Name: Rozwój Metarhizium anisopliae jako mykosektycydu: od izolacji do wydajności polowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Poznaj rozwój mykosektycydu z Metarhizium anisopliae dla zrównoważonej ochrony roślin przed szkodnikami. Metoda obejmuje izolację, identyfikację i selekcję szczepów grzybów z lokalnych izolatów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy doceniają wkład współpracowników z programu Indo-Swiss Collaboration in Biotechnology (ISCB) Departamentu Biotechnologii w New Delhi oraz Szwajcarskiej Agencji Rozwoju i Współpracy w Bernie w Szwajcarii. Docenia się wkład studentów i pracowników projektu zaangażowanych w rozwój mycoinsecticide, w tym Vandany Ghormade, Pallavi Nahar, Priya Yadav, Shuklangi Kulkarni, Manisha Kapoor, Santosh Chavan, Ravindra Vidhate, Shamala Mane i Abhijeet Lande. EKP i SGT dziękują odpowiednio Komisji ds. Grantów Uniwersyteckich w Indiach oraz Radzie Badań Naukowych i Przemysłowych (CSIR) w Indiach za stypendia badawcze. MVD dziękuje za wsparcie ze strony Rady Badań Przemysłowych i Naukowych w New Delhi dla programu dla Emeritus Scientist Scheme. Autorzy są wdzięczni Departamentowi Biotechnologii w New Delhi w Indiach za wsparcie finansowe w ramach programów ISCB i SBIRI. Jesteśmy wdzięczni recenzentom za ich wkład.

