Analiza remodelingu adhezji powierzchni komórek w odpowiedzi na naprężenia mechaniczne za pomocą kulek magnetycznych

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie szlaków biochemicznych aktywowanych w odpowiedzi na napięcie, z wykorzystaniem powlekanych ligandami magnetycznych mikrokulek oraz wymuszonego przyłożenia siły do receptorów adhezyjnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytania z dziedziny mechanotransdukcji, takie jak to, w jaki sposób napięcie mechaniczne z elementów helometrycznych kieruje ich różnicowaniem lub w jaki sposób podatność tkanki napędza ich transformację. Główną zaletą tej techniki jest możliwość stymulacji wielu komórek do analizy chemicznej poprzez zastosowanie kulek w celu przyłożenia napięcia do konkretnego podzbioru receptorów adhezyjnych.

Na początek należy dokładnie resuspendować superparamagnetyczne kulek aktywowane tosylem w oryginalnej fiolce, mieszając w wirówce typu vortex przez co najmniej 30 sekund. Odmiarkować 40 µL resuspendowanych kulek superparamagnetycznych do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 0,1 M fosforanu sodu pH 7,4. Następnie umieścić probówkę na statywie do separacji magnetycznej, aby oddzielić kulki magnetyczne od roztworu.

Odlej nadsącz i wyjmij probówkę ze statywu do separacji magnetycznej. Resuspenduj kulki w 1 ml 0,1 M fosforanu sodu o pH 7,4. Po dwukrotnym przemyciu kulek, resuspenduj je w 1 ml tego samego buforu.

Następnie połącz 100 µg fibronektyny wołowej lub innego ligandu receptora adhezji komórkowej z kuleczkami i wymieszaj w wstrząsarku typu vortex. Powtórz ten krok, zastępując ligand BSA, poli-D-lizyną lub apotransferyną w celu przygotowania kontroli negatywnych. Inkubuj kuleczki w roztworze zawierającym ligand przez 12 do 24 godzin w temperaturze 37 °C na rotorze.

Jeśli po zakończeniu reakcji pojawią się agregaty kulek, poddać je sonikacji przez nie więcej niż 10 do 20 sekund. Następnie wyizolować kulki za pomocą statywu do separacji magnetycznej i odessać pozostały roztwór. Następnie dodać jeden mililitr roztworu PBS uzupełnionego o 0,2% bovine serum albumen.

Inkubować przez jedną godzinę na rotorze w temperaturze 37°C. Przy użyciu magnesu przemyć kuleczki dwukrotnie jednym mililitrem roztworu PBS uzupełnionego o 0,2% albuminy surowicy bydlęcej. Następnie resuspenderować je w jednym mililitrze tego samego buforu.

Jeśli pojawią się agregaty, poddać kuleczki sonikacji nie dłużej niż przez 20 do 30 sekund. Przejść do analiz komórkowych lub przechowywać kuleczki w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza przez maksymalnie jeden miesiąc. Hodować komórki adherentne na 60 mililitrowej płytce do hodowli tkanek w odpowiednim medium wzrostowym do osiągnięcia 80% konfluencji.

