Metody samointegracji biopolimerów megamolekularnych na granicy faz powietrze-LC
7 kwietnia 2017
Metoda indukowanej suszeniem samointegracji megamolekularnych biopolimerów na granicy powietrzno-ciekłokrystalicznej jest dostępna tutaj. Metodologia ta będzie przydatna nie tylko do zrozumienia makroskopowego potencjału biopolimerów, ale także jako metoda oceny materiałów miękkich w dziedzinach biomedycznych i środowiskowych.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena wpływu powietrza suszącego ciekłokrystalicznego lub granicy faz powietrze-LC na orientację megamolekularnych biopolimerów, takich jak polisacharydy, mikrotubule i DNA, jako wizualizowane zachowania dynamiczne w skali milimetrowej. Wiadomość ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie struktur dyspersyjnych, takich jak samoorganizacja biopolimerów w suchym środowisku, w którym żywe organizmy wpełzły na ziemię około 500 milionów lat temu. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona wykonanie rzutów z boku próbki podczas procesu suszenia bez suszenia w płaszczyźnie poziomej.
Aby rozpocząć tę procedurę, dodaj 0,5 grama sakranu do 100 mililitrów wody. Przykryj pojemnik folią spożywczą i mieszaj roztwór w temperaturze około 80 stopni Celsjusza przez ponad 12 godzin. Po pozostawieniu roztworów gumy sakranowej i ksantanowej do ostygnięcia, odwiruj roztwór sakranu w celu usunięcia zanieczyszczeń.
Teraz przygotuj 0,5-procentowy roztwór tubuliny w buforze Brittona-Robinsona na lodzie. Wymieszać 50 mikrolitrów roztworu tubuliny z 5 mikrolitrami GpCpp. Następnie inkubować roztwór w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, aby uzyskać stabilną mikrotubulę lub jądro MT.
Następnie wymieszaj 950 mikrolitrów roztworu tubuliny i 50 mikrolitrów GpCpp zawierającego roztwór tubuliny. Następnie pozostaw roztwór na jeden dzień w temperaturze około 25 stopni Celsjusza, aby uzyskać stabilny roztwór MT o zawartości 0,5 procenta wagowego. Następnie przygotuj 0,5-procentowy roztwór DNA i roztwór buforowy Tris-EDTA.
Roztwory próbek biopolimeru o zawartości 0,5 procent wagowych należy przechowywać w temperaturze 25 stopni Celsjusza do eksperymentu suszenia. Wytnij arkusz silikonu do odpowiedniego kształtu o grubości 1 milimetra. Zamontuj jednostronnie otwartą komórkę składającą się z silikonowej przekładki i dwóch niemodyfikowanych szkiełek szkiełkowych.
Zamocuj obie strony celi za pomocą podwójnych klipsów, aby zapobiec wyciekaniu roztworów próbki. Używając końcówki pipety o wielkości porów o wielkości jednego milimetra, powoli dodaj od 100 do 300 mikrolitrów każdego roztworu biopolimeru o zawartości 0,5% wagowych do każdej komórki w temperaturze około 25 stopni Celsjusza. Usunąć pęcherzyki powietrza z komórki za pomocą igły strzykawki.
Następnie umieść komórki w piekarniku z cyrkulatorem powietrza na 18 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza pod ciśnieniem atmosferycznym w celu odparowania. Kierunek działania jest przeciwny do kierunku grawitacji. Umiejscowienie to jest również stosowane do monitorowania tych ostatnich opinii.
Użyj 100-watowej lampy halogenowej ze źródłem światła o płaskiej powierzchni na dużym obszarze, aby zapewnić proste światło widzialne. Ustaw polaryzatory na 45 stopni i 135 stopni za pomocą uchwytów. Ustal pozycje źródła światła, polaryzatorów, sample stage i kamery za pomocą szyny optycznej i rozstawu prętów.
Umieść sample stage między dwoma polaryzatorami. Następnie umieść aparat w odległości około 20 centymetrów od stolika próbki, aby umożliwić ustawienie ostrości. W podanych godzinach wskazanych w protokole tekstowym należy umieścić próbki biopolimeru pomiędzy polaryzatorami na stoliku równolegle do płaszczyzny XZ i przykryć urządzenie czarną kurtyną.
