Name: Kompleksowa procedura oceny skuteczności in vivo nanoleków przeciwnowotworowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metodę oceny nanoleków przeciwnowotworowych in vivo na myszach z guzami, obejmującą poziomy systemowy, tkankowy, komórkowy i subkomórkowy. Technika dual-labeling umożliwia kompleksową charakteryzację od makroskopowej do mikroskopowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Helene Salmon i Miriam Merad z Icahn School of Medicine w Mount Sinai za dostarczenie komórek B16-F10-YFP i za ich fachowe porady na temat mysich modeli czerniaka. Autorzy dziękują również Animal Imaging Core Facility, Radiochemistry and Molecular Imaging Probes Core Facility oraz Molecular Cytology Core Facility w Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) za ich wsparcie. Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health NIH 1 R01 HL125703 (W.J.M.M.), R01CA155432 (W.J.M.M.), K25 EB016673 (T.R.) i P30 CA008748 (MSK Center Grant). Autorzy dziękują również Centrum Obrazowania Molekularnego i Nanotechnologii (CMINT) MSK za wsparcie finansowe (T.R.).

Procedura składa się z podwójnego radioaktywnego i fluorescencyjnego znakowania nanocząstek, obrazowania in vivo PET-CT, pomiarów biodystrybucji ex vivo oraz analiz immunobarwienia ex vivo i cytometrii przepływowej. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt Memorial Sloan Kettering Cancer Center.
1. Przygotowanie podwójnie znakowanych liposomów
UWAGA: Syngeniczne guzy czerniaka B16 mogą być wywołane przez wstrzyknięcie 300 000 komórek B16-F10 w tylne boki myszy C57BL/6 pod narkozą z powodu wdychania tlenu zawierającego 2% izofluran. Podczas operacji należy używać sterylnych odczynników i narzędzi w sterylnym miejscu pracy. Po zabiegu uważnie obserwuj zwierzęta, aż do ich powrotu do zdrowia po znieczuleniu. Zwierzęta należy umieścić z powrotem w klatkach dopiero wtedy, gdy odzyskają pełną świadomość i mobilność. Trzymaj je w sterylnych pomieszczeniach dla zwierząt z ksenoprzeszczepowanymi guzami. Guzy o wielkości 300 mm 3 są idealne do charakteryzacji nanocząstek ze względu na ich wyraźną zwiększoną przepuszczalność i efekty retencji (EPR), które mogą zwiększyć akumulację nanocząstek. Szczegółowe protokoły znajdują się poniżej.
<ol>
	W kolbie okrągłodennej rozpuścić mieszaninę 20 mg lipidów w 2 ml chloroformu zawierającego 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-foscholinę (DPPC), cholesterol, 1,2-disearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloaminę-poli(glikol etylenowy)2000 (DSPE-PEG2000), DSPE-deferoksaminę (DSPE-DFO) 8 i kwas 1,1-diododecylo-3,3,3,3-tetrametylindokarbocyjanino-5,5-disulfonowy (DiIC12[5]-DS) w stosunku molowym 61,3%, 33,4%, 5, 0,2% i 0,1%,<li> odpowiednio. 
	UWAGA: Ten skład lipidowy jest bardzo podobny do liposomalnego preparatu doksorubicyny stosowanego obecnie w klinice <klasa sup="xref">2. Liposomy uzyskane w wyniku naszej procedury będą ściśle naśladować działanie in vivo klinicznej nanomedycyny.</li>
	<li>Użyj wyparki obrotowej, aby usunąć rozpuszczalnik organiczny i utworzyć cienką warstwę lipidową w temperaturze pokojowej. Dodaj 20 ml PBS i sonikuj przez 30 minut, aby wytworzyć liposomalne nanocząstki za pomocą końcówki sonicznej 3,8 mm i amplitudy 30 W, z wystarczającym chłodzeniem na lodzie.</li>
	<li>Odwirować roztwór liposomowy o stężeniu 4 000 x g przez 10 minut w celu usunięcia agregatów i przepłukać nanocząstki PBS za pomocą filtracji odśrodkowej (odcięcie masy cząsteczkowej (MWCO: 100 kDa) w celu usunięcia wolnych lipidów i pozostałości rozpuszczalnika organicznego. Skoncentruj liposomy, które pozostaną w górnej komorze, i przenieś je do nowej probówki. Liposomy można przechowywać w lodówce w PBS do 1 tygodnia przed kolejnymi etapami.</li>
	<li>W celu kontroli jakości scharakteryzuj liposomy za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). W szczególności wymieszaj 50 μl liposomów z 950 μl PBS, a następnie przenieś mieszaninę do kuwety do sortowania. Umieść kuwetę w analizatorze i zmierz rozmiary cząstek oraz ich rozkład wielkości. Oczekuje się, że rozmiary cząstek i ich rozkład wielkości (wskaźnik polidyspersyjności (PDI)) wynoszą odpowiednio 90 - 120 nm i 0,1 - 0,2.</li>
	<li>W celu znakowania radioizotopem zmieszać oczyszczone liposomy, co odpowiada 2 mg lipidów, w PBS o pH między 6,9 a 7,1 z 1 mCi 89Zr-szczawianem w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w probówce o pojemności 1,5 ml (całkowita objętość: ~ 100 μl). Usunąć wolne, nieprzereagowane 89Zr przez filtrację odśrodkową (MWCO = 100 kDa), podobnie jak w kroku 1.3. Przemyć retentat sterylnym PBS i rozcieńczyć go do pożądanej objętości. Wydajność radiochemiczna powinna wynosić 80 - 95%. 
	ostrożność! Praca z materiałami promieniotwórczymi podlega ścisłym regulacjom. Instytucje muszą być certyfikowane i zapewniać niezbędne obiekty, szkolenie personelu i ścisłe monitorowanie stosowania promieniotwórczości. Naukowcy muszą przejść odpowiednie szkolenie i nosić środki ochrony osobistej oraz pierścienie/odznaki dozymetryczne podczas pracy z promieniotwórczością.</li>
	<li>Określ czystość radiochemiczną znakowanych radioizotopem liposomów przez wykluczenie rozmiaru radio-HPLC, które zazwyczaj powinno wynosić ponad 98% 10. Czystość radiochemiczna niższa niż 95% wskazuje na niewystarczające mycie na etapie 1.5.</li>
	<li>Po znakowaniu radioaktywnym należy określić wielkość nanocząstek za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Oczekuje się, że rozmiar i PDI będą mieścić się w tym samym zakresie, co pomiary w kroku 1.4 10. 
	UWAGA: Jeśli próbki promieniotwórcze nie są dozwolone w cytometrze przepływowym lub mikroskopie fluorescencyjnym, do znakowania liposomów w kroku 1.5 można użyć nieradioaktywnego szczawianu natZr. Te nieradioaktywne liposomy mają identyczne właściwości jak ich radioaktywne analogi. Ilustracja tej procedury znajduje się na rysunku 2.</li>
</ol>
2. Obrazowanie in vivo PET-CT i biodystrybucja podwójnie znakowanych liposomów
<ol>
	<li>Wstrzyknąć około 100 μl podwójnie znakowanych liposomów z około 300 μCi radioaktywności powściągliwym myszom z czerniakiem (C57BL / 6, samica, 10-16 tygodni) przez żyły ogonowe, przy około 10 mCi 89Zr/kg masy ciała.</li>
