwoli na manipulację jajnikiem, ułatwiając wykonywanie nakłuć i uderzeń gorąca. Po wprowadzeniu sondy igłowej jeden operator musi manipulować jajnikiem tak, aby był skierowany w stronę sondy, podczas gdy drugi operator manipuluje igłą. Zlokalizuj dominujący pęcherzyk na obrazie echograficznym.
Następnie za pomocą igły przebij ścianę pochwy i ścianę mieszka dominującego. Po uzyskaniu dostępu do przestrzeni mieszków włosowych odessać płyn pęcherzykowy. Obróć igłę, aby zeskrobać ścianę pęcherzyka i przymocować kompleks wzgórek-oocyt.
Następnie wlej płyn do dużej szalki Petriego. I pod stereoskopem poszukaj COC. W międzyczasie wypłucz mieszek włosowy ciepłym zmodyfikowanym PBS firmy Dulbecco zawierającym heparynę.
Zebranie COC może zająć kilka spłukiwań. Po znalezieniu COC zmień igłę na igłę o podwójnym przeźrnicy i zbierz niedojrzałe COC ze wszystkich mieszków włosowych o średnicy od pięciu do 25 milimetrów. Zostaną one wykorzystane do dojrzewania in vitro.
Gdy wszystkie pęcherzyki z jednego jajnika zostaną odessane, powtórz te same procedury, aby pobrać niedojrzałe COC z drugiego jajnika. Teraz wybierz między COC. Trzymaj tylko COC z kilkoma pełnymi warstwami komórek wzgórka i brązową, drobnoziarnistą ooplazmą.
Odrzuć pozostałe. Pod koniec zabiegu wstrzyknij klaczy 15 000 jednostek penicyliny benzylowej, aby zapobiec infekcji. Następnie umieść klacz w cichej, czystej stajni przez co najmniej dwie godziny, podczas gdy dochodziła do siebie.
Przed rozpoczęciem OPU podgrzej butelkę uzupełnionego buforem HEPS TCM-199 do 37 stopni Celsjusza. Następnie przygotuj pożywkę IVM. Dozuj 500 mikrolitrów uzupełnionego wodorowęglanu sodu TCM-199 do studzienek naczynia czterodołkowego.
Następnie inkubuj naczynie w temperaturze 38,5 stopni Celsjusza przez co najmniej dwie godziny. Przenieś odzyskane niedojrzałe COC do 3,5-centymetrowego naczynia wypełnionego dwoma mililitrami podgrzanego HEPES TCM-199. Przesuwaj COC przez różne obszary naczynia, aby delikatnie zmyć otaczające zanieczyszczenia.
Teraz przenieś COC na pożywkę IVM i inkubuj je przez 28 godzin w temperaturze 38,5 stopni Celsjusza. Aby wykonać liczenie chromosomów na dojrzałych COC, inkubuj je w 100-mikromolowym monoastrolu przez godzinę w temperaturze 38,5 stopni Celsjusza. Następnie usuń komórki wzgórka, traktując COC 0,5% hialuronidazą w buforowanym przez HEPS TCM-199.
Monitoruj tę reakcję na podgrzewanym stoliku ustawionym na 38 stopni Celsjusza. W ciągu około pięciu minut usuń wszystkie komórki. Użyj delikatnego pipetowania, aby usunąć kilka ostatnich uporczywych komórek.
Następnie usuń osłonkę przejrzystą za pomocą 0,2% pronazy w buforowanym HEPS TCM-199. Monitoruj tę reakcję również na podgrzanym scenie. Powinno to zająć około pięciu minut.
Następnie utrwal oocyty w 4% paraformaldehydzie w DPBS przez 15 minut w temperaturze 38,5 stopni Celsjusza, a następnie przez kolejne 45 minut utrwalaj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po utrwaleniu umyj oocyty, przenosząc je kolejno między trzema studzienkami 0,1% alkoholu poliwinylowego w DPBS. Użyj około pół mililitra roztworu na studzienkę.
Następnie przenieś oocyty do studzienki wypełnionej 0,3% Triton X-100 w PBS i pozwól im inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Aby zablokować niespecyficzne sygnały, zanurz komórki w DPBS z 1% BSA i 10% normalną surowicą osła. Inkubować komórki przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
Po 30 minutach nałóż przeciwciało pierwszorzędowe, a następnie inkubuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia umyj oocyty i stosuj przeciwciało drugorzędowe przez godzinę w temperaturze pokojowej, chronione przed ekspozycją na światło. Po nałożeniu wtórnego ponownie umyj oocyty.
Następnie, przed montażem, przymocuj dwustronne paski taśmy do prowadnic, aby służyły jako podpory szkiełka nakrywkowego. Teraz zamontuj oocyty po trzy do czterech na szkiełko w kropli nietwardniejącego, zapobiegającego blaknięciu podłoża uzupełnionego 20 mikromolami YO-PRO-1. Pozwól oocytom osiąść przez około 10 minut, a następnie nałóż szkiełka nakrywkowe.
