Name: Indukcja odpowiedzi zapalnej w pierwotnych kulturach hepatocytów od myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnych hepatocytów mysich do badania odpowiedzi zapalnej wątroby. Technika ta umożliwia analizę ekspresji cytokin CRP i IL6 metodami ELISA oraz PCR w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez NIH (R01HL128714 do C.F.) i (F31DK10236101 do K.S.) oraz American Heart Association (C.F. i A.G.).

Wszystkie protokoły i procedury eksperymentalne dla zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Szkoły Medycznej Uniwersytetu w Miami.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Podgrzej pożywkę do perfuzji wątroby i pożywkę do trawienia wątroby w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Ustawić pompę perfuzyjną (30 ml/min). Ostrożnie napełnij system przewodów pompy pożywką do perfuzji wątroby. Unikaj pęcherzyków powietrza w systemie i przygotuj mikroskop stereotaktyczny.</li>
	<li>Naczynia z hodowli komórkowych pokryć kolagenem typu I zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
2. Regeneracja wątroby
<ol>
	<li>Znieczulić mysz dawcę za pomocą inhalacji tlenu/izofluranu (izofluran 4%/2 l/min tlenu).
	<ol>
		<li>Utrzymuj znieczulenie, obniżając izofluran do 2-2,5% lub wstrzykując ketaminę (100 mg/kg masy ciała dootrzewnowo) i ksylazynę (10 mg/kg masy ciała dootrzewnowo). Preferowane jest ciągłe znieczulenie izofluranem, ponieważ ketamina obniża ciśnienie krwi i może powodować hepatotoksyczność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na podkładce chłonnej. Przymocuj kończyny myszy taśmą klejącą.</li>
	<li>Ogolić i zdezynfekować brzuch myszy i wykonać laparotomię brzuszną od łona do czaszkowej granicy wątroby za pomocą nożyczek chirurgicznych z ostrymi/końcówkami. Naciąć ścianę brzucha po obu stronach, ogonową przeponę.</li>
	<li>Odsłoń żyłę główną dolną (IVC), ostrożnie przesuwając jelito na prawą stronę. Ostrożnie wypreparuj tkankę tłuszczową wokół IVC za pomocą sterylnych wacików bawełnianych i kleszczyków z kątową końcówką.</li>
	<li>Naciąć przeponę nadwątrobową i otworzyć klatkę piersiową przez dwa boczne nacięcia za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych z ostrymi/ostrymi końcówkami. Podwiązywać IVC klatki piersiowej za pomocą jedwabiu chirurgicznego (5/0).</li>
	<li>Kankatulować IVC podnerkowe za pomocą osłoniętego cewnika dożylnego, ostrożnie wyjąć igłę, podłączyć pompę perfuzyjną i rozpocząć perfuzję wątroby. Jeśli zostanie wykonana prawidłowo, wątroba powinna natychmiast zacząć blednąć i puchnąć.</li>
	<li>Przeciąć żyłę wrotną umożliwiającą odpowiedni drenaż krwi i mediów perfuzyjnych za pomocą cienkich nożyczek chirurgicznych.</li>
	<li>Perfuzję wątroby należy podać około 30 ml pożywki do perfuzji wątroby, a następnie przejść na pożywkę do trawienia wątroby (30 ml). Wyłącz pompę perfuzyjną i wyjmij kaniulę po zakończeniu perfuzji.</li>
	<li>Delikatnie odsłoń centralny obszar wątroby i zlokalizuj tkankę łączącą płaty wątroby. Chwyć środkowe włókna łączące i ostrożnie wypreparuj wszystkie tkanki utrzymujące wątrobę na miejscu i delikatnie usuń wątrobę.</li>
	<li>Natychmiast przenieść wątrobę do stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml zawierającej 15 ml pożywki do trawienia wątroby. 
	UWAGA: Nie ma określonego harmonogramu dla tego etapu. Po perfuzji wątroba pozostaje w pożywce trawiennej w celu transportu do sterylnego kaptura do hodowli komórek. Wszystkie kolejne kroki powinny być wykonywane w sterylnym środowisku.</li>
</ol>
3. Izolacja i leczenie komórek
<ol>
	<li>W kapturze do hodowli komórkowej przenieść wątrobę z 50 ml polipropylenowej stożkowej rurki zawierającej pożywkę do trawienia do sterylnego naczynia do hodowli tkankowych.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych kleszczy delikatnie rozerwij cztery płaty wątroby. Przy prawidłowym wykonaniu pożywka trawienna powinna stać się mętna z powodu izolacji hepatocytów z wątroby.</li>
	<li>Używając sterylnej końcówki pipety o pojemności 25 ml, przefiltruj mętną pożywkę wytrawiającą przez nylonowe sitko o pojemności 70 μm do nowej stożkowej rurki polipropylenowej o pojemności 50 ml, aby usunąć niestrawione cząstki tkanek i resztki komórek.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 3.2 i 3.3 z jałowym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Pomaga to w usuwaniu wszelkich pozostałych hepatocytów z wątroby.</li>
	<li>Wirować przy 50 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant zawierający nadmiar resztek komórek i delikatnie zawiesić komórki w 25 ml zimnego 1x Williams' Medium E.</li>
	<li>Używając sterylnej końcówki do pipety o pojemności 25 ml, przefiltruj zawiesinę przez nowe sitko do komórek nylonowych o pojemności 70 μm do stożkowej rurki polipropylenowej o pojemności 50 ml, aby uzyskać czystszą zawiesinę.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.5 i 3.6 dla trzech dodatkowych płukań przy użyciu zimnego Williams' Medium E 1x, aby uzyskać bardziej klarowną zawiesinę komórek.</li>
	<li>Po ostatnim etapie płukania odessać supernatant, aby usunąć nadmiar resztek komórek. Ponownie zawieś i przefiltruj komórki w 25 ml ciepłego Williams' Media E 1x, który zawiera pierwotne suplementy do rozmrażania i powlekania hepatocytów, przez nowe sitko do komórek nylonowych o średnicy 70 μm w stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Policz komórki w zawiesinie komórek o objętości 25 ml za pomocą hemocytometru. Średnio spodziewaj się 15 - 20 milionów komórek na dorosłą wątrobę. Określ żywotność komórek za pomocą barwienia błękitem trypanowym.</li>
	<li>Płytki komórkowe w 2 ml Williams' Media E 1x, który zawiera pierwotne suplementy rozmrażania i powlekania hepatocytów na pokrytym kolagenem 6-dołkowym klastrze kultur komórkowych (9 x 105 komórek na dołek).</li>