	<li>Aby określić okres półtrwania, należy pobrać krew z żyły ogonowej od znieczulonych zwierząt pod 2% tlenem zawierającym izofluran za pomocą strzykawek insulinowych 28-G. Krew (10 - 20 μl) należy pobrać do wstępnie zważonych probówek po 2 minach, 15 minutach, 1 godzinach, 4 godzinach, 8 godzinach, 24 godzinach i 48 godzinach od wstrzyknięcia. Zważyć krew według różnicy, oznaczyć zawartość radioaktywności za pomocą licznika gamma i obliczyć stężenie radioaktywności jako procent wstrzykniętej dawki na gram (%ID/g). 
	UWAGA: Zabieg należy wykonać w pomieszczeniu wyposażonym w system anestezjologiczny, klatki rekonwalescencji, ogrzewanie i kaptur chroniący przed zagrożeniem biologicznym. Upewnij się, że zwierzęta w pełni wyzdrowieją i uzyskają normalną mobilność po zabiegu przed przeniesieniem ich z klatek rekonwalescencyjnych do klatek. Zwierzęta z nowotworami są trzymane w pomieszczeniach przeznaczonych dla zwierząt, którym podawano materiały radioaktywne.</li>
	<li>24 lub 48 godzin po wstrzyknięciu liposomów zobrazuj myszy w skanerze MicroPET-CT dla małych zwierząt 10. Ułóż znieczulone zwierzę poziomo na brzuchu i utrzymuj je w znieczuleniu. Podawać 2% izofluranu-tlenu przez stożek nosowy. Nałóż maść okulistyczną na oczy przed skanowaniem, aby zapobiec ich wysuszeniu.</li>
	<li>Wykonaj statyczne skanowanie PET całego ciała, rejestrując co najmniej 50 milionów zbieżnych zdarzeń, o przybliżonym czasie trwania 15 minut. Ustaw okno czasowe energii i koincydencji odpowiednio na 350-700 keV i 6 ns. Następnie wykonaj 5-minutową tomografię komputerową (CT). Ustaw lampę rentgenowską na napięcie 80 kV i prąd 500 μA; tomografia komputerowa wykorzystuje 120 kroków obrotowych, co daje łącznie 220 stopni, z około 145 ms na klatkę 10.</li>
	<li>Po badaniu PET-CT należy natychmiast złożyć myszy w ofierze przez uduszenie dwutlenkiem węgla i potwierdzić zgon poprzez uszczypnięcie łap zwierząt. Po potwierdzeniu wykonaj zwichnięcia szyjki macicy.</li>
	<li>Usuń krew z tkanek myszy, najpierw rozcinając prawy przedsionek, a następnie wstrzykując 20 ml PBS do lewej komory, a następnie zbierz odpowiednie tkanki, takie jak guz, wątroba, śledziona, płuca, nerki, mięśnie i inne 16.</li>
	<li>Zważyć tkanki, zmierzyć ich radioaktywność przez zliczanie promieniowania gamma 8 , 9 i obliczyć akumulację radioaktywności tkanek jako procent wstrzykniętej dawki na g (%ID/g).</li>
</ol>
3. Cytometria przepływowa ex vivo i barwienie immunologiczne
UWAGA: Wstrzyknij około 100 μL fluorescencyjnych liposomów myszom z czerniakiem przez żyłę ogonową w dawce 0,5 mg barwnika na kg masy ciała. Jeżeli próbki promieniotwórcze nie są dopuszczone do cytometru przepływowego i mikroskopu fluorescencyjnego, należy użyć nieradioaktywnych liposomów.
<ol>
	<li>Poświęć myszy 24 godziny po wstrzyknięciu, jak w kroku 2.5, i zbierz guzy, które muszą być przechowywane w zimnym PBS.</li>
	<li>W przypadku cytometrii przepływowej wykonaj następujące kroki 17:
	<ol>
		<li>Przygotować koktajl enzymatyczny składający się z mieszaniny oczyszczonej kolagenazy I i II (4 U/ml), hialuronidazy (60 U/ml) i DNazy I (60 U/ml) w buforze cytometrii przepływowej (PBS z 0,5% BSA i 1 mM EDTA).</li>
		<li>Wymieszaj 100 mg tkanki nowotworowej z 200 μl buforu koktajlu enzymatycznego w probówce o pojemności 1,5 ml i pokrój tkankę na małe kawałki drobnymi nożyczkami. Dodaj kolejne 1,3 ml koktajlu enzymatycznego do probówki i przenieś jego zawartość na płytkę 6-dołkową.</li>
		<li>Potrząsać płytką 6-dołkową na wytrząsarce poziomej umieszczonej w piekarniku o temperaturze 37 °C przez 60 minut przy 60 obr./min.</li>
		<li>Przemyć homogenat tkankowy buforem do cytometrii przepływowej 3 razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.</li>
		<li>Wybarwić komórki koktajlem przeciwciał specyficznych dla biomarkerów, w tym CD45, CD11b, Ly6C, CD11c, CD64, CD3, MHCII i CD31 (rozcieńczenie 1:200 dla wszystkich przeciwciał; informacje o klonach są podane w arkuszu kalkulacyjnym materiałów). Zidentyfikuj odpowiednie typy komórek i określ ich średnią intensywność fluorescencji (MFI) DiIC12(5)-DS w każdej populacji komórek za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W przypadku barwienia immunologicznego wykonaj następujące kroki:
	<ol>
		<li>Umieść guz w kasecie wypełnionej optymalnym medium tnącym (OCT) i zamroź go na suchym lodzie.</li>
		<li>Wykonać 6-μm zamrożone skrawki z tkanki nowotworowej i umieścić je na szkiełkach histologicznych; skrawki powinny obejmować największe przekroje guza, które dostarczają najbardziej reprezentatywnych informacji o tkance.</li>
		<li>Wybarwić biomarkery (np. CD31 dla komórek śródbłonka) będących przedmiotem zainteresowania odpowiednimi przeciwciałami (np. anty-CD31, klon MEC13.3). Napraw sekcje paraformaldehydem; zablokować je surowicą pasującą do pochodzenia gatunkowego przeciwciał drugorzędowych; inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 12 godzin w temperaturze 4 °C, a następnie z przeciwciałami drugorzędowymi przez 2 godziny; a na koniec umyć PBS i przykryć szkiełkami nakrywkowymi. Zobrazuj barwione szkiełka za pomocą pionowego mikroskopu konfokalnego Leica SP5 13 , 16.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Peer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanocarriers+as+an+emerging+platform+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy.</a> Nat Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).</li>
<li>Barenholz, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxil%28R%29--the+first+FDA-approved+nano-drug%3A+lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned.</a> J Control Release. 160, 117-134 (2012).</li>
<li>Green, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abraxane%2C+a+novel+Cremophor-free%2C+albumin-bound+particle+form+of+paclitaxel+for+the+treatment+of+advanced+non-small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Abraxane, a novel Cremophor-free, albumin-bound particle form of paclitaxel for the treatment of advanced non-small-cell lung cancer.</a> Ann Oncol. 17, 1263-1268 (2006).</li>
<li>Juliano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine%3A+is+the+wave+cresting%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine: is the wave cresting?</a> Nat Rev Drug Discov. 12, 171-172 (2013).</li>