Spośród 32 COC pobranych przez OPU z pęcherzyków dominujących, 28 znajdowało się w metafazie II.Stosując dojrzewanie in vitro, 37 z 44 COC pobranych z pęcherzyków niedominujących dojrzało do metafazy II. Następnie porównano chromosomy obu grup. Oocyty dojrzałe in vitro były często dotknięte aneuploidią, głównie hiperploidią. Nie zaobserwowano tego w oocytach dojrzałych in vivo.
Następnie zmierzono długość wrzeciona od bieguna do bieguna oraz średnicę wrzeciona w momencie maksymalnym. Oocyty dojrzałe in vitro były znacznie dłuższe i szersze niż oocyty dojrzałe in vivo. W tych samych próbkach zmierzono globalny poziom acetylacji H4K16.
Wyniki były zgodne z oczekiwaniami. Acetylacja H4K16 była istotnie niższa w oocytach dojrzałych in vitro niż w oocytach dojrzałych in vivo. Dobrze wyszkolony zespół może przetworzyć pięć klaczy w ciągu jednego ranka OPU z 80% wskaźnikiem pobierania oocytów przedowulacyjnych i 50 do 60% pobierania niedojrzałych oocytów.
Podczas OPU należy zawsze monitorować stan zdrowia i samopoczucie zwierzęcia oraz być gotowym do zapewnienia odpowiedniej opieki weterynaryjnej w razie potrzeby. Podejście eksperymentalne może być również stosowane do oocytów innych gatunków i ma szczególne zastosowanie tam, gdzie dostępność próbek jest problemem, na przykład w przypadku ludzi. Na podstawie naszych wyników należy podjąć badania, aby lepiej zrozumieć warunki hodowli potrzebne do prawidłowej segregacji chromosomów i zmian epigenetycznych.
Nadrzędnym celem jest poprawa efektywności dojrzewania in vitro zarówno w medycynie weterynaryjnej, jak i w leczeniu niepłodności u ludzi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia eksperymentalne podejście do morfologicznej i biochemicznej charakterystyki oocytów konia. Szczegółowo opisano proces pozyskiwania niedojrzałych i dojrzałych oocytów konia za pomocą metody aspiracji pęcherzyków jajowych (OPU) pod kontrolą ultradźwięków oraz przeanalizowano segregację chromosomów, morfologię wrzeciona kariokinetycznego, globalną acetylację histonów oraz ekspresję mRNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia oocytów
- Płodność u gatunków monowulacyjnych
- Procedury manipulacji gametami
Wprowadzenie
- Zrozumienie charakterystyki oocytów jest kluczowe dla badań nad płodnością.
- Gatunki monowulacyjne charakteryzują się ograniczoną dostępnością oocytów.
- OPU pod kontrolą ultradźwięków może usprawnić pobieranie próbek.
- Niezbędna jest analiza porównawcza gamet przetwarzanych in vitro oraz in vivo.
Cel badania
- Charakteryzacja morfologiczna i biochemiczna oocytów konia.
- Porównanie gamet pochodzących od tego samego zwierzęcia, przetwarzanych w różnych środowiskach.
- Poprawa bezpieczeństwa procedur manipulacji gametami.
Zastosowane metody
- Pobieranie oocytów (OPU) pod kontrolą USG.
- Ocena średnicy pęcherzyków jajnikowych u dorosłych klaczy.
- Badanie segregacji chromosomów i morfologii wrzeciona podziałowego.
- Analiza globalnej acetylacji histonów i ekspresji mRNA.
Główne wyniki
- Skuteczne pobranie niedojrzałych i dojrzałych oocytów końskich.
- Wnioski dotyczące segregacji chromosomów i morfologii wrzeciona.
- Dane dotyczące globalnych poziomów acetylacji histonów.
- Ustalono profile ekspresji odpowiednich mRNA.
Wnioski
- Badanie dostarcza podstaw do charakterystyki oocytów u koni.
- Wyniki mogą poszerzyć wiedzę na temat płodności u gatunków monovulacyjnych.
- Techniki OPU mogą zwiększyć bezpieczeństwo manipulacji gametami.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Charakterystyka biologii oocytów u gatunków monowulacyjnych pozwala rozwiązać krytyczny problem w badaniach i rozwoju nad rozprodukcją, gdzie ograniczona dostępność próbek utrudnia badania mechanistyczne. Podejście to umożliwia analizę porównawczą efektów dojrzewania in vitro i in vivo w odniesieniu do integralności chromosomowej i regulacji epigenetycznej, dostarczając przewidywalnych informacji niezbędnych do optymalizacji warunków hodowli. Takie dane wspierają ograniczanie ryzyka w technologiach wspomaganego rozrodu poprzez identyfikację aneuploidii i wad wrzeciona indukowanych przez hodowlę przed ich wdrożeniem do praktyki klinicznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie mechanizmów wierności mejozy poprzez kwantyfikację częstości występowania aneuploidii jako funkcjonalnego odczytu zdolności do segregacji chromosomów.
