Kinetyka syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez białka replikacji bakteriofagów T7

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie kinetyki syntezy DNA nici prowadzącej i opóźnionej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu replikacji DNA, takie jak sposób formowania starterów przez prymazę DNA, ich przekazywania oraz wykorzystywania przez polimerazę DNA. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zidentyfikowania kluczowych etapów podczas syntezy fragmentów Okazaki.

Ponieważ w tym eksperymencie wykorzystywane są materiały radioaktywne, należy przestrzegać wszystkich regulacji instytucjonalnych dotyczących bezpiecznego użycia i utylizacji materiałów radioaktywnych. W pierwszej kolejności należy odmierzyć dwie mikrolitry buforu barwiącego z formamidem do ośmiu polipropylenowych probówek o pojemności 1,5 mililitra, co odpowiada liczbie analizowanych punktów czasowych. Następnie należy przygotować 20 mikrolitrów mieszaniny składającej się z buforu, ATP, CTP, CTP znakowanego P32 w grupie alfa-fosforanowej, jednoniciowej matrycy DNA oraz białka genu cztery, czyli primazy helikazy GP4.

Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po pięciu minutach za pomocą pipety pobrać 2 µL mieszaniny i zmieszać ją z 2 µL buforu z barwnikiem formamidowym w jednej z wcześniej przygotowanych probówek o pojemności 1,5 ml. Jest to kontrola braku reakcji.

Dodaj 2 µL 0,1 M chlorku magnezu do mieszaniny reakcyjnej i natychmiast uruchom stoper. W odstępach 10 s ręcznie pobieraj próbki mieszaniny reakcyjnej o objętości 2 µL i mieszaj je z barwnikiem z formamidem w probówkach 1,5 ml. Po zebraniu próbek dla wszystkich punktów czasowych, podgrzej je w bloku grzewczym w temperaturze 95 °C przez pięć minut.

Nanieś alikwoty próbek na żel denaturujący do elektroforezy. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania mieszanin reakcyjnych. Przygotuj 400 µL roztworu A zawierającego bufor, heksamer GP4, matrycę jednoniciowego DNA, dNTP, ATP oraz CTP znakowane P32 w grupie alfa-fosforanowej.

Przygotuj 400 µL roztworu B, zawierającego bufor X oraz 20 mM chlorku magnezu. Następnie skonfiguruj aparat do szybkiego przepływu z gaszeniem (rapid quench flow). Włącz urządzenie, a po pojawieniu się menu głównego wpisz cyfrę siedem na klawiaturze instrumentu, aby przesunąć napęd strzykawki do pozycji domyślnej.

Otwórz pozycję strzykawki z buforem, aby ją załadować. Napełnij strzykawkę C roztworem gaszącym, a następnie, używając strzykawki o pojemności 10 ml, napełnij zbiorniki buforowe instrumentu A i B buforem. Usuń pęcherzyki powietrza, przesuwając tłoki do wewnątrz i na zewnątrz.

Zmień pozycję pokrętła na tryb strzelania (fire). Wpisz dwa, aby dostosować położenie poprzeczki napędu strzykawki. Naciśnij przycisk regulacji w dół, aby obniżyć strzykawkę, aż bufor wypłynie przez pętlę wylotową.

Wciśnij escape, aby powrócić do menu głównego. Aby wypłukać dreny, podłącz linię wyjściową do pompy próżniowej. Przełącz pokrętła próbek w pozycję płukania.

Ustaw pokrętła w pozycji poziomej, aby zamknąć strzykawkę z buforem. Włącz próżnię, zanurz dwie pętle płukania w wodzie na 10 sekund, a następnie zanurz je w metanolu na 10 sekund. Osusz pętle, zasysając powietrze przez około 15 sekund lub do momentu ich całkowitego wyschnięcia.

Aby załadować próbki, zmień położenie pokrętła próbek na pozycję ładowania. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 mL roztworem A, a następnie podłącz strzykawkę do jednego z portów ładowania próbek; w analogiczny sposób wprowadź roztwór B do przeciwległego portu ładowania próbek. Rozpocznij pomiar punktów czasowych, wpisując cyfrę 1 w menu głównym dla przebiegu quench flow.

