System badań przesiewowych skuteczności i cytotoksyczności inhibitorów ukierunkowanych na wewnątrzkomórkowe prątki gruźlicy

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest wielowymiarowa ocena wpływu związków na przeżywalność M.tuberculosis wewnątrz ludzkich makrofagów. Metoda ta opiera się na teście skuteczności z wykorzystaniem lucyferazy. W połączeniu z oceną cytotoksyczności oraz oznaczeniem MIC, może ona dostarczyć cennych informacji przydatnych przy modyfikacji związków typu HIT w procesie opracowywania leków przeciwgruźliczych.

Główną zaletą naszej metody jest oszczędność czasu i pracy. Zastępuje ona analizę CFU (jednostek tworzących kolonie) analizą opartą na lucyferazie. Zazwyczaj osoby początkujące w tej technice mają trudności z zachowaniem powtarzalności przy ręcznym pipetowaniu w porównaniu z automatyzacją.

Kluczowe jest stosowanie spójystej techniki pipetowania. Hodować komórki THP1 w pożywce RPMI w medium kompletnym, utrzymując gęstość komórek od 0,2 do jednego miliona komórek na mililitr medium pomiędzy pasażami.

Użyj spektrofotometru, aby zmierzyć OD600 aktywnie rosnącej zawiesiny bakteryjnej. Następnie oblicz gęstość bakterii, przyjmując przelicznik 0,1 OD600 równy 3 × 10⁷ bakterii na ml. Odpipetuj odpowiednią ilość bakterii dla MOI 10:1 do nowej probówki do wirowania.

Następnie odwiruj bakterie, aby otrzymać osad, przy 3 000 ×g przez 10 minut. W celu opsonizacji bakterii dodaj 50 µL ludzkiej surowicy do 450 µL RPMI 1640 i użyj tej mieszaniny do resuspensji osadu bakteryjnego w gęstości 1 × 10⁸ bakterii na 500 µL medium. Inkubuj mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 30 minut.

Następnie, używając komory Counting chamber i mikroskopu odwróconego, należy określić gęstość hodowli komórek THP1. Następnie, w sterylnych probówkach do wirowania, należy zwirować komórki z prędkością 100 ×g w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Należy odessać nadsącz i resuspenderować komórki w medium RPMI w pełnym medium do gęstości 1 000 000 komórek/mL.

Dodać PMA do stężenia końcowego 40 nanograms per milliliter. Jest to mieszanina różnicująca. Połączyć opsonizowany M.tuberculosis z mieszaniną różnicującą THP1 przy MOI 10:1.

Następnie nanieś końcową mieszaninę w ilości 100 µL na dołek w białej płytce 96-dołkowej z płaskim dnem. Po tym procesie inkubuj różnicowanie i infekcję w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaczem i zawartością 5% CO2 przez noc. Następnego dnia przemyj dołki dwukrotnie, używając 100 µL medium RPMI.

Następnie dodać związki rozcieńczone do pożądanych stężeń oraz pożywkę RPMI w pełnym medium. Inkubować płytki przez trzy dni. Podczas korzystania z pipet wielokanałowych należy pamiętać o powolnym i jednostajnym naciskaniu tłoka oraz zawsze umieszczać końcówki pipety w tym samym miejscu wewnątrz każdej studni, aby zminimalizować zakłócenia dla komórek THP1.

Po inkubacji odessać pożywkę z dołków i dodać 50 µL odczynnika do analizy lucyferazy do każdego dołka. Następnie uszczelnić płytki za pomocą przezroczystych przylepnych uszczelniaczy do płytek. Inkubować płytki w temperaturze 22 °C przez pięć minut, a następnie użyć luminometru w celu dokonania odczytu przy czasie jednej sekundy na dołek.

Aby zróżnicować komórki THP1, po przygotowaniu mieszaniny do różnicowania zgodnie z instrukcją przedstawioną wcześniej w tym filmie, należy odmierzyć 100 µL mieszaniny do każdego dołka przezroczystej płytki 96-dołkowej z komórkami. Komórki należy inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2 przez noc. Następnego dnia należy odessać medium z dołków i przemyć je dwukrotnie za pomocą RPMI 1640.

Do studni dodaj 100 µL związków rozcieńczonych w niepełnym medium RPMI. Następnie inkubuj komórki przez trzy dni. Rozpuść 0,5 g MTT w 100 mL PBS, aby przygotować roztwór zapasowy o stężeniu 5 mg/mL.

