Indukcja odpowiedzi zapalnej w pierwotnych kulturach hepatocytów od myszy

Ogólnym celem tej procedury jest pomyślne wyizolowanie funkcjonalnych hepatocytów mysich w celu zbadania ekspresji i sekrecji cytokin zapalnych, takich jak CRP i IL6, w odpowiedzi na mediatory ostrej reakcji fazowej wątroby. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji hepatocytów oraz wpływu cytokin wątrobowych na przedłużający się stan zapalny, występujący np. w przewlekłej chorobie nerek. Główną zaletą tej techniki jest to, że stanowi ona niezawodne narzędzie do prostej, szybkiej i powtarzalnej analizy metabolomiki i stanu zapalnego wątroby, a także odpowiedzi na działanie leków.

Na początek należy podgrzać medium do perfuzji wątroby oraz medium do trawienia wątroby w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C. Przygotować pompę perfuzyjną zgodnie z instrukcją pokazaną tutaj. Następnie za pomocą medium do perfuzji wątroby należy ostrożnie wstępnie napełnić układ drenów pompy.

Należy dążyć do uniknięcia pęcherzyków powietrza w układzie. Przygotuj mikroskop stereotaktyczny do procedury perfuzji. Następnie, po znieczuleniu myszy dawcy zgodnie z protokołem tekstowym, umieść znieczulone zwierzę na podkładce chłonnej.

Użyj taśmy klejącej do unieruchomienia kończyn myszy. Następnie ogol i zdezynfekuj brzuch myszy. Potem, używając nożyczek chirurgicznych z ostro-tępymi końcówkami, wykonaj brzuszną laparotomię od kości łonowej do kranialnej krawędzi wątroby.

Nacinamy ścianę brzucha po obu stronach w miejscu gorszym względem przepony. Odsłaniamy żyłę główną dolną (IVC), ostrożnie przesuwając jelita na prawą stronę za pomocą sterylnych patyczków bawełnianych. Za pomocą drobnych nożyczek chirurgicznych o ostrych końcach wykonujemy nacięcia boczne w obrębie przepony nad wątrobą i otwieramy jamę klatki piersiowej.

Następnie użyć jedwabnej nici chirurgicznej 5-0 do podwiązania żylnej części dolnej żyły głównej w klatce piersiowej. Za pomocą osłoniętego kaniuli do żył przeprowadzić kaniulację podnerkowej części dolnej żyły głównej. Podłączyć pompę perfuzyjną i rozpocząć perfuzję wątroby.

Przy prawidłowym wykonaniu wątroba powinna natychmiast zacząć blednąć i pęcznieć. Następnie, za pomocą precyzyjnych nożyczek chirurgicznych, przetnij żyłę wrotną, aby umożliwić odpowiedni odpływ krwi i medium perfuzyjnego. Po przepłukaniu wątroby około 30 mililitrami medium perfuzyjnego do wątroby, zatrzymaj pompę perfuzyjną.

Przełącz na pożywkę do trawienia wątroby i ponownie uruchom pompę. Po zakończeniu perfuzji usuń kaniulę. Ostrożnie odsłoń centralny obszar wątroby i zlokalizuj tkankę łączną łączącą płaty wątroby.

Chwyć centralne włókna łączące i ostrożnie odetnij wszystkie tkanki utrzymujące wątrobę na miejscu. Następnie delikatnie usuń wątrobę. Natychmiast przenieś organ do 50 mililitrowej polipropylenowej probówki stożkowej zawierającej 15 mililitrów medium do trawienia wątroby.

Podczas pracy w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przenieś wątrobę z 50 mililitrowej polipropylenowej probówki stożkowej do sterylnej szalki do hodowli tkanek. Za pomocą sterylnej pincety delikatnie rozdziel cztery płaty wątroby. Jeśli procedura zostanie wykonana prawidłowo, medium do trawienia powinno stać się mętne w wyniku izolacji hepatocytów z wątroby.

