Name: System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj system przesiewowy do oceny skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe Mycobacterium tuberculosis. Ta metoda oparta na lucyferazie przyspiesza odkrywanie nowych leków przeciwgruźliczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez BC Lung Association i Mitacs.

1. Szczep bakteryjny i pożywka wzrostowa
<ol>
	<li>Przygotować albuminę, dekstrozę i roztwór podstawowy soli (ADS), rozpuszczając 25 g albuminy surowicy bydlęcej, 10,0 g dekstrozy i 4,05 g chlorku sodu w 460 ml wody dejonizowanej. Wysterylizuj ADS z filtrem i przechowuj w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować bulion 7H9, dodając 4,7 g proszku 7H9 i 2 ml glicerolu do 900 ml oczyszczonej wody. Bulion 7H9 należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 10 minut i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej przed kontynuowaniem. Przygotuj 7H9ADST, dodając 100 ml ADS i 0,5 ml Tween80 do 900 ml bulionu 7H9. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odważyć 50 mg siarczanu kanamycyny i rozpuścić w 1 ml wody dejonizowanej; końcowe stężenie wynosi 50 mg/ml. Filtrować-sterylizować i przechowywać w temperaturze -20 °C. Dodać 0,5 ml roztworu podstawowego kanamycyny na 1 l 7H9ADST. 
	UWAGA: To podłoże powinno być świeże, więc odpowiednio skaluj objętości w zależności od wielkości kultury.</li>
	<li>Hoduj M. tuberculosis w 7H9ADST uzupełniony kanamycyną w kulturze stojącej. Codziennie wstrząsaj kulturą i rozcieńczaj ją, zanim OD600 osiągnie 1,0, aby uniknąć zbrylania. 
	UWAGA: Szczep M. tuberculosis wykorzystany do opracowania tej metody był przekształcony za pomocą plazmidu pJAK2.A plasmid12. pJAK2.A jest integracyjnym plazmidem opartym na wektorze pMV361, który umożliwia ekspresję wysokiego poziomu genu lucyferazy świetlika z promotora hsp60 i może być wybrany za pomocą kanamycyny.</li>
</ol>
2. THP-1 Medium i konserwacja
<ol>
	<li>Dodaj 50 ml inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 5 ml 200 ml L-glutaminy do 500 ml RPMI 1640, aby RPMI było niekompletne (około 10% FBS i 2 mM glutaminy).</li>
	<li>Utrzymuj hodowlę komórkową THP-1 zgodnie ze standardowym protokołem13. Krótko mówiąc, hoduj komórki THP-1 w niekompletnym pożywce RPMI, utrzymując gęstość komórek od 0,2 do 1 miliona na ml pożywki między przejściami.</li>
</ol>
3. Wysokoprzepustowe wewnątrzkomórkowe badania przesiewowe z użyciem M. tuberculosis wykazującej ekspresję lucyferazy H37Rv
<ol>
	<li>Zmierzyć gęstość optyczną aktywnie rosnącej zawiesiny bakteryjnej w spektrofotometrze o długości fali 600 nm. Obliczyć gęstość bakterii, używając współczynnika konwersji 0,1 OD600 = 3 x 107 bakterii na ml.</li>
	<li>Odpipetować wystarczającą ilość bakterii do wielokrotności infekcji (MOI) 10:1 do nowej probówki wirówkowej. Granulować przy 3,000 x g przez 10 minut i zassać płyn. Dodać 50 μl ludzkiej surowicy do 450 μl RPMI1640. Przeskaluj wolumin do wartości odpowiednich dla eksperymentu.</li>
	<li>Aby zoptymalizować bakterie, ponownie zawiesić osad o gęstości 1 x 108 bakterii na 500 μl RPMI1640 zawierających 10% surowicy ludzkiej. Pozostawić mieszaninę do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Określ gęstość hodowli komórek THP-1, licząc za pomocą hemocytometru i mikroskopu odwróconego.</li>
	<li>Granulować komórki w sterylnych probówkach wirówkowych o temperaturze 100 x g i temperaturze 37 °C przez 10 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w RPMI w stanie niekompletnym przy gęstości 1 miliona komórek na ml. Dodać octan forbolu-12-mirystynianu-13 (PMA) do końcowego stężenia 40 ng / ml. 
	UWAGA: Będzie to określane jako mieszanka różnicująca.</li>
	<li>Połączyć opsonizowaną M. tuberculosis z mieszanką różnicującą THP-1 przy MOI 10:1 i podwielokrotną końcową mieszaninę w ilości 100 μl na studzienkę na 96-dołkowej białej płytce z płaskim dnem. Regularnie mieszaj mieszaninę, aby zapewnić jednolitość. Pozostawić różnicowanie i zakażenie do przebiegu przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO2 .</li>
	<li>Umyj studzienki dwukrotnie po 100 μl RPMI każda. Dodaj związki rozcieńczone do pożądanych stężeń w RPMI niepełne i inkubuj przez 3 dni.</li>
