Name: Znakowanie mysich limfocytów za pomocą receptora przeciwciał Cu 64w celu transportu komórek in vivo za pomocą PET / CT (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Poznaj metodę znakowania mysich limfocytów przeciwciałem z Cu-64 do śledzenia migracji komórek in vivo za pomocą PET/CT. Technika umożliwia obrazowanie z wysokim kontrastem przez 48 godzin z minimalnym wpływem na żywotność komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Julii Mannheim, Walterowi Ehrlichmannowi, Ramonie Stumm, Funda Cay, Danielowi Bukali, Maren Harant oraz Natalie Altmeyer za wsparcie podczas eksperymentów i analizy danych. Prace te były wspierane przez Fundację Wernera Siemensa, DFG za pośrednictwem SFB685 (projekt B6) i Fortüne (2309-0-0).

<ol><li>Cerri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracarotid+Infusion+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+an+Animal+Model+of+Parkinson%27s+Disease%2C+Focusing+on+Cell+Distribution+and+Neuroprotective+and+Behavioral+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Trans+Med%22%5BJournal%5D)">Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson's Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects.</a> Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).</li>
<li>Hasenbach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+glioma+tropism+of+bone+marrow-derived+progenitor+cells+by+2-photon+laser+scanning+microscopy+and+positron+emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography.</a> Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).</li>
<li>Sood, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+18F-FDG-Labeled+Autologous+Bone+Marrow+%E2%80%93+Derived+Stem+Cells+in+Patients+With+Type+2+Diabetes+Mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus.</a> Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).</li>
<li>Perez-Diez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4+cells+can+be+more+efficient+at+tumor+rejection+than+CD8+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells.</a> Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).</li>
<li>Muranski, P., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+immunotherapy+of+cancer+using+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells.</a> Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).</li>
<li>Braumuller, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-helper-1-cell+cytokines+drive+cancer+into+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence.</a> Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+B-lineage+cells+and+regression+of+lymphoma+in+a+patient+treated+with+autologous+T+cells+genetically+engineered+to+recognize+CD19%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19.</a> Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).</li>
<li>Cherry, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+Positron+Emission+Tomography+and+Applications+in+Preclinical+Drug+Development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development.</a> J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).</li>
<li>Tavaré, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Effective+Immuno-PET+Imaging+Method+to+Monitor+CD8-Dependent+Responses+to+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy.</a> Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).</li>
<li>Tavaré, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antibody+fragments+for+immuno-PET+imaging+of+endogenous+CD8%2B+T+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).</li>
<li>Dobrenkov, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+Efficacy+of+Adoptively+Transferred+Prostate+Cancer-Targeted+Human+T+Lymphocytes+with+PET+and+Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging.</a> J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).</li>
<li>Rini, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+with+FDG-labeled+Leukocytes+versus+Scintigraphy+with+111In-Oxine-labeled+Leukocytes+for+Detection+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection.</a> Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).</li>
<li>Ritchie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+macrophage+activated+killer+cells+to+sites+of+metastatic+ovarian+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma.</a> Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).</li>
<li>Adonai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+cell+labeling+with+64Cu-pyruvaldehyde-bis%28N4-methylthiosemicarbazone%29+for+imaging+cell+trafficking+in+mice+with+positron-emission+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).</li>
<li>Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiolabeling+Rhesus+Monkey+CD34%2B+Hematopoietic+and+Mesenchymal+Stem+Cells+with+64Cu-Pyruvaldehyde-Bis%28N4-Methylthiosemicarbazone%29+for+MicroPET+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging.</a> Mol. Imaging. 7 (1), (2008).</li>
<li>Griessinger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Tracking+of+Th1+Cells+by+PET+Reveals+Quantitative+and+Temporal+Distribution+and+Specific+Homing+in+Lymphatic+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue.</a> J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).</li>
<li>Griessinger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((64Cu+antibody-targeting+of+the+T-cell+receptor+and+subsequent+internalization+enables+in+vivo+tracking+of+lymphocytes+by+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).</li>
<li>McCarthy, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+production+of+high+specific+activity+64Cu+using+a+biomedical+cyclotron%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron.</a> Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).</li>
<li>Kalkhof, S., Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chances+and+pitfalls+of+chemical+cross-linking+with+amine-reactive+N-hydroxysuccinimide+esters%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters.</a> Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).</li>
<li>Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii,, J, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Th17+Differentiation+of+Naive+CD4+T+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes.</a> J Vis Exp. (79), e50765(2013).</li>
<li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Naive+CD4%2B+T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), e52739(2015).</li>
<li>Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642129445">Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide</a>. , Springer. 363-370 (2011).</li>
<li>Phelps, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPhelps%2C+ME+%22PET.+Molecular+Imaging+and+Its+Biological+Applications%22">PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications</a>. , Springer-Verlag. 93-101 (2004).</li>
<li>Wu, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+and+Antimatter%3A+The+Resurgence+of+Immuno-PET%5BTitle%5D)+AND+%22JNM%22%5BJournal%5D)">Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET.</a> JNM. 50 (1), 2-5 (2009).</li>
<li>Lewis, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evaluation+of+pretargeted+64Cu+for+tumor+imaging+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy.</a> J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).</li>
<li>Boswell, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+in+vivo+stability+of+copper-64-labeled+cross-bridged+and+conventional+tetraazamacrocyclic+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes.</a> J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).</li>
<li>Ghosh, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+DOTA+and+NODAGA+as+chelators+for+%2864%29Cu-labeled+immunoconjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates.</a> Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).</li>
<li>Johnson, T. E., Birky, B. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnson%2C+TE+%22Health+Physics+and+Radiological+Health%22">Health Physics and Radiological Health</a>. , 4th ed, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten stanowi niezawodną i łatwą metodę stabilnego znakowania radioizotopem komórek w celu śledzenia in vivo za pomocą PET. Wykorzystując tę metodę, komórki cOVA-TH1, wyizolowane i namnażone in vitro od myszy dawców, można było znakować radioaktywnie 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb, a ich naprowadzanie śledzono do płucnych i okołotymicznych LN jako miejsc prezentacji cOVA w ostrym DTHR dróg oddechowych wywołanym przez cOVA.
Modyfikacja mAb za pomocą chelatora wymaga sz...