	<li>Po 4 godzinach zmień pożywkę na Williams Media E 1x, która zawiera podstawowe suplementy podtrzymujące hepatocyty.</li>
	<li>Po 24 godzinach surowica głodza się za pomocą zmodyfikowanej pożywki Eagle (DMEM) firmy Dulbecco 1x przez 6 godzin.</li>
	<li>Traktować komórki z PBS jako nośnikiem, FGF23 (25 ng/ml), LPS (100 μg/ml) lub IL-6 (50 ng/ml) w pożywce bez surowicy i inkubować przez 24 godziny.</li>
</ol>
4. Izolacja RNA
<ol>
	<li>Przygotuj RNA za pomocą komercyjnego zestawu kolumny wirowej zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>
5. Generowanie cDNA z wyizolowanego RNA metodą odwrotnej transkrypcji
<ol>
	<li>Dodać 200 ng izolowanej próbki RNA do probówki PCR.</li>
	<li>Dodać 14 μl H2O wolnego od endonukleaz do probówki PCR z kroku 5.1.</li>
	<li>Dodaj 4 μl odwrotnej transkryptazy do probówki PCR z kroku 5.1.</li>
	<li>Delikatnie zawiesić zawartość, aby mieszanina była jednorodna; delikatnie odwirować.</li>
	<li>Umieścić probówkę PCR zawierającą mieszaninę w termocyklerze. Uruchom termocykler do odwrotnej transkrypcji: 1 cykl 25 °C (5 min), 42 °C (30 min), 85 °C (5 min), a następnie przytrzymaj w temperaturze 4 °C. Produktem końcowym będzie pożądane cDNA.</li>
</ol>
6. Analiza komórek metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)
<ol>
	<li>Przygotuj płytkę 96-dołkową.
	<ol>
		<li>Umieść wszystkie składniki reakcji qPCR na lodzie: 1 μL cDNA, .25 μM startera do przodu, .25 μM startera odwrotnego, 5 μL SYBR Green, 3,5 μL wody klasy PCR do całkowitej objętości 10 μL. Używając SYBR Green, przygotuj mieszankę główną, aby uruchomić wszystkie próbki w trzech egzemplarzach.</li>
		<li>Gdy mieszanka główna jest gotowa, zwiruj, aby uzyskać jednorodność. Podwielokrotność 9 μl wzorca qPCR wymieszać do każdego dołka na płytce o pojemności 96 szt. Następnie ostrożnie dodaj 1 μl cDNA do każdej studzienki. Całkowita objętość reakcji wyniesie 10 μl.</li>
		<li>Po zakończeniu ładowania zamknąć 96-dołkową płytkę optyczną folią samoprzylepną i krótko odwirować 96-dołkową płytkę (50 x g przez 1 min).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom próbki w aparacie Real Time-PCR. Umieść szczelnie zapieczętowaną 96-dołkową płytkę w aparacie Real Time-PCR i uruchom próbki zgodnie z zaleceniami producenta urządzenia. Przykłady cykli standardowych i szybkich znajdują się poniżej.
	<ol>
		<li>Dla standardowych parametrów cyklicznych należy zastosować następujące kryteria: początkową denaturację w temperaturze 94 °C przez 120 s, następnie 40 cykli w temperaturze 94 °C przez 15 s, 60 °C przez 60 s, a następnie opcjonalnie utrzymać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>W przypadku parametrów szybkich cykli należy zastosować następujące środki: początkową denaturację w temperaturze 94 °C przez 30 s, następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 5 s, 58 °C przez 15 s, a następnie 72 °C przez 10 s.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapoznaj się z instrukcją obsługi urządzenia, aby uzyskać wskazówki dotyczące analizowania danych.</li>
</ol>
7. Analiza supernatantów komórkowych za pomocą testu ELISA
UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane zgodnie z protokołem producenta.
<ol>
	<li>Przygotowanie próbki
	<ol>
		<li>Dozować 398 μl rozcieńczalnika do oddzielnych probówek. Odpipetować 2 μl próbki supernatantu do probówki z rozcieńczalnikiem o pojemności 398 μl. Zapewni to fałd rozcieńczenia wynoszący 200.</li>
		<li>Powtórzyć krok 7.1.1 dla każdej badanej próbki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>procedura
	<ol>
		<li>Odpipetować 100 μl 200-krotnie rozcieńczonej próbki i wzorca do dołków 96-dołkowej płytki.</li>
		<li>Inkubować 96-dołkową płytkę w temperaturze 25 °C przez 45 minut na wytrząsarce mikropłytki z prędkością 150 obr./min.</li>
		<li>Przemyć studzienki 5 razy 1x roztworem buforowym do płukania. Po zakończeniu ostatniego prania usuń wszystkie resztki roztworu myjącego za pomocą papieru chłonnego.</li>
		<li>Dodać 500 μl odczynnika sprzężonego z HRP do każdej studzienki.</li>
		<li>Powtórz kroki 7.2.2 - 7.2.3.</li>
		<li>Odpipetować 100 μl odczynnika tetrametylobenzydyny (TMB) do każdego dołka na 96-dołkowej płytce.</li>
		<li>Delikatnie mieszać płytkę 96-dołkową w temperaturze 25 °C przez 20 minut na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 150 obr./min. Zatrzymaj reakcję, dodając bezpośrednio 100 μl roztworu zatrzymującego do każdej studzienki i delikatnie wymieszaj. Po dodaniu roztworu zatrzymującego kolor powinien zmienić kolor na żółty. Informuje to, że roztwór zatrzymujący został prawidłowo wymieszany.</li>
		<li>Za pomocą czytnika płytek do mikromiareczkowania oznaczyć gęstość optyczną przy 450 nm w ciągu pierwszych 5 minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obliczanie wyników
	<ol>
		<li>Obliczyć tabelę średnich wartości absorbancji (A450) dla każdej próbki i każdego wzorca.</li>
		<li>Złóż krzywą wzorcową, wykreślając średnią A450 każdego wzorca w stosunku do jego wzorcowego stężenia w ng / ml na wykresie liniowym. Pozwól, aby oś x reprezentowała stężenie, a oś y reprezentowała wartości A450.</li>
		<li>Wykorzystując średnią A450 z każdej rozcieńczonej próbki, określ stężenie pożądanego białka w ng / ml z krzywej wzorcowej.</li>
		<li>Pomnożyć stężenie próbki przez współczynnik rozcieńczenia. Pozwoli to na określenie rzeczywistego stężenia pożądanego białka w próbce supernatantu komórkowego.</li>
		<li>Wykreśl utworzoną tabelę z próbek na wykres liniowy. Jeżeli wartości OD450 wykraczają poza krzywą wzorcową, próbki należy odpowiednio rozcieńczyć i ponownie przebadać.</li>
		<li>Normalizuj wyniki do 500 000 komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Silverstein, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+chronic+kidney+disease%3A+role+in+the+progression+of+renal+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Nephro%22%5BJournal%5D)">Inflammation in chronic kidney disease: role in the progression of renal and cardiovascular disease.</a> Pediatr Nephro. 24 (8), 1445-1452 (2008).</li>