	<li>Odessać pożywkę ze studzienek. Dodać 50 μl odczynnika do oznaczania lucyferazy do każdego dołka. Uszczelnij płytki za pomocą przezroczystych samoprzylepnych uszczelniaczy do płyt. Pozostawić 5 minut inkubacji w temperaturze 22 °C, a następnie uzyskać odczyt w luminometrze po upływie 1 s na studzienkę.</li>
</ol>
4. Analiza cytotoksyczności przy użyciu testu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu (MTT)14
<ol>
	<li>Różnicować komórki THP-1 w niekompletnym RPMI uzupełnionym 40 ng / ml PMA na przezroczystych 96-dołkowych płytkach. Utrzymuj gęstość komórek 1 milion na ml i podwielokrotność 100 μl na studzienkę. Pozostawić różnicowanie do przeprowadzenia przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5 % CO2 .</li>
	<li>Odessać pożywkę ze studzienek i umyć je dwukrotnie za pomocą RPMI 1640. Dodaj związki rozcieńczone w RPMI niekompletne do studzienek. Inkubować przez 3 dni.</li>
	<li>Rozpuścić 0,5 g MTT w 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w celu uzyskania roztworu podstawowego o stężeniu 5 mg/ml. Sterylny filtr i przechowywać w temperaturze -20 °C, z dala od światła; Najlepiej, aby to rozwiązanie było świeże.</li>
	<li>2,5 godziny przed końcem 3-dniowego okresu inkubacji dodać 25 μl roztworu MTT do każdego dołka i zakończyć okres inkubacji.</li>
	<li>Przygotuj 50% N,N-dimetyloformamid (DMF), mieszając 250 ml DMF z 250 ml wody dejonizowanej. </li>
	<li>Przygotować bufor ekstrakcyjny MTT w następujący sposób: Zważyć 100 g SDS w butelce o pojemności 500 ml i dodać 300 ml 50% DMF. Zastosuj małe ciepło, aby SDS się rozpuścił. Dodać 10 ml czystego kwasu octowego i 12,5 ml 1 M HCl. Napełnić do oznaczenia 500 ml 50% DMF; końcowy skład buforu ekstrakcyjnego to 50% DMF, 20% SDS, 2,5% kwas octowy i 2,5% 1 M kwas solny.</li>
	<li>Pod koniec okresu poddawania działaniu substancji dodać 100 μl buforu ekstrakcyjnego (podgrzanego do 45 °C w celu rozpuszczenia kryształów) do każdej studzienki. Pozostawić mieszaninę do inkubacji przez noc w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO2 . Odczytać absorbancję przy 570 nm. 
	UWAGA: Test cytotoksyczności najlepiej przeprowadzić równolegle z wewnątrzkomórkowym badaniem przesiewowym przy użyciu tej samej partii i wieku komórek THP-1.</li>
</ol>
5. Analiza aktywności w bulionie za pomocą testu Resazurin Asuzin class=3
<ol>
	<li>Uprawiać M. tuberculosis w 7H9ADST do środkowej fazy logarytmicznej (~ 0,5 - 0,8 OD600). Rozcieńczyć kulturę za pomocą 7H9ADST do 0,01 OD600. Rozcieńczyć związki w 7H9ADST do 2-krotności stężeń badanych i podsycić 100 μl każdego rozcieńczonego związku do każdego dołka.</li>
	<li>Przenieść 100 μl rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej do każdej studzienki. Pozostawić płytki do inkubacji w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze przez 5 dni. Rozpuść 10 mg rezazuryny w 100 ml wody dejonizowanej i sterylnym filtrze.</li>
	<li>Dodać 30 μl roztworu rezazuryny i monitorować zmianę koloru po 48 godzinach; wzrost bakterii jest wskazywany przez konwersję koloru z niebieskiego na różowy. 
	UWAGA: Analizę ilościową można również przeprowadzić, mierząc fluorescencję przy 590 nm ze wzbudzeniem przy 530 - 560 nm lub absorbancję przy 570 nm i 600 nm15.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+tuberculosis+report+2015%22">Global tuberculosis report 2015</a>. , WHO. (2016).</li>
<li>USFDA. FDA news realease. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm">http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm</a> (2012).</li>
<li>Yajko, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+method+for+determining+MICs+of+antimicrobial+agents+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).</li>
<li>Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+screening-based+identification+of+inhibitors+against+the+intraphagosomal+survival+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).</li>
<li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).</li>
<li>Mak, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+to+identify+inhibitors+of+ATP+homeostasis+in+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis.</a> ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).</li>
<li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+screen+in+Mycobacterium+tuberculosis+identifies+carbon-source-dependent+growth+inhibitors+devoid+of+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 1, 57(2010).</li>