1. Izolacja grzybów entomopatogenicznych
<ol>
	<li>Metoda rozcieńczania gleby
	<ol>
		<li>Zbierz próbki gleby i grzybicze owady z różnych pól uprawnych (tabela 1). Wyizoluj grzyby entomopatogeniczne z próbek gleby za pomocą metody rozcieńczania gleby8. 
		Uwaga: W tym badaniu próbki pobrano z dystryktów Pune (18°31'13''N; 73°51'24''E) i Buldhana (19°58'36''N 76°30'30''E) w stanie Maharasztra w Indiach.</li>
		<li>Zważyć 10 g każdej próbki gleby i dodać je oddzielnie do 90 ml sterylnego 0,1% (w/v) Tween-80.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj próbki za pomocą mieszadła magnetycznego przez 60 minut, aby uwolnić zarodniki przylegające do cząstek gleby.</li>
		<li>Po wymieszaniu rozprowadzić od 100 do 200 μl podwielokrotności z każdej próbki na selektywnej pożywce zawierającej (g/L): pepton, 10; glukoza, 20; agar, 18; streptomycyna, 0,6; tetracyklina, 0,05; cykloheksamid, 0,05; i dodyna, 0,1 ml; pH 7,09. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C przez 3-7 dni.</li>
		<li>Wybierz i subkulturuj poszczególne kolonie zarodnikujące na tym samym podłożu, aby uzyskać czyste kultury.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Od grzybicowych owadów
	<ol>
		<li>Zbierz grzybicze owady z pola. 
		Uwaga: Twarde ciało larwalne może być zakażone grzybem entomopatogenicznym. W przypadku infekcji bakteryjnej lub wirusowej ciało martwego owada jest miękkie.</li>
		<li>Zbieraj żywe owady o nieprawidłowym zachowaniu, słabej koordynacji i gwałtownych ruchach.</li>
		<li>Trzymaj owady aż do śmierci, a następnie przenieś je do wilgotnych komór w celu dalszego rozwoju grzybicy i zarodnikowania, jeśli występuje, w temperaturze 28 °C i wilgotności względnej 70-80%.</li>
		<li>Zarodniki ze zwłok zarodnikujących należy rozbić na wyżej wymienionej pożywce selektywnej i uzyskać czyste kultury przez dalszą hodowlę 2-3 razy na tym samym pożywce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Metoda przynęty
	<ol>
		<li>Do fiolki (3,85 x 6,0 cm) zawierającej 60 g próbki gleby dodać 4 larwy ryżowej (Corcyra cephalonica) i przechowywać fiolki w temperaturze 25 ± 2 °C przez okres 14 dni.</li>
		<li>Codziennie należy odwracać fiolki do góry dnem. Po 14 dniach należy przesiać próbki gleby pod kątem obecności larw grzybicy ryżowej. Wyizoluj grzyba entomopatogenicznego, rozpylając zarodniki ze zwłok zarodnikujących na selektywnej pożywce.</li>
		<li>Po uzyskaniu czystych kultur przenieść izolaty na skosy z agatorem z dekstrozą ziemniaczaną (PDA) i inkubować w temperaturze 28 °C i 70-80% wilgotności względnej przez 7 dni, aby umożliwić zarodnikowanie. Po zarodnikowaniu należy utrzymywać kultury mateczne w temperaturze 8 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Identyfikacja grzybów entomopatogenicznych
<ol>
	<li>Identyfikuj grzyby entomopatogeniczne, obserwując cechy morfologiczne (tj. wielkość i kształt bezpłciowych zarodników oraz rozmieszczenie zarodników na konidioforach); można zidentyfikować izolaty 3 głównych rodzajów: Metarhizium, Beauveria i Nomuraea.</li>
	<li>W celu identyfikacji molekularnej szczepów Metarhizium, należy wyekstrahować genomowe DNA z biomasy grzybni za pomocą zestawu do izolacji DNA; postępować zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela Materiałów). Sprawdź jakość genomowego DNA, wykonując elektroforezę na 0,8% żelu agarozowym.
	<ol>
		<li>Amplifikacja PCR regionu rDNA ITS1-5.8S-ITS2 i 26S. Użyj genomowego DNA jako szablonu, z starterami ITS1 do przodu (TCCGTAGGTGAACCTGCGG) i ITS4 do tyłu (TCCTCCGCTTATTGATATGC)10.</li>
		<li>Eluować żel i oczyścić amplikony o oczekiwanej wielkości za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu; postępuj zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Określić ilościowo oczyszczony amplikon i sekwencję.</li>
		<li>Przeczytaj i edytuj sekwencje za pomocą oprogramowania i przeprowadź wyszukiwanie BLAST sekwencji nukleotydowych w bibliotece danych NCBI GenBank, aby przeanalizować bliską homologię11.</li>
		<li>Zdeponuj sekwencje zidentyfikowanych izolatów entamopatogennych w bazie danych NCBI GenBank w celu pobrania numerów dostępu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Badania przesiewowe izolatów Metarhizium przeciwko H. armigera
<ol>
	<li>Hodowla owadów
	<ol>
		<li>Ustal początkową kulturę H. armigera, zbierając zdrowe larwy i poczwarki owada z pola.</li>
		<li>Do hodowli larwy hoduj pojedynczo w sterylnych fiolkach polipropylenowych (3,85 x 6,0 cm, pojemność 50 ml) zawierających kawałki okry zdezynfekowane 0,5% (v/v) podchlorynem sodu przez 10 min12.</li>
		<li>Zbierz jaja owadów złożone podczas chowu i wysterylizuj je powierzchniowo 0,5% (v/v) podchlorynem sodu.</li>
		<li>Utrzymuj larwy w temperaturze 25 ± 2 °C i wilgotności względnej od 65 ± 5%.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test biologiczny owadów 
	Uwaga: Do testu biologicznego owadów, produkcji zarodników i badań wydajności w terenie wykorzystano pierwsze subkultury szczepów Metarhizium z larw grzybicy H. armigera, chyba że zaznaczono inaczej.
	<ol>
		<li>Do testów biologicznych owadów należy użyć larw H. armigera w stadium III.</li>
		<li>Zanurz zestaw 30 larw w trzech próbach pojedynczo w 10-mililitrowej zawiesinie zarodników izolatów Metarhizium (1 x 107 zarodników/ml, chyba że zaznaczono inaczej; żywotność > 90%) przez 5 s.</li>
		<li>Po leczeniu każdą larwę należy przenieść indywidualnie do oddzielnej, sterylnej fiolki, aby uniknąć kanibalizmu. Do każdej fiolki dodaj wilgotną bibułę filtracyjną Whatmann nr 1 i kawałek zdezynfekowanej okry jako paszę. Zmień papier i podawaj co drugi dzień.</li>
		<li>Utrzymuj larwy w temperaturze 25 ± 2 °C, wilgotności względnej 65 ± 5% i jasności 16:8: ciemne przez 14 dni lub do śmierci.</li>
		<li>Przenieść martwe larwy na sterylne płytki Petriego zawierające wilgotne waciki bawełniane i przechowywać je w temperaturze 28 °C i 70-80% wilgotności względnej przez 3-7 dni, aby umożliwić tworzenie się grzybni i zarodników na zwłokach.</li>
		<li>W celu kontroli należy potraktować zestaw 30 larw w trzech egzemplarzach 0,1% (w/v) Tween-80 w sterylnej wodzie destylowanej.</li>
		<li>Przeprowadzić wszystkie eksperymenty w trzech egzemplarzach, używając świeżo przygotowanych zawiesin zarodników. Zbierz i połącz dane dotyczące procentowej śmiertelności z trzech eksperymentów, aby uzyskać średnie wartości. Oblicz skorygowany procent śmiertelności, korzystając ze wzoru Abbotta13.</li>
		<li>Wykonaj eksperymenty przy użyciu randomizowanego układu pełnego bloku (RCBD), przy czym każdy zabieg zawiera zestaw 30 larw w trzech egzemplarzach. Na podstawie procentowej śmiertelności w stosunku do H. armigera, wybierz izolaty Metarhizium do dalszych badań przesiewowych najlepszego izolatu do produkcji komercyjnej.</li>
		<li>Wybrać izolaty wykazujące >90% śmiertelność wobec larw H. armigera III-instarvale. 
		Uwaga: W tym przypadku wybrano 12 izolatów.</li>
		<li>Określ LT50 tych izolatów i wybierz izolaty wykazujące najszybsze zabijanie (w krótszym czasie). 
		Uwaga: Tutaj wybrano 5 izolatów z 12 najsilniejszych izolatów.</li>
		<li>Oznaczyć wartości LC50 wybranych izolatów przy użyciu czterech różnych stężeń (tj. 1 ×10 3, 1 × 105, 1 × 107 i 1 × 109 zarodników/ml) zawiesiny przetrwalników.</li>
		<li>Określić LC50 izolatów Metarhizium w stosunku do larw H. armigera w stadium III, aby zwiększyć możliwość zidentyfikowania różnicy w zjadliwości izolatów o wysokich wartościach śmiertelności, które mogą pozostać niewykryte, jeśli zostanie zastosowana tylko jedna dawka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Produkcja zarodników izolatu metarhizium do badań terenowych
<ol>
	<li>Produkcja zarodników Metarhizium przez SSF
	<ol>
		<li>Dla SSF przygotuj inokulum, dodając 2 x 107 zarodników izolatów Metarhizium do 200 ml pożywki YPG (0,3% ekstraktu drożdżowego, 0,5% peptonu i 1,0% glukozy). Inkubować kolby w temperaturze 28 °C z wytrząsaniem (180 obr./min) przez 48 godzin.</li>
		<li>Do masowej produkcji zarodników przezSSF, użyj ryżu jako substratu, chyba że zaznaczono inaczej.</li>