<li>Ledford, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bankruptcy+filing+worries+developers+of+nanoparticle+cancer+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bankruptcy filing worries developers of nanoparticle cancer drugs.</a> Nature. 533, 304-305 (2016).</li>
<li>Venditto, V. J., Szoka, F. C. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+nanomedicines%3A+so+many+papers+and+so+few+drugs%21%5BTitle%5D)+AND+%22+Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Cancer nanomedicines: so many papers and so few drugs!</a> Adv Drug Deliv Rev. 65, 80-88 (2013).</li>
<li>Dunphy, M. P., Lewis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiopharmaceuticals+in+preclinical+and+clinical+development+for+monitoring+of+therapy+with+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">Radiopharmaceuticals in preclinical and clinical development for monitoring of therapy with PET.</a> J Nucl Med. (50 Suppl 1), (2009).</li>
<li>Perez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+Imaging+of+Tumor-Associated+Macrophages+with+89Zr-Labeled+High-Density+Lipoprotein+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">PET Imaging of Tumor-Associated Macrophages with 89Zr-Labeled High-Density Lipoprotein Nanoparticles.</a> J Nucl Med. 56, 1272-1277 (2015).</li>
<li>Perez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+labeling+strategy+for+in+vivo+PET+and+near-infrared+fluorescence+imaging+of+nanoparticle+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">A modular labeling strategy for in vivo PET and near-infrared fluorescence imaging of nanoparticle tumor targeting.</a> J Nucl Med. 55, 1706-1711 (2014).</li>
<li>Perez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/ncomms11838">Nanoreporter PET predicts the efficacy of anti-cancer therapy.</a> Nature communications. , (2016).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+macrophage+proliferation+suppresses+atherosclerotic+plaque+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+advances%22%5BJournal%5D)">Inhibiting macrophage proliferation suppresses atherosclerotic plaque inflammation.</a> Science advances. , (2015).</li>
<li>Priem, B., Tian, C., Tang, J., Zhao, Y., Mulder, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+nanoparticles+for+the+accurate+detection+of+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Fluorescent nanoparticles for the accurate detection of drug delivery.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12, 1881-1894 (2015).</li>
<li>Gianella, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+nanoemulsion+platform+for+imaging+guided+therapy+evaluated+in+experimental+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Multifunctional nanoemulsion platform for imaging guided therapy evaluated in experimental cancer.</a> ACS Nano. 5, 4422-4433 (2011).</li>
<li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+with+liposomes+as+pharmaceutical+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers.</a> Nat Rev Drug Discov. 4, 145-160 (2005).</li>
<li>Salmon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+Activation+of+CD103%28%2B%29+Dendritic+Cell+Progenitors+at+the+Tumor+Site+Enhances+Tumor+Responses+to+Therapeutic+PD-L1+and+BRAF+Inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition.</a> Immunity. 44, 924-938 (2016).</li>
<li>Perez-Medina, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+PET+Imaging+of+HDL+in+Multiple+Atherosclerosis+Models%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovasc+Imaging%22%5BJournal%5D)">In Vivo PET Imaging of HDL in Multiple Atherosclerosis Models.</a> JACC Cardiovasc Imaging. 9, 950-961 (2016).</li>
<li>Duivenvoorden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+statin-loaded+reconstituted+high-density+lipoprotein+nanoparticle+inhibits+atherosclerotic+plaque+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation.</a> Nature communications. 5, 3065(2014).</li>
<li>Carney, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+PET+Imaging+of+PARP1+Expression+in+Glioblastoma+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Non-invasive PET Imaging of PARP1 Expression in Glioblastoma Models.</a> Mol Imaging Biol. , (2015).</li>
<li>Salinas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioiodinated+PARP1+tracers+for+glioblastoma+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22EJNMMI+Res%22%5BJournal%5D)">Radioiodinated PARP1 tracers for glioblastoma imaging.</a> EJNMMI Res. 5, 123(2015).</li>
<li>Carlucci, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-Modality+Optical%2FPET+Imaging+of+PARP1+in+Glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-Modality Optical/PET Imaging of PARP1 in Glioblastoma.</a> Mol Imaging Biol. 17, 848-855 (2015).</li>
<li>Tang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+screening+of+a+nanoparticle+library+improves+atherosclerosis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Immune cell screening of a nanoparticle library improves atherosclerosis therapy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , (2016).</li>
<li>Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapy+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Antibody therapy of cancer.</a> Nat Rev Cancer. 12, 278-287 (2012).</li>
<li>Goodwill, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-space+MPI%3A+magnetic+nanoparticles+for+safe+medical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">X-space MPI: magnetic nanoparticles for safe medical imaging.</a> Adv Mater. 24, 3870-3877 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kluczowe kroki w ramach Protokołu:
Wysoka jakość podwójnie znakowanych liposomów jest kluczem do uzyskania spójnych wyników przez długi czas. Wolne barwniki fluorescencyjne lub jony 89Zr mogą generować zupełnie inne wzorce celowania i muszą zostać całkowicie usunięte na etapie oczyszczania. Ponadto, jeśli układ odpornościowy znacząco wpływa na skuteczność eksperymentalnej nanomedycyny przeciwnowotworowej, preferowane powinno być stosowanie immunokompetentnych modeli mysich, takich jak ...