<li>Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoevasion+and+immunosuppression+of+the+macrophage+by+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis.</a> Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).</li>
<li>Ramon-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+drug+combinations+for+tuberculosis+therapy+identified+by+a+novel+high-throughput+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).</li>
<li>Lam, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitazoxanide+stimulates+autophagy+and+inhibits+mTORC1+signaling+and+intracellular+proliferation+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS Pathog. 8, e1002691(2012).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Intracellular+Screen+for+New+Compounds+Able+To+Inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+Growth+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad-range+of+recombination+cloning+vectors+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria.</a> Plasmid. 62, 158-165 (2009).</li>
<li>ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx">https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx</a> (2016).</li>
<li>Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-examination+and+further+development+of+a+precise+and+rapid+dye+method+for+measuring+cell+growth%2Fcell+kill%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill.</a> J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).</li>
<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/PI-DAL1025-1100_TI%20alamarBlue%20Rev%201.1.pdf">AlamarBlue assay</a>. , Invitrogen. (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handbook+of+anti-tuberculosis+agents.+Introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction.</a> Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).</li>
<li>Riss, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiss%2C+TL+%22Cell+Viability+Assays%22">Cell Viability Assays</a>. , (2004).</li>
<li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+apramycin+in+murine+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of apramycin in murine infection models.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).</li>
<li>Ballell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+open-source+drug+discovery%3A+177+small-molecule+leads+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis.</a> ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).</li>
<li>Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18752626">Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice.</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).</li>
<li>Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+protein+tyrosine+phosphatase+%28PtpA%29+excludes+host+vacuolar-H%2B-ATPase+to+inhibit+phagosome+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).</li>
<li>Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+virulence+is+mediated+by+PtpA+dephosphorylation+of+human+vacuolar+protein+sorting+33B%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B.</a> Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).</li>
<li>Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. <a target="_blank" href="http://edepot.wur.nl/374646">The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models</a>. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).</li>
<li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> J Vis Exp. , e51960(2014).</li>
<li>Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+protein+C3+binding+to+Mycobacterium+tuberculosis+is+initiated+by+the+classical+pathway+in+human+bronchoalveolar+lavage+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid.</a> Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria.</a> PLoS One. 5, e10777(2010).</li>
<li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput%2Fhigh-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. , e51114(2014).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5, e1000645(2009).</li>
<li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Q203%2C+a+potent+clinical+candidate+for+the+treatment+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis.</a> Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych w odniesieniu do tej pracy.

