Name: Metody samointegracji biopolimerów megamolekularnych na granicy faz powietrze-LC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj metodę samointegracji megamolekularnych biopolimerów na granicy faz powietrze-LC. Technika umożliwia obserwację orientacji polisacharydów, mikrotubul i DNA podczas suszenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant dla Młodych Naukowców (16K17956) z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii Japonii, Centrum Technonauki w Kioto oraz Fundacji Mitani na rzecz Badań i Rozwoju.

1. Instrumenty
<ol>
	<li>Urządzenie polaryzacyjne
	<ol>
		<li>Aby skonstruować urządzenie polaryzacyjne, należy zapewnić źródło światła z lampą halogenową, światłowodem, polaryzatorami, stolikiem na próbkę, szyną optyczną, stojakami na pręty i cyfrową lustrzanką jednoobiektywową (patrz rysunek 1C i lista materiałów dla części urządzenia polaryzacyjnego).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworu biopolimeru
<ol>
	<li>Roztwory polisacharydowe
	<ol>
		<li>Rozpuść sacran7 (0.5 g) w czystej wodzie (100 ml) mieszając w temperaturze ~80 °C przez ponad 12 godzin. Podczas rozpuszczania przykryj pojemnik folią, aby zapobiec parowaniu. W ten sam sposób przygotuj wodny roztwór gumy ksantanowej.</li>
		<li>Schłodzić roztwory w temperaturze ~25 °C do uzyskania 0,5% wag. roztworów wodnych.</li>
		<li>Odwirować roztwór sakranowy w celu usunięcia zanieczyszczeń (48 400 x g, 4 °C, 1 h, 3 razy).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozwiązanie MT
	<ol>
		Przygotować 0,5% wag. roztwór tubuliny (1 ml) w buforze Brittona-Robinsona (80 mM piperazyno-N,N′-bis(kwas 2-etanosulfonowy) (PIPES); 1 mM glikolu etylenowego-bis(β-aminoetyloeter)-N,N,N',N'-tetraoctowego (EGTA); i 5 mM MgCl2, pH 6,8) na lodzie8.<li></li>
		<li>Użyć 0,5% wag. roztworu tubuliny (50 μl) i trifosforanu guanozyno-5'-[(α,β)-metyleno]trifosforanu (GpCpp) (5 μl) w celu przygotowania roztworu tubuliny zawierającego GpCpp (50 μl). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 godziny w celu uzyskania stabilnego jądra MT. 
		UWAGA: Rolą GpCpp jest wspomaganie tworzenia MT i całkowite zahamowanie depolimeryzacji MT do tubuliny.</li>
		<li>Mieszać 0,5% wag. roztwór tubuliny (950 μl) i roztwór tubuliny zawierający GpCpp (50 μL) w temperaturze ~25 °C przez 1 dzień, aby uzyskać stabilny roztwór MT o stężeniu 0,5% wag.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwór DNA
	<ol>
		<li>Przygotować 0,5% wagowy roztwór DNA (1 ml) w roztworze buforowym Tris-EDTA (10 mM Tris, pH 8,0, z 1 mM EDTA).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Roztwory próbek biopolimeru o stężeniu 0,5% wagowym należy przechowywać w temperaturze 25 °C do czasu przeprowadzenia eksperymentu suszenia.</li>
</ol>
3. Eksperymenty i obserwacje suszenia w świetle spolaryzowanym krzyżowo
<ol>
	<li>Roztwory w celi jednostronnie otwartej (rysunek 1A)
	<ol>
		<li>Wytnij arkusz silikonu (patrz Lista materiałów) na odpowiedni kształt o grubości 1 mm (wymiar wewnętrzny 5-15 mm, 1 mm i ~20 mm; Rysunek 1A).
		<ol>
			<li>Zamontuj jednostronnie otwartą komórkę składającą się z silikonowej przekładki o wymiarze wewnętrznym 5-15 mm, 1 mm i ~20 mm oraz dwóch niemodyfikowanych szkiełek szklanych (76 mm × 1 mm × 26 mm). Zamocuj wcześniej obie strony celi za pomocą podwójnych klipsów, aby zapobiec wyciekaniu roztworu próbki.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Powoli dodawać każdy z 0,5% wagowych roztworu biopolimeru (100-300 μl) za pomocą końcówki pipety o wielkości porów ~1 mm do każdej komórki w temperaturze ~25 °C. Usunąć pęcherzyki powietrza z komórek za pomocą igły strzykawki.</li>
		<li>Umieścić komórki w piecu z cyrkulatorem powietrza o temperaturze 60 °C pod ciśnieniem atmosferycznym w celu odparowania; kierunek parowania jest przeciwny do kierunku grawitacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacje w świetle spolaryzowanym krzyżowo (Rysunek 1B-1C)
	<ol>
		<li>Zapewniają proste światło widzialne za pomocą lampy halogenowej o mocy 100 W ze źródłem światła o płaskiej powierzchni na dużym obszarze (80 mm x 80 mm). Ustaw polaryzatory na 45° i 135° za pomocą uchwytów (Rysunek 1C).</li>
		<li>Ustal pozycje źródła światła, polaryzatorów, sample stage i kamery za pomocą szyny optycznej i stojaków na pręty (Rysunek 1C). Umieść sample stage między dwoma polaryzatorami (odległość między polaryzatorami powinna wynosić ~5 cm). Umieść aparat w odległości ~20 cm od stolika na próbki, aby umożliwić ustawienie ostrości.</li>