Nieinwazyjne śledzenie komórek to wszechstronne narzędzie do monitorowania funkcji komórek, migracji i naprowadzania in vivo. Ostatnie badania nad śledzeniem komórek koncentrowały się na mezenchymalnych1,2 lub komórkach macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego3 w kontekście medycyny regeneracyjnej, autologicznych białych krwinek obwodowych w stanie zapalnym lub limfocytach T w adoptywnych terapiach komórkowych przeciwko rakowi3,4. Wyjaśnienie miejsc działania i podstawowych zasad biologicznych terapii komórkowych ma ogromne znaczenie. Cytotoksyczne limfocyty T CD8 +, genetycznie modyfikowane limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) lub limfocyty naciekające nowotwór (TIL) były powszechnie uważane za złoty standard. Jednak komórki TH1 specyficzne dla antygenu nowotworu okazały się skuteczną alternatywną opcją leczenia4,5,6,7.
Jako kluczowi gracze w stanach zapalnych, chorobach autoimmunologicznych specyficznych dla narządów (np. reumatoidalnym zapaleniu stawów lub astmie oskrzelowej) oraz komórkach o dużym zainteresowaniu immunoterapią nowotworów, ważne jest scharakteryzowanie czasowej dystrybucji i wzorców naprowadzania komórek TH1. Nieinwazyjne obrazowanie in vivo metodą PET przedstawia ilościową, bardzo czułą metodę8 do badania wzorców migracji komórek, naprowadzania in vivo oraz miejsc działania i odpowiedzi limfocytów T podczas stanu zapalnego, alergii, infekcji lub odrzucenia nowotworu9,10,11.
Klinicznie, 111In-oxine jest używany do scyntygrafii leukocytów w celu rozróżnienia stanu zapalnego i infekcji12, podczas gdy 2-deoksy-2-(18F)fluoro-D-glucose (18F-FDG) jest powszechnie używany do badań śledzenia komórek przez PET3,13. Jedną z głównych wad tego znacznika PET jest jednak krótki okres półtrwania radionuklidu 18F po 109,7 min oraz niska stabilność wewnątrzkomórkowa, która utrudnia obrazowanie w późniejszych punktach czasowych po adoptywnym transferze komórek. W przypadku długoterminowych badań in vivo śledzenia komórek za pomocą PET, chociaż niestabilny w komórkach, 64Cu-PTSM jest często używany do niespecyficznego znakowania komórek14,15 ze zminimalizowanym szkodliwym wpływem na żywotność i funkcję limfocytów T16.
Ten protokół opisuje metodę dalszego zmniejszania niekorzystnego wpływu na żywotność i funkcjonowanie komórek za pomocą specyficznego dla receptora limfocytów T (TCR) znakowanego radioaktywnie mAb. Po pierwsze, pokazano wytwarzanie radioizotopu 64Cu, koniugację mAb KJ1-26 z chelatorem DOTA, a następnie znakowanie radioaktywne 64Cu. W drugim etapie szczegółowo opisano izolację i ekspansję komórek cOVA-TH1 myszy dawców DO11.10 oraz znakowanie radioaktywne mAb KJ1-26 KJ1-26 (64Cu-DOTA-KJ1-26) naładowane radiowolnie. Przedstawiono ocenę wartości wychwytu i wypływu promieniotwórczości odpowiednio za pomocą kalibratora dawki i zliczania γ, a także ocenę wpływu znakowania radioaktywnego 64Cu na żywotność komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego i funkcjonalność testu ELISA IFN-γ. W przypadku nieinwazyjnego śledzenia komórek in vivo opisano uzyskanie mysiego modelu ostrego DTHR w drogach oddechowych wywołanego cOVA oraz akwizycję obrazu za pomocą PET/CT po adoptywnym transferze komórek.
Ponadto, to podejście do etykietowania może być przeniesione do różnych modeli chorób, mysich limfocytów T z różnymi TCR lub ogólnie interesujących komórek z receptorami związanymi z błoną lub markerami ekspresji leżącymi u podstaw ciągłego transportu błonowego17.