Celem tego badania było stworzenie prostej i opłacalnej metody HTS z wykorzystaniem wewnątrzkomórkowego modelu zakażenia M. tuberculosis. Gruźlica jest chorobą człowieka charakteryzującą się zakażeniem makrofagów pęcherzykowych przez M. tuberculosis. Ze względu na kwestie bezpieczeństwa biologicznego w przeszłości stosowano badania obejmujące modele biologiczne zarówno bakterii, jak i komórek gospodarza. Wykazano jednak, że wykorzystanie bakterii zastępczych i modeli innych niż ludzkie są słabymi predyk...

Mycobacterium tuberculosis, czynnik wywołujący gruźlicę (TB), jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Gruźlica lekowrażliwości jest chorobą uleczalną, która wymaga stosowania wielu antybiotyków przez okres 6 miesięcy. Pomimo tego, że jest to choroba uleczalna, śmiertelność z powodu gruźlicy oszacowano na 1,5 miliona w 2015 roku1. W ciągu ostatnich 10 lat wzrosły obawy dotyczące występowania lekoopornej M. tuberculosis. Gruźlica wielolekooporna (MDR-TB) jest definiowana jako gruźlica, która jest oporna na co najmniej izoniazyd (INH) i ryfampicynę (RMP), a większość szczepów MDR-TB jest również oporna na wybrane leki przeciwgruźlicze drugiego rzutu, co ogranicza możliwości leczenia. Skutki lekooporności stanowią większe wyzwanie w leczeniu pacjentów jednocześnie zakażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV); 400 000 pacjentów na całym świecie zmarło na gruźlicę związaną z HIV w 2015 roku1. Rozczarowujące jest to, że Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków zatwierdziła tylko jeden nowy lek na gruźlicę przeciwko MDR-TB, bedakilinę, w ciągu ostatnich 40 lat2. Pilnie potrzebne są postępy w znalezieniu lepszych i krótszych terapii gruźlicy, aby utrzymać przewagę w walce z gruźlicą i MDR-TB.
Tradycyjnie, badania przesiewowe leków na gruźlicę są wykonywane w warunkach wzrostu in vitro na pożywce wzrostowej, gdzie związki są dodawane do hodowli i ich skuteczność w zwalczaniu mikroorganizmów jest określana przez liczenie jednostek tworzących kolonie (CFU) na pożywce stałej. Ponieważ liczenie CFU jest pracochłonne, czasochłonne i kosztowne, opracowano różne metody pośrednie w celu złagodzenia tego problemu. Do takich metod zalicza się test żywotności Alamar Blue3, oznaczanie fluorescencji4 z białka zielonej fluorescencji (GFP) lub luminescence5 z bakterii eksprymujących lucyferazę oraz oszacowanie całkowitego trifosforanu adenozyny (ATP)6,7.
Typowa gruźlica charakteryzuje się zakażeniem płuc M. tuberculosis, gdzie bakterie rezydują i namnażają się wewnątrz fagosomów makrofagów pęcherzykowych8. Prosty fenotypowy ekran w bulionie może być odpowiedni dla patogenów zewnątrzkomórkowych; jednak w perspektywie historycznej związki trafione przeciwko M. tuberculosis zidentyfikowane za pomocą tej metody często nie spełniają oczekiwań na dalszych etapach walidacji w modelach infekcji. Sugerujemy, że lek na gruźlicę najlepiej sprawdza się w wewnątrzkomórkowym modelu zakażenia komórek gospodarza. Niemniej jednak modele wewnątrzkomórkowe mają wiele barier technologicznych i biologicznych dla rozwoju wysokoprzepustowych badań przesiewowych (HTS). Dużą przeszkodą jest złożoność procesu infekcji, której przykładem są liczne etapy i staranne usuwanie bakterii zewnątrzkomórkowych poprzez mycie między myciami. Drugą poważną przeszkodą są długie wymagania czasowe, ponieważ wykrywanie wzrostu, zwykle wykonywane przez CFU liczące na płytkach hodowlanych, jest procesem, który trwa ponad 3 tygodnie. Jednym z rozwiązań, które zastąpiło liczbę CFU, została dostarczona przez zautomatyzowaną mikroskopię fluorescencyjną w połączeniu z bakteriami fluorescencyjnymi. Rozwiązanie to wymaga jednak początkowej inwestycji w sprzęt, która jest poza zasięgiem wielu laboratoriów badawczych. Prosta, tania i istotna z punktu widzenia choroby metoda HTS znacznie usprawniłaby proces odkrywania leków.
W tym badaniu przedstawiamy nowy, modułowy system HTS, który ma na celu dostarczenie szybkiego, wysoce skalowalnego, a jednocześnie ekonomicznego testu odpowiedniego do określania aktywności związków przeciwko wewnątrzkomórkowej M. tuberculosis. System ten składa się z trzech modułów: (i) wewnątrzkomórkowego, (ii) cytotoksyczności i (iii) testów w bulionie. Połączony wynik końcowy dostarcza wyczerpującego opisu właściwości związku, wraz z dodatkowymi informacjami na temat potencjalnego sposobu działania. Ten system badań przesiewowych został wykorzystany w kilku projektach z różnymi bibliotekami związków, które są ukierunkowane na sposób działania, w tym analiza synergii leków9, stymulacja autofagii10 oraz hamowanie czynnika wirulencji wydzielanego przez M. tuberculosis (niepublikowane). Badano również związki o nieznanym sposobie działania11. Zmodyfikowana wersja tej metody została również przyjęta przez naszego partnera przemysłowego jako podstawowa metoda przesiewowa w celu identyfikacji nowych związków przeciwko wewnątrzkomórkowej M. tuberculosis11.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>271210</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164</td><td></td></tr><tr><td>Albumina, bydlęce pH7</td><td>Affymetrix</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>siarczan kanamycyny</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N- Dimetyloformamid (DMF)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D131</td><td></td></tr><tr><td>1 M Kwas hydrocholorowy (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>351279212</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>351269</td><td></td></tr><tr><td>SDS Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Resazurin</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21187</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>M. gruźlica H37Rv</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa biała płytka z płaskim dnem</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>95-dołkowa przezroczysta płytka z płaskim dnem</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysta zgrzewarka do płyt</td> Spektrofotometr <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Biomate 3</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikropłytkowy</td><td>Biotek</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Luminometr</td><td>Applied Biosystems</td><td>Tropix TR717</td><td></td></tr></tbody></table>

system badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, czynnik wywołujący gruźlicę (TB), jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Wraz ze zwiększonym rozprzestrzenianiem się gruźlicy wielolekoopornej (MDR-TB) istnieje pilna potrzeba opracowania nowych strategii terapeutycznych przeciwko zakażeniom M. tuberculosis. Tradycyjnie, związki są oceniane na podstawie ich aktywności przeciwbakteryjnej w warunkach wzrostu in vitro w bulionie; jednak wyniki są często mylące w przypadku patogenów wewnątrzkomórkowych, takich jak M. tuberculosis, ponieważ fenotypowe warunki przesiewowe w bulionie znacznie różnią się od rzeczywistych stanów chorobowych w organizmie ludzkim. Badania przesiewowe w kierunku inhibitorów, które działają wewnątrz makrofagów, były tradycyjnie trudne ze względu na złożoność, zmienność infekcji i powolne tempo replikacji M. tuberculosis. W tym badaniu przedstawiamy nowe podejście do szybkiej oceny skuteczności związków na żywotność M. tuberculosis w modelu infekcji makrofagami. Korzystając z połączenia testu cytotoksyczności i testu żywotności M. tuberculosis w bulionie, byliśmy w stanie stworzyć system przesiewowy, który generuje kompleksową analizę związków będących przedmiotem zainteresowania. System ten jest w stanie generować dane ilościowe przy niskich kosztach, które są w zasięgu większości laboratoriów, a jednocześnie są wysoce skalowalne, aby dopasować się do dużych środowisk przemysłowych.