		<li>W określonych momentach umieść próbki z kroku 3.1.3 między polaryzatorami na stoliku równoległym do płaszczyzny XZ i przykryj urządzenie czarną kurtyną; rzeczywiste urządzenie pokazano na rysunku 1C.</li>
		<li>Sfotografuj próbki przez liniowe skrzyżowane polaryzatory za pomocą cyfrowej lustrzanki jednoobiektywowej ze standardowym obiektywem zmiennoogniskowym (patrz Lista materiałów). Kontroluj ustawienia aparatu, takie jak odległość ogniskowa, za pomocą oprogramowania komputerowego (patrz Lista materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza czasoprzestrzenna natężenia światła przechodzącego (rys. 1C)
	<ol>
		<li>Aby ocenić zmianę parametru kolejności orientacji w procesie suszenia, należy zbierać zdjęcia co godzinę przez 24 godziny.</li>
		<li>Zmierz natężenie światła przechodzącego wzdłuż linii środkowej w kierunku Z jako wartość szarości za pomocą programu do przetwarzania obrazu (np. ImageJ).</li>
		<li>Narysuj wykres wartości szarości w funkcji odległości od górnej otwartej strony.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacje mikroskopowe w świetle spolaryzowanym krzyżowo (rysunek 1D)
	<ol>
		<li>Aby sprawdzić metody, wykonaj obserwacje mikroskopowe za pomocą mikroskopu polaryzacyjnego wyposażonego w kamerę CCD9. Utrzymuj płytkę opóźniającą pierwszego rzędu na ścieżce światła. Kontroluj warunki na zdjęciach za pomocą oprogramowania komputerowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Flemming, H. -C., Wingender, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20676145">The biofilm matrix.</a> Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).</li>
<li>Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOsada%2C+Y+%22Hydrogels+of+cytoskeletal+proteins%22">Hydrogels of cytoskeletal proteins</a>. , Springer. (2016).</li>
<li>Rothemund, P. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+DNA+to+create+nanoscale+shapes+and+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns.</a> Nature. 440, 297-302 (2006).</li>
<li>Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milliscale+self-integration+of+megamolecule+biopolymers+on+a+drying+gas-aqueous+liquid+crystalline+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface.</a> Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).</li>
<li>De Gennes, P. G., Prost, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Gennes%2C+PG+%22The+physics+of+liquid+crystals%22">The physics of liquid crystals</a>. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).</li>
<li>De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Gennes%2C+PG+%22Capillarity+and+wetting+phenomena%3A+drops%2C+bubbles%2C+pearls%2C+waves%22">Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves</a>. , Springer. (2003).</li>
<li>Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ma802829x">Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations.</a> Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).</li>
<li>Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2014/%E2%80%8Btb/c3tb21242d">Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin.</a> J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).</li>
<li>Olympus. Support BX51P. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/">http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/</a> (2016).</li>
<li>Matsuo, E. S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.455115">Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels.</a> J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).</li>
<li>Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2015/RA/C5RA18585H">Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules.</a> RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).</li>
<li>Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+control+of+diffusion+and+swelling+in+megamolecular+polysaccharide+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels.</a> Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Czasami aparat miał trudności z ustawieniem ostrości na próbce ze względu na zbyt niskie natężenie przepuszczanego światła. W takich przypadkach umieszczenie na scenie przedłużonej przezroczystej folii z tworzywa sztucznego pomogło w ustawieniu ostrości. Ograniczenie obserwowalnej rozdzielczości było zależne od obiektywu aparatu, w tym przypadku ~10 μm. Obserwowane ograniczenie grubości próbki, Δy, zależało od maksymalnego natężenia światła lampy, w tym przypadku ~10 mm.
Zaletą urządzenia poka...