Nanomedycyna zmienia paradygmat rozwoju leczenia raka1. Zainspirowani ogromnym wpływem klinicznym poprzednich nanoleków przeciwnowotworowych, takich jak nanoterapie oparte na liposomach i albuminach2,3, w ciągu ostatniej dekady opracowano wiele nowatorskich preparatów. Jednak ostatnie analizy klinicznego sukcesu translacyjnego tych nanoleków przeciwnowotworowych wskazują, że tylko kilka z nich zostało zatwierdzonych do użytku klinicznego4,5. Jedną z głównych przeszkód w klinicznym przekładzie nowych nanoleków przeciwnowotworowych jest ograniczona poprawa indeksu terapeutycznego w porównaniu z bezpośrednim podawaniem wolnych związków terapeutycznych6. W związku z tym dokładna ocena skuteczności in vivo nanoleków na poziomie ogólnoustrojowym, tkankowym i komórkowym w przedklinicznych modelach zwierzęcych jest niezbędna do zidentyfikowania tych leków o optymalnych wskaźnikach terapeutycznych do przyszłego zastosowania klinicznego.
Nanomateriały mogą być znakowane radioaktywnie w celu ilościowej charakterystyki żywych zwierząt za pomocą obrazowania metodą pozytonowej tomografii emisyjnej (PET), która charakteryzuje się doskonałą czułością i powtarzalnością wśród wszystkich metod obrazowania klinicznego7. Na przykład, 89długo krążących nanoleków znakowanych Zr zostało scharakteryzowanych w mysich modelach raka8,9,10, a także w innych modelach chorób11. Ponadto, okres półtrwania i biodystrybucja nanoleków we krwi mogą być szeroko oceniane za pomocą pomiarów radioaktywności ex vivo w poszczególnych tkankach8. W związku z tym znakowanie radioaktywne pozwala na ilościową ocenę nanoleków na poziomie ogólnoustrojowym i tkankowym.
Co ważne, znakowane radioaktywnie nanoleki na ogół nie mogą być analizowane na poziomie pojedynczej komórki lub subkomórkowej ze względu na ograniczoną rozdzielczość przestrzenną sygnału radioaktywnego. Dlatego znakowanie fluorescencyjne okazuje się być uzupełniającą metodą oceny nanocząstek za pomocą technik obrazowania optycznego, takich jak cytometria przepływowa i mikroskopia fluorescencyjna12. W tym celu nanocząstki znakowane izotopami promieniotwórczymi i znacznikami fluorescencyjnymi mogą być oceniane ilościowo in vivo za pomocą obrazowania jądrowego i ex vivo za pomocą zliczania radioaktywności, a także mogą być szeroko charakteryzowane na poziomie komórkowym za pomocą obrazowania optycznego.
Poprzednio opracowaliśmy modułowe procedury włączania radioaktywnych i fluorescencyjnych etykiet do różnych nanocząstek, w tym lipoprotein o wysokiej gęstości (HDL)11, liposomy9,10, nanocząstki polimerowe, fragmenty przeciwciał i nanoemulsje10,13. Te znakowane nanocząstki pozwoliły na ilościową charakterystykę w odpowiednich modelach zwierzęcych na różnych poziomach, co pomogło w optymalizacji tych nanomateriałów pod kątem ich konkretnych zastosowań. W obecnym badaniu celem jest wykorzystanie nanocząstek liposomalnych - najbardziej uznanej platformy nanomedycznej14 - jako przykładu, aby zademonstrować kompleksowe procedury generowania podwójnie znakowanej nanocząstki i dokładnie scharakteryzować ją w klasycznym mysim modelu czerniaka syngenicznego B16-F1015. Na podstawie uzyskanych wyników jesteśmy przekonani, że to podejście do charakterystyki nanocząstek można zaadaptować do oceny innych nanoleków przeciwnowotworowych w odpowiednich modelach mysich.

