Name: Kinetyka syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez białka replikacji bakteriofagów T7 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Poznaj kinetykę syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przy użyciu białek replikacji bakteriofagów T7. Ta metoda pozwala badać tworzenie i wykorzystanie primerów przez primazę i polimerazę DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy członkom laboratorium C.C.R. za komentarze i S. Moskowitzowi za przygotowanie rysunku. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) i GM54397 (C.C.R.).

UWAGA: Przestrzegaj wszystkich przepisów instytucjonalnych dotyczących bezpiecznego używania i usuwania materiałów radioaktywnych, w tym, ale nie ograniczając się do używania środków ochrony osobistej, takich jak rękawice, okulary ochronne, fartuch laboratoryjny i odpowiednie osłony akrylowe.
UWAGA: Standardowy bufor składa się z 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM glutaminianu potasu, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (ten bufor jest wstępnie przygotowany przy 5-krotnym stężeniu) i 0,3 mM każdego dNTP. Białka replikacyjne T7 są oczyszczane zgodnie z opisem8,9,10. Jednoniciowe DNA zawierające pojedyncze miejsce rozpoznawania prymazy T7 (5'-GGGTC-3', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3') można kupić w różnych firmach zajmujących się syntezą DNA (długość ssDNA może zależeć od wybranego enzymu, w przypadku prymazy T7 pentamer to minimalna długość matrycy do syntezy startera o pełnej długości11, ponieważ kryptyczne C jest niezbędne, jednak jeśli starter ma być rozszerzony przez polimerazę, dodatkowe nukleotydy muszą być obecne na końcu 3' matrycy. Reakcje rozpoczyna się przez dodanie końcowego stężenia 10 mM MgCl2 i inkubuje w temperaturze 25 °C. Ręczne pobieranie próbek sprawdza się w przypadku punktów czasowych wynoszących 5 sekund lub więcej. Jeśli wymagane są krótsze punkty czasowe, zaleca się użycie przyrządu do szybkiego wygaszania w celu uzyskania dokładnych danych.
1. Reakcja syntezy starterów z wieloma obrotami przez ręczne pobieranie próbek
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem eksperymentu należy podatkować 2 μl buforu barwnika formamidowego (93% (v/v) formamidu, 50 mM EDTA, 0,01% cyjanolu ksylenowego i 0,01% błękitu bromofenolowego) do 8 probówek polipropylenowych o pojemności 1,5 ml. Ogólnie rzecz biorąc, liczba rur jest równa liczbie analizowanych punktów czasowych.</li>
	<li>Przygotuj mieszaninę o objętości 20 μl składającą się z 1x buforu, 0,1 mM ATP i CTP, 0,25 mCi/ml [α-32P] CTP, 0,1 μM matrycy ssDNA i 0,1 μM gp4 (wyrażonej jako stężenie heksameru - 0,6 μM monomeru).</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć 2 μl mieszaniny za pomocą pipetora i wymieszać z 2 μl buforu barwnika formamidowego w probówce o pojemności 1,5 ml przygotowanej w kroku 1.1 w celu kontroli braku reakcji (czas zerowy).</li>
	<li>Dodać 2 μL 0,1 M MgCl2 do mieszaniny reakcyjnej (do końcowego stężenia 10 mM).</li>
	<li>Ręcznie pobrać 2 μl próbek mieszanin reakcyjnych za pomocą pipetora w odstępach 10 s i wymieszać z barwnikiem formamidowym wstępnie dozowanym w probówkach o pojemności 1,5 ml przygotowanych w kroku 1.1.</li>
	<li>Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut w bloku grzewczym.</li>
	<li>Załadować podwielokrotności próbek do żelu denaturującego. Małe produkty starterów tetrarybonukleotydowych syntetyzowane przez prymazę T7 są dobrze rozdzielone na 25% akryloamidzie o grubości 0,4 mm i zawartości 25% akryloamidu (19:1), 3 M mocznika, 1x TBE (100 mM tris-boran, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Umieść cały żel na bibule chromatograficznej i przykryj folią. Wysuszyć żel za pomocą suszarki do żelu.</li>
	<li>Przygotować serię rozcieńczeń pozostałej części mieszaniny reakcyjnej i umieścić tę samą objętość załadowaną na żel na bibułę chromatograficzną, tj. umieścić 4 μl rozcieńczenia, jeśli załadowano 4 μl próbki. 