Wysokoprzepustowy screening wewnątrzkomórkowy z użyciem M. tuberculosis wykazującego ekspresję genu lucyferazy
Rysunek 2A oraz Tabela 1 zawierają surowe dane zebrane za pomocą luminometru, wyrażone w względnych jednostkach luminescencyjnych (RLU), wykazujące wpływ rosnącego stężenia leku przeciwgruźliczego ryfampicyny na M. tuberculosis wewnątrz komórek THP-1. Rysunek 2A</...

Opracowaliśmy modułowy, wysokoprzepustowy system przesiewowy do odkrywania nowych związków przeciwko Mycobacterium tuberculosis, ukierunkowanych na bakterie rosnące wewnątrzkomórkowo i w bulionie, a także cytotoksyczność wobec komórki gospodarza ssaków.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wielowymiarowa ocena wpływu związków na przeżywalność M.tuberculosis wewnątrz ludzkich makrofagów. Metoda ta opiera się na teście skuteczności z wykorzystaniem lucyferazy. W połączeniu z oceną cytotoksyczności oraz oznaczeniem MIC, może ona dostarczyć cennych informacji przydatnych przy modyfikacji związków typu HIT w procesie opracowywania leków przeciwgruźliczych.Główną zaletą naszej metody jest oszczędność czasu i pracy. Zastępuje ona analizę CFU (jednostek tworzących kolonie) analizą opartą na lucyferazie. Zazwyczaj osoby początkujące w tej technice mają trudności z zachowaniem powtarzalności przy ręcznym pipetowaniu w porównaniu z automatyzacją.Kluczowe jest stosowanie spójystej techniki pipetowania. Hodować komórki THP1 w pożywce RPMI w medium kompletnym, utrzymując gęstość komórek od 0,2 do jednego miliona komórek na mililitr medium pomiędzy pasażami.Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć OD600 aktywnie rosnącej zawiesiny bakteryjnej. Następnie oblicz gęstość bakterii, przyjmując przelicznik 0,1 OD600 równy 3 × 10⁷ bakterii na ml. Odpipetuj odpowiednią ilość bakterii dla MOI 10:1 do nowej probówki do wirowania.Następnie odwiruj bakterie,

system-for-efficacy-cytotoxicity-screening-inhibitors-targeting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film pokazuje test do oceny skuteczności leków przeciwko zakażeniu Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  Generowany jest model infekcji in vitro zawierający agregaty Mtb/makrofagów, który naśladuje infekcję in vivo. Po wprowadzeniu odpowiednich antybiotyków ich skuteczność jest testowana za pomocą testu resuzaryny w celu monitorowania przeżywalności bakterii przy rosnących stężeniach leku.

Test do oceny skuteczności leku przeciwko modelowi zakażenia Mycobacterium tuberculosis

Ten film demonstruje test w bulionie w celu określenia skuteczności antybiotyku przeciwko Mycobacterium tuberculosis. Kultura bakteryjna jest inkubowana z różnymi stężeniami antybiotyku bakteriobójczego. Skuteczność bakteriobójczą mierzy się, oceniając obecność żywych bakterii za pomocą testu resazurynowego.