<table><tbody><tr><td>DPPC</td><td>Avantilipids</td><td>850355</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG2000</td><td>Avantilipids</td><td>880120P</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-DFO</td><td>Domowe</td><td>110634</td><td>Perez-Medina et al., JNM, 2014</td></tr><tr><td>DiIC12[5]-DS</td><td>AAT Bioquest</td><td>22051</td><td></td></tr><tr><td>Filtr odśrodkowy</td><td>Vivaproducts</td><td>VS2061</td><td></td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>Buchi</td><td>R-100</td><td></td></tr><tr><td>Radio-HPLC</td><td>Shimadzu HPLC z 2 pompami LC-10AT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>89Zr-szczawian</td><td>MSKCC</td><td>Zsyntetyzowany w domu</td><td>cyklotron o zmiennej wiązce TR19/9 (Ebco Industries Inc.)</td></tr><tr><td>Micro PET-CT</td><td>Siemens</td><td>Inveon Micro-PET/CT</td><td></td></tr><tr><td>Licznik gamma</td><td>PerkinElmer</td><td>2470-0150</td><td></td></tr><tr><td>Cytometria przepływowa</td><td>BD Biosciences</td><td>Fortessa</td><td>Wystarczą dowolne wieloparametryczne analizatory cytometrii przepływowej</td></tr><tr><td>C57BL/6 myszy</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B16-YFP komórki czerniaka</td><td>Domowe</td><td>N/A</td><td>Łosoś et al., Odporność, 2016</td></tr><tr><td>Ly6C (klon HK1.4)--APC-Cy7</td><td>128025</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>MHCII (M5/114/152)--APC</td><td>107613</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (30-F11)--BV510</td><td>103137</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7</td><td>139313</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (M1/70)--BV605</td><td>101237</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (17A2) - BV711</td><td>100241</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13,3) - PE</td><td>561073</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11c (M418) - PerCP-Cy5.5</td><td>117327</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13,3) bez fluoroforu</td><td>550274</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr></tbody></table>