Skupiając się na sztywnych, prętowatych strukturach biopolimerów, dynamiczne miękkie materiały zostały użyte do różnych zastosowań, w tym polisacharydowe matryce biofilmu1, "aktywne żele" złożone z białek cytoszkieletu2, oraz "DNA origami" o pożądanych kształtach3. Aby wyjaśnić właściwości strukturalne, zbadano wiele strategii, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa, skaningowa mikroskopia elektronowa, mikroskopia sił atomowych i konfokalna mikroskopia fluorescencyjna. Ponieważ jednak metody te są najczęściej podejmowane w stanie suchym lub statycznym, trudno jest wyjaśnić dynamiczne zachowania w skalach makroskopowych, jak to widać w rzeczywistych żywych systemach. Ostatnio z powodzeniem zaobserwowaliśmy dynamiczne zachowanie biopolimerów na granicy faz powietrze-LC w świetle spolaryzowanym4. Podczas wizualizacji zorientowanej struktury podczas suszenia roztworu biopolimeru, zmiany czasowe wskazywały na samointegrację biopolimerów na niestabilnym granicy faz powietrze-LC.
Tutaj opisujemy protokół suszenia roztworów biopolimeru LC na granicy faz powietrze-LC za pomocą spolaryzowanych instrumentów. W przeciwieństwie do innych analiz fazy LC, które nie uwzględniają suszenia5,6, dynamika LC podczas procesu suszenia została tutaj zbadana poprzez ocenę parametru kolejności orientacyjnej w widoku bocznym fazy płynnej w komorze jednostronnie otwartej. Połączenie parowania komórek i zastosowanie spolaryzowanych instrumentów pozwoliło na makroskopowy monitoring z kontrolowanym kierunkiem parowania. Ponadto możliwe było zweryfikowanie zapisów suszenia poprzez skupienie się na strukturach krystalicznych zaadsorbowanych mikrodomen, na które miała wpływ masa cząsteczkowa, stężenie itp. Aby wykazać skuteczność metody, zbadano procesy suszenia podstawowych biopolimerów o sztywnych kształtach prętów, takich jak polisacharydy, mikrotubule (MT) i DNA. Wybraliśmy te biopolimery, ponieważ są one typowymi przykładami hierarchicznych makrocząsteczek o masach megacząsteczkowych, a ich interakcje międzycząsteczkowe umożliwiają im tworzenie stanów LC.