- Wartość naukowa: Profilowanie acetylacji histonów (H4K16) wiąże stan epigenetyczny z morfologią wrzeciona, co wspiera walidację celów dla szlaków HDAC/HAT w dojrzewaniu oocytów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowany schemat cytologiczny do oceny parametrów jakości oocytów, stosowalny u gatunków z ograniczonym dostępem do oocytów.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Ilościowa morfometria chromosomów i wrzecion dostarcza obiektywnych i powtarzalnych wskaźników do oceny warunków hodowli dojrzewania.
- Wartość operacyjna: Protokoły immunobarwienia tubuliny i acetylowanych histonów umożliwiają stworzenie przenośnych testów do wysokoprzepustowego przesiewu modyfikatorów epigenetycznych.
- Wartość naukowa: Analiza stabilności mRNA za pomocą qPCR w warunkach wyciszenia transkrypcyjnego dostarcza informacji niezbędnych do identyfikacji celów regulacji potranskrypcyjnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Bezpośrednie porównanie oocytów dojrzewających in vitro i in vivo pochodzących z jednego zwierzęcia pozwala wyodrębnić efekty specyficzne dla hodowli, co zwiększa istotność translacyjną modeli przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Ustanawia referencyjne wymiary wrzeciona oraz progi acetylacji dla definiowania fizjologicznych stanów dojrzewania u gatunków z ograniczeniami monowulacyjnymi.
- Wartość naukowa: Zbiory danych dotyczących modyfikacji histonów wspierają odkrywanie biomarkerów służących do przewidywania kompetencji oocytów w procedurach wspomaganej prokreacji.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w fazę biologii odkrywczej, w której mechanistyczne wglądy w jakość gamet służą do walidacji celów terapeutycznych na etapie wstępnym oraz do opracowywania testów analitycznych na etapie końcowym w celu stworzenia leków stosowanych w terapeutyce rozrodu.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących indukowanej hodowlą dysregulacji epigenetycznej oraz jej wpływu na wierność segregacji chromosomowej.
- Przesiewanie: Dostarcza standaryzowane, ilościowe wyniki (liczba chromosomów, morfometria wrzecion, poziomy acetylacji) do oceny wpływu związków lub warunków na dojrzewanie oocytów.
- Analityka: Generuje mierzalne dane wyjściowe (częstość aneuploidii, intensywność H4K16, wymiary wrzecion), które umożliwiają statystyczne porównanie grup eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane in vitro z punktami odniesienia in vivo, redukując ryzyko błędnej ekstrapolacji gatunkowej podczas opracowywania przedklinicznych modeli płodności.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Protokoły OPU i fiksacji tworzą wielokrotnego użytku platformę charakterystyki oocytów, którą można zastosować u innych gatunków monowulacyjnych z ograniczoną dostępnością próbek.
Wpływ operacyjny i korporacyjny
- Wartość naukowa: Przewidywalna pewność co do bezpieczeństwa protokołu dojrzewania dzięki bezpośredniemu powiązaniu warunków hodowli z wskaźnikami integralności epigenetycznej i chromosomalnej.
- Wartość operacyjna: Zstandaryzowane przepływy pracy w zakresie pobierania i przetwarzania oocytów poprawiają powtarzalność wyników pomiędzy laboratoriami i gatunkami.
- Wartość strategiczna: Wczesne wykrywanie defektów meiotycznych indukowanych przez hodowlę zmniejsza ryzyko niepowodzeń na późnych etapach rozwoju technologii wspomaganego rozrodu.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja formulacji mediów do dojrzewania w oparciu o dane dotyczące progów aneuploidii i prawidłowości wrzeciona.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w obchodzeniu się z oocytami, mikromanipulacji oraz mikroskopii fluorescencyjnej w celu dokładnej analizy chromosomów i wrzecion.
- Konfokalna mikroskopia skaningowa oraz systemy z podgrzewanym stolikiem są niezbędne do fiksacji rozdzielonej w czasie oraz obrazowania struktur meiotycznych.
- Międzylaboratoryjna standaryzacja walidacji przeciwciał (tubulina, H4K16ac) oraz protokołów montowania zapewnia porównywalne wyniki ilościowe.
- Adaptacja do różnych gatunków wymaga optymalizacji progów wielkości pęcherzyków OPU oraz dawkowania hormonów w oparciu o fizjologię rozrodczą.
- Ograniczenia obejmują niską wydajność oocytów na sesję oraz brak możliwości oceny aktywności transkrypcyjnej ze względu na globalne wyciszanie podczas dojrzewania, co przesuwa punkt ciężkości na regulację potranskrypcyjną.