<table><tbody><tr><td>HCl, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.00318</td><td>64Cu produkcja</td></tr><tr><td>metanolu, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.06007</td><td>64Cu produkcja</td></tr><tr><td>Isopropanol, Suprapur</td><td>Merck, Darmstadt, Niemcy</td><td>1.0104</td><td>64Cu produkcja</td></tr><tr><td>Pt/Ir (90/10) plate</td><td>&Ouml; gussa</td><td>Produkcja na zamówienie</td><td>64Cu</td></tr><tr><td>Komora PEEK</td><td>WKL</td><td>Produkcja na zamówienie</td><td>64Cu produkcja</td></tr><tr><td>64Ni</td><td>Chemotrade</td><td></td><td>64Cu produkcja</td></tr><tr><td>Polygram SIL G/UV 254 płyta</td><td>Macherey-Nagel</td><td>805021</td><td>64Cu</td></tr><tr><td>produkcja Wymiana jonowa kolumna</td><td>BioRad</td><td>AG1-X8</td><td>64Cu produkcja</td></tr><tr><td>Półprzewodnikowy system docelowy dla PETtrace</td><td>Produkcja kostiumów WKL</td><td></td> <td>64Cu production</td></tr><tr><td>64Cu Produkcja</td><td>kostiumów</td><td>WKL wykonany</td><td>64Cu</td></tr><tr><td>Kalibrator dawki</td><td>Capintec</td><td>CRC-25R</td><td></td></tr><tr><td>PETtrace cyklotron</td><td>General Electric Medical Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS</td><td>Makrocykliczne</td><td>B-280</td><td>Koniugacja DOTA</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-cOVA-TCR (KJ1-26)</td><td></td><td>Wyizolowane z hodowli komórek hybrydoma</td><td>Koniugacja DOTA</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71633</td><td>Koniugacja DOTA</td></tr><tr><td>H+ Chelex 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7901</td><td>Koniugacja DOTA</td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca Amicon Ultra-15</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC910008</td><td>koniugacja DOTA</td></tr><tr><td>Rotipuran ultraczysta woda</td><td>Carl Roth</td><td>HN68.3</td><td>Koniugacja DAT</td></tr><tr><td>Octan amonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32301</td><td>Koniugacja DAT</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Uniwersytet w Tybindze</td><td></td><td>Koniugacja DOTA</td></tr><tr><td>Micro Bio-spin P-6</td><td>kolumna Bio-Rad Laboratories</td><td>7326221</td><td>Koniugacja DOTA</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71497</td><td>Koniugacja DOTA</td></tr><tr><td>Cyclone Plus PhosphorImager&nbsp;</td><td>Perkin-Elmer</td><td>L2250116</td><td>koniugacja DOTA</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Merck Millipore</td><td>102568</td><td>składnik do pożywki z limfocytów T&nbsp;</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Merck Millipore</td><td>S0115/1004B</td><td>składnik do podłoża limfocytów T&nbsp;</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Merck Millipore</td><td>L0473</td><td>składnik dla pożywki z limfocytów T&nbsp;</td></tr><tr><td>MEM-aminokwasy</td><td>Merck Millipore</td><td>K0293</td><td>składnik dla pożywki limfocytów T&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>L 1613</td><td>składnik dla pożywki z limfocytów T&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp; Penicylina/Streptomycyna</td><td>Merck Millipore</td><td>A2212</td><td>składnik na pożywkę z limfocytów T&nbsp;</td></tr><tr><td>0,05 mM 2-&beta;-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>składnik do pożywki limfocytów T&nbsp;</td></tr><tr><td>DO11.10 myszy hodowla</td><td></td><td>własna</td><td>Hodowla komórkowa TH1</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>Hodowla komórkowa TH1</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe 40 i mikro; m&nbsp;</td><td>Corning</td><td>352340</td><td>Hodowla komórkowa TH1</td></tr><tr><td>ACK Bufor do lizowania</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Hodowla komórkowa TH1</td></tr><tr><td>Mikrokulki CD4, mysz</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-097-145</td><td>Hodowla komórkowa TH1</td></tr><tr><td>Separator QuadroMACS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-090-976</td><td>Kolumna LS do hodowli komórkowej TH1</td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td>Hodowla</td></tr> <tr>komórkowa