<li>Isakova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+is+elevated+before+parathyroid+hormone+and+phosphate+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 is elevated before parathyroid hormone and phosphate in chronic kidney disease.</a> Kidney Int. 79 (12), 1370-1378 (2011).</li>
<li>Faul, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF23+induces+left+ventricular+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">FGF23 induces left ventricular hypertrophy.</a> J Clin Invest. 121 (11), 4393-4408 (2011).</li>
<li>Gutiérrez, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+and+mortality+among+patients+undergoing+hemodialysis%5BTitle%5D)+AND+%22N+England+J+Med%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 and mortality among patients undergoing hemodialysis.</a> N England J Med. 359 (6), 584-592 (2008).</li>
<li>Munoz Mendoza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+and+Inflammation+in+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 and Inflammation in CKD.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 7 (7), 1155-1162 (2012).</li>
<li>Hanks, L. J., Casazza, K., Judd, S. E., Jenny, N. S., Gutiérrez, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+Fibroblast+Growth+Factor-23+with+Markers+of+Inflammation%2C+Insulin+Resistance+and+Obesity+in+Adults%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Associations of Fibroblast Growth Factor-23 with Markers of Inflammation, Insulin Resistance and Obesity in Adults.</a> PLoS ONE. 10 (3), e0122885(2015).</li>
<li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+23+directly+targets+hepatocytes+to+promote+inflammation+in+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 23 directly targets hepatocytes to promote inflammation in chronic kidney disease.</a> Kidney Int. , 1-12 (2016).</li>
<li>Howard, R. B., Christensen, A. K., Gibbs, F. A., Pesch, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+preparation+of+isolated+intact+parenchymal+cells+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver.</a> J Cell Biol. 35 (3), 675-684 (1967).</li>
<li>Moshage, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+interleukin-1%2C+interleukin-6+and+its+interrelationship+on+the+synthesis+of+serum+amyloid+A+and+C-reactive+protein+in+primary+cultures+of+adult+human+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioch+Biophysi+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">The effect of interleukin-1, interleukin-6 and its interrelationship on the synthesis of serum amyloid A and C-reactive protein in primary cultures of adult human hepatocytes.</a> Bioch Biophysi Res Commun. 155 (1), 112-117 (1988).</li>
<li>Soldatow, V. Y., LeCluyse, E. L., Griffith, L. G., Rusyn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+for+liver+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models for liver toxicity testing.</a> Toxicol. Res. 2 (1), 23-39 (2013).</li>
<li>Lee, S. M. L., Schelcher, C., Demmel, M., Hauner, M., Thasler, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Human+Hepatocytes+by+a+Two-step+Collagenase+Perfusion+Procedure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure.</a> J Vis Exp. (79), (2013).</li>
<li>Kegel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+Isolation+of+Primary+Human+Hepatocytes+and+Corresponding+Major+Populations+of+Non-parenchymal+Liver+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Protocol for Isolation of Primary Human Hepatocytes and Corresponding Major Populations of Non-parenchymal Liver Cells.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Moshage, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines+and+the+hepatic+acute+phase+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cytokines and the hepatic acute phase response.</a> J Pathol. 181 (3), 257-266 (1997).</li>
<li>Klaunig, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+liver+cell+culture.+I.+Hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22In+vitro%22%5BJournal%5D)">Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation.</a> In vitro. 17 (10), 913-925 (1981).</li>
<li>Lu, Y. C., Yeh, W. C., Ohashi, P. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1782563/">LPS/TLR4 signal transduction pathway.</a> Cytokine. 42 (2), 145-151 (2008).</li>
<li>Schmidt-Arras, D., Rose-John, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+pathway+in+the+liver%3A+From+physiopathology+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">IL-6 pathway in the liver: From physiopathology to therapy.</a> J Hepatol. 64 (6), 1403-1415 (2016).</li>
<li>Grabner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Cardiac+Fibroblast+Growth+Factor+Receptor+4+Causes+Left+Ventricular+Hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Activation of Cardiac Fibroblast Growth Factor Receptor 4 Causes Left Ventricular Hypertrophy.</a> Cell Metab. 22 (6), 1020-1032 (2015).</li>
<li>Shulman, M., Nahmias, Y. Chapter 17, Long-Term Culture and Coculture of Primary Rat and Human Hepatocytes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShulman%2C+M+%22Methods+Mol+Biol%22">Methods Mol Biol</a>. 945, 287-302 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Izolowanie pierwotnych hepatocytów od myszy jest szybkim, niedrogim i niezawodnym narzędziem do badania reakcji zapalnych ex vivo. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, wyniki można łatwo wygenerować i odtworzyć w sposób terminowy i opłacalny. Następujące punkty powinny zostać dokładnie ocenione, aby zapewnić skuteczną izolację.
Nacięcie chirurgiczne i kaniulacja IVC powinny być wykonane w znieczuleniu ogólnym, a nie po eutanazji. Młody, niedoświadczony badacz będzie potrzebował na p...