<table><tbody><tr><td>sacran</td><td>Green Science Materials Inc., Japonia</td><td></td><td>Z Aphanothece sacrum. Mw = 1,9 &times; 107 g mol-1</td></tr><tr><td>guma ksantanowa</td><td>Taiyo Kagaku Co., Japonia</td><td>Neosoft XC</td><td>Z Xanthomonas campestris. Mw = 4,7 &times; 106 g mol-1</td></tr><tr><td>tubulina</td><td>Cytoskeleton, Inc., USA</td><td>T240</td><td>Z mózgu świni.</td></tr><tr><td>GpCpp</td><td>Jena Bioscience, Niemcy</td><td>NU405L</td><td></td></tr><tr><td>piperazyna-N,N&prime; -bis (kwas 2-etanosulfonowy)</td><td>Sigma-Aldrichi, Co. LLC.</td><td>Kwas P6757-500G</td><td></td></tr><tr><td>glikol-bis(&beta;-aminoetylowy)-N,N,N',-tetraoctowy</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Inc.</td><td>342-01314</td><td>EGTA</td></tr><tr><td>MgCl2-6H2</td><td>O Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>135-15055</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>162-21813</td><td>granulki</td></tr><tr><td>DNA</td><td>Sigma-Aldrich, Co. LLC.</td><td>D1626</td><td>Z jąder łososia. Mw = 1,3 & razy; 106 Da (~ 2,000 pz)</td></tr><tr><td>Roztwór buforowy Tris-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, Co. LLC.</td><td>T9285-100ML</td><td>10 mM Tris, pH 8,0, ze</td></tr><tr><td>szkłem szkiełkowym</td> 1 mM EDTA <td>Matsunami Glass Ind., Ltd., Japonia</td> Arkusz kauczuku silikonowego <td>S1111</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Asone Co.</td><td>6-611-32</td><td>Grubość: 1 mm</td></tr><tr><td>wirówka</td><td>Beckman-Coulter, Inc., USA</td><td>Avanti J-25</td><td>wyposażona w źródło światła z wirnikiem JA-20</td></tr><tr><td></td><td>Sumita Optical Glass, Inc., Japonia</td> Światłowód <td>LS-LHA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sumita Optical Glass, Inc., Japonia</td><td>GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)</td>Lampa halogenowa <td>80 mm & 80 mm</td></tr><tr><td></td><td>Ushio Inc., Japonia</td><td>JCR 15V150WBN</td><td></td></tr><tr><td>posiadacz</td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td>Stolik na próbkę <td>KMH-80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>TARW-25503L</td><td></td></tr><tr><td>uchwyt na próbki</td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Pręt SHA-25RO</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>ROU-12-40</td><td></td></tr><tr><td>uchwyt słupków</td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td>Uchwyt słupków <td>RS-6-40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td>Uchwyt słupków <td>RS-12-60</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td>Uchwyt słupków <td>RS-12-80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Przewoźnik RS-12-130</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Uchwyt kamery CAA-25LS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>CMH-2</td><td></td></tr><tr><td>średnia szyna optyczna</td><td>Sigmakoki, Co., Ltd.</td><td>Tubus obiektywu OBA-500SH</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tomytech, tubus obiektywu BORG</td><td>BK</td><td>80&phi;, L25 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>tubus</td><td>obiektywu Tomytech, tubus obiektywu BORG</td><td>BK</td><td>80&phi;, L50 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>wielopasmowy</td><td>Tomytech, BORG</td><td></td><td>80&phi; &nbsp;</td></tr><tr><td>Płyta V</td><td>Tomytech, BORG</td><td>V płyta 60S uchwyt talerza</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Viexen, Co., Ltd.</td><td>uchwyt na talerz SX</td><td></td></tr><tr><td>EOS Kiss X7i&nbsp;</td><td>Canon Inc., Japonia</td><td>8594B001</td><td>ze standardowym obiektywem zmiennoogniskowym,&nbsp; Oprogramowanie fotograficzne EFP 18-55 mm</td></tr><tr><td></td><td>Canon Inc., Japonia</td><td>EOS Utility</td><td></td></tr><tr><td>PC</td><td>Microsoft</td><td>Surface</td><td></td></tr> mikroskop <tr><td>polaryzacyjny</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>płyta opóźniająca pierwszego rzędu</td><td>Olympus</td><td>U-TP530</td><td>&lambda; = 530 nm</td></tr><tr><td>Aparat</td> fotograficzny <td>Olympus</td><td>DP80</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>cellSens Standardowy</td><td></td></tr><tr><td>program do przetwarzania obrazów oparty na Javie</td><td>, National Institutes of Health</td><td>ImageJ</td><td></td></tr></tbody></table>

metody samointegracji biopolimerów megamolekularnych na granicy faz powietrze-lc

Methods for the Self-integration of Megamolecular Biopolymers on the Drying Air-LC Interface

Żywe organizmy, które używają wody, są zawsze podatne na wysychanie w środowisku. Ich aktywność jest napędzana przez mikro- i makrostruktury oparte na biopolimerach, co widać w przypadkach przemieszczania wody w wiązkach naczyniowych i nawilżania wody w warstwach skóry. W niniejszej pracy opracowaliśmy metodę oceny wpływu wodnych roztworów ciekłokrystalicznych (LC) składających się z biopolimerów na suszenie. Ponieważ biopolimery LC mają masę megacząsteczkową, zdecydowaliśmy się zbadać polisacharydy, białka cytoszkieletu i DNA. Obserwacja roztworów biopolimerowych podczas suszenia w świetle spolaryzowanym ujawnia miliskalową samointegrację, zaczynając od niestabilnej granicy faz powietrze-LC. Dynamikę wodnych roztworów biopolimeru LC można monitorować poprzez odparowanie wody z jednostronnie otwartej komórki. Analizując zdjęcia wykonane przy użyciu światła spolaryzowanego krzyżowo, możliwe jest rozpoznanie zmian czasoprzestrzennych w orientational order parametr. Metoda ta może być przydatna do charakteryzacji nie tylko sztucznych materiałów w różnych dziedzinach, ale także naturalnych żywych tkanek. Wierzymy, że zapewni on metodę oceny materiałów miękkich w dziedzinie biomedycyny i środowiska.