		<li>W przypadku SSF napełnij worki autoklawu (typ / 14 pojedynczym filtrem mikrowentylacyjnym 0,5 μm; pojemność 2 kg; 64 × 36 cm) 2 kg ryżu. Dodaj 1,000 ml wody destylowanej do ryżu w torebkach i moczyć przez noc14. Torebki z namoczonym ryżem należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 45 min15.</li>
		<li>Zaszczepić torebki 48-godzinnym inokulum grzybni (10% inokulum, 200 ml na 2 kg ryżu) i inkubować w temperaturze 28 °C i wilgotności względnej 70-80% przez 14 dni.</li>
		<li>Zbierz zarodniki przez ekstrakcję płynem przy użyciu 0,1% Tween-80. W tym celu dodaj zawartość torebki do 0,1% Tween-80 (3 l na 1 kg ryżu), dokładnie wymieszaj, oddziel zarodniki od płynu przez odwirowanie i susz w temperaturze 37 °C przez 2 dni.</li>
		<li>Alternatywnie, suszyć worki zawierające ryż z zarodnikami i odrobiną grzybni w temperaturze 37 °C przez 2 dni, aby zmniejszyć zawartość wilgoci (<20%). Zbierz zarodniki za pomocą kombajnu myko-kombajnów lub przesiewacza wibracyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badania wykonalności
	<ol>
		<li>Określ procentową żywotność zebranych zarodników za pomocą różnych metod15. W tym celu przygotuj zawiesiny zarodników w 0,1% (w/v) Tween-80 i dostosuj liczbę do 1 × 103 zarodników/ml.</li>
		<li>Rozprowadzić zawiesiny przetrwalników (0,1 ml) na płytkach PDA w trzech egzemplarzach i inkubować w temperaturze 28 °C i wilgotności względnej 70–80% przez 72 godziny.</li>
		<li>Ręcznie policz izolowane kolonie i określ całkowitą liczbę żywotnych dla odpowiedniej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szybkość sedymentacji zarodników
	<ol>
		<li>Aby uzyskać jednolitą dawkę, wymagana jest jednorodna zawiesina zarodników; określić tempo sedymentacji zarodników dla izolatów Metarhizium zgodnie z opisem16. Sprawdź tempo sedymentacji zarodników w 0,2 M siarczanie amonu i 0,1% Tween-80.</li>
		<li>Dostosuj liczbę zawiesiny zarodników do ~7 × 107 zarodników/ml, aby uzyskać początkową absorbancję 0,6 przy 540 nm. Pozostaw kuwety w spokoju na 6 godzin, aby zarodniki opadły.</li>
		<li>Rejestrować absorbancję przez okres do 6 godzin. Wyrazić szybkość sedymentacji w procentach i obliczyć czas potrzebny do 50% sedymentacji (ST50). Powtórz eksperyment trzy razy, używając świeżo przygotowanych zawiesin zarodników.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Terenowe badania zdolności wybranego izolatu M. anisopliae do zwalczania H. armigera w grochu gołębim
<ol>
	<li>Preparat zarodników M. anisopliae M 34412 w postaci zwilżalnego proszku
	<ol>
		<li>Przygotuj preparat w postaci 2,5-5% zwilżalnego proszku, mieszając zarodniki z talkiem.</li>
		<li>Dostosuj końcową liczbę żywotnych (TVC) do 1 x 1012 zarodników na kg preparatu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Terenowe badania wydajności zarodników M. anisopliae M 34412
	<ol>
		<li>Do badań terenowych zdolności wybranego izolatu M. anisopliae do zwalczania inwazji H. armigera w grochu gołębim należy użyć RCBD z czterema powtórzeniami. 
		Uwaga: Tutaj wykonane w Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth (MPKV), Rahuri (19.3927° N, 74.6488° E).</li>
		<li>Stosować dwie różne formuły w sprayu: preparat olejowy z zarodników (5 x 1012 zarodników/3 l oleju napędowego: olej słonecznikowy, 7:3) i preparat wodny w Tween-80 (0,1%). Spryskać preparat olejowy opryskiwaczem o bardzo małej objętości (ULV) (70 min; 3 l/ha), preparat wodny opryskiwaczem plecakowym (5 x 1012 zarodników, 500 l/ha). 
		Uwaga: W tym przypadku populacje larw rejestrowano dzień przed opryskiem oraz 3 i 7 dni po zastosowaniu każdego oprysku na 5 losowo wybranych roślinach. Całkowita populacja została przekształcona na pierwiastek kwadratowy z n + 1 na potrzeby analizy statystycznej.
		<ol>
			<li>Zgodnie z praktykami rolniczymi dotyczącymi uprawy grochu gołębiego, pierwsze opryskiwanie należy wykonać między 10 a 15 dni po złożeniu jaj i jeszcze 2 razy w odstępie 14 dni. Oprysk należy wykonać między godziną 16:00 a 18:00 czasu polskiego. Monitoruj kierunek wiatru i, jeśli to konieczne, używaj zasłon z tkaniny, aby uniknąć przedostania się zarodników na sąsiednie działki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Dla porównania, spryskaj chemiczne środki owadobójcze ręcznym opryskiwaczem plecakowym.</li>
		<li>Określić trwałość inokulum w terenie, zbierając larwy H. armigera 0, 3, 5, 7 i 14 dni po oprysku.</li>
		<li>Larwy te należy obserwować przez okres 14 dni, a po śmierci przenieść je do plastikowej fiolki zawierającej wilgotną bibułę filtracyjną. Inkubować w temperaturze 25 ± 2 °C i wilgotności względnej 70 ± 10%, aby zaobserwować grzybicę.</li>
		<li>Określić trwałość inokulum w populacji larw na podstawie danych dotyczących procentowej śmiertelności larw zebranych z pola po oprysku.</li>
		<li>Oceń badania terenowe na podstawie procentowej skuteczności17, procentu uszkodzenia strąków i procentu plonów18. 
		Uwaga: W tym przypadku dane dotyczące parametrów, takich jak temperatura, wilgotność, prędkość wiatru (km/h), nasłonecznienie (h), opady deszczu (mm), dni deszczowe i parowanie (mm), zostały zarejestrowane podczas próby na uniwersytecie rolniczym (Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth, Rahuri, 19.3927° N, 74.6488° E).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Program partycypacyjny dla rolników
	<ol>
		<li>Wybierz liczbę rolników, którzy mają wziąć udział w próbach demonstracyjnych. Dostarcz rolnikom nasiona grochu gołębiego (BSMR - 736) wraz z nawozem. 
		Uwaga: W badaniu wzięło udział 20 rolników. Miejscowość: Deolali Pravara, (19.473° N 74.6° E).</li>
		<li>Stosować te same preparaty do opryskiwania i taką samą liczbę oprysków, jak w kroku 5.2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Wpływ na organizmy niebędące przedmiotem zwalczania
<ol>
	<li>Obserwuj wpływ sprayu mycoinsecticide, jeśli występuje, na liście grochu gołębiego.</li>
	<li>Stawonogi żyjące w glebie i owady zasiedlające liście należy zbierać 1 dzień po każdym zabiegu na poletkach niepoddanych działaniu środka oraz na poletkach, na których podawano M. anisopliae.</li>
	<li>W ciągu 24 godzin po podaniu działaniu środka należy zebrać stawonogi żyjące w glebie z pułapkami, a owady zasiedlające liście za pomocą siatki zamiatającej następnego ranka po podaniu działaniu (tj. około 15-18 godzin po zabiegu).</li>
	<li>Przechowuj je pojedynczo w cylindrycznych plastikowych pudełkach o średnicy 3,5 cm i wysokości 4,0 cm. Codziennie sprawdzaj owady pod kątem infekcji i karm je odpowiednim pokarmem.</li>
	<li>Zarejestruj obecność M. anisopliae, jeśli w ogóle, i wyizoluj grzyba.</li>
</ol>
7. Identyfikacja parametrów kontroli jakości
<ol>
	<li>Sprawdzić żywotność zarodników, mierząc zdolność kiełkowania zarodników na PDA w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Zmierz aktywność enzymów rozkładających naskórek, takich jak chitynaza, deacetylaza chitynowa, chitozanaza, proteaza i lipaza, wytwarzanych w pożywkach YPG i chitynowych, jak opisano wcześniej15.</li>
	<li>Określ procentową śmiertelność H. armigera w laboratoryjnym teście biologicznym15.</li>
	<li>Użyj markerów molekularnych, takich jak wzór PCR-RFLP genów chitynaz (Chit 1, 2 i 4) i proteazy (Pr1A), jako atrybutów wirulencji M. anisopliae.
	<ol>
		<li>Wyekstrahuj genomowe DNA z biomasy grzybni za pomocą zestawu do izolacji DNA15. Amplifikacja PCR fragmentów genów Chit1 i Chit2 przy użyciu genomowego DNA jako matrycy, z parami starterów Chit1F/Chit1R (CTCTGCAGGCCACTCTCGGT/AGCCATCTGCTTCCTCATAT) i Chit2F/Chit2R (GACAAGCACCCGGAGCGC/GCCTTGCTTGACACATTGGTAA). W przypadku Chit4 użyj pary starterów Chit4F/Chit4R (ATCCGGCAGCACGGCTAC/CTTGGATC CGTCCCAGTTG).</li>
		<li>Do amplifikacji genu Pr1A należy użyć pary starterów METPR2 i METPR5 (AGGTAGGCAGCCAGACCGGC/TGCCACTATTGGGGGGGGGCGG).</li>
		<li>Wykonaj trawienie restrykcyjne19 genu Chit1 z BsaJI, BstUI i ScrFI; genu Chit2 z AluI, HpyCH4IV i HpyCH4V oraz genu Chit4 z BstUI, HaeIII i MboI. Do trawienia genu Pr1A użyj RsaI, DdeI i MspI20.</li>
