Kompleksowa procedura oceny skuteczności in vivo nanoleków przeciwnowotworowych

Ogólnym celem tej procedury jest ocena zachowania nanoleków przeciwnowotworowych in vivo na poziomach systemowym, tkankowym, pojedynczych komórek oraz subkomórkowym u immunokompetentnych myszy z nowotworami. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytanie w dziedzinie nanomedycyny nowotworów: w jaki sposób nanoleki kumulują się ilościowo w różnych tkankach żywych zwierząt w czasie?

Główną zaletą tej techniki jest to, że podejście z podwójnym znakowaniem umożliwia charakterystykę nanoleków in vivo od poziomu makroskopowego do mikroskopowego. Jako przykład do zademonstrowania naszej procedury wybraliśmy liposomy, ponieważ są one obecnie stosowane w praktyce klinicznej, a także stanowią powszechną platformę dla eksperymentalnych nanoleków. Aby rozpocząć procedurę, rozpuść 20 mg mieszaniny lipidowej, zawierającej 0,1% molowo lipofilowego kationowego barwnika fluorescencyjnego, w dwóch mililitrach chloroformu.

Następnie wysusz lipidy za pomocą ewaporatora obrotowego. Do wysuszonych lipidów dodaj 20 mililitrów soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. Sonicuj mieszaninę na lodzie za pomocą sonikatora z sondą 3,8 milimetra przy mocy 30 watów przez 30 minut, utrzymując przez cały czas temperaturę mieszaniny między czterema a 20 stopniami Celsjusza.

Odwiruj otrzymaną zawiesinę liposomalnych nanocząsteczek przy 4 000 G przez 10 minut. Usuń osad i przemyj liposomy buforem PBS, używając odwirającej jednostki filtrującej o MWCO 100 kilodalton przy 4000 G. Przenieś skoncentrowane liposomy z górnej komory do nowej probówki do wirowania. Liposomy można przechowywać w buforze PBS w lodówce do jednego tygodnia.

Przeprowadź dynamiczne rozpraszanie światła na mieszaninie 50 µL oczyszczonej zawiesiny liposomów i 950 µL PBS. Zmierz wielkość cząstek i określ rozkład wielkości. Aby rozpocząć procedurę radioznakowania, przenieś do probówki o pojemności 1,5 ml odpowiednią objętość oczyszczonych liposomów i PBS, aby uzyskać 2 mg lipidów.

Dodaj do tego jeden milikiur szczawianu cyrkonu-89, aby uzyskać końcową objętość 100 µL i pH od 6,9 do 7,1. Mieszaj mieszaninę w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Następnie usuń wolny cyrkon-89 poprzez filtrację odśrodkową z użyciem jednostki filtrującej 100 kDa przy 4 000 ×g. Przemyj retentat sterylnym PBS trzykrotnie przy 4 000 ×g. Następnie rozcieńcz retentat do stężenia około trzech mikrokiur na µL przed wstrzyknięciem.

Użyj metody HPLC z wykluczaniem rozmiarów w połączeniu z detektorem promieniowania, aby określić czystość radiochemiczną znakowanych izotopowo liposomów. Jeśli czystość radiochemiczna wynosi poniżej 95%, należy ponownie przygotować dawkę. Wykorzystaj dynamiczne rozpraszanie światła, aby potwierdzić, że wartości rozmiaru i rozkładu cząstek są zbliżone do wartości uzyskanych dla liposomów nieznakowanych.

Aby rozpocząć procedurę obrazowania, wstrzyknij około 300 microcurie znakowanych radiologicznie liposomów do żyły ogonowej unieruchomionej myszy z czerniakiem. Dwie minuty po wstrzyknięciu, używając strzykawki insulinowej o rozmiarze 28G, pobierz od 10 do 20 µL krwi z żyły ogonowej myszy. Przenieś próbkę krwi do wcześniej zważonej probówki do licznika.