Wykorzystując urządzenie przedstawione na Rysunku 1, oceniono samointegrację z mikrodomeny do makrodomeny na wysychającym interfejsie powietrze-LC (Rysunek 2A). Jako pierwszą demonstrację eksperymentu suszenia porównano dwa rodzaje makromolekularnych polisacharydów: sacran (Mw = 1.9 x 107 g mol-1) oraz gumę ksantanową (4.7 x 106 g mol-1). Rysunek 2B przedstawia fotografie ro...

Metoda indukowanej suszeniem samointegracji megamolekularnych biopolimerów na granicy powietrzno-ciekłokrystalicznej jest dostępna tutaj. Metodologia ta będzie przydatna nie tylko do zrozumienia makroskopowego potencjału biopolimerów, ale także jako metoda oceny materiałów miękkich w dziedzinach biomedycznych i środowiskowych.

Metody samointegracji biopolimerów megamolekularnych na granicy faz powietrze-LC

Living organisms that use water are always prone to drying in the environment. Their activities are driven by biopolymer-based micro- and ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest ocena wpływu interfejsu powietrze-ciekły kryształ (air-LC) podczas wysychania na orientację makromolekularnych biopolimerów, takich jak polisacharydy, mikrotubule i DNA, w formie wizualizacji zachowań dynamicznych w skali milimetrowej. Badanie to może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu struktur dyspersyjnych, takich jak samoorganizacja biopolimerów w środowisku wysychającym, w którym organizmy żywe wyszły na ląd około 500 milionów lat temu. Główną zaletą tej techniki jest możliwość obrazowania próbki z widoku bocznego podczas procesu wysychania, bez konieczności suszenia w płaszczyźnie poziomej.Aby rozpocząć tę procedurę, należy dodać 0,5 g sacranu do 100 ml wody. Pojemnik należy przykryć folią spożywczą i mieszać roztwór w temperaturze około 80 °C przez ponad 12 godzin. Po ochłodzeniu roztworów sacranu i gumy ksantanowej, roztwór sacranu należy odwirować w celu usunięcia zanieczyszczeń.Następnie przygotuj na lodzie 0,5% wagowo roztwór tubuliny w buforze Brittona-Robinsona. Wymieszaj 50 µL roztworu tubuliny z 5 µL GpCpp. Następnie inkubuj roztwór w temperaturze 37 °C przez trzy godziny, aby uzyskać stabilne mikrotubule lub jądro MT.Następnie wymieszaj 950 µL roztworu tubuliny oraz 50 µL roztworu tubuliny zawierającego GpCpp. Po tym czasie pozostaw roztwór na jedną dobę w temperaturze około 25 °C, aby uzyskać stabilny 0,5% wagowy roztwór MT. Następnie przygotuj 0,5% wagowy roztwór DNA oraz roztwór buforu Tris-EDTA.Próbki roztworów biopolimeru o stężeniu masowym 0,5% należy przechowywać w temperaturze 25 °C na potrzeby eksperymentu suszenia. Arkusz krzemu należy wyciąć w odpowiedni kształt o grubości 1 mm. Następnie należy złożyć ogniwo otwarte z jednej strony, składające się z krzemowego dystansera i dwóch niemodyfikowanych szkiełek podstawowych.Obie strony cewki należy przymocować podwójnymi klipsami, aby zapobiec wyciekowi roztworów próbek. Używając końcówki do pipety o rozmiarze porów 1 mm, powoli dodaj od 100 do 300 µL każdego 0,5% wagowo roztworu biopolimeru do każdej cewki w temperaturze około 25 °C. Pęcherzyki powietrza z cewki należy usunąć za pomocą igły strzykawki.Następnie umieść komórki w inkubatorze z cyrkulacją powietrza na 18 godzin w temperaturze 60 °C pod ciśnieniem atmosferycznym w celu odparowania. Kierunek operacji jest przeciwny do kierunku działania grawitacji. Takie rozmieszczenie stosuje się również podczas monitorowania do późniejszych analiz.Należy użyć lampy halogenowej o mocy 100 W z płaskim źródłem światła o szerokim polu, aby zapewnić liniowe światło widzialne. Za pomocą uchwytów należy ustawić polaryzatory pod kątem 45 stopni i 135 stopni. Pozycje źródła światła, polaryzatorów, stolika z próbką i kamery należy ustalić za pomocą szyny optycznej i prętów stabilizujących.Umieść stolik z próbką pomiędzy dwoma polaryzatorami. Następnie ustaw kamerę w odległości około 20 centymetrów od stolika z próbką, aby umożliwić ustawienie ostrości. W określonych czasach wskazanych w protokole tekstowym umieść próbki biopolimerów pomiędzy polaryzatorami na stoliku równolegle do płaszczyzny XZ i osłoń urządzenie czarną zasłoną.Na koniec należy sfotografować próbki przez liniowe polaryzatory skrzyżowane, używając cyfrowej lustrzanki z systemem wymiennej optyki i standardowym obiektywem typu zoom. Oceniono samoorganizację od mikrodomen do makrodomen na wysychającym interfejsie powietrze-LC. Przed wyschnięciem zaobserwowano jasne obszary ze światłem przechodzącym w stanie rozproszonym.Po wysuszeniu obszar poniżej interfejsu powietrze-LC oraz roztwór sakranu uległy wyniesieniu, a intensywność roztworu ksantyny zmniejszyła się wraz z pojawieniem się niewielkich makidomen. Analiza czasoprzestrzenna wykazała wzrost grubości oraz maksymalnej intensywności w okolicach interfejsu powietrze-ciecz, co wskazuje, że mikrodomeny zaczynają orientować się od interfejsu powietrze-LC i rozrastają się w domeny w skali mili, równoległe do interfejsu. Obrazy z mikroskopu polaryzacyjnego fazy płynnej sakranu wykazały jeden niebieski obszar, co oznacza utworzenie pojedynczej makidomeny.Faza ciekła gumy ksantanowej wykazywała obszary niebieskie, żółte i różowe, co oznacza, że utworzyło się wiele makrodomen o dowolnej orientacji. Przed wyschnięciem roztwory sakranu i MT wykazywały podobne stany LC z rozproszonymi domenami. Podczas wysychania roztwór MT uległ samointegracji, a rozproszone domeny połączyły się w jedną makdomenę.Roztwór DNA nie wykazywał specyficznej orientacji w fazie ciekłej. Zapis suszenia sacranu wykazał znaczną dwójłomność, natomiast w zapisie suszenia MT zaobserwowano faliste wiązki. Zapis suszenia DNA wykazał makrodomeny o kształcie ziarnistym w dowolnych kierunkach.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie inżynierii biomedycznej wykorzystującej biopolimery do analizy wizualnej dynamiki strumienia powietrza w procesach suszenia i zwilżania w podejściach geometrycznych.