		<li>Obserwuj wzorzec polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) na 1,5% żelu agarozowym za pomocą elektroforezy dla każdego genu dla większości zjadliwych szczepów (>90% śmiertelności); można go użyć jako markera wirulencji do selekcji M. anisopliae.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Aktar, M. W., Sengupta, D., Chowdhury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+pesticides+use+in+agriculture%3A+their+benefits+and+hazards%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Impact of pesticides use in agriculture: their benefits and hazards.</a> Interdisciplinary Toxicology. 2 (1), 1-12 (2009).</li>
<li>Dhaliwal, G. S., Jindal, V., Mohindru, B. <a target="_blank" href="http://www.indianjournals.com/ijor.aspx?target=ijor:ije&volume=77&issue=2&article=012">Crop losses due to insect pests: Global and Indian scenario.</a> Indian J Entomol. 77 (2), 165-168 (2015).</li>
<li>Popp, J., Peto, K., Nagy, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s13593-012-0105-x">Pesticide productivity and food security. A review.</a> Agronomy for Sustainable Development. 33 (1), 243-255 (2015).</li>
<li>van Lenteren, J. C., Manzaroli, G. Evaluation and use of predators and parasitoids for biological control of pests in greenhouses. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+Lenteren%2C+JC+%22Integrated+pest+and+disease+management+in+greenhouse+crops%22">Integrated pest and disease management in greenhouse crops</a>. Albajes, R., Gullino, M. L., van Lenteren, J. C., Elad, Y. , Kluwer. Dordrecht, The Netherlands. 183-201 (1999).</li>
<li>Charnley, A. K., Collins, S. A. Entomopathogenic fungi and their role in pest control. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCharnley%2C+AK+%22The+Mycota+IV%3A+Environmental+and+Microbial+Relationships%22">The Mycota IV: Environmental and Microbial Relationships</a>. Kubicek, C. P., Druzhinina, I. S. , 2nd, Springer-Verlag. Berlin. 159-187 (2007).</li>
<li>Deshpande, M. V., et al. Comparative evaluation of indigenous fungal isolates, Metarhizium anisopliae M34412, Beauveria bassiana B3301 and Nomuraea rileyi N812 for the control of Helicoverpa armigera (Hüb.) on pulses. <a target="_blank" href="null">Proceeding of the international workshop on entomopathogenic fungi - a valuable alternative to fight against insect pests</a>. MV, D. eshpande , National Chemical Laboratory. Pune, India. 51-59 (2004).</li>
<li>Roberts, D. W., Hajek, A. E. Entomopathogenic fungi as bioinsecticides. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoberts%2C+DW+%22Frontiers+in+industrial+mycology%22">Frontiers in industrial mycology</a>. Leathan, G. F. , Chapman & Hall. New York, NY. 144-159 (1992).</li>
<li>Goettel, M., Inglis, G. D. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/book/9780124325555">Fungi: Hyphomycetes. Manual of techniques in insect pathology</a>. Lacey, L. A. , Academic Press. USA. 213-245 (1996).</li>
<li>Keller, S., Kessler, P., Schweizer, C. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1023/A:1023646207455">Distribution of insect pathogenic soil fungi in Switzerland with special reference to Beauveria brongniartii and Metharhizium anisopliae.</a> BioControl. 48 (3), 307-319 (2003).</li>
<li>White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWhite%2C+TJ+%22PCR-Protocols%3A+A+guide+to+methods+and+applications%22">PCR-Protocols: A guide to methods and applications</a>. Innis, M. A., et al. , Academic Press, Inc. San Diego. USA. 315-322 (1990).</li>
<li>Basic Local Alignment Search Tool. , 
 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST ">http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST </a> (2017).</li>
<li>Ignoffo, C. M., Futtler, B., Marston, N. L., Hostetter, D. L., Dickerson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022201175902943">Seasonal incidence of the entomopathogenic fungus Spicaria rileyi associated with noctuid pests of soybeans.</a> J Invertebr Pathol. 25 (1), 135-137 (1975).</li>
<li>Abbott, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+computing+the+effectiveness+of+an+insecticide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Econ+Entomol%22%5BJournal%5D)">A method for computing the effectiveness of an insecticide.</a> J Econ Entomol. 18 (2), 265-267 (1925).</li>
<li>Nahar, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+of+biocontrol+agents+for+the+control+of+pests+in+agriculture+using+chitin+metabolism+as+target%22">Development of biocontrol agents for the control of pests in agriculture using chitin metabolism as target</a>. , PhD thesis submitted to Department of Microbiology, University of Pune 137(2004).</li>
<li>Kulkarni, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/09583150802366475?journalCode=cbst20">Comparison of Metarhizium isolates for biocontrol of Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) in chickpea.</a> Biocontrol Sci Tech. 18 (8), 809-828 (2008).</li>
<li>Jeffs, L. B., Khachatourians, G. G. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/m97-004#.WNVDdDvyuUk">Estimation of spore hydrophobicity for members of the genera Beauveria, Metarhizium, and Tolypocladium by salt-mediated aggregation and sedimentation.</a> Can J Microbiol. 43 (1), 23-28 (1997).</li>
<li>Henderson, C. F., Tilton, E. W. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/48/2/157/2205826/Tests-with-Acaricides-against-the-Brown-Wheat-Mite?redirectedFrom=fulltext">Tests with acaricides against the brow wheat mite.</a> J Econ Entomol. 48 (2), 157-161 (1955).</li>
<li>Hassani, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Development+and+proving+of+biocontrol+methods+based+on+Bacillus+thuringiensis+and+entamopathogenic+fungi+against+the+cotton+pests+Spodoptera+littoralis%2C+Helicoverpa+armigera+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29+and+Aphis+gossypii+%28Homoptera%3A+Aphididae%29%22">Development and proving of biocontrol methods based on Bacillus thuringiensis and entamopathogenic fungi against the cotton pests Spodoptera littoralis, Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae) and Aphis gossypii (Homoptera: Aphididae)</a>. , PhD thesis submitted to Justus-Liebig-University Giessen, Germany (2000).</li>
<li>Enkerli, J., Ghormade, V., Oulevey, C., Widmer, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19682457">PCR-RFLP analysis of chitinase genes enable efficient genotyping of Metarhizium anisopliae var. anisopliae.</a> J Invert Pathol. 102 (2), 185-188 (2009).</li>
<li>Bidochka, M. J., Melzer, M. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11142404">Genetic polymorphism in three subtilisin-like protease isoforms (Pr1A, Pr1B and Pr1C) from Metarhizium strains.</a> Can. J. Microbiol. 46 (12), 1138-1144 (2000).</li>
<li>McCoy, C. W., Samson, R. A., Boucias, D. G. Entomogenous fungi. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMcCoy%2C+CW+%22Handbook+of+natural+pesticides%2C+Microbial+insecticides%2C+Part+A.+Entomogenous+protozoa+and+fungi%22">Handbook of natural pesticides, Microbial insecticides, Part A. Entomogenous protozoa and fungi</a>. Ignoffo, C. M., Mandava, N. B. , CRC Press. Boca Raton, FL. 151-236 (1988).</li>
<li>Nahar, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/09583150801935650">Effect of repeated in vitro sub-culturing on the virulence of Metarhizium anisopliae against Helicoverpa armigera (Lepidoptera Noctuidae).</a> Biocontrol Sci Tech. 18 (4), 337-355 (2008).</li>
<li>Kapoor, M., Deshpande, M. V. Development of mycoinsecticide for the control of insect pests: Issues and challenges in transfer of technology from laboratory to field. Kavaka. 40, 45-56 (2013).</li>
<li>Deshpande, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycopesticide+Production+by+Fermentation%3A+Potential+and+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycopesticide Production by Fermentation: Potential and Challenges.</a> Crit Rev Microbiol. 25 (3), 229-243 (1999).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W latach osiemdziesiątych XIX wieku podjęto pierwszą próbę wykorzystania Metarhizium do zwalczania skarabeusza (Anisoplia austriaca) i buraka cukrowego (Cleonis punctiventris21). W tym protokole jednym z warunków wstępnych było wyizolowanie zjadliwego szczepu z gleby lub z zakażonych owadów. Rzeczywiście, inne parametry, takie jak LC50, LT50 i ST50, w znacznym stopniu przyczyniły się do opłacalności produktu22,23<s...