	nuta: Będzie to służyć jako krzywa standardowa do określenia stężenia produktów powstających podczas reakcji. Na przykład pięciokrotne rozcieńczenia przy użyciu buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) działają dobrze, obejmując zakres od 1:25 do 1:15,625 (52-5 6), ale rozcieńczenia należy dostosować w zależności od poziomu aktywności.</li>
	<li>Odsłonięty suchy żel i wzorzec za pomocą sita fosforowego. Określ ilościowo radioaktywność w serii rozcieńczeń i skonstruuj krzywą standardową zgodnie z opisem 8,12 
	nuta: Włączenie polimerazy DNA T7 do mieszaniny reakcyjnej pozwala na zbadanie wykorzystania starterów tetrarybonukleotydowych przez ten enzym. Optymalnie stężenie polimerazy powinno być nasycone, aby uprościć interpretację danych. Stężenie polimerazy 0,4 μM lub wyższe daje dobre wyniki. Ponadto w ten sposób można zbadać wpływ innych białek, takich jak jednoniciowe białka wiążące DNA, na syntezę starterów lub inicjację opóźnionej nici.</li>
</ol>
2. Reakcja syntezy starterów wieloobrotowych przy użyciu przyrządu do szybkiego wygaszania
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszanin reakcyjnych
	<ol>
		<li>Przygotuj 400 μl roztworu A, zawierającego 1x bufor, 0,2 μM heksameru gp4, 0,2 μM matrycy ssDNA, 0,6 mM dNTP, 0,2 mM ATP i CTP (w tym 0,5 mCi/ml [α-32P] CTP.</li>
		<li>Przygotować 400 μl roztworu B, zawierającego 1x bufor i 20 mM MgCl2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Działanie przyrządu do szybkiego wygaszania
	<ol>
		<li>Włącz przyrząd do szybkiego wygaszania; po wyświetleniu menu głównego wpisz 7 na klawiaturze instrumentu, aby przesunąć sterownik strzykawki do pozycji wyjściowej.</li>
		<li>Otwórz pozycję strzykawki buforowej na "LOAD".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie strzykawek buforowych
	<ol>
		<li>Podłączyć strzykawkę o pojemności 10 ml zawierającą bufor do portu strzykawki napędu. Zmień pozycję pokrętła strzykawki na "LOAD".</li>
		<li>Za pomocą strzykawek o pojemności 10 ml napełnić zbiornik buforowy instrumentu A i B 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA i napełnić strzykawkę C roztworem gaszącym (250 mM EDTA i 0,2% SDS). Usunąć pęcherzyki powietrza, wciskając i wysuwając tłoki.</li>
		<li>Zmień pozycje pokrętła na "FIRE". Wpisz 2, aby wyregulować położenie pręta sterownika strzykawki. Naciśnij przycisk "ADJUST DOWN", aby opuścić strzykawkę, aż bufor wyjdzie z pętli wyjściowej: (7-schodzi w dół; 8-duży krok w dół; 9-mały krok w dół). Wpisz "ESC", aby powrócić do menu głównego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj rurki
	<ol>
		<li>Podłącz przewód wyjściowy do próżni. Zmień sample pokrętła na "FLUSH". Zamknąć strzykawkę z buforem, ustawiając pokrętła w pozycji poziomej. Włącz próżnię i zanurz 2 pętle spłukujące w H2O na 10 s, a następnie zanurz w MeOH na 10 s. Suszyć pętle, zasysając powietrze przez ~15 s lub do wyschnięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ładowanie próbek
	<ol>
		<li>Zmień pozycję pokrętła próbki na "LOAD". Umieścić roztwór A w strzykawce o pojemności 1 ml. Podłączyć strzykawkę do jednego z portów ładowania próbki. Powtórzyć te czynności dla roztworu B i umieścić w przeciwległym porcie ładowania próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieranie punktów czasowych
	<ol>
		<li>W menu głównym wpisz 1 dla przebiegu wygaszania. Wprowadź czas reakcji (s) i naciśnij "ENTER". Zostanie wyświetlony numer pętli reakcyjnej, której należy użyć. Przełącz na wymaganą pętlę reakcyjną. Powtórz procedurę prania w kroku 2.2.4.</li>
		<li>Przekręć sample pokrętła w położenie "LOAD". Załaduj mieszaniny reakcyjne w pętlach próbki, aż znajdą się tuż poza centralną komorą mieszania. Przekręć wszystkie pokrętła w położenie "FIRE". Upewnij się, że wszystkie pokrętła są we właściwej pozycji.</li>
		<li>Umieść probówkę o pojemności 1.5 ml na końcu pętli wyjściowej. Naciśnij "GO", aby uruchomić reakcję. Powtórz procedurę prania w kroku 2.2.4. Załaduj strzykawki buforowe A i B, aż uderzą w kierowcę.</li>