kompleksowa procedura oceny skuteczności in vivo nanoleków przeciwnowotworowych

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Zainspirowani sukcesem poprzednich nanoleków na raka w klinice, naukowcy stworzyli dużą liczbę nowych preparatów w ciągu ostatniej dekady. Jednak tylko niewielka liczba nanoleków została zatwierdzona do użytku klinicznego, podczas gdy większość nanoleków będących w fazie rozwoju klinicznego przyniosła rozczarowujące wyniki. Jedną z głównych przeszkód w pomyślnym zastosowaniu klinicznym nowych nanoleków przeciwnowotworowych jest brak dokładnego zrozumienia ich działania in vivo. W artykule przedstawiono rygorystyczną procedurę charakteryzującą zachowanie in vivo nanoleków u myszy z nowotworem na poziomie ogólnoustrojowym, tkankowym, jednokomórkowym i subkomórkowym poprzez integrację pozytonowej tomografii emisyjnej i tomografii komputerowej (PET-CT), metod kwantyfikacji radioaktywności, cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej. Korzystając z tego podejścia, naukowcy mogą dokładnie ocenić nowe preparaty w nanoskali w odpowiednich mysich modelach raka. Protokoły te mogą być w stanie zidentyfikować najbardziej obiecujące nanoleki przeciwnowotworowe o wysokim potencjale translacyjnym lub pomóc w optymalizacji nanoleków przeciwnowotworowych pod kątem przyszłej translacji.

Rycina 1 przedstawia ogólny przebieg procedury. Rycina 2 prezentuje schemat procedury syntezy liposomów z podwójnym znakowaniem opisanej w kroku 110. Rycina 3 pokazuje reprezentatywny obraz PET-CT (Rycina 3a), ilościowe określenie radioaktywności z obrazowania PET (Rycina 3b), okres półtrwania w krwi (Rycina 3c) oraz biodystrybucję (Rycina 3d) nano...

Słabe zrozumienie skuteczności nanoleków in vivo utrudnia ich kliniczne tłumaczenie. Opisano tutaj procedury oceny zachowania in vivo nanoleków przeciwnowotworowych na poziomie ogólnoustrojowym, tkankowym, jednokomórkowym i subkomórkowym u myszy immunokompetentnych z nowotworem. Podejście to może pomóc naukowcom w zidentyfikowaniu obiecujących nanoleków przeciwnowotworowych do zastosowania klinicznego.