Przewlekła choroba nerek (PChN) może być zdefiniowana jako stan ostrego i przewlekłego stanu zapalnego1. U pacjentów z PChN stężenie hormonu fosfaturycznego czynnika wzrostu fibroblastów 23 (FGF23) w surowicy stopniowo wzrasta w celu utrzymania homeostazy fosforanów w surowicy2. Podwyższony poziom FGF23 w surowicy jest niezależnie związany z zachorowalnością na choroby sercowo-naczyniowe i śmiertelnością wśród pacjentów rozpoczynających leczenie hemodializą3,4. Ponadto kilka badań klinicznych wykazało silną korelację między podwyższonym poziomem FGF23 a poziomem białka C-reaktywnego (CRP), interleukiny-6 (IL-6) w surowicy i czynnika martwicy nowotworów α (TNFα)5,6. Co więcej, w badaniu eksperymentalnym wykazaliśmy niedawno, że FGF23 może bezpośrednio celować w hepatocyty i powodować reakcję zapalną poprzez zwiększenie produkcji CRP i IL-6 w wątrobie7. W związku z tym FGF23 może działać jako czynnik krążący, który przyczynia się do ogólnoustrojowego stanu zapalnego w PChN.
Na początku lat 70-tych, pierwotne hepatocyty zostały wyizolowane i zbadane po raz pierwszy8. Od tego czasu pierwotne hodowane komórki wątroby są szeroko wykorzystywane do badania procesów metabolicznych, funkcji hormonalnych, metabolizmu i toksyczności leków, a także odporności i reakcji zapalnych9,10. Poprzednie protokoły opisywały głównie enzymatyczną izolację pierwotnych hepatocytów z ludzkiej tkanki wątroby11,12. Chociaż jest to doskonały model, pomija on możliwość badania, w jaki sposób manipulacja genetyczna wpływa na złożone mechanizmy sygnalizacji wątrobowej, a także na funkcjonalne konsekwencje dla różnych rodzajów bodźców. Poniżej opisujemy izolację mysich hepatocytów pierwotnych. Warto zauważyć, że wpływ kilku mediatorów ostrej odpowiedzi wątroby, takich jak lipopolisacharyd (LPS), IL-6 i FGF23, może być analizowany w łatwy, szybki i powtarzalny sposób13.
Tutaj prezentujemy protokół enzymatycznej izolacji hepatocytów od dorosłych myszy i pokazujemy, że uznane induktory stanu zapalnego, takie jak LPS i IL-6, a także nowe mediatory stanu zapalnego, takie jak FGF23, mogą bezpośrednio stymulować ekspresję i wydzielanie cytokin zapalnych, takich jak CRP i IL-6 w hodowanych hepatocytach.