Od czasu wprowadzenia pestycydów chloroorganicznych w latach 40. w Indiach, użycie pestycydów wzrosło wielokrotnie 1, przy czym szkodniki upraw nadal kosztują miliardy rupii2 rocznie pod względem utraty plonów w produkcji rolnej. Powszechne i nierozsądne stosowanie syntetycznych pestycydów stanowi ciągłe zagrożenie dla środowiska i zdrowia ludzkiego1. Masowe stosowanie pestycydów prowadzi do pozostałości w glebie i zubożenia naturalnych drapieżników szkodników. Służy również jako potężna presja selekcyjna do zmiany składu genetycznego populacji szkodnika, prowadząc do rozwoju odporności1. Pomimo ogromnych korzyści płynących z zielonej rewolucji, która wymagała dużych nakładów, takich jak nawozy i pestycydy, szkodniki nadal stanowią poważne ograniczenie biotyczne. Ogólne szacunki odnotowanych rocznych strat w uprawach w Indiach i na całym świecie wynoszą odpowiednio 12 mld USD2 i 2 000 mld USD3.
Gdy chemiczne pestycydy mają szkodliwy wpływ, gdy są używane do zwalczania szkodników owadzich, konieczne staje się poszukiwanie alternatywnych metod, które są ekologiczne, niezawodne, ekonomiczne i zrównoważone. Kontrola biologiczna stanowi odpowiednią alternatywę i obejmuje wykorzystanie pasożytów, drapieżników i patogenów mikrobiologicznych4. Na przykład grzyby są znane z infekowania szerokiej gamy szkodników owadzich, w tym lepidoptera, błonkoskrzydłych, chrząszczy i muchówek, często powodując naturalne epizootia. Ponadto, w przeciwieństwie do innych środków zwalczających owady bakteryjne i wirusowe, sposób działania grzybów chorobotwórczych dla owadów polega na kontaktach5. Grzyby te stanowią niejednorodną grupę ponad 100 rodzajów, z około 750 gatunkami zgłoszonymi wśród różnych owadów. Ważnymi patogenami grzybowymi są: Metarhizium sp., Beauveria sp., Nomuraea rileyi, Lecanicillium lecanii i Hirsutella sp., żeby wymienić tylko kilka6. M. anisopliae (Metchnikoff) Sorokin jest drugim najczęściej stosowanym grzybem entomopatogenicznym w kontroli biologicznej. Wiadomo, że atakuje ponad 200 gatunków owadów7.
W tym badaniu przedstawiono różne etapy związane z opartym na wiedzy rozwojem mykopestycydu z wykorzystaniem M. anisopliae. Obejmuje to: 1) identyfikację źródła (tj. gleby lub grzybicowych owadów) zjadliwych entomopatogenów, 2) identyfikację i selekcję entomopatogenów, 3) strategie utrzymania ich zjadliwego charakteru i skuteczności w laboratoryjnym teście biologicznym i w terenie, 4) opłacalne formułowanie zakaźnych rozpędów, 5) opracowanie unikalnych parametrów kontroli jakości zjadliwego preparatu, oraz 6) poszukiwania biologiczne i tworzenie wartości dodanej.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Hi-Media</td><td>RM666</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Siarczan amonu&nbsp;</td><td>Thomas Baker</td><td>11645</td><td>Analizator DNA odczynnika</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Biosystem zastosowany</td><td>Pryzmat ABI 3730&nbsp; &nbsp;</td><td>instrument</td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji DNA</td><td>Qiagen</td><td>69104</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Dodine</td><td>Sigma</td><td>45466</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Hi-Media</td><td>GRM077</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Knapsac sparyer</td><td>Kaypee</td><td>HY-16L (1004)</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Hi-Media</td><td>RM006-500G</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Fiolki z polipropylenu&nbsp;</td><td>Laxbro</td><td>SV-50</td><td>Plastikowe wyroby</td></tr><tr><td>Agar z dekstrozą ziemniaczaną (PDA)&nbsp;</td><td>Odczynnik Hi-Media</td><td>M096-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>SRL</td><td>28940</td><td>Odczynnik</td></tr><tr><td>Ultra niskoobjętościowy sparyer</td><td>Matabi</td><td>INSECDISK</td><td>Instrument</td></tr><tr><td>Worki jednorożców&nbsp;</td><td>Jednorożec</td><td>UP-140024-SMB</td><td>Torba autoklalawowa do</td></tr><tr><td>ekstraktu drożdżowego</td> SSF Oprogramowanie <td>Hi-Media</td><td>RM027-500G</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Chromas 2.1</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rozwój metarhizium anisopliae jako mykosektycydu: od izolacji do wydajności polowej