		<li>Powtórz kroki 2.2.6.2-2.2.6.3 dla każdego żądanego punktu czasowego. Wyjątek: Nie należy ładować roztworu zawierającego odczynnik początkowy (tj. w tym przypadku MgCl2) podczas hartowania kontroli punktu zerowego.</li>
		<li>Po zakończeniu pobierania próbek wprowadź "ESC", aby powrócić do menu głównego. Naciśnij "7", aby przywrócić sterownik strzykawki buforowej do pozycji wyjściowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie instrumentów
	<ol>
		<li>Wyjąć strzykawki z mieszaniną reakcyjną. Przekręć pokrętło ładowania próbki do pozycji "LOAD". W próżni przemyć każdą pętlę próbki 10 ml 0,2 N NaOH, a następnie 10 ml 0,3 N H3PO4 i 10 ml MeOH.</li>
		<li>Przekręć pokrętła strzykawki do pozycji "LOAD". Nacisnąć wszystkie 3 tłoki strzykawki, aby pobrać reakcyjne i wygaszające. Umyć strzykawki 5 mlH2Oco najmniej dwa razy.</li>
		<li>Ponownie napełnić strzykawki 5 ml H2O i przekręcić pokrętła do pozycji "FIRE". Zmień pozycje pokrętła i włącz podciśnienie, aby usunąć H2O. Spłukiwać jak w kroku 2.2.4. Wyłącz instrument. 
		nuta: Produkty są analizowane zgodnie z opisem w krokach 1.7-1.12. Ponadto polimeraza DNA T7 i inne białka replikacyjne mogą być dodawane do mieszaniny reakcyjnej w celu przeanalizowania ich wpływu na syntezę lub wydłużenie starterów.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Reakcja syntezy startera jednoobrotowego
UWAGA: Testy syntezy/przedłużania starterów jednoobrotowych są przeprowadzane podobnie jak reakcje wielokrotnej rotacji, z kilkoma zasadniczymi różnicami: testy te następują po przemianie znakowanego radioaktywnie ATP w produkty startera lub przedłużenia, jednak stężenie substratów i białek jest znacznie wyższe. Ponadto, aby uzyskać rozdzielczość milisekundową umożliwiającą analizę reakcji syntezy starterów, należy użyć maszyny o szybkim przepływie.
<ol>
	<li>Przygotowanie mieszanin reakcyjnych.
	<ol>
		<li>Przygotuj 400 μl roztworu A, zawierającego 1x bufor, 3 μM heksameru gp4, 6 μM matrycy ssDNA, 0,6 mM dNTP, 1 mM CTP i 2 nM [γ-32P] ATP. Przygotować 400 μl roztworu B, zawierającego 1x bufor i 20 mM MgCl2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Praca z szybkim przepływem hartowania
	<ol>
		<li>Przeprowadzić reakcje zgodnie z opisem w kroku 2.2. W razie potrzeby dodać polimerazę DNA T7 lub białko wiążące jednoniciowe DNA T7 w stężeniu odpowiednio 15 μM i 20 μM. W takim przypadku produkty przedłużające gromadzą się w reżimie czasowym, który pozwala na ręczne pobieranie próbek reakcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Dopasuj krzywe postępu produktu do nieliniowych modeli najmniejszych kwadratów za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania zdolnego do dopasowania metodą najmniejszych kwadratów i/lub integracji numerycznej. Szczegóły operacji będą się różnić w zależności od zastosowanego oprogramowania, ale poniżej znajdują się uogólnione formy równań używanych do dopasowywania danych.</li>
	<li>Określ szybkość powstawania produktu w reakcjach syntezy starterów z wieloma obrotami, dopasowując krzywe postępu do równania liniowego. Jeśli krzywizna jest znaczna, użyj metody szybkości początkowej13,14, dopasowując dane do funkcji jednowykładniczej: y=A(e-k t ), gdzie y jest stężeniem produktu, A jest amplitudą reakcji, k jest obserwowaną stałą szybkości, t jest czasem w sekundach. Nachylenie linii stycznej w czasie=0 jest szybkością początkową. 
	UWAGA: Dopasuj reakcje syntezy startera w stanie wstępnym do równania liniowego lub do równania wybuchu przed stanem ustalonym y=A (e-k burst t) +ratess t, gdzie A to amplituda reakcji, k burst jest obserwowaną stałą szybkości dla rozbłysku w stanie wstępnym, ratess jest szybkością w stanie ustalonymss = k cat [Enzym]), t oznacza czas w sekundach. Dopasuj krzywe postępu reakcji syntezy startera z pojedynczym obrotem do pojedynczej funkcji wykładniczej y=A(e-k t). W przypadku gp4 dopasuj dane według całkowania numerycznego15, do modelu z trzema etapami kondensacji NTP, gdzie każdy produkt pośredni jest w równowadze z enzymem, przy użyciu dostępnego na rynku oprogramowania.</li>
</ol>