Na koniec sfotografuj próbki przez liniowe skrzyżowane polaryzatory za pomocą cyfrowej lustrzanki jednoobiektywowej ze standardowym obiektywem zmiennoogniskowym. Oceniono samointegrację z mikrodomeny do makrodomeny na interfejsie powietrze-LC suszące. Przed wysuszeniem zaobserwowano jasne obszary ze światłem przechodzącym w stanie rozproszonym.
Po wysuszeniu obszar pod granicą faz powietrze-LC i roztworu sakranu stał się wysoki, a intensywność roztworu ksantyny zmniejszyła się wraz z małymi makrodomenami. Analiza czasoprzestrzenna wykazała, że szczytowa intensywność wokół granicy faz powietrze-ciecz i grubość wzrosły, co wskazuje, że mikrodomeny zaczynają orientować się od granicy faz powietrze-LC i rosną w domenę w skali mili równoległej do granic fazy. Mikroskopijne obrazy polaryzacyjne fazy płynu sakranowego pokazały jeden niebieski obszar, co oznaczało, że utworzyła się pojedyncza makrodomena.
Faza płynu gumy ksantanowej wykazywała niebieskie, żółte i różowe obszary, co oznacza, że wiele makrodomen utworzyło się o dowolnej orientacji. Przed suszeniem roztwory sakranu i MT wykazywały podobne stany LC z rozproszonymi domenami. Podczas suszenia rozwiązanie MT uległo samointegracji, a rozproszone domeny zostały zintegrowane w jedną makrodomenę.
Roztwór DNA nie wykazywał specyficznej orientacji w fazie ciekłej. Zapis suszenia sakranów wykazywał znaczną dwójłomność, a w przypadku rekordu suszenia MT zaobserwowano faliste wiązki. Zapis suszenia DNA wykazał makrodomeny w kształcie ziaren w dowolnych kierunkach.
Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się inżynierią biomedyczną wykorzystującą biopolimery do zbadania wizualizacji dynamiki strumienia powietrza zarówno w procesach suszenia, jak i zwilżania w podejściach geometrycznych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę indukowanej suszeniem samointegracji megamolekularnych biopolimerów na granicy fazy powietrze-ciecz kryształyczna. Technika ta ma na celu zrozumienie zachowania biopolimerów w środowisku wysychającym, co jest istotne zarówno w zastosowaniach biomedycznych, jak i środowiskowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biopolimery
- Materiały miękkie
- Zastosowania biomedyczne
Wstęp
- Megamolekularne biopolimery obejmują polisacharydy, mikrotubule i DNA.
- Zrozumienie samoorganizacji biopolimerów jest kluczowe dla wielu dziedzin nauki.
- Niniejsze badanie analizuje dynamikę biopolimerów w warunkach wysychania.
- Zastosowana technika umożliwia obserwację próbek z profilu podczas procesu wysychania.
Cel badania
- Ocena wpływu interfejsu powietrze-LC na orientację biopolimerów.
- Wizualizacja dynamicznych zachowań biopolimerów w skali milimetrowej.
- Rozwiązanie kwestii dotyczących samoorganizacji biopolimerów.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworu sacranu poprzez rozpuszczenie 0,5 g w 100 ml wody.
- Mieszanie roztworu w temperaturze około 80 °C przez ponad 12 godzin.
- Centryfugowanie roztworu sacranu w celu usunięcia zanieczyszczeń.
- Obserwacja zachowania biopolimeru podczas procesu suszenia.
Główne wyniki
- Udało się zwizualizować dynamiczne zachowania biopolimerów.
- Proces suszenia wpłynął na orientację biopolimerów.
- Widoki boczne dostarczyły unikalnych informacji na temat procesu samointegracji.
- Metoda ta ma potencjalne zastosowania w różnych dziedzinach.
Wnioski
- Metoda samointegracji indukowanej suszeniem jest skuteczna w badaniu biopolimerów.
- Technika ta może zwiększyć zrozumienie zachowania biopolimerów w środowiskach naturalnych.