TH1<td>przeciwciało anty-CD4 (Gk1.5)</td><td></td><td>Wyizolowane z hodowli komórek hybrydoma</td> Przeciwciało anty-CD8 do <td>hodowli komórek TH1</td></tr><tr><td>(5367.2)</td><td></td><td>Izolowane z hodowli komórek hybrydoma</td><td>Hodowla komórkowa TH1</td></tr><tr><td>Przeciwciało antyszczurze (MAR18.5)</td><td></td><td>Izolowane z hodowli komórek hybrydoma</td><td>Hodowla komórkowa TH1</td></tr><tr><td>Dopełniacz królika MA</td><td>tebu-Bio</td><td>CL3221</td><td>Hodowla komórkowa TH1</td></tr><tr><td>Anty-IL-4 przeciwciało (11B11)</td><td></td><td>Wyizolowane z hodowli komórkowej hybrydoma</td><td>Hodowla komórkowa TH1</td></tr><tr><td>cOVA 323-339-peptyd&nbsp;</td><td>Mikrokolekcje EMC</td><td>Hodowla</td><td>komórkowa TH1</td>na zamówienie</tr><tr><td>CPG1668-oligonukleotydy</td><td>Eurofins MWG Operon</td><td>Hodowla komórkowa TH1</td>na <td>zamówienie</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>Novartis</td><td>65483-116-07</td><td>Hodowla komórkowa TH1</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>655180</td><td>Hodowla komórkowa TH1</td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>662160</td><td>Kolba do hodowli komórkowych TH1</td></tr><tr><td></td><td>Greiner&nbsp;</td><td>660175</td><td>Hodowla komórkowa TH1</td></tr><tr><td>48-dołkowe płytki</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>677 Etykietowanie komórek 180</td><td></td></tr><tr><td>Gammacell 1000</td><td>Best Theratronics</td><td>przez zapytanie&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gulmay RT225</td><td>Gulmay</td><td>przez zapytanie&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ocena błękitu trypanowego</td><td>Merck Millipore</td><td>L6323</td><td>in vitro</td></tr><tr><td>Mysz IFN-&gamma; ELISA</td><td>BD Biosciences</td><td>558258</td><td>in vitro ocena</td></tr><tr><td>PE Zestaw do wykrywania apoptozy Aneksyny V&nbsp;</td><td>Ocena 559763</td><td></td><td>in vitro</td></tr><tr><td>Probówka 5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>55.476</td><td>in vitro ocena</td></tr><tr><td>Probówki okrągłodenne&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td>in vitro ocena</td></tr><tr><td>Kreator &gamma;-licznik</td><td>Perkin-Elmer</td><td>2480-0010</td><td>in vitro ocena</td></tr><tr><td>Czytnik ELISA MultiscanEX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51118177</td><td>in vitro ocena</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>via zapytanie&nbsp;</td><td>Ocena in vitro</td></tr><tr><td>BD LSRII&nbsp;</td><td>Zapytanie BD Biosciences</td><td>via&nbsp;</td><td>in vitroevaluation</td></tr><tr><td>Myszy BALB/c</td><td>Charles River</td><td>028</td><td>in vivo transport komórek</td></tr><tr><td>Żel aluminiowy</td><td>Serva Elektroforeza</td><td>12261.01</td><td>in vivo transport komórek</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Bayer</td><td>HealthCare Zamówione przez Szpital Uniwersytecki</td><td>in vivo transport komórek</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Ratiopharm</td><td>Zamówione przez Szpital Uniwersytecki</td><td>in vivo transport komórek</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>CP-Pharma Zamówione</td><td>przez Szpital Uniwersytecki</td><td>in vivo transport komórek</td></tr><tr><td>30 G igła</td><td>BD Biosciences</td><td>304000</td><td>in vivo strzykawka do transportu komórek</td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>11612491</td><td>in vivo transport komórkowy Naczynia</td></tr><tr><td>włosowate 10 i mikro; L</td><td>VWR</td><td>612-2439</td><td></td></tr><tr><td>Skaner PET Inveon</td><td>Siemens Healthineers</td><td>nie jest już dostępny</td><td>in vivo handel komórkami, alternatywne firmy: Bruker, Mediso&nbsp;</td></tr><tr><td>Skaner Inveon SPECT/CT</td><td>Siemens Healthineers</td><td>nie jest już dostępny</td><td>in vivo transport komórkowy</td></tr><tr><td>Inveon Research Workplace</td><td>Siemens Healthineers</td><td></td><td>analiza obrazu, alternatywne oprogramowanie: Pmod</td></tr></tbody></table>

