Kompleksowa procedura oceny skuteczności in vivo nanoleków przeciwnowotworowych

Ogólnym celem tej procedury jest ocena zachowania in vivo nanoleków przeciwnowotworowych na poziomie ogólnoustrojowym, tkankowym, jednokomórkowym i subkomórkowym u myszy immunokompetentnych z nowotworem. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie nanomedycyny nowotworów. W jaki sposób nanoleki kumulują się ilościowo w różnych tkankach żywych zwierząt w czasie?

Główną zaletą tej techniki jest to, że podejście oparte na podwójnym znakowaniu pozwala na charakterystykę nanomedycyny in vivo od poziomu makroskopowego do mikroskopowego. Wybieramy liposomy jako przykład, aby zademonstrować naszą procedurę, ponieważ liposomy są obecnie w użyciu klinicznym, a także są powszechną platformą dla eksperymentalnych nanoleków. Aby rozpocząć procedurę, rozpuść 20 miligramów mieszaniny lipidów, która zawiera 0,1% mola lipofilowego kationowego barwnika fluorescencyjnego i dwa mililitry chloroformu.

Następnie wysusz lipidy za pomocą wyparki obrotowej. Dodaj 20 mililitrów soli fizjologicznej buforowanej fosforanami do wysuszonych lipidów. Sonikuj mieszaninę na lodzie za pomocą sonografu z sondą o mocy 3,8 milimetra o mocy 30 watów przez 30 minut, utrzymując mieszaninę w temperaturze od czterech do 20 stopni Celsjusza przez cały czas.

Odwirować otrzymaną zawiesinę liposomalnych nanocząstek o stężeniu 4 000 G przez 10 minut. Wyrzuć osad i umyj liposomy PBS, używając 100 kilodaltonowego filtra odśrodkowego MWCO o stężeniu 4000 G. Przenieś skoncentrowane liposomy z górnej komory do nowej probówki wirówkowej. Liposomy mogą być przechowywane w PBS w lodówce do jednego tygodnia.

Wykonaj dynamiczne rozpraszanie światła na mieszaninie 50 mikrolitrów oczyszczonej zawiesiny liposomowej i 950 mikrolitrów PBS. Zmierz wielkości cząstek i określ rozkład wielkości. Aby rozpocząć procedurę znakowania radioizotopowego, przenieś do probówki o pojemności 1,5 mililitra potrzebną objętość oczyszczonych liposomów i PBS, aby uzyskać dwa miligramy lipidów.

Dodaj do tego jedną milicurie szczawianu zurkonu-89, aby uzyskać końcową objętość 100 mikrolitrów i pH od 6,9 do 7,1. Mieszaj mieszaninę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Następnie usunąć wolny cyrkon-89 przez filtrację odśrodkową za pomocą 100 kilodaltonowej jednostki filtrującej przy 4 000 G. Przemyć retentat sterylnym PBS trzy razy w 4 000 G. Następnie rozcieńczyć retentat do około trzech mikrokiurów na mikrolitr do wstrzykiwań.

Użyj HPLC wykluczającej rozmiar w połączeniu z detektorem promieniowania, aby określić czystość radiochemiczną liposomów znakowanych radioaktywnie. Jeśli czystość radiochemiczna jest niższa niż 95%, należy zmienić formułę dawki. Użyj dynamicznego rozpraszania światła, aby potwierdzić, że zarówno wielkość cząstek, jak i wartości rozkładu są podobne do wartości liposomów nieznakowanych radioaktywnie.

Aby rozpocząć procedurę obrazowania, wstrzyknij około 300 mikrokiurów znakowanych radioaktywnie liposomów do żyły ogonowej unieruchomionej myszy z czerniakiem. Dwie minuty po wstrzyknięciu użyj strzykawki insulinowej o rozmiarze 28, aby pobrać od 10 do 20 mikrolitrów krwi z żyły ogonowej myszy. Przenieść próbkę krwi do wstępnie zważonej probówki liczącej.