Zważ próbkę krwi i zmierz jej aktywność za pomocą licznika gamma. Oblicz stężenie radioaktywności jako procent podanej dawki na gram. Piętnaście minut po wstrzyknięciu pobierz i zmierz kolejną próbkę krwi w ten sam sposób.

Następnie znieczul mysz, podając 2% isofluranu i tlen za pomocą maski nosowej. Pobierz i zmierz trzecią próbkę krwi godzinę po wstrzyknięciu. Następnie pozwól myszy dojść do siebie w klatce regeneracyjnej, aż do odzyskania normalnej sprawności ruchowej.

Pobierz dodatkowe próbki po 4, 8, 24 i 48 godzinach od wstrzyknięcia. Pozwól myszy na pełną rekonwalescencję pomiędzy wstrzyknięciami. Przechowuj mysz w pomieszczeniu przeznaczonym dla zwierząt, którym podano materiały radioaktywne.

W 24. lub 48. godzinie po wstrzyknięciu liposomów znieczul mysz 2% isoflurane i tlenem. Umieść mysz na brzuchu na stole skanera mikroPET-CT dla małych zwierząt. Kontynuuj podawanie 2% isoflurane i tlenu za pomocą stożka nosowego.

Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec ich wysychaniu. Następnie wprowadź stół skanera do urządzenia. Wykonaj 15-minutowe statyczne badanie PET całego ciała, rejestrując co najmniej 50 milionów zdarzeń koincydentnych, przy energii od 250 do 700 kiloelektronowoltów i oknie czasowym koincydencji wynoszącym sześć nanosekund.

Następnie przeprowadź pięciominutowe badanie tomograficzne (CT) z 120 krokami rotacyjnymi na zakresie 220 stopni, z czasem około 145 milisekund na klatkę. Po zakończeniu skanowania niezwłocznie uśmierć mysz poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla. Potwierdź zgon, uciskając łapę zwierzęcia, a następnie wykonaj zwichnięcie kręgów szyjnych.

Przeprowadź perfuzję tkanek za pomocą PBS w celu usunięcia krwi, a następnie pobierz odpowiednie próbki tkanek. Zważ zebrane tkanki i zmierz ich aktywność. Oblicz akumulację znakowanych radiacyjnie liposomów w tkance jako procent wstrzykniętej dawki na gram.

Tkankę guza należy przechowywać w schłodzonym PBS. W pobranej tkance guza przeprowadzono cytometrię przepływową ex vivo oraz obrazowanie immunofluorescencyjne, aby zmierzyć akumulację w odniesieniu do populacji komórek. Obrazowanie PET/CT myszy z nowotworem, którym wstrzyknięto nanocząsteczki znakowane cyrkonem-89, wykazało znaczną akumulację nanocząsteczek w tkance guza 24 godziny po wstrzyknięciu.

Określono, że okres półtrwania nanocząstek we krwi wynosi około 10 godzin. Pomiary biodystrybucji ex vivo wykonane 24 godziny po wstrzyknięciu były zgodne z pomiarami PET/CT in vivo. Następnie zbadano akumulację nanocząstek na poziomie pojedynczych komórek przy użyciu technik immunobarwienia.

Cytometria przepływowa wykazała, że nanocząsteczki ulegają preferencyjnej akumulacji w makrofagach związanych z nowotworem. Obrazowanie immunofluorescencyjne próbek nowotworowych wskazało również na specyficzne celowanie nanocząsteczek w komórki śródbłonka. Technika ta może pomóc badaczom w zidentyfikowaniu obiecujących nanoleków do zastosowań klinicznych.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu trzech dni. Podczas znakowania nanoleków izotopami promieniotwórczymi ważne jest stosowanie wysokich standardów kontroli jakości. Zgodnie z tą procedurą można znakować inne nanoleki, takie jak nanoemulsje, nanocząsteczki polimerowe, micelle, przeciwciała i fragmenty przeciwciał, w celu pomiaru ich efektywności in vivo u myszy z nowotworem.