znakowanie mysich limfocytów za pomocą receptora przeciwciał cu 64w celu transportu komórek in vivo za pomocą pet / ct

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

Ten protokół ilustruje produkcję 64Cu i koniugację/radioznakowanie chelatora przeciwciała monoklonalnego (mAb), a następnie hodowlę komórek mysich limfocytów i celowanie w receptor przeciwciała 64Cu komórek. Opisano ocenę in vitro znakowania radioaktywnego oraz nieinwazyjne śledzenie komórek in vivo w zwierzęcym modelu reakcji nadwrażliwości typu opóźnionego (DTHR) dróg oddechowych za pomocą PET/CT.
Szczegółowo, pokazano koniugację mAb z chelatatorem kwasu 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctowego (DOTA). Po wytworzeniu radioaktywnego 64Cu opisano znakowanie radioaktywne mAb sprzężonego z DOTA. Następnie przedstawiono ekspansję komórek pomocniczych T wytwarzających interferon CD4 + (IFN) swoisty dla albuminy jaja kurzego (cOVA) (cOVA-TH1) i γ późniejsze znakowanie radioaktywne komórek cOVA-TH1. Przedstawiono różne techniki in vitro w celu oceny wpływu znakowania radioaktywnego 64Cu na komórki, takie jak określenie żywotności komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego, barwienie apoptozą za pomocą aneksyny V w cytometrii przepływowej oraz ocena funkcjonalności za pomocą testu immunoenzymatycznego IFN-γ (ELISA). Ponadto szczegółowo opisano sposób oznaczania wychwytu promieniotwórczego przez komórki i stabilność znakowania. Protokół ten opisuje ponadto, w jaki sposób przeprowadzać badania śledzenia komórek w modelu zwierzęcym dla DTHR dróg oddechowych, a zatem uwzględniono indukcję ostrego DHTR w drogach oddechowych wywołanego cOVA u myszy BALB/c. Na koniec przedstawiono solidny przebieg pracy PET/CT, w tym akwizycję, rekonstrukcję i analizę obrazu.
Podejście do celowania w receptor przeciwciał 64Cu z późniejszą internalizacją receptora zapewnia wysoką specyficzność i stabilność, zmniejszoną toksyczność komórkową i niskie wskaźniki wypływu w porównaniu do popularnych znaczników PET do znakowania komórek, np. 64Cu-pirowaldehyd bis(N4-metylotiosemikarbazon) (64Cu-PTSM). Wreszcie, nasze podejście umożliwia nieinwazyjne śledzenie komórek in vivo za pomocą PET/CT z optymalnym stosunkiem sygnału do tła przez 48 godzin. To eksperymentalne podejście można przenieść na różne modele zwierzęce i typy komórek z receptorami związanymi z błoną, które są zinternalizowane.