methods-for-self-integration-megamolecular-biopolymers-on-drying-air

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film demonstruje metodę generowania polimerowej bańki lub nowatorskiej platformy opartej na polibańkach, która umożliwia opóźnione uwalnianie impulsów. Polimery na bazie poliestru są używane do tworzenia polipęcherzyków o strukturze rdzeń-powłoka, a małe cząsteczki i antygeny mogą być używane jako ładunek.

Technika generowania nowatorskiej platformy dostarczania do opóźnionego uwalniania cząsteczek w trybie burst

Procedura polimeryzacji indukowanej plazmą jest opisana dla inicjowanej powierzchniowo polimeryzacji na membranach polimerowych. Dalsza postmodyfikacja szczepionego polimeru substancjami fotochromowymi została przedstawiona wraz z protokołem przeprowadzenia pomiarów przepuszczalności membran reagujących na światło.

Przygotowanie membran reagujących na światło w połączonym procesie szczepienia powierzchniowego i postmodyfikacji

Przedstawiamy protokół syntezy mikrohydrożeli Janusa składających się całkowicie z tego samego materiału bazowego, poli(N-izopropylacrylamidu) (PNIPAAm), z wyraźnie podzieloną strukturą opartą na separacji faz przesyconego roztworu monomeru NIPAAm. Zsyntetyzowane mikrohydrożele Janus wykazują unikalne właściwości, takie jak anizotropowa termoczułość i zdolność ładowania organofilowego/hydrofilowego.