Wprowadź czas reakcji i naciśnij enter. Wyświetlony zostanie numer pętli reakcyjnej, której należy użyć. Przełącz się na wymaganą pętlę reakcyjną.

Po umyciu probówki zgodnie z wcześniejszą instrukcją, przekręć pokrętła próbek do pozycji ładowania. Napełnij pętle próbek mieszaninami reakcyjnymi, aż znajdą się one tuż przed centralną komorą mieszania. Przekręć wszystkie pokrętła do pozycji startu i upewnij się, że wszystkie pokrętła znajdują się w prawidłowej pozycji.

Umieść probówkę o pojemności 1,5 ml na końcu pętli wylotowej. Naciśnij przycisk start, aby uruchomić reakcję. Po powtórzeniu procedury płukania cewek, ponownie napełnij strzykawki z buforem A i B, aż dotkną one napędu strzykawek.

Powtórz kroki przeprowadzania reakcji dla każdego z wybranych punktów czasowych, z jednym wyjątkiem: nie należy dodawać roztworu B podczas przerywania reakcji w próbce kontrolnej dla czasu zero. Po zakończeniu pobierania próbek naciśnij Escape, aby powrócić do menu głównego. Naciśnij siedem, aby przywrócić sterownik strzykawki z buforem do pozycji domyślnej.

Rozpocznij czyszczenie instrumentu od wyjęcia strzykawek z mieszaniną reakcyjną, a następnie przekręć pokrętło załadunku próbek do pozycji load. W warunkach próżni przemyj każdą pętlę próbkową po 10 milliliters wodorotlenku sodu, kwasu fosforowego oraz metanolu. Naciśnij tłoki wszystkich trzech strzykawek, aby odessać bufory reakcyjne i bufor zatrzymujący reakcję.

Przepłucz strzykawki pięcioma mililitrami wody co najmniej dwukrotnie. Ponownie napełnij strzykawki pięcioma mililitrami wody, przekręć pokrętła do pozycji zapłonu, włącz pompę próżniową i za pomocą polecenia z klawiatury opuść tłok, aby usunąć wodę. Przepłucz dreny zgodnie z wcześniejszą instrukcją.

Na koniec wyłącz urządzenie do szybkiego hartowania przepływu. Próbki są następnie analizowane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wyniki te uzyskano poprzez ręczne pobieranie próbek z reakcji syntezy primera katalizowanej przez GP four w warunkach wielokrotnego obrotu.

Oznaczony prekursor CTP wykazuje najwyższą mobilność i migruje w kierunku dołu żelu, a za nim następują wolniej migrujące formy, odpowiadające barwnikowi i tetraribonukleotydom syntetyzowanym przez GP four. W zależności od czasu inkubacji i kontekstu sekwencji matrycy można zaobserwować dodatkowe oznaczone produkty odpowiadające wyższym oligomerom. W przypadku użycia instrumentu do szybkiego gaszenia (rapid quench) w celu zbadania reakcji katalizowanej przez GP four w skalach czasowych od sekund do kilku ms, ewidentne jest, że akumulacja primera nie jest liniowa, lecz wykazuje profil dwufazowy wskazany linią ciągłą.

Sugeruje to, że tworzenie produktu zachodzi szybko, a etapem limitującym w stanie stacjonarnym jest jego uwalnianie. Linia przerywana reprezentuje hipotetyczną krzywą postępu, która wystąpiłaby, gdyby tworzenie primera przez GP four nie przebiegało z gwałtownym wzrostem w stanie przedstacjonarnym. Eksperyment syntezy primera w pojedynczym cyklu obrotu dostarcza informacji o powstawaniu i zanikaniu gatunków pośrednich podczas konwersji substratu w produkt.

Obraz żelu przedstawia przebieg czasowy tworzenia się tetramerów. Wykres pokazuje powstawanie produktów pośrednich w funkcji czasu. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w 90 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.

Należy pamiętać, że praca z odczynnikami radioaktywnymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak odpowiednie ekranowanie.