Ocena skuteczności badanego związku przeciwko prątkom w bulionie

Tutaj opisujemy test fenotypowy mający zastosowanie do wysokoprzepustowych/wysokotreściowych ekranów małych interferujących bibliotek syntetycznego RNA (siRNA), związków chemicznych i Mycobacterium tuberculosis. Metoda ta polega na wykrywaniu znakowanych fluorescencyjnie Mycobacterium tuberculosis w znakowanej fluorescencyjnie komórce gospodarza za pomocą zautomatyzowanej mikroskopii konfokalnej.

Mikroskopowy test fenotypowy do oznaczania ilościowego prątków wewnątrzkomórkowych przystosowany do badań przesiewowych o wysokiej przepustowości/wysokiej zawartości

Próba CARA) to półilościowa, średnio przepustowa metoda oceny aktywności badanych agentów przeciwko prątkom, które się replikują, nie replikują, lub jedno i drugie.  CARA pozwala na szybką ocenę aktywności zależnej od czasu i stężenia oraz identyfikuje parametry, które należy realizować za pomocą testów jednostek tworzących kolonie (CFU).

Wizualizacja testu resazuryny agarowej z węglem drzewnym do półilościowego, średnioprzepustowego oznaczania liczby prątków

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Nowe modele i testy, które poprawiłyby wczesny proces opracowywania leków przeciwgruźliczych nowej generacji, są wysoce pożądane. Tutaj opisujemy szybki, niedrogi i zgodny z BSL-2 test do oceny skuteczności leku przeciwko Mycobacterium tuberculosis, który można łatwo dostosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych.

Wysokoprzepustowy, kompatybilny test do oceny skuteczności leku przeciwko prątkom gruźlicy pasażowanym przez makrofagi

Szybkie i skuteczne oznaczanie wzrostu wewnątrzkomórkowego M. tuberculosis jest kluczowe dla poszukiwania lepszych terapii przeciwko gruźlicy (TB). Protokół ten opisuje test detekcji kolorymetrycznej na bazie bulionu przy użyciu zautomatyzowanego systemu hodowli płynów do ilościowego określenia wzrostu Mtb w makrofagach traktowanych potencjalnymi terapiami kierowanymi przez gospodarza.

Zautomatyzowany system hodowli do stosowania w badaniach przedklinicznych terapii gruźlicy ukierunkowanych na gospodarza

Oznaczanie jednostek tworzących kolonie (CFU) jest złotym standardem w ilościowym oznaczaniu bakterii, w tym Mycobacterium tuberculosis, które mogą potrzebować tygodni na utworzenie widocznych kolonii. W tym miejscu opisujemy mikro-CFU do oznaczania CFU ze zwiększoną wydajnością czasową, zmniejszoną przestrzenią laboratoryjną i kosztami odczynników oraz skalowalnością do eksperymentów o średniej i wysokiej przepustowości.

Test jednostkowy tworzenia mikrokolonii do oceny skuteczności szczepionek przeciwko gruźlicy

To badanie opracowało test do wysokoprzepustowych badań przesiewowych przeciwko Mycobacterium abscessus z niedawno stworzonym podwójnym szczepem reporterowym, wykorzystując fluorescencję i luminescencję do szybkiej oceny żywotności bakterii. Protokół ten będzie istotny dla naukowców dążących do badań przesiewowych nowych leków przeciwko tej lekoopornej bakterii.

Opracowanie testów do wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków przeciwko prątkom

Przedstawiamy tutaj protokół do identyfikacji potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych poprzez badanie fenotypową, obejmujące syntezę chemiczną związku 4-aminochinolinowego, określenie jego minimalnego stężenia hamującego wobec Mycobacterium tuberculosis i ocenę jego cytotoksyczności w liniach komórek ssaczych.

Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Poznaj system przesiewowy do oceny skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe Mycobacterium tuberculosis. Ta metoda oparta na lucyferazie przyspiesza odkrywanie nowych leków przeciwgruźliczych.

System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Przeglądaj więcej filmów