Synteza mikrohydrożeli Janusa z poli(N-izopropyloakrylamidu) Janusa dla anizotropowej reakcji termicznej i zdolności ładowania organofilowego/hydrofilowego

Dwu- i trójwymiarowe superhydrofobowe materiały polimerowe są przygotowywane przez elektroprzędzenie lub elektronatryskiwanie biodegradowalnych polimerów zmieszanych z polimerem o niższej energii powierzchniowej o podobnym składzie.

Wytwarzanie superhydrofobowych materiałów polimerowych do zastosowań biomedycznych

W tym artykule opisujemy międzyfazową syntezę sprzężonych mikroporowatych polimerów (CMP) na podłożach protektorowych oraz rozpuszczanie substratu do przygotowania wolnostojących nanomembran CMP. Ponadto opiszemy, w jaki sposób kruche nanomembrany mogą być przenoszone na inne podłoża.

Synteza i transfer warstwa po warstwie wolnostojących mikroporowatych nanomembran polimerowych

Demonstrujemy system tworzenia dwuwarstwowych lipidów, który można przechowywać, przenośny. Dwuwarstwowa błona lipidowa może powstać w ciągu 1 godziny z ponad 80% skutecznością, gdy zamrożony prekursor błony zostanie doprowadzony do temperatury otoczenia. System ten ograniczy pracochłonne procesy i wiedzę specjalistyczną związaną z kanałami jonowymi.

Zautomatyzowane tworzenie dwuwarstwowej błony lipidowej za pomocą cienkiej warstwy polidimetylosiloksanu

Ten artykuł opisuje proces dostrajania rozmiaru i gęstości sieciowania kowalencyjnie usieciowanych nanocząstek z liniowych poliestrów zawierających funkcjonalność wisiorka. Dostosowując parametry syntezy (masa cząsteczkowa polimeru, włączenie funkcjonalności wisiorka i równoważniki środków sieciujących), można osiągnąć pożądany rozmiar nanocząstek i gęstość usieciowania do zastosowań związanych z dostarczaniem leków.

Przestrajalność nanogąbek pod względem wielkości i gęstości usieciowania

Udostępniamy protokół do testów samoorganizacji MinD i MinE in vitro na podpartej dwuwarstwie lipidowej w otwartej komorze. Dodatkowo opisujemy, jak zamknąć test w mikrokompartmentach PDMS pokrytych lipidami, aby naśladować warunki in vivo poprzez uwięzienie reakcji.

In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Wszechstronnie wykorzystywana, spektroskopia oscylacyjna generowania częstotliwości sumy (SFG) może pomóc w ujawnieniu kolejności konformacyjnej łańcucha i wtórnych zmian strukturalnych zachodzących na granicy faz polimerów i biomakromolekuł.

Międzyfazowe struktury molekularne polimerów i biomakrocząsteczek ujawnione za pomocą spektroskopii oscylacyjnej generacji częstotliwości sumarycznej

Samoorganizacja sterowana krystalizacją (CDSA) wykazuje unikalną zdolność do wytwarzania cylindrycznych nanostruktur o wąskich rozkładach długości. Wykazano organokatalizowaną polimeryzację ε-kaprolaktonu z otwarciem pierścienia oraz późniejsze wydłużenia łańcuchów metakrylanu metylu i N,N-dimetyloakrylamidu. Przedstawiono żywy protokół CDSA, który wytwarza cylindry monodyspersyjne o długości do 500 nm.

Synteza monodyspersyjnych cylindrycznych nanocząstek poprzez samoorganizację biodegradowalnych kopolimerów blokowych sterowaną krystalizacją

Protokół syntezy i charakterystyki samoorganizujących się monowarstw szkieletu metaloorganicznego jest dostarczany przy użyciu szczepionych polimerami, kryształów metaloorganicznych (MOF). Procedura pokazuje, że cząstki MOF szczepione polimerem mogą być samoorganizujące się na granicy faz powietrze-woda, co skutkuje dobrze uformowanymi, wolnostojącymi, jednowarstwowymi strukturami, czego dowodem jest obrazowanie za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.

Synteza i charakterystyka samoorganizujących się monowarstw metaloorganicznych z wykorzystaniem cząstek pokrytych polimerem

Poznaj metodę samointegracji megamolekularnych biopolimerów na granicy faz powietrze-LC. Technika umożliwia obserwację orientacji polisacharydów, mikrotubul i DNA podczas suszenia.

Metody samointegracji biopolimerów megamolekularnych na granicy faz powietrze-LC

Przeglądaj więcej filmów