<table><tbody><tr><td><mocny>Materiały eksploatacyjne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Sitko 70 &mu; m Nylonowe sitko</td><td>komórkowe Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polipropylenowa stożkowa tuba</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>100 6-calowych aplikatorów z bawełnianą końcówką&nbsp;</td>Strzykawka <td>insulinowa Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>1cc U-100 28 G 1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli tkankowych 100 x 20 mm Styl Corning</td><td></td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowy klaster do hodowli komórkowych</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>5/0 pleciony jedwab chirurgiczny (100 jardów)</td><td>LOOK</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma<</td><td>strong>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 Pompy perfuzyjne</td><td>Gilson</td><td>F155007</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy hemacytometru, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-474</td><td></td></tr><tr><td>Okulary ochronne do hemacytometru, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-470</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne - ostre/</td><td>FST</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do irysów-ToughCut proste</td><td>FST</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont SS-45 FST</td><td></td><td>11203-25</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze tkankowe studenckie</td><td>FST</td><td>991121-12</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</strong</td><td>>Uwagi</td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu octowego, 2,0 N</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; A8976-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran, USP 250 mL</td><td>Piramal Healthcare</td><td>&nbsp; &nbsp; 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>KetaVed 1,000 mg/10 mL (100 mg/mL)</td><td>VEDCO</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>Ksylazyna 100 mg / ml</td><td>AnaSed do wstrzykiwań</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Willamsa E (1x)</td><td>gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do perfuzji wątroby (1x)</td><td>gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka do trawienia wątroby (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowe suplementy do rozmrażania i powlekania hepatocytów</td> Life <td>Technologies</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowe suplementy podtrzymujące hepatocyty</td><td>Technologie życiowe</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PBS) o pH 7,4</td><td>ThermoFisher 10010031</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagen typu 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>roztwór błękitu trypanowego</td><td>VWR</td><td>45000-717</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja odpowiedzi zapalnej w pierwotnych kulturach hepatocytów od myszy