Development of Metarhizium anisopliae as a Mycoinsecticide: From Isolation to Field Performance

Głównym problemem podczas opracowywania komercyjnych mycoinsecticides jest szybkość zabijania w porównaniu do chemicznych insektycydów. Dlatego ważnym krokiem jest izolacja i badania przesiewowe w celu wyboru szybko działającego, wysoce zjadliwego grzyba entomopatogenicznego. Grzyby entomopatogeniczne, takie jak Metarhizium, Beauveria i Nomurea, które działają kontaktowo, są lepiej przystosowane niż Bacillus thuringiensis lub wirus nukleopolihedrozy (NPV), który musi zostać spożyty przez szkodnika owadziego. W niniejszej pracy wyizolowaliśmy 68 szczepów Metarhizium od zakażonych owadów za pomocą metody rozcieńczania gleby i przynęty. Izolaty zidentyfikowano poprzez amplifikację i sekwencjonowanie regionu rDNA ITS1-5.8S-ITS2 i 26S. Najbardziej zjadliwy szczep Metarhizium anisopliae został wybrany na podstawie mediany stężenia śmiertelnego (LC50) i czasu (LT50) uzyskanych w testach biologicznych owadów przeciwko larwom Helicoverpa armigera. Masową produkcję zarodników przez wybrany szczep przeprowadzono za pomocą fermentacji w stanie stałym (SSF) przy użyciu ryżu jako substratu przez 14 dni. Zarodniki wyekstrahowano z zarodnikowanej biomasy przy użyciu 0,1% tween-80 i przygotowano różne formuły zarodników. Próby terenowe preparatów do zwalczania inwazji H. armigera w grochu gołębim przeprowadzono metodą randomizowanego projektowania blokowego. Poziomy kontroli porażenia uzyskane przy użyciu oleju i preparatów wodnych (odpowiednio 78,0% i 70,9%) były lepsze niż 63,4% uzyskane przy użyciu pestycydów chemicznych.