- Przyszłe zastosowania mogą obejmować postępy w badaniach biomedycznych i środowiskowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Metoda ta umożliwia wizualizację samoorganizacji megamolekularnych biopolimerów na granicy fazy powietrze-ciekły kryształ podczas suszenia, dostarczając informacji o zachowaniu materiałów miękkich istotnych w zastosowaniach biomedycznych i środowiskowych. Poprzez rejestrowanie czasowo-przestrzennych zmian w uporządkowaniu orientacyjnym w warunkach kontrolowanego odparowania, metoda ta wspomaga ograniczanie ryzyka mechanistycznego na wczesnym etapie charakterystyki biopolimerów. Podejście to zapewnia skalowalną, bezznakową platformę do oceny organizacji biopolimerów bez zaburzania stanów natywnych, co wpisuje się w potrzeby walidacji celów i opracowywania testów w procesach odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie dynamiki samoorganizacji biopolimerów w warunkach stresu związanego z wysychaniem, wyjaśniając funkcjonalne powiązania między polisacharydami, białkami cytoszkieletu a DNA.
- Wartość operacyjna: Dostarcza powtarzalny protokół obrazowania z widoku bocznego z wykorzystaniem światła spolaryzowanego krzyżowo do monitorowania integracji domen w skali milimetrowej bez artefaktów wynikających z poziomego wysychania.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych odczytów dwójłomności i morfologii domen, które odzwierciedlają zmiany w orientacji molekularnej podczas odparowywania rozpuszczalnika.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację analizy dzięki konstrukcji ogniwa otwartego z jednej strony oraz stałemu ustawieniu polaryzatorów, co umożliwia spójne porównywanie różnych typów biopolimerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy indukowaną w warunkach in vitro samointegrację wywołaną wysychaniem z naturalnymi procesami odwodnienia tkanek, oferując system istotny w kontekście chorób do badania funkcji barierowej skóry lub tkanek naczyniowych.
- Wartość operacyjna: Zwiększa pewność predykcji poprzez korelację zachowania na styku powietrze-ciecz (LC) z przejściami fazowymi biopolimerów w całej objętości, które można obserwować za pomocą mikroskopii polaryzacyjnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w przepływy pracy na etapie wczesnego odkrywania, wspierając weryfikację hipotez w walidacji celu oraz umożliwiając przygotowanie biopolimerów gotowych do analiz w ramach późniejszych badań przesiewowych i studiów mechanistycznych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez wizualizację wpływu warunków suszenia na orientację biopolimerów od domen mikro- do makroskalowych, dostarczając informacji o oddziaływaniach z celem w warunkach stresu środowiskowego.
- Przesiewanie: Umożliwia przygotowanie testów dzięki standaryzowanemu sporządzaniu roztworów sacranu, mikrotubul i DNA w kontrolowanych komorach środowiskowych.
- Analityka: Dostarcza wyników ilościowych poprzez analizę intensywności i grubości domen dwójłomnych, co pozwala na porównanie kinetyki samointegracji różnych klas biopolimerów.
- Badania translacyjne: Łączy się z ciągłością badań przedklinicznych poprzez modelowanie indukowanych suszeniem zmian strukturalnych istotnych dla funkcji bariery nabłonkowej lub przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do oceny stabilności formulacji biopolimerowych w warunkach stresu odwodnienia, możliwą do zastosowania w wielu projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w samoorganizacji biopolimerów poprzez bezpośrednią obserwację integracji kierowanej przez interfejs powietrze-ciecz krystaliczna (LC).
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu montażowi komórek, odparowywaniu w kontrolowanej temperaturze oraz stałemu ustawieniu optycznemu.
- Wartość strategiczna: Poprawia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) przy wyborze biopolimerów poprzez wczesne przewidywanie strukturalnych skutków indukowanych przez suszenie na etapie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów na biopolimery z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o ich zachowanie podczas samointegracji oraz stabilność orientacyjną.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu mikroskopii polaryzacyjnej oraz obsługi biopolimerów w kontrolowanych warunkach nawodnienia.
- Metoda opiera się na zastosowaniu szyn optycznych, polaryzatorów, halogenowych źródeł światła oraz komór środowiskowych zapewniających stabilne odparowywanie.
- Niezbędna jest standaryzacja procesu nakładania próbek, usuwania pęcherzyków powietrza i uszczelniania w celu zapobiegania artefaktom krawędziowym podczas suszenia.
- Adaptacja w różnych systemach modelowych wymaga walidacji stężenia, kompatybilności buforów oraz kinetyki nukleacji dla każdego biopolimeru.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na wibracje, wahania wilgotności oraz konieczność stosowania warunków obrazowania w ciemnym polu, aby uniknąć fotoblaknięcia.
