Analiza remodelingu adhezji powierzchni komórek w odpowiedzi na naprężenia mechaniczne za pomocą kulek magnetycznych

Ogólnym celem tego eksperymentu jest zbadanie szlaków biochemicznych, które są aktywowane w odpowiedzi na napięcie za pomocą mikrokulek magnetycznych pokrytych ligandem i wymuszonej aplikacji do receptorów adhezyjnych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie transakcji mechanicznych, takie jak to, w jaki sposób napięcie mechaniczne z helometrii ekspresowej kieruje je od różnicowania lub jak podatność tkanek napędza ich transformację. Główną zaletą tej techniki jest to, że wiele komórek można stymulować do analizy chemicznej za pomocą kulek do wywierania napięcia na określony podzbiór receptorów adhezyjnych.

Na początek dokładnie zamieszaj super paramagnetyczne kulki aktywowane tosylem w oryginalnej fiolce, wirując przez co najmniej 30 sekund. Podać 40 mikrolitrów zawieszonych kulek superparamagnetycznych do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej zawierającej jeden mililitr 0,1 molowego fosforanu sodu o pH 7,4. Następnie umieść probówkę na stojaku do separacji magnetycznej, aby oddzielić kulki magnetyczne od roztworu.

Odrzucić supernatant i wyjąć probówkę ze stojaka do separacji magnetycznej. Ponownie zawiesić kulki w jednym mililitrze 0,1 molowego fosforanu sodu o pH 7,4. Po dwukrotnym umyciu kulek ponownie zawieś je w jednym mililitrze tego samego bufora.

Następnie połącz 100 mikrogramów fibronektyny bydlęcej lub dowolnego innego liganda receptora adhezyjnego komórek z kulkami i wirem. Powtórz ten krok, zastępując ligand BSA, poli-D-lizyną lub apotransferyną w przypadku kontroli ujemnych. Inkubować kulki z roztworem zawierającym ligand przez 12 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza na rotorze.

Jeśli po zajściu reakcji pojawią się agregaty kulek, należy sonikować przez nie więcej niż 10 do 20 sekund. Następnie odizoluj kulki za pomocą magnetycznego stojaka separacyjnego i odessaj pozostały roztwór. Następnie dodać jeden mililitr roztworu PBS uzupełnionego 0,2% białka surowicy bydlęcej.

Inkubować przez godzinę na wirniku w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Za pomocą magnesu przemyj kulki jednym mililitrem roztworu PBS uzupełnionego dwukrotnie 0,2% białko surowicy bydlęcej. Przed ponownym wymieszaniem ich w jednym mililitrze tego samego buforu.

Sonikuj kulki, jeśli agregaty pojawiają się nie dłużej niż 20 do 30 sekund. Przejdź do testów komórkowych lub przechowuj kulki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca. Hoduj przylegające komórki na 60-mililitrowym naczyniu do hodowli tkankowej w odpowiednim pożywce wzrostowej, aż do osiągnięcia 80% zgryzu.

Po zagnieżdżeniu kulek pokrytych ligandem, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze roztworu PBS uzupełnionego 0,2% białka surowicy bydlęcej. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu kulek pokrytych ligandem do pięciu mililitrów ciepłej pożywki hodowlanej i wiruj. Następnie odessać pożywkę do 60-mililitrowego naczynia hodowlanego i dodać pięć mililitrów ciepłej pożywki wzrostowej uzupełnionej kulkami.

Inkubować zawiesinę przez 20 minut w warunkach hodowli komórkowej, aby kulki mogły osiąść i przylgnąć do komórek. Ważne jest, aby nie przekraczać 20 minut, ponieważ koraliki mogą zostać zinternalizowane przez fagocytozę. Następnie obserwuj koraliki pod mikroskopem świetlnym za pomocą obiektywu 10X lub 20X.

Sprawdź przyczepność koralików, lekko potrząsając naczyniem, aby odróżnić koraliki przymocowane od pływających. Umieść okrągły magnes neodymowy o średnicy 38 milimetrów na górnej powierzchni normalnej pokrywki naczynia do hodowli 60 milimetrów i utrzymuj go na miejscu za pomocą dwóch mniejszych magnesów neodymowych o średnicy 13 milimetrów umieszczonych na dolnej powierzchni pokrywki. Inkubuj komórki poddane napięciu przez pożądane punkty czasowe i warunki hodowli komórek.

Zamień normalną pokrywkę naczynia na pokrywkę z magnesem. Ponieważ magnesy są bardzo silne, manipuluj nimi ostrożnie. Po zabiegu umieść naczynie na lodzie i ostrożnie odessaj całe podłoże z naczynia.

Dodaj 300 mikrolitrów buforu do lizy komórek i inkubuj przez 10 minut na lodzie. Następnie zbierz lizat za pomocą skrobaka do komórek i przenieś go do wstępnie schłodzonej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Granuluj kulki magnetyczne za pomocą magnetycznego stojaka separacyjnego i przenieś całkowity lizat komórkowy do nowej, wstępnie schłodzonej 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.

Usunąć 15 mikrolitrów podwielokrotności z całkowitego lizatu komórkowego otrzymanego po oddzieleniu kulek do analizy western blot. Umyj kulki trzykrotnie jednym mililitrem lodowatego buforu do lizy. Następnie dodaj 50 mikrolitrów buforu próbki do granulki kulki.

Po wymieszaniu zawiesiny przez wirowanie gotować ją w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut za pomocą suchego podgrzewacza blokowego. Frakcja ta zawiera izolowane kompleksy adhezyjne. Przystąp do analizy biochemicznej lub przechowuj frakcję w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Rysunek ten ma na celu zademonstrowanie oczyszczania kompleksów adhezyjnych. Immunoblotting GAPDH jest stosowany jako kontrola obciążenia całkowitego lizatu komórkowego oraz do sprawdzania czystości kompleksów adhezyjnych. Długa ekspozycja została wykorzystana do sprawdzenia braku sygnału cytoplazmatycznego w oczyszczonej frakcji kompleksu adhezyjnego.

Kulki pokryte fibronektyną wykorzystano do zbadania procesów mechano-transdukcji, które zachodzą w czasie w kompleksach adhezyjnych w odpowiedzi na napięcie. Po magnetycznym oddzieleniu frakcji kompleksu adhezyjnego, lizat i frakcję kompleksu adhezyjnego analizowano za pomocą western blot. Kontrola obciążenia i kandydaci, o których wiadomo, że są rekrutowani lub fosforylowani w kompleksach adhezyjnych w odpowiedzi na napięcie mechaniczne, poddano immunoblottingowi.

Podczas gdy napięcie nie wpływało na rekrutację Paxillin do kompleksów adhezyjnych, jej fosforylacja na tyrozynie 31 była zwiększona w odpowiedzi na napięcie mechaniczne zarówno w całkowitym lizacie komórkowym, jak i we frakcji kompleksu adhezyjnego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przyłożyć siły rozciągające do adhezji białek powierzchniowych za pomocą kulek magnetycznych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby zachować ostrożność w przypadku silnych magnesów. Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić badania biochemiczne, takie jak plamy zachodnie, test polimeryzacji aktyny lub test enzymatyczny, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak to, czy aktywność kinazy jest regulowana przez napięcie. Technika ta może pomóc naukowcom zajmującym się biologią komórki w badaniu wrażliwych na pole magnetyczne szlaków sygnałowych w komórkach.