Podczas badań, różne szczepy Metarhizium, Beauveria i Nomuraea zostały wyizolowane różnymi metodami izolacji (dane nie pokazane)6,14 Ponieważ stwierdzono, że szczepy Metarhizium są bardziej skuteczne w zwalczaniu H. armigera, straszliwego szkodnika roślin strączkowych6,14, dalsze izolacje były celem izolacji.Szczepy Metarhizium z różnych pól uprawnych i owadów ...

Tutaj opisujemy różne etapy związane z opartym na wiedzy rozwojem skutecznego środka mykosektycydowego, w tym izolację, identyfikację, badania przesiewowe i wybór "najlepiej dopasowanego" grzyba entomopatogenicznego, Metarhizium anisopliae, do zwalczania szkodników owadzich w rolnictwie.

Rozwój Metarhizium anisopliae jako mykosektycydu: od izolacji do wydajności polowej

A major concern when developing commercial mycoinsecticides is the kill speed compared to that of chemical insecticides. Therefore, isolation and ...

Nieostrożne stosowanie syntetycznych pestycydów stanowi ciągłe zagrożenie dla środowiska i zdrowia ludzi. Biokontrola z wykorzystaniem bakterii, wirusów i grzybów jest odpowiednią alternatywą w zwalczaniu różnych szkodników owadzich w rolnictwie. W przeciwieństwie do bakterii i wirusów, grzyby entomopatogenne działają poprzez kontakt.Gatunki z rodzaju Metarhizium należą do najskuteczniejszych grzybów entomopatogennych. Wiadomo, że atakują one ponad 200 gatunków owadów szkodników. Opracowaliśmy mykoinsektycyd z wykorzystaniem zarodników rodzimych izolatów Metarhizium.W tym filmie zostaną przedstawione protokoły izolacji i identyfikacji lokalnych izolatów grzybów, bioassay na owadach w celu przesiewania i wyboru bardziej potencjalnych szczepów, produkcja zarodników wybranych szczepów Metarhizium oraz protokół tworzenia opłacalnej formulacji mycoinsektycydu do zastosowań polowych. Omówione zostaną również środki kontroli jakości, które należy podjąć podczas produkcji komercyjnej. Izolację grzybów entomopatogennych można przeprowadzić za pomocą trzech metod.Po pierwsze, z gleb. Metarhizium jest grzybem naturalnie występującym w większości gleb. W celu uzyskania szerokiej gamy izolatów pobiera się próbki gleby z pól z różnymi rodzajami upraw oraz z obszarów oddalonych od siebie.Próbkę gleby pobiera się z głębokości od czterech do sześciu cali pod powierzchnią. Próbki z terenu zbiera się do oznakowanych woreczków, a następnie w laboratorium 10 g każdej próbki przenosi się do fiolek. Metarhizium izoluje się metodą seryjnych rozcieńczeń gleby na płytkach.10 g próbki gleby przenosi się do 90 ml sterylnego 0,1% Tween 80. Zawiesinę miesza się za pomocą mieszadła magnetycznego przez 60 minut. W międzyczasie przygotowuje się alikwoty Tween 80 o objętości 900 µl do rozcieńczeń seryjnych.Nadpływ z zawiesiny poddaje się teraz rozcieńczaniu seryjnem w alikwotach Tween 80. Alikwot o objętości 100 µL z każdej próbki nanosi się na podłoże opisane przez Kellera i współpracowników. Płytki inkubuje się w temperaturze 28 °C przez okres od trzech do siedmiu dni.Poszczególne kolonie sporulujące są następnie podkulturywane na tym samym podłożu w celu uzyskania kultur czystych. Aby wyizolować grzyba patogennego dla owadów, z pól zbiera się martwe owady. Zarodniki z mumiowatych zwłok oddziela się poprzez przeniesienie ich do Tween 80, a następnie za pomocą wortexowania.Następnie zawiesinę zarodników wymazuje się na płytce z agarem. Czyste kultury uzyskuje się poprzez dalsze pasażowanie na tym samym podłożu. W celu wyizolowania grzybów entomopatogennych z gleby wykorzystuje się larwy żywiące się słodem ryżowym.Do fiolki zawierającej 60 g próbki gleby dodaje się cztery larwy mącznika ryżowego. Fiolki inkubuje się w temperaturze 28°C. Larwy te zazwyczaj zagłębiają się w glebie, dlatego fiolki odwraca się codziennie przez maksymalnie 14 dni, aby ułatwić kontakt larw z zarodnikami grzybów znajdującymi się w glebie.Martwe larwy są okresowo wyjmowane i przenoszone do inkubatora wilgotnościowego w celu sporulacji. Procedura izolacji grzyba jest taka sama, jak ta stosowana w przypadku zwłok owadów. Po uzyskaniu czystych kultur izolaty są utrzymywane na skosach z agarem PDA, a kultury matki są przechowywane w temperaturze ośmiu stopni Celsjusza do momentu użycia.W celu identyfikacji grzybów z biomasy grzybni ekstrahuje się genomowe DNA. Do identyfikacji izolatów Metarhizium stosuje się startery 5', 3', ITS1 oraz ITS4. Amplikony o oczekiwanej wielkości są wycinane z żelu, oznaczane ilościowo i sekwencjonowane.Następnie sekwencje sprawdzono w bazie danych NCBI GenBank w celu identyfikacji izolatów na poziomie gatunkowym. Próbki gleby oraz martwe owady zebrane w dystryktach Pune i Buldana w stanie Maharashtra w Indiach dostarczyły 68 odrębnych izolatów Metarhizium. Z tej liczby 58 wyizolowano z gleb, a 10 z owadów.55 stanowiły Metarhizium anisopliae, osiem Metarhizium flavoviridae, a pięć Metarhizium robertsii. Zarodniki z podłoża pochyłego dodaje się do 10 ml Tween 80 i miesza w wstrząsarku wirotexowym. W celu przeprowadzenia bioanalizy na owadach, liczbę zarodników mierzy się przy użyciu hemocytometru.Następnie miano zostaje dostosowane do poziomu 10⁷ zarodników/ml. Zestaw 30 larw w trzech powtórzeniach jest zanurzanym indywidualnie na pięć sekund w 10 ml zawiesiny zarodników każdego izolatu Metarhizium. Do bioassayów owadów wykorzystuje się larwy Helicoverpa armigera w późnym drugim lub wczesnym trzecim stadium rozwojowym.Po potraktowaniu każdą larwę przenosi się do sterylnej fiolki zawierającej zwilżony papier filtracyjny Whatman nr 1 oraz kawałek zdezynfekowanej okry jako pokarm. Zestaw 30 larw w trzech powtórzeniach, potraktowanych 0,1% Tween 80 w sterylnej wodzie destylowanej, służy jako kontrola. Larwy utrzymuje się do momentu ich śmierci, monitorując je przez maksymalnie 14 dni.Kroki te powtórzono dla wszystkich 68 izolatów. Procent śmiertelności oblicza się poprzez zliczenie martwych i żywych larw. Martwe larwy przenosi się na sterylne szalki Petriego zawierające wilgotne tampony bawełniane i przechowuje w temperaturze 28 °C oraz przy wilgotności względnej od 70 do 80% przez okres od trzech do siedmiu dni w celu wywołania mykozy i sporulacji.Dane dotyczące procentowej śmiertelności z trzech eksperymentów zostały zestawione w celu wyznaczenia wartości średnich, które następnie skorygowano przy użyciu wzoru Abbotta. Wyselekcjonowano 12 izolatów Metarhizium, które wykazały śmiertelność powyżej 90%, aby określić medianowy czas letalny dla larw trzeciego stadium Helicoverpa armigera. Na podstawie wartości LT 50 zidentyfikowano pięć izolatów charakteryzujących się szybszym działaniem owadobójczym.Mediana stężeń letalnych dla pięciu zidentyfikowanych izolatów została określona przy użyciu czterech różnych stężeń zawiesiny zarodników. Na podstawie wartości LC 50 wybrano trzy izolaty Metarhizium do produkcji zarodników metodą fermentacji w stanie stałym. Pożywkę YPD przygotowano i wysterylizowano w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 minut.Zarodniki z podłoża w rurkach są przenoszone do 0,1% Tween 80. Zawiesiny zarodników trzech wybranych izolatów Metarhizium dodaje się do pożywki YPD. Kolby są następnie inkubowane na wytrząsarce.Autoklawowalne worki Unicorn wypełnione dwoma kilogramami ryżu namaczano przez noc w jednym litrze wody destylowanej, a następnie autoklawowano w temperaturze 121 °C przez 45 minut. Fermentację w stanie stałym testowano na takich podłożach jak ryż, sorgo, kukurydza i pszenica. spośród przetestowanych podłoży ryż zapewnił maksymalną sporulację izolatów Metarhizium.Worki szczepi się 10% biomasą grzybni w wieku 48 godzin. Zawartość należy dokładnie wymieszać i inkubować przez 14 dni. Zarodniki można zbierać przy użyciu różnych metod.W przypadku izolacji z wykorzystaniem Mycoharvester i Vibrosifter, worki zawierające sporulującą grzybnię są suszone w temperaturze 37 °C przez dwa dni, aby obniżyć zawartość wilgoci do poziomu poniżej 20%. Ekstrakcja w cieczy jest metodą bardziej wydajną. Ryż z zarodnikami umieszcza się w dużych naczyniach. Do naczyń wlewa się 0,1% Tween 80, a następnie mieszaninę dokładnie miesza się.Nadpływ jest filtrowany w celu usunięcia cząsteczek ryżu. Zarodniki są zagęszczane i oddzielane poprzez wirowanie. Następnie zarodniki są suszone w temperaturze 37 °C przez dwa dni.Zarodniki te można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu użycia. Aby zwiększyć okres przydatności podczas przechowywania, dodaje się talk i miesza go z zarodnikami. Aby metoda była skuteczna, zarodniki muszą być żywotne, dlatego należy zidentyfikować izolat, który daje maksymalną liczbę żywotnych zarodników.Zawiesiny zarodników przygotowuje się w 0,1% Tween 80 i dostosowuje ich stężenie do 10⁷ zarodników na ml. 10 µl zawiesiny zarodników nanosi się na szkiełka z PDA w trzech powtórzeniach, a następnie inkubuje. W ciągu 12 godzin żywe zarodniki zaczynają kiełkować.Po 12 godzinach pod mikroskopem zlicza się zarodniki tworzące rurki kiełkowe. Hydrofilowość zarodników jest istotna dla przylegania grzyba do kutykuli owada. Zawiesinę zarodników w siarczanie amonu i Tween 80 pobiera się kiretą.Drugą próbkę, bez zarodników, wykorzystuje się jako kontrolę. Stężenie zawiesiny zarodników dostosowuje się do poziomu około 7×10⁷ zarodników na ml, aby uzyskać początkową absorbancję 0,6 przy 540 nanometrach. Kuwety pozostawia się w spokoju przez około sześć godzin w celu osadzenia się zarodników.Rejestrowano absorbancję i obliczano czas potrzebny na 50% alimentation. Na podstawie uzyskanych wyników jeden szczep wybrano do zastosowań polowych. Pozostałe dwa posłużyły jako szczepy zapasowe.Badania polowe nad skutecznością zarodników wybranego izolatu Metarhizium M34412 w zwalczaniu infestacji Helicoverpa armigera na uprawach grochu cytrynowego przeprowadzono w układzie bloków randomizowanych z czterema powtórzeniami. Zastosowano dwie różne formulacje do oprysku. Formulację w 0,1% Tween 80 aplikowano za pomocą opryskiwacza plecakowego.Olejowa formulacja zarodników jest rozpylana za pomocą opryskiwacza ultra niskiej objętości. Oprysk wykonuje się rano lub wieczorem. Pierwszy oprysk przeprowadza się w fazie kwitnienia, a następnie powtarza go dwukrotnie w odstępach 14 dni.Owady *Helicoverpa armigera* zbierano w zernym, trzecim, piątym, siódmym i czternastym dniu po oprysku, a następnie przetrzymywano w komorze wilgotnościowej w celu wywołania mikozy. Podczas prób polowych dotyczących zwalczania *Helicoverpa armigera* w grochu strączkowym uzyskano skuteczność przekraczającą 70% przy zastosowaniu *Metarhizium anisopliae* M34412. Stwierdzono, że uszkodzenia strąków były najmniejsze w parcelach traktowanych *Metarhizium anisopliae* w porównaniu z parcelami traktowanymi chemicznymi pestycydami oraz w nie traktowanych parcelach kontrolnych.Liście grochu rzepnego przebadano pod kątem ewentualnych skutków zastosowania formulacji mykoinsektycydu na bazie oleju słonecznikowego i oleju napędowego. Z poletek traktowanych Metarhizium anisopliae zebrano stawonogi glebowe oraz owady zamieszkujące liście. Nie zaobserwowano żadnego szkodliwego wpływu na organizmy niecelowe z grupy stawonogów.Próby demonstracyjne przeprowadzono w miejscowości doo-lally-pra-va-da z udziałem 20 rolników. Preparat jest skuteczny przeciwko innym szkodnikom z rzędu owadów, takim jak ziemiórka, wiertel strąkowy, mączniki, mszyce wełniste oraz komary. Eksperymenty pozwoliły na zidentyfikowanie kluczowych parametrów kontroli jakości w produkcji mycoinsektycydów.Żywotność zarodników, mierzona jako stopień kiełkowania zarodników, powinna wynosić ponad 90% na podłożu PDA po 16 godzinach w temperaturze 28 stopni centigrade oraz przy wilgotności względnej od 70 do 80%. Śmiertelność Helicoverpa armigera powinna przekraczać 90% przy dawce 10 raised to seven zarodników w laboratoryjnym bioanalizie. W wyniku wielokrotnego pasażowania na sztucznym podłożu laboratoryjnym organizm traci swoją wirulencję.Po hodowli grzyba na pożywce chitynowej przez 72 godziny mierzy się aktywność enzymów degradujących kutykulę, takich jak chitynaza, chityn-deacetylaza, chitosanaza, proteaza i lipaza. Służą one jako markery biochemiczne wirulencji. Do trawienia genów chitynazy wykorzystano cztery różne zestawy po trzy enzymy restrykcyjne.Izolaty wykazujące śmiertelność powyżej 90% wykazały specyficzny wzór dla wszystkich trzech genów. Wzory te wykazują istotną korelację z profilami enzymów degradujących kutykulę, produkowanych zewnątrzkomórkowo przez izolaty Metarhizium. Po raz pierwszy sugerujemy wykorzystanie aktywności enzymu chitynazy oraz wzoru PCR genu chitynazy jako markerów wirulencji.Może to służyć jako wskaźniki jakości dla produkcji na skalę przemysłową. Aby zwiększyć opłacalność produktu, można zastosować biomasę grzybni do stymulacji wzrostu korzeni roślin. Może ona być również wykorzystana do izolacji chitosanazy w zastosowaniach medycznych.Te produkty z dodaną wartością sprawią, że ten mycoinsektycyd oparty na Metarhizium stanie się bardziej rentowny.