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Wątroba odgrywa decydującą rolę w regulacji ogólnoustrojowego stanu zapalnego. Szczególnie w przewlekłej chorobie nerek wątroba reaguje w odpowiedzi na środowisko mocznicowe, stres oksydacyjny, endotoksemię i zmniejszony klirens krążących cytokin prozapalnych poprzez wytwarzanie dużej liczby reagentów ostrej fazy. Narzędzia eksperymentalne do badania stanu zapalnego i leżącej u jego podstaw roli hepatocytów mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia regulacji i udziału cytokin wątrobowych w ogólnoustrojowej odpowiedzi ostrej fazy i przedłużonym scenariuszu prozapalnym, szczególnie w skomplikowanym otoczeniu, takim jak przewlekła choroba nerek. Ponieważ badanie złożonych mechanizmów zapalenia in vivo pozostaje wyzwaniem, wymaga dużych zasobów i zwykle wymaga wykorzystania zwierząt transgenicznych, pierwotne izolowane hepatocyty stanowią solidne narzędzie do uzyskania mechanistycznego wglądu w reakcję ostrej fazy wątroby. Ponieważ ta technika in vitro charakteryzuje się umiarkowanymi kosztami, wysoką odtwarzalnością i powszechną wiedzą techniczną, pierwotne izolowane hepatocyty mogą być również z łatwością stosowane jako metoda przesiewowa. W tym miejscu opisujemy enzymatyczną metodę izolacji pierwotnych mysich hepatocytów i opisujemy ocenę odpowiedzi zapalnej w tych komórkach za pomocą testu ELISA i ilościowego PCR w czasie rzeczywistym.