Następnie roztwór należy wysterylizować przez filtrowanie. Na dwie i pół godziny przed zakończeniem trzy dniowego okresu inkubacji do każdej studzienki z komórkami należy dodać 25 µL roztworu MTT i dokończyć inkubację. Przygotować 50% dimetyloformamid (DMF), mieszając 250 ml DMF z 250 ml wody dejonizowanej.

Bufor do ekstrakcji MTT należy przygotować w następujący sposób. Do butelki o pojemności 500 ml wsyp 100 g SDS i dodaj 300 ml 50% DMF. Podgrzać delikatnie, aby SDS całkowicie się rozpuścił.

Dodać 10 ml czystego kwasu octowego oraz 12,5 ml jednomolowego kwasu solnego. Następnie dopełnić butelkę do kreski 500 ml za pomocą 50%DMF. Po zakończeniu okresu inkubacji dodać 100 µl buforu ekstrakcyjnego do każdej studzienki.

Inkubować mieszaninę w temperaturze 37°C w inkubatorze z nawilżaniem i 5% CO2 przez noc. Następnego dnia odczytać absorbancję przy 570 nm. Aby przeprowadzić test rezazurynowy, hodować M.tuberculosis w pożywce 7H9 ADST do środkowej fazy wzrostu logarytmicznego.

Rozcieńczyć kulturę w 7H9 ADST do OD600 wynoszącej 0,01. Do rozcieńczenia związków do dwukrotności stężeń testowych należy użyć 7H9 ADST. Następnie do każdego dołka przezroczystej płytki 96-dołkowej nanieść 100 µl każdego rozcieńczonego związku.

Przenieś 100 µL rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej do każdego dołka. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C w inkubatorze z nawilżeniem przez pięć dni. Rozpuść 10 mg rezazuryny w 100 mL wody dejonizowanej.

Następnie roztwór należy wysterylizować za pomocą filtra. Do otworów dodać 30 µL roztworu rezauryny. Następnie komórki inkubować przez 48 godzin.

Wzrost bakterii jest sygnalizowany zmianą koloru z niebieskiego na różowy. Przeprowadzić analizę ilościową zgodnie z protokołem tekstowym. Ten wykres rozrzutu przedstawia surowe dane luminescencyjne mierzone w względnych jednostkach luminescencji dla różnych stężeń ryfampicyny zastosowanych w badaniu M.tuberculosis oraz komórek THP1.

Na tym wykresie przedstawiono procentową redukcję oraz luminescencję w studzienkach traktowanych w porównaniu do studzienek nietraktowanych. Ryfampicyna jest w stanie zredukować o 99,9% względne jednostki światła, czyli RLU, pochodzące od wewnątrzkomórkowych M.tuberculosis przy stężeniu 0,1 µg/mL. Wyniki te są zgodne z wcześniej opublikowanymi danymi określonymi na podstawie CFU.

Na tej rycinie przedstawiono cytotoksyczność wywołaną przez rosnące stężenia G1-1H zastosowane w teście MTT. Stężenia 10 i trzech mikromolarnych znajdują się wyraźnie poniżej punktu odcięcia IC 50. Rycina ta obrazuje wpływ różnych stężeń antybiotyku apramycyny na konwersję rezauryny przez M.tuberculosis.

Wartość MIC90 w bulionie wyniosła od 2.5 do 5 µg/mL. Jest to wartość nieco wyższa niż wcześniej opublikowana wartość 1.5 µg/mL, jednak wciąż mieści się ona w dopuszczalnym zakresie.

Jak wykazano w niniejszym materiale, odparowanie staje się istotnym czynnikiem we wszystkich eksperymentach z przedłużonym czasem inkubacji. Należy zatem zadbać o odpowiednie nawilżenie inkubatorów, aby uniknąć niespójności wyników. Po opanowaniu technika ta pozwala na uzyskanie wiarygodnych danych wewnątrzkomórkowych w czasie zaledwie czterech dni.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby obchodzić się z komórkami THP1 delikatnie i zachować powtarzalność pipetowania w przypadku pracy bez użycia automatyzacji. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak wysokoprzepustowe obrazowanie (high content screening), aby ustalić, czy związki aktywnie działają bakteriostatycznie czy bakteriobójczo. Po opracowaniu protokół ten umożliwił badaczom zajmującym się poszukiwaniem leków przeciwgruźliczych szybką ocenę skuteczności związków przeciwko MTB wewnątrz ludzkich makrofagów.

Należy pamiętać, że praca z Mycobacterium tuberculosis jest niebezpieczna. Podczas obchodzenia się z tym mikroorganizmem należy stosować środki ostrożności i odpowiedni sprzęt.