Rysunek 1 przedstawia schemat znakowania komórek cOVA-TH1 za pomocą 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb oraz projekt eksperymentalny dla badań in vitro i in vivo opisanych w niniejszym protokole.
<img alt="Schemat procesu radiomarkowania: od izolacji limfocytów T CD4+ do analizy PET/CT w badaniu receptorów." src="/files/ftp_upload/55270/55270fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Ryc...

Po przygotowaniu zmodyfikowanego 64Cu przeciwciała monoklonalnego wiążącego się z transgenicznym receptorem mysich limfocytów T, limfocyty T są znakowane radioaktywnie in vivo, analizowane pod kątem żywotności, funkcjonalności, stabilności znakowania i apoptozy, a następnie adoptycyjnie przenoszone do myszy z reakcją nadwrażliwości typu opóźnionego w drogach oddechowych do nieinwazyjnego obrazowania za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej/tomografii komputerowej (PET/CT).

Znakowanie mysich limfocytów za pomocą receptora przeciwciał Cu 64w celu transportu komórek in vivo za pomocą PET / CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest trwałe znakowanie limfocytów mysich radioaktywnym przeciwciałem monoklonalnym zmodyfikowanym miedzią, aby śledzić czasową dystrybucję i wzorce homingu limfocytów in vivo za pomocą PET/CT w mysich modelach stanu zapalnego lub nowotworu. Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu miejsc działania i kluczowych biologicznych zasad leżących u podstaw terapii komórkowych, takich jak terapie komórkami macierzystymi w medycynie regeneracyjnej czy immunoterapie nowotworów. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona obrazowanie migracji komórek przez 48 godzin z wysokim kontrastem i minimalnym niekorzystnym wpływem na komórki.Metodę tę można łatwo przenieść na dowolny interesujący typ komórek posiadający specyficzne receptory błonowe i odpowiadające im przeciwciała monoklonalne. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z procesami koniugacji chelatora i znakowania radioizotopowego, co skutkuje niższą frakcją immunoreaktywną oraz niższą aktywnością specyficzną dla komórek. Należy rozpocząć od dezynfekcji myszy DO11.10 za pomocą 70% ethanol.Następnie unieruchom kończyny za pomocą taśmy klejącej i wykonaj cięcie pośrodkowe wz

murine-lymphocyte-labeling-64cu-antibody-receptor-targeting-for-vivo

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie demonstrujemy wewnątrzkomórkowe znakowanie radiokomórkowe komórek pomocniczych T za pomocą radioaktywnych przeciwciał monoklonalnych sprzężonych z izotopami do nieinwazyjnego obrazowania pozytonowej tomografii emisyjnej.

Znakowanie mysich limfocytów T Helper za pomocą znakowanych radioaktywnie przeciwciał monoklonalnych

Ten film demonstruje technikę wykorzystującą radioimmunokoniugat do obrazowania in vivo guza na modelu mysim. Po wstrzyknięciu radioimmunokoniugatu przeciwciała koniugatu wiążą się ze specyficznym antygenem błonowym na komórkach nowotworowych. Radioznacznik koniugatu emituje pozytony, które oddziałują z sąsiednimi elektronami w celu wytworzenia energii, która jest wykrywana przez skaner pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) w celu stworzenia obrazu guza.

Technika obrazowania PET in vivo do wykrywania guzów w modelu mysim przy użyciu przeciwciał znakowanych radioaktywnie

Opisujemy ogólny protokół śledzenia komórek in vivo za pomocą MRI w modelu mysim z komórkami oznaczonymi ex vivo. Dołączony jest typowy protokół do znakowania komórek, przetwarzania akwizycji obrazu i kwantyfikacji.