Histologia
Reprezentatywne obrazy z mikroskopii świetlnej pierwotnych, izolowanych i hodowanych komórek przedstawiono na Ryc. 1A. Analiza immunocytochemiczna wykazuje, że izolowane hepatocyty wykazują wysoką ekspresję albuminy (kolor czerwony) oraz receptora czynnika wzrostu fibroblastów 4 (FGFR4) (kolor zielony). Jądra komórkowe zabarwiono 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) (kolor niebieski). (Ryc. 1B</...

Tutaj pokazujemy enzymatyczne podejście do izolacji pierwotnych hepatocytów od dorosłych myszy i opisujemy kwantyfikację odpowiedzi zapalnej za pomocą ELISA i PCR w czasie rzeczywistym.

Indukcja odpowiedzi zapalnej w pierwotnych kulturach hepatocytów od myszy

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomyślne wyizolowanie funkcjonalnych hepatocytów mysich w celu zbadania ekspresji i sekrecji cytokin zapalnych, takich jak CRP i IL6, w odpowiedzi na mediatory ostrej reakcji fazowej wątroby. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji hepatocytów oraz wpływu cytokin wątrobowych na przedłużający się stan zapalny, występujący np. w przewlekłej chorobie nerek. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona niezawodne narzędzie do prostej, szybkiej i powtarzalnej analizy metabolomiki i stanu zapalnego wątroby, a także odpowiedzi na działanie leków.Na początek należy podgrzać medium do perfuzji wątroby oraz medium do trawienia wątroby w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C. Przygotować pompę perfuzyjną zgodnie z instrukcją pokazaną tutaj. Następnie za pomocą medium do perfuzji wątroby należy ostrożnie wstępnie napełnić układ drenów pompy.Należy dążyć do uniknięcia pęcherzyków powietrza w układzie. Przygotuj mikroskop stereotaktyczny do procedury perfuzji. Następnie, po znieczuleniu myszy dawcy zgodnie z protokołem tekstowym, umieść znieczulone zwierzę na podkładce chłonnej.Użyj taśmy klejącej do unieruchomienia

induction-an-inflammatory-response-primary-hepatocyte-cultures-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zakażenie myszy adenowirusem wykazującym ekspresję głównego ludzkiego autoantygenu cytochromu P450 2D6 (hCYP2D6), rozpoznawanego przez surowice pacjentów cierpiących na autoimmunologiczne zapalenie wątroby typu 2, prowadzi do utrwalonej formy autoimmunologicznej choroby wątroby charakteryzującej się rozległym zapaleniem wątroby, włóknieniem oraz generowaniem swoistej odpowiedzi immunologicznej przeciwko CYP2D6.