Zważyć próbkę krwi i zmierzyć aktywność za pomocą licznika gamma. Obliczyć stężenie promieniotwórczości jako procent wstrzykniętej dawki na gram. Piętnaście minut po wstrzyknięciu należy pobrać i zmierzyć kolejną próbkę krwi w ten sam sposób.

Następnie znieczulij mysz, podając 2% izofluranu i tlen przez nos. Pobrać i zmierzyć trzecią próbkę krwi godzinę po wstrzyknięciu. Następnie pozwól myszy zregenerować się w klatce odzyskiwania, dopóki nie zostanie odzyskana normalna mobilność.

Pobrać dodatkowe próbki cztery, osiem, 24 i 48 godzin po wstrzyknięciu. Należy pozwolić, aby mysz w pełni zregenerowała się między wstrzyknięciami. Umieść mysz w pomieszczeniu przeznaczonym dla zwierząt, którym podano materiały radioaktywne.

Po 24 lub 48 godzinach od wstrzyknięcia liposomu znieczulij mysz 2% izofluranem i tlenem. Umieść mysz na brzuchu na łóżku skanera microPET-CT dla małych zwierząt. Kontynuuj dostarczanie 2% izofluranu i tlenu przez stożek nosowy.

Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec ich wysuszeniu. Następnie przenieś łoże skanera do urządzenia. Wykonaj 15-minutowy skan statyczny PET całego ciała z co najmniej 50 milionami zbieżnych zdarzeń, z energią od 250 do 700 kiloelektronowoltów i oknem czasowym koincydencji wynoszącym sześć nanosekund.

Następnie wykonaj pięciominutową tomografię komputerową ze 120 krokami obrotowymi w zakresie 220 stopni, z około 145 milisekundami na klatkę. Po zakończeniu skanowania natychmiast poświęć mysz przez uduszenie dwutlenkiem węgla. Potwierdź śmierć, szczypiąc łapę zwierzęcia, a następnie wykonaj zwichnięcie szyjki macicy.

Perfuzję tkanek za pomocą PBS w celu usunięcia krwi i pobrania odpowiednich próbek tkanek. Zważ pobrane tkanki i zmierz ich aktywność. Obliczyć akumulację liposomów znakowanych radioaktywnie w tkance jako procent wstrzykniętej dawki na gram.

Przechowuj tkankę nowotworową w zimnym PBS. Wykonaj cytometrię przepływową ex vivo i obrazowanie immunoflurescencyjne na pobranej tkance nowotworowej w celu zmierzenia akumulacji w odniesieniu do populacji komórek. Obrazowanie PET/CT myszy z nowotworem, którym wstrzyknięto nanocząstki znakowane cyrkonem-89, wykazało znaczną akumulację nanapcząstek w tkance nowotworowej 24 godziny po wstrzyknięciu.

Okres półtrwania nanocząstek we krwi określono na około 10 godzin. Pomiary biodystrybucji ex vivo po 24 godzinach od wstrzyknięcia były zgodne z pomiarami PET/CT in vivo. Akumulacja nanocząstek została następnie zbadana na poziomie pojedynczej komórki za pomocą technik barwienia immunologicznego.

Cytometria przepływowa wykazała, że nanocząstki preferencyjnie gromadzą się w makrofagach wspomaganych nowotworem. Obrazowanie immunoflurescencyjne próbek guza również wykazało specyficzne ukierunkowanie nanocząstek na komórki śródbłonka. Technika ta może pomóc naukowcom w zidentyfikowaniu obiecujących nanoleków do zastosowania w translacji klinicznej.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas znakowania radioizotopowego nanoleków ważne jest stosowanie wysokich standardów kontroli jakości. Po tej procedurze inne nanoleki, takie jak nanoemulsje, nanocząstki polimerowe, micele, przeciwciała i fragmenty przeciwciał, mogą być znakowane w celu zmierzenia ich działania in vivo u myszy z nowotworem.