Kompleksowa procedura oceny skuteczności in vivo nanoleków przeciwnowotworowych

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena zachowania nanoleków przeciwnowotworowych in vivo na poziomach systemowym, tkankowym, pojedynczych komórek oraz subkomórkowym u immunokompetentnych myszy z nowotworami. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytanie w dziedzinie nanomedycyny nowotworów: w jaki sposób nanoleki kumulują się ilościowo w różnych tkankach żywych zwierząt w czasie?Główną zaletą tej techniki jest to, że podejście z podwójnym znakowaniem umożliwia charakterystykę nanoleków in vivo od poziomu makroskopowego do mikroskopowego. Jako przykład do zademonstrowania naszej procedury wybraliśmy liposomy, ponieważ są one obecnie stosowane w praktyce klinicznej, a także stanowią powszechną platformę dla eksperymentalnych nanoleków. Aby rozpocząć procedurę, rozpuść 20 mg mieszaniny lipidowej, zawierającej 0,1% molowo lipofilowego kationowego barwnika fluorescencyjnego, w dwóch mililitrach chloroformu.Następnie wysusz lipidy za pomocą ewaporatora obrotowego. Do wysuszonych lipidów dodaj 20 mililitrów soli fizjologicznej z buforem fosforanowym. Sonicuj mieszaninę na lodzie za pomocą sonikatora z sondą 3,8 milimetra przy mocy 30 watów przez 30 minut, utrzymując przez cały czas temperaturę mieszaniny między czterema a 20 stopniami Celsjusza.Odwiruj otrzymaną zawiesinę liposomalnych nanocząsteczek przy 4 000 G przez 10 minut. Usuń osad i przemyj liposomy buforem PBS, używając odwirającej jednostki filtrującej o MWCO 100 kilodalton przy 4000 G. Przenieś skoncentrowane liposomy z górnej komory do nowej probówki do wirowania. Liposomy można przechowywać w buforze PBS w lodówce do jednego tygodnia.Przeprowadź dynamiczne rozpraszanie światła na mieszaninie 50 µL oczyszczonej zawiesiny liposomów i 950 µL PBS. Zmierz wielkość cząstek i określ rozkład wielkości. Aby rozpocząć procedurę radioznakowania, przenieś do probówki o pojemności 1,5 ml odpowiednią objętość oczyszczonych liposomów i PBS, aby uzyskać 2 mg lipidów.Dodaj do tego jeden milikiur szczawianu cyrkonu-89, aby uzyskać końcową objętość 100 µL i pH od 6,9 do 7,1. Mieszaj mieszaninę w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Następnie usuń wolny cyrkon-89 poprzez filtrację odśrodkową z użyciem jednostki filtrującej 100 kDa przy 4 000 ×g. Przemyj retentat sterylnym PBS trzykrotnie przy 4 000 ×g. Następnie rozcieńcz retentat do stężenia około trzech mikrokiur na µL przed wstrzyknięciem.Użyj metody HPLC z wykluczaniem rozmiarów w połączeniu z detektorem promieniowania, aby określić czystość radiochemiczną znakowanych izotopowo liposomów. Jeśli czystość radiochemiczna wynosi poniżej 95%, należy ponownie przygotować dawkę. Wykorzystaj dynamiczne rozpraszanie światła, aby potwierdzić, że wartości rozmiaru i rozkładu cząstek są zbliżone do wartości uzyskanych dla liposomów nieznakowanych.Aby rozpocząć procedurę obrazowania, wstrzyknij około 300 microcurie znakowanych radiologicznie liposomów do żyły ogonowej unieruchomionej myszy z czerniakiem. Dwie minuty po wstrzyknięciu, używając strzykawki insulinowej o rozmiarze 28G, pobierz od 10 do 20 µL krwi z żyły ogonowej myszy. Przenieś próbkę krwi do wcześniej zważonej probówki do licznika.Zważ próbkę krwi i zmierz jej aktywność za pomocą licznika gamma. Oblicz stężenie radioaktywności jako procent podanej dawki na gram. Piętnaście minut po wstrzyknięciu pobierz i zmierz kolejną próbkę krwi w ten sam sposób.Następnie znieczul mysz, podając 2% isofluranu i tlen za pomocą maski nosowej. Pobierz i zmierz trzecią próbkę krwi godzinę po wstrzyknięciu. Następnie pozwól myszy dojść do siebie w klatce regeneracyjnej, aż do odzyskania normalnej sprawności ruchowej.Pobierz dodatkowe próbki po 4, 8, 24 i 48 godzinach od wstrzyknięcia. Pozwól myszy na pełną rekonwalescencję pomiędzy wstrzyknięciami. Przechowuj mysz w pomieszczeniu przeznaczonym dla zwierząt, którym podano materiały radioaktywne.W 24. lub 48. godzinie po wstrzyknięciu liposomów znieczul mysz 2% isoflurane i tlenem. Umieść mysz na brzuchu na stole skanera mikroPET-CT dla małych zwierząt. Kontynuuj podawanie 2% isoflurane i tlenu za pomocą stożka nosowego.Nałóż maść weterynaryjną na oczy myszy, aby zapobiec ich wysychaniu. Następnie wprowadź stół skanera do urządzenia. Wykonaj 15-minutowe statyczne badanie PET całego ciała, rejestrując co najmniej 50 milionów zdarzeń koincydentnych, przy energii od 250 do 700 kiloelektronowoltów i oknie czasowym koincydencji wynoszącym sześć nanosekund.Następnie przeprowadź pięciominutowe badanie tomograficzne (CT) z 120 krokami rotacyjnymi na zakresie 220 stopni, z czasem około 145 milisekund na klatkę. Po zakończeniu skanowania niezwłocznie uśmierć mysz poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla. Potwierdź zgon, uciskając łapę zwierzęcia, a następnie wykonaj zwichnięcie kręgów szyjnych.Przeprowadź perfuzję tkanek za pomocą PBS w celu usunięcia krwi, a następnie pobierz odpowiednie próbki tkanek. Zważ zebrane tkanki i zmierz ich aktywność. Oblicz akumulację znakowanych radiacyjnie liposomów w tkance jako procent wstrzykniętej dawki na gram.Tkankę guza należy przechowywać w schłodzonym PBS. W pobranej tkance guza przeprowadzono cytometrię przepływową ex vivo oraz obrazowanie immunofluorescencyjne, aby zmierzyć akumulację w odniesieniu do populacji komórek. Obrazowanie PET/CT myszy z nowotworem, którym wstrzyknięto nanocząsteczki znakowane cyrkonem-89, wykazało znaczną akumulację nanocząsteczek w tkance guza 24 godziny po wstrzyknięciu.Określono, że okres półtrwania nanocząstek we krwi wynosi około 10 godzin. Pomiary biodystrybucji ex vivo wykonane 24 godziny po wstrzyknięciu były zgodne z pomiarami PET/CT in vivo. Następnie zbadano akumulację nanocząstek na poziomie pojedynczych komórek przy użyciu technik immunobarwienia.Cytometria przepływowa wykazała, że nanocząsteczki ulegają preferencyjnej akumulacji w makrofagach związanych z nowotworem. Obrazowanie immunofluorescencyjne próbek nowotworowych wskazało również na specyficzne celowanie nanocząsteczek w komórki śródbłonka. Technika ta może pomóc badaczom w zidentyfikowaniu obiecujących nanoleków do zastosowań klinicznych.Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, można ją przeprowadzić w ciągu trzech dni. Podczas znakowania nanoleków izotopami promieniotwórczymi ważne jest stosowanie wysokich standardów kontroli jakości. Zgodnie z tą procedurą można znakować inne nanoleki, takie jak nanoemulsje, nanocząsteczki polimerowe, micelle, przeciwciała i fragmenty przeciwciał, w celu pomiaru ich efektywności in vivo u myszy z nowotworem.