<ol><li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+replication%22">DNA replication</a>. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).</li>
<li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motors%2C+switches%2C+and+contacts+in+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li>
<li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li>
<li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li>
<li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li>
<li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li>
<li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li>
<li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li>
<li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li>
<li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li>
<li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li>
<li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658(2013).</li>
<li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+enzyme+kinetic+analysis%2C+1913%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li>
<li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56(2013).</li>
<li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Najważniejszym czynnikiem w przeprowadzaniu tych eksperymentów jest dostępność wysoce aktywnego oczyszczonego enzymu. Podczas naszej pracy z gp4 stwierdziliśmy, na przykład, że przechowywanie oczyszczonego enzymu w buforze (20 mM fosforanu potasu, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) zawierającym 50% glicerolu w temperaturze -20 °C prowadzi do zmniejszenia specyficznej aktywności preparatu w ciągu kilku miesięcy. Dlatego teraz zamrażamy małe porcje oczyszczonego gp4 w 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM TCEP ...

Replikacja DNA jest zachowaną cechą całego życia komórkowego. Chociaż tożsamość i liczba komponentów replikacji są bardzo różne, ogólne mechanizmy są wspólne dla wszystkich evolution1. W tym miejscu opisano żelowe, nieciągłe eksperymenty kinetyczne z wykorzystaniem substratów promieniotwórczych, mające na celu zrozumienie kinetyki syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez składniki replikosomu T7. Maszyneria replikacji bakteriofaga T7 jest bardzo prosta, składa się tylko z czterech białek (polimerazy DNA, gp5 i jej czynnika procesywności, tioredoksyny E. coli, dwufunkcyjnej prymazy-helikazy gp4 i jednoniciowego białka wiążącego DNA, gp2.5)2. Ta cecha sprawia, że jest to atrakcyjny system modelowy do badania konserwatywnych mechanizmów biochemicznych zaangażowanych w replikację DNA.
Szczególny nacisk kładziony jest na tworzenie starterów rybonukleotydowych przez prymazę DNA T7, co jest kluczowym krokiem w inicjacji syntezy DNA. Ponadto można również zbadać zastosowanie tych starterów przez polimerazę DNA T7 lub inne białka replikacyjne, włączając je do mieszaniny reakcyjnej. Helikaza prymazy T7, gp4, katalizuje tworzenie starterów do syntezy DNA w określonych sekwencjach DNA zwanych miejscami rozpoznawania prymazów lub PRS (5'-GTC-3'). Cytozyna w PRS jest tajemnicza, jest niezbędna do rozpoznania witryny, ale nie jest kopiowana do product3. Pierwszy etap syntezy starterów przez gp4 polega na utworzeniu dinukleotydu pppAC, który jest następnie rozszerzany do trimera, a ostatecznie do funkcjonalnych starterów tetranukleotydowych pppACCC, pppACCA lub pppACAC w zależności od sekwencji w szablonie4. Te startery mogą być następnie wykorzystane przez polimerazę DNA T7 do zainicjowania syntezy DNA, która jest również procesem wspomaganym przez gp45,6. W związku z tym domena prymazowa stabilizuje niezwykle krótkie tetrarybonukleotydy z matrycą, zapobiegając ich dysocjacji, angażuje polimerazę DNA w sposób sprzyjający zabezpieczeniu startera/matrycy w miejscu aktywnym polimerazy7. Etapy te (synteza startera RNA, przekazanie startera do polimerazy i wydłużenie) są powtarzane w wielu cyklach w celu replikacji opóźnionej nici i muszą być skoordynowane z replikacją nici wiodącej.
Opisane tutaj testy są bardzo czułe i mogą być wykonane w umiarkowanym czasie. Są one jednak stosunkowo mało przepustowe i należy zachować dużą ostrożność przy stosowaniu i usuwaniu materiałów promieniotwórczych. W zależności od szybkości, z jaką przebiega reakcja, można użyć przyrządu do szybkiego wygaszania, aby uzyskać próbki w skalach czasowych nadających się do miarodajnej analizy przebiegów czasu reakcji w stanie ustalonym lub wstępnym. Ostatnio użyliśmy opisanych tutaj testów, aby dostarczyć dowodów na znaczenie uwalniania starterów z domeny prymazowej gp4 w inicjacji fragmentów Okazaki. Ponadto znaleźliśmy dowody na regulacyjną rolę jednoniciowego białka wiążącego DNA T7, gp2.5, w promowaniu wydajnego tworzenia i wykorzystania starterów8.