Używając sterylnego końcówki do pipety o pojemności 25 ml, przefiltruj mętne medium do trawienia przez nylonowe sito do komórek o rozmiarze oczek 70 µm do nowej stożkowej probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml, aby usunąć niestrawione cząstki tkanki i szczątki komórkowe. Odwiruj połączony filtrat z prędkością 50 ×g w temperaturze 4 °C przez dwie minuty, następnie odessij nadsącz zawierający nadmiar szczątków komórkowych i użyj 25 ml zimnego 1X William's Medium E, aby delikatnie resuspendować komórki. Po trzykrotnym powtórzeniu filtrowania i płukania hepatocytów, odessij nadsącz, aby usunąć nadmiar szczątków komórkowych.

Resuspenduj komórki w 25 mililitrach ogrzanego 1X William's Medium E zawierającego suplementy do rozmrażania i wysiewania pierwotnych hepatocytów, a następnie przefiltruj zawiesinę przez nowe nylonowe sitko komórkowe o rozmiarze oczek 70 mikrometrów do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Po policzeniu komórek wysiej je w 2 mililitrach William's Medium E zawierającego suplementy do rozmrażania i wysiewania pierwotnych hepatocytów na sześciodołową płytkę do hodowli komórkowej pokrytą kolagenem. Po dwóch zmianach medium w celu doprowadzenia komórek do stanu głodzenia, potraktuj komórki w medium beztłuszczowym PBS jako nośnikiem, 25 nanogramami na mililitr FGF23, 100 mikrogramami na mililitr LPS lub 50 nanogramami na mililitr IL6.

Inkubować hodowle przez 24 godziny. Po wyizolowaniu RNA za pomocą zestawu do kolumn wirówkowych zgodnie z instrukcją producenta, dodać 200 nanogramów wyizolowanego RNA do probówki do PCR. Następnie do probówki dodać 14 mikrolitrów wody wolnej od endonukleaz oraz cztery mikrolitry odwrotnej transkryptazy.

Umieść probówkę PCR w termocyklerze i uruchom poniższy program odwrotnej transkrypcji w celu otrzymania cDNA. Aby przeprowadzić ilościową PCR, połącz w probówce na lodzie następujące składniki master mixu do QPCR. Zamieszaj master mix w wortexerze.

Następnie odmień dziewięć µL roztworu do każdego dołka płytki 96-dołkowej. Ostrożnie dodaj jeden µL cDNA do każdego dołka, przygotowując trzy powtórzenia dla każdej próbki. Na koniec poddaj próbki analizie w urządzeniu do real-time PCR i przeanalizuj dane zgodnie z protokołem tekstowym.

Tutaj przedstawiono reprezentacyjny obraz mikroskopii świetlnej pierwotnych wyizolowanych i hodowlanych komórek. Analiza immunocytochemiczna wykazuje, że wyizolowane hepatocyty wykazują wysoką ekspresję albuminy oraz receptora czynnika wzrostu fibroblastów 4. W tym eksperymencie pierwotne wyizolowane hepatocyty traktowano FGF23, LPS lub IL6 przez 24 godziny, a poziomy mRNA dla CRP i IL6 analizowano za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym.

LPS, IL6 oraz FGF23 znacząco zwiększyły ekspresję CRP i IL6. Jak pokazano tutaj, poziomy CRP w supernatantach hodowli komórkowych wyizolowanych pierwotnych hepatocytów przeanalizowano metodą ELISA. Jak wykazano w analizie QPCR, traktowanie LPS, IL6 oraz FGF23 znacząco zwiększyło poziomy CRP w supernatantach komórkowych w porównaniu z komórkami traktowanymi PBS.

Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zająć zaledwie kilka godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest zachowanie sterylnych warunków. Ze względu na pracę z kulturą pierwotną, minimalizacja ryzyka ewentualnego zanieczyszczenia jest kluczowa dla uzyskania optymalnych wyników.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak skutecznie izolować hepatocyty mysie w celu badania różnych funkcji hepatocytów, takich jak ekspresja i sekrecja cytokin wątrobowych.