a-comprehensive-procedure-to-evaluate-vivo-performance-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Przedstawiamy nowatorskie podejście do ilościowego określania lokalizacji nanocząsteczek w naczyniach krwionośnych ludzkich guzów ksenoprzeszczepionych z wykorzystaniem dynamicznego obrazowania intravitalnego w czasie rzeczywistym w modelu zarodka ptaka.

Ocena wychwytu nanocząsteczek w guzach w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem obrazowania intravitalnego

Nanocząstki wirusowe pochodzenia roślinnego (VNPs) stanowią obiecujące platformy do zastosowań w biomedycynie. W niniejszym materiale opisujemy procedury propagacji, oczyszczania, charakteryzacji oraz biokoniugacji roślinnych VNP. Na koniec przedstawiamy zastosowanie VNP w celowanym dostarczaniu do guzów oraz obrazowaniu z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu u myszy i obrazowania fluorescencyjnego.

Nanocząsteczki wirusowe do obrazowania guzów in vivo

Przedstawiono przykład nanoleku opartego na kwasie polimalowym w kierunku racjonalnego projektowania medycyny spersonalizowanej, która ma zastosowanie w leczeniu raka. Opisuje syntezę nanoleku do leczenia Her2-dodatniego ludzkiego raka piersi u nagiej myszy.

Nanobiopolimery na bazie kwasu polimalowego do celowania w wiele markerów nowotworowych: szansa dla medycyny spersonalizowanej?

Tutaj, monitorowanie metabolizmu komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym, w połączeniu z modelem przerzutów in vivo błony kosmówkowo-omocznikowej (CAM) zarodka kurczaka, są wykorzystywane do oceny nowych celów/środków przeciwnowotworowych pod kątem ich zdolności do uwrażliwiania komórek nowotworowych na chemoterapeutyki uszkadzające DNA.

Ocena skuteczności uczulenia na leki przeciwnowotworowe in vitro i in vivo

Ten protokół określa kroki wymagane do przeprowadzenia walidacji ex vivo eksperymentów obrazowania ksenoprzeszczepów w bliskiej podczerwieni in vivo na myszach przy użyciu nanociał znakowanych fluoroforem i konwencjonalnych przeciwciał.

Walidacja eksperymentów obrazowania NIRF in vivo na podstawie ksenoprzeszczepu nowotworowego na myszach przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii ex vivo

Ten protokół przedstawia techniki i metodologię niezbędne do dokładnego dostarczania hipertermii magnetycznych nanocząstek przy użyciu zaawansowanego systemu dostarczania i monitorowania.

Dostarczanie hipertermii nanocząstek magnetycznych in vitro i in vivo za pomocą specjalnie zaprojektowanego systemu dostarczania

Opisano standardowy protokół do badania aktywności przeciwnowotworowej i związanej z nią toksyczności IL-1α w syngenicznym mysim modelu HNSCC.

Ocena aktywności przeciwnowotworowej in vivo nanocząstek bezwodnika IL-1α

Tutaj prezentujemy szczegółowe metody przygotowania i oceny nosowej samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsji in vitro i in vivo.

Przygotowanie, charakterystyka, toksyczność i skuteczność oceny samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsją do nosa in vitro i in vivo

Tutaj opisujemy protokół dostarczania in vivo magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza przenoszących oligomery RNA do przerzutowego raka piersi w modelach zwierzęcych, zapewniając klinicznie realne podejście do terapeutycznego wyciszania onkogennych kwasów nukleinowych.

Monitorowanie akumulacji nanoleków w przerzutach mysiego raka piersi

Poznaj metodę oceny nanoleków przeciwnowotworowych in vivo na myszach z guzami, obejmującą poziomy systemowy, tkankowy, komórkowy i subkomórkowy. Technika dual-labeling umożliwia kompleksową charakteryzację od makroskopowej do mikroskopowej.

Kompleksowa procedura oceny skuteczności in vivo nanoleków przeciwnowotworowych

Przeglądaj więcej filmów