<table><tbody><tr><td>Wstępnie ustawione kryształy Tris pH 7,5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy sól potasowa monohydrat</td><td>SIGMA</td><td>G1501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Ditiothreitol</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr><tr><td>(Ethylenedinitrilo) Kwas tetraoctowy, sól disodowa, dihydrat</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&alpha;-32P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radioaktywny, podejmij środki ochronne</td></tr>[<tr><td>&gamma;-32P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radioaktywny, podejmij środki ochronne</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>cztery dNTP część zestawu</td></tr><tr><td>100 mM ATP i CTP</td><td>Epicentrum</td><td>RN02825</td><td>część zestawu NTP</td></tr><tr><td>konstrukcje ssDNA</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>Nie dotyczy</td><td>niestandardowych sekwencji&nbsp;</td></tr><tr><td>metanol&nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamid</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>błękit bromofenolowy</td><td>SIGMA</td><td>B8026&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cylen Xyanol&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>akryloamid</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>N,N&prime; -metylenobisakryloamid</td><td>SIGMA</td><td>M7279&nbsp;</td><td>toksyczny</td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do szybkiego gaszenia&nbsp;</td><td>Kintek Corp.</td><td>RQF-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Odkrywca Kintek</td><td>Kintek Corp.</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

kinetyka syntezy opóźnionej nici dna in vitro przez białka replikacji bakteriofagów t7

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Tutaj udostępniamy protokoły do badania kinetycznego syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez białka replikacyjne bakteriofaga T7. Replisom T7 jest jednym z najprostszych znanych systemów replikacji, składającym się tylko z czterech białek, co jest atrakcyjną cechą dla eksperymentów biochemicznych. Szczególny nacisk kładziony jest na syntezę starterów rybonukleotydowych przez prymazę-helikazę T7, które są wykorzystywane przez polimerazę DNA do inicjacji syntezy DNA. Ponieważ mechanizmy replikacji DNA są zachowane w całej ewolucji, protokoły te powinny być stosowane lub użyteczne jako koncepcyjna odskocznia dla badaczy korzystających z innych systemów modelowych. Opisane tutaj protokoły są bardzo czułe, a doświadczony badacz może przeprowadzić te eksperymenty i uzyskać dane do analizy w ciągu około jednego dnia. Jedynym wymaganym specjalistycznym sprzętem jest przyrząd do szybkiego wygaszania, ale ten sprzęt jest stosunkowo powszechny i dostępny z różnych źródeł komercyjnych. Do głównych wad tych testów należy jednak zastosowanie radioaktywności i stosunkowo niska przepustowość.