development-metarhizium-anisopliae-as-mycoinsecticide-from-isolation

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Ten protokół demonstruje dwie metody inokulacji w celu wprowadzenia entomopatogenu grzyba Beauveria bassiana jako endofitu do fasoli zwyczajnej (Phaseolus vulgaris), w ramach przygotowań do kolejnych ocen endofitycznej kontroli biologicznej.

Ustanawianie entomopatogenów grzybów jako endofitów: w kierunku endofitycznej kontroli biologicznej

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Grzyby entomopatogeniczne zyskały na znaczeniu jako środki biologicznej kontroli szkodników rolniczych. W tym badaniu z powodzeniem przeprowadzono masową produkcję wystarczającej liczby odpornych zakaźnych propagul południowoafrykańskich izolatów zarówno Metarhizium robertsii, jak i M. pinghaense do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim, przy użyciu rolnych produktów zbożowych.

Masowa produkcja grzybów entomopatogenicznych, Metarhizium robertsii i Metarhizium pinghaense, do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

Ten protokół przedstawia zoptymalizowany system testów biologicznych z oderwanymi liśćmi do oceny skuteczności grzybów entomopatogenicznych (EPF) przeciwko mszycy musztardowej (Lipaphis erysimi (Kalt.)), owadowi partenogenetycznemu. Metoda ta przedstawia w zarysie proces gromadzenia danych podczas eksperymentów na szalce Petriego, umożliwiając naukowcom konsekwentne mierzenie zjadliwości EPF wobec mszyc musztardowych i innych owadów partenogenetycznych.

Ocena wpływu mszyc grzybów entomopatogenicznych na owada partenogenetycznego, mszycę musztardową, Lipaphis erysimi (Kalt.)

Tutaj prezentujemy protokół pozyskiwania entomopatogenicznych grzybów z omacnicy leśnej oraz zastępczy sposób oceny ich entomopatogenicznej aktywności za pomocą modelowego owada Coleoptera. Ta metoda jest skuteczna i wygodna w badaniu entomopatogenicznych zasobów grzybów ze szkodników owadzich drążących drewno w lasach naturalnych.

Izolacja, identyfikacja behawioralna i ocena chorobotwórczości grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej

Eutrofizacja jezior jest problemem jakości wody na całym świecie, co sprawia, że potrzeba identyfikacji i kontroli źródeł składników odżywczych jest krytyczna. Laboratoryjne określenie szybkości uwalniania fosforu z rdzeni osadów jest cennym podejściem do określania roli wewnętrznego obciążenia fosforem i kierowania decyzjami zarządczymi.

Wyznaczony laboratoryjnie strumień fosforu z osadów jeziornych jako miara wewnętrznego obciążenia fosforem

Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół do oceny dostępności organicznych i nieorganicznych składników odżywczych oraz obfitości i struktury społeczności mikroorganizmów i wirusów w odległych środowiskach morskich.

Odkrywanie niewidzialnych graczy w oceanie - przewodnik terenowy po chemii wody i mikrobiologii morskiej

Przedstawiono szczegółowe metody produkcji biodiesla wraz z koizolacją alkenonów jako cennych produktów ubocznych z komercyjnych mikroalg Isochrysis.

Protokół eksperymentalny produkcji biodiesla z izolacją alkenonów jako produktów ubocznych z komercyjnej biomasy glonów Isochrysis

Ocena obfitości stawonogów w uprawach jest kluczowa dla badania dynamiki populacji i interakcji między gatunkami. Tutaj opisujemy modyfikację i zastosowanie dmuchawy do liści do odkurzania do pobierania próbek stawonogów w ryżu.

Modyfikacja i zastosowanie dmuchawy do liści do pobierania próbek stawonogów w terenie

Poznaj rozwój mykosektycydu z Metarhizium anisopliae dla zrównoważonej ochrony roślin przed szkodnikami. Metoda obejmuje izolację, identyfikację i selekcję szczepów grzybów z lokalnych izolatów.

Rozwój Metarhizium anisopliae jako mykosektycydu: od izolacji do wydajności polowej

Przeglądaj więcej filmów