Model zwierzęcy CYP2D6: Jak indukować autoimmunologiczne zapalenie wątroby u myszy

Zakłócenie przepływu żółci powoduje ciężkie zapalne cholestatyczne uszkodzenie wątroby z charakterystyczną, zależną od czasu sekwencją zmian morfologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół chirurgicznego podwiązania przewodu żółciowego wspólnego u myszy, który pozwala na wywołanie silnej odpowiedzi zwłóknieniowej po 21 do 28 dniach.

Podwiązanie dróg żółciowych u myszy: indukcja zapalnego uszkodzenia wątroby i zwłóknienia przez chalestazę obturacyjną

Tutaj opisujemy powszechną metodę wywoływania przewlekłego uszkodzenia wątroby u myszy poprzez karmienie dietą ubogą w cholinę i uzupełnioną etyoniną (CDE). Pokazujemy monitorowanie stanu zdrowia, perfuzję wątroby, izolację i konserwację. Sześciotygodniowy przebieg może informować o uszkodzeniu wątroby, patohistologii, zwłóknieniu, zapaleniu i odpowiedziach komórek progenitorowych wątroby.

Model przewlekłego uszkodzenia wątroby z niedoborem choliny i etyoniną (CDE)

Tutaj prezentujemy protokół izolacji zdrowych i funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy. Opracowano instrukcje dotyczące wykrywania powstającej syntezy białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego, aby pomóc w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw syntezy białek w kontekście homeostazy metabolizmu energetycznego w wątrobie.

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

Opisujemy model immunizacji in vivo, translacyjnego zapalenia wątroby u myszy BALB/c, który może być wykorzystany do badania patogenezy indukowanego lekami autoimmunologicznego zapalenia wątroby, w tym różnic płci obserwowanych w tej chorobie. Opiszemy, w jaki sposób model ten demonstruje powtarzalne analizy przy użyciu technik eksperymentalnych in vivo i in vitro.

Indukcja indukowanego przez leki, autoimmunologicznego zapalenia wątroby u myszy BALB/c w celu zbadania jego mechanizmów patogennych

Tutaj opisujemy rozwój klinicznie istotnego mysiego modelu raka wątroby, podsumowującego typowe cechy immunologiczne raka wątrobowokomórkowego (HCC).

Onkogenny, indukowany hepatocytami, ortotopowy mysi model raka wątrobowokomórkowego powstającego w warunkach zapalenia i zwłóknienia wątroby

Opisano prosty i niezawodny model gryzoni indukowany dietą dla niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH), osiągnięty dzięki trzymaniu zwierząt bez SPF i podawaniu specyficznej diety wysokotłuszczowej. Opisujemy identyfikację podzbiorów komórek odpornościowych wątroby i tkanki tłuszczowej w celu podsumowania ludzkich warunków immunologicznych poprzez wystawienie myszy na zarazki środowiskowe.

Zaawansowany mysi model niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby w połączeniu z cukrzycą typu 2

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji hepatocytów myszy z wątroby dorosłych myszy przy użyciu zmodyfikowanej techniki perfuzji kolagenazy. Opisano również długoterminową hodowlę hepatocytów w warstwie kolagenowej 3D, a także znakowanie immunologiczne składników cytoszkieletu w celu zbadania tworzenia kanałów żółciowych i ich odpowiedzi na leczenie.

Izolacja i hodowla kanapkowa kolagenu 3D pierwotnych hepatocytów myszy w celu zbadania roli cytoszkieletu w tworzeniu kanałów żółciowych in vitro

Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.

Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy

W niniejszym filmie przedstawiono sposób indukowania autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL oraz metodę oceny stopnia jego nasilenia za pomocą badania histopatologicznego.

Indukcja eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia przysadki u myszy szczepu SJL

Poznaj metodę izolacji pierwotnych hepatocytów mysich do badania odpowiedzi zapalnej wątroby. Technika ta umożliwia analizę ekspresji cytokin CRP i IL6 metodami ELISA oraz PCR w czasie rzeczywistym.

Indukcja odpowiedzi zapalnej w pierwotnych kulturach hepatocytów od myszy

Przeglądaj więcej filmów