Wyniki przedstawione w Rysunek 1A pozyskano zgodnie z opisem w krok 1 protokołu, t. j.poprzez ręczne pobieranie próbek z reakcji syntezy startera katalizowanej przez gp4 w warunkach wielokrotnego obrotu. W tym przypadku, po elektroforezie żelowej, można zaobserwować szereg produktów przy użyciu CTP znakowanego za pomocą 32P w pozycji α w reakcjach syntezy starterów (Rycina 1A). Oznakowany prekursor, CTP, wykazuje najwy...

Opisujemy czułe, żelowe testy nieciągłe, aby zbadać kinetykę inicjacji opóźnionej nici przy użyciu białek replikacyjnych bakteriofaga T7.

Kinetyka syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez białka replikacji bakteriofagów T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie kinetyki syntezy DNA nici prowadzącej i opóźnionej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu replikacji DNA, takie jak sposób formowania starterów przez prymazę DNA, ich przekazywania oraz wykorzystywania przez polimerazę DNA. Główną zaletą tej techniki jest możliwość zidentyfikowania kluczowych etapów podczas syntezy fragmentów Okazaki.Ponieważ w tym eksperymencie wykorzystywane są materiały radioaktywne, należy przestrzegać wszystkich regulacji instytucjonalnych dotyczących bezpiecznego użycia i utylizacji materiałów radioaktywnych. W pierwszej kolejności należy odmierzyć dwie mikrolitry buforu barwiącego z formamidem do ośmiu polipropylenowych probówek o pojemności 1,5 mililitra, co odpowiada liczbie analizowanych punktów czasowych. Następnie należy przygotować 20 mikrolitrów mieszaniny składającej się z buforu, ATP, CTP, CTP znakowanego P32 w grupie alfa-fosforanowej, jednoniciowej matrycy DNA oraz białka genu cztery, czyli primazy helikazy GP4.Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po pięciu minutach za pomocą pipety pobrać 2 µL mieszaniny i zmieszać ją z 2 µL buforu z barwnikiem formamidowym w jednej z wcześniej przygotowanych probówek o pojemności 1,5 ml. Jest to kontrola braku reakcji.Dodaj 2 µL 0,1 M chlorku magnezu do mieszaniny reakcyjnej i natychmiast uruchom stoper. W odstępach 10 s ręcznie pobieraj próbki mieszaniny reakcyjnej o objętości 2 µL i mieszaj je z barwnikiem z formamidem w probówkach 1,5 ml. Po zebraniu próbek dla wszystkich punktów czasowych, podgrzej je w bloku grzewczym w temperaturze 95 °C przez pięć minut.Nanieś alikwoty próbek na żel denaturujący do elektroforezy. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania mieszanin reakcyjnych. Przygotuj 400 µL roztworu A zawierającego bufor, heksamer GP4, matrycę jednoniciowego DNA, dNTP, ATP oraz CTP znakowane P32 w grupie alfa-fosforanowej.Przygotuj 400 µL roztworu B, zawierającego bufor X oraz 20 mM chlorku magnezu. Następnie skonfiguruj aparat do szybkiego przepływu z gaszeniem (rapid quench flow). Włącz urządzenie, a po pojawieniu się menu głównego wpisz cyfrę siedem na klawiaturze instrumentu, aby przesunąć napęd strzykawki do pozycji domyślnej.Otwórz pozycję strzykawki z buforem, aby ją załadować. Napełnij strzykawkę C roztworem gaszącym, a następnie, używając strzykawki o pojemności 10 ml, napełnij zbiorniki buforowe instrumentu A i B buforem. Usuń pęcherzyki powietrza, przesuwając tłoki do wewnątrz i na zewnątrz.Zmień pozycję pokrętła na tryb strzelania (fire). Wpisz dwa, aby dostosować położenie poprzeczki napędu strzykawki. Naciśnij przycisk regulacji w dół, aby obniżyć strzykawkę, aż bufor wypłynie przez pętlę wylotową.Wciśnij escape, aby powrócić do menu głównego. Aby wypłukać dreny, podłącz linię wyjściową do pompy próżniowej. Przełącz pokrętła próbek w pozycję płukania.Ustaw pokrętła w pozycji poziomej, aby zamknąć strzykawkę z buforem. Włącz próżnię, zanurz dwie pętle płukania w wodzie na 10 sekund, a następnie zanurz je w metanolu na 10 sekund. Osusz pętle, zasysając powietrze przez około 15 sekund lub do momentu ich całkowitego wyschnięcia.Aby