Rezonans magnetyczny in vivo 19F do śledzenia komórek

Bioortogonalna cykloaddycja Dielsa-Aldera została wykorzystana do stworzenia skutecznej i modułowej, pretargetowanej strategii obrazowania PET dla raka. W niniejszym protokole etapy tej metodologii są opisane w kontekście systemu modelowego wykorzystującego przeciwciało ukierunkowane na raka jelita grubego huA33 i radioligand znakowany 64Cu.

Wykorzystanie bioortogonalnej cykloaddycji Dielsa-Aldera z odwróconym zapotrzebowaniem elektronów do wstępnie ukierunkowanego obrazowania PET

Peptydy pochodzenia wirusowego sprzężone z koniugatami przeciwciał (AC) to podejście, które nabiera rozpędu ze względu na potencjał dostarczania ładunków molekularnych ze zwiększoną akumulacją komórek nowotworowych. Wykorzystując powszechne metody oceny koniugacji peptydów, akumulacji wewnątrzkomórkowej AC i ładunku oraz celowania w guz, protokół ten pomaga naukowcom w kluczowych początkowych fazach rozwoju.

Wstępna ocena koniugatów przeciwciał zmodyfikowanych peptydami pochodzącymi z wirusów w celu zwiększenia akumulacji komórkowej i poprawy celowania w guz

Ten protokół opisuje metodę obrazowania rezydentnych komórek T CD8 infiltrujących nowotwór, oznaczonych fluorescencyjnie sprzężonymi przeciwciałami w wycinkach ludzkiego guza płuc. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T CD8 w czasie rzeczywistym przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Ex vivo Obrazowanie rezydentnych limfocytów T CD8 w wycinkach ludzkiego guza płuc za pomocą mikroskopii konfokalnej

Protokoły ilościowej oceny chemotaksji i migracji limfocytów są ważnymi narzędziami do badań immunologicznych. Opisano w nim protokół in vitro, który umożliwia multipleksowaną ocenę migracji komórek w czasie rzeczywistym, a także komplementarną technikę in vivo umożliwiającą śledzenie komórek natywnych do śledziony.

Kwantyfikacja chemotaksji ludzkich monocytów in vitro i handlu mysimi limfocytami in vivo

Tutaj demonstrujemy metody ilościowego oznaczania in vivo wyjścia leukocytów z naiwnej, zapalnej i złośliwej skóry myszy. Przeprowadzamy bezpośrednie porównanie dwóch modeli: transdermalnej aplikacji FITC i fotokonwersji in situ. Ponadto wykazujemy przydatność fotokonwersji do śledzenia wychodzenia leukocytów z guzów skóry.

Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów

Ten protokół opisuje technikę obrazowania różnych populacji komórek w drenujących węzłach chłonnych bez zmian w strukturze narządu.

Wizualizacja struktury węzłów chłonnych i lokalizacji komórkowej za pomocą mikroskopii konfokalnej ex-vivo

Ten protokół opisuje metodologię nieinwazyjnego śledzenia limfocytów T genetycznie zmodyfikowanych do ekspresji chimerycznych receptorów antygenowych in vivo za pomocą klinicznie dostępnej platformy.

Dynamiczne obrazowanie limfocytów T z chimerycznym receptorem antygenowym za pomocą pozytonowej tomografii emisyjnej [18F] tetrafluoroboranu / tomografii komputerowej

Ten artykuł szczegółowo opisuje metodologię znakowania radioaktywnego przeciwciała monoklonalnego anty-CD19 specyficznego dla człowieka i jak go używać do ilościowego oznaczania limfocytów B w ośrodkowym układzie nerwowym i tkankach obwodowych mysiego modelu stwardnienia rozsianego przy użyciu obrazowania in vivo PET, zliczania gamma ex vivo i metod autoradiograficznych.

Obrazowanie limfocytów B CD19 + w eksperymentalnym mysim modelu autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia przy użyciu pozytonowej tomografii emisyjnej

Poznaj metodę znakowania mysich limfocytów przeciwciałem z Cu-64 do śledzenia migracji komórek in vivo za pomocą PET/CT. Technika umożliwia obrazowanie z wysokim kontrastem przez 48 godzin z minimalnym wpływem na żywotność komórek.

Znakowanie mysich limfocytów za pomocą receptora ^{przeciwciał Cu 64}w celu transportu komórek in vivo za pomocą PET / CT

Przeglądaj więcej filmów