załadować próbki, zmień położenie pokrętła próbek na pozycję ładowania. Napełnij strzykawkę o pojemności 1 mL roztworem A, a następnie podłącz strzykawkę do jednego z portów ładowania próbek; w analogiczny sposób wprowadź roztwór B do przeciwległego portu ładowania próbek. Rozpocznij pomiar punktów czasowych, wpisując cyfrę 1 w menu głównym dla przebiegu quench flow.Wprowadź czas reakcji i naciśnij enter. Wyświetlony zostanie numer pętli reakcyjnej, której należy użyć. Przełącz się na wymaganą pętlę reakcyjną.Po umyciu probówki zgodnie z wcześniejszą instrukcją, przekręć pokrętła próbek do pozycji ładowania. Napełnij pętle próbek mieszaninami reakcyjnymi, aż znajdą się one tuż przed centralną komorą mieszania. Przekręć wszystkie pokrętła do pozycji startu i upewnij się, że wszystkie pokrętła znajdują się w prawidłowej pozycji.Umieść probówkę o pojemności 1,5 ml na końcu pętli wylotowej. Naciśnij przycisk start, aby uruchomić reakcję. Po powtórzeniu procedury płukania cewek, ponownie napełnij strzykawki z buforem A i B, aż dotkną one napędu strzykawek.Powtórz kroki przeprowadzania reakcji dla każdego z wybranych punktów czasowych, z jednym wyjątkiem: nie należy dodawać roztworu B podczas przerywania reakcji w próbce kontrolnej dla czasu zero. Po zakończeniu pobierania próbek naciśnij Escape, aby powrócić do menu głównego. Naciśnij siedem, aby przywrócić sterownik strzykawki z buforem do pozycji domyślnej.Rozpocznij czyszczenie instrumentu od wyjęcia strzykawek z mieszaniną reakcyjną, a następnie przekręć pokrętło załadunku próbek do pozycji load. W warunkach próżni przemyj każdą pętlę próbkową po 10 milliliters wodorotlenku sodu, kwasu fosforowego oraz metanolu. Naciśnij tłoki wszystkich trzech strzykawek, aby odessać bufory reakcyjne i bufor zatrzymujący reakcję.Przepłucz strzykawki pięcioma mililitrami wody co najmniej dwukrotnie. Ponownie napełnij strzykawki pięcioma mililitrami wody, przekręć pokrętła do pozycji zapłonu, włącz pompę próżniową i za pomocą polecenia z klawiatury opuść tłok, aby usunąć wodę. Przepłucz dreny zgodnie z wcześniejszą instrukcją.Na koniec wyłącz urządzenie do szybkiego hartowania przepływu. Próbki są następnie analizowane zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Wyniki te uzyskano poprzez ręczne pobieranie próbek z reakcji syntezy primera katalizowanej przez GP four w warunkach wielokrotnego obrotu.Oznaczony prekursor CTP wykazuje najwyższą mobilność i migruje w kierunku dołu żelu, a za nim następują wolniej migrujące formy, odpowiadające barwnikowi i tetraribonukleotydom syntetyzowanym przez GP four. W zależności od czasu inkubacji i kontekstu sekwencji matrycy można zaobserwować dodatkowe oznaczone produkty odpowiadające wyższym oligomerom. W przypadku użycia instrumentu do szybkiego gaszenia (rapid quench) w celu zbadania reakcji katalizowanej przez GP four w skalach czasowych od sekund do kilku ms, ewidentne jest, że akumulacja primera nie jest liniowa, lecz wykazuje profil dwufazowy wskazany linią ciągłą.Sugeruje to, że tworzenie produktu zachodzi szybko, a etapem limitującym w stanie stacjonarnym jest jego uwalnianie. Linia przerywana reprezentuje hipotetyczną krzywą postępu, która wystąpiłaby, gdyby tworzenie primera przez GP four nie przebiegało z gwałtownym wzrostem w stanie przedstacjonarnym. Eksperyment syntezy primera w pojedynczym cyklu obrotu dostarcza informacji o powstawaniu i zanikaniu gatunków pośrednich podczas konwersji substratu w produkt.Obraz żelu przedstawia przebieg czasowy tworzenia się tetramerów. Wykres pokazuje powstawanie produktów pośrednich w funkcji czasu. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w 90 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury.Należy pamiętać, że praca z odczynnikami radioaktywnymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak odpowiednie ekranowanie.

kinetics-lagging-strand-dna-synthesis-vitro-bacteriophage-t7

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Niniejszy protokół demonstruje prostą technikę mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek służącą do wizualizacji replikacji DNA przez poszczególne replisomy w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja replikacji pojedynczych cząsteczek DNA za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Opisujemy metodę obserwacji replikacji pojedynczych cząsteczek DNA w czasie rzeczywistym, pośredniczonej przez białka systemu replikacyjnego bakteriofaga.

Bezpośrednia obserwacja enzymów replikujących DNA z wykorzystaniem testu rozciągania pojedynczej cząsteczki DNA

Los replisomu po zderzeniu z polimerazą RNA (RNAP) w układzie czołowym pozostaje nieznany. Wykazaliśmy, że replisom zatrzymuje się po zderzeniu z RNAP w układzie czołowym, lecz wznawia elongację po usunięciu RNAP z DNA. Białko Mfd wspomaga restart replikacji, ułatwiając przemieszczenie RNAP po kolizji.

Bezpośrednie wznowienie ruchu widelca replikacyjnego zablokowanego przez polimerazę RNA w kolizji czołowej

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Nowa generacja bezkomórkowych platform transkrypcyjno-translacyjnych została zaprojektowana do budowy systemów biochemicznych in vitro poprzez wykonywanie obwodów genowych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób bakteriofagi, takie jak MS2, ΦΧ174 i T7, są syntetyzowane z ich genomu przy użyciu systemu TXTL wolnego od komórek E. coli.

Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli

Powtarzalna, dokładna i efektywna czasowo metoda ilościowego PCR (qPCR) do oznaczania bakteriofagów T7 jest opisana tutaj. Protokół jasno opisuje przygotowanie genomowego DNA fagowego, przygotowanie reakcji PCR, warunki cykliczne qPCR i analizę danych qPCR.

Ilościowy PCR bakteriofaga T7 z biopanowania

W tym manuskrypcie opisujemy protokół do funkcjonalnego badania transkrypcji i hamującej aktywności środków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na bakteryjną transkrypcję.

In vitro Testy transkrypcji i ich zastosowanie w odkrywaniu leków

Interakcje RNA-białko leżą u podstaw wielu procesów komórkowych. W tym miejscu opisujemy metodę in vivo do izolowania specyficznego RNA i identyfikowania nowych białek, które są z nim związane. Może to rzucić nowe światło na to, w jaki sposób RNA są regulowane w komórce.

Izolacja nowych białek wiążących RNA metodą RaPID

Oogeneza Drosophila nadal jest wyjątkowo przydatna w badaniach nad proliferacją i dziedziczeniem mitochondriów. Manuskrypt ten opisuje szczegółowy protokół używany do oznaczania replikującego się mitochondrialnego DNA (mtDNA) w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU), co ułatwia odkrycie mechanizmów związanych z dziedziczeniem mitochondriów, które wcześniej były dyskusyjne.

In Situ Znakowanie replikacji mitochondrialnego DNA w dorosłych jajnikach Drosophila za pomocą barwienia EdU

Opisujemy tutaj stosunkowo szybkie i proste podejście do mapowania czasu replikacji ssaków w całym genomie, od izolacji komórki do podstawowej analizy wyników sekwencjonowania. Mapa genomiczna reprezentatywnego programu replikacji zostanie dostarczona zgodnie z protokołem.

Określenie czasu replikacji ssaków w całym genomie za pomocą pomiaru zawartości DNA

Poznaj kinetykę syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przy użyciu białek replikacji bakteriofagów T7. Ta metoda pozwala badać tworzenie i wykorzystanie primerów przez primazę i polimerazę DNA.

Kinetyka syntezy opóźnionej nici DNA in vitro przez białka replikacji bakteriofagów T7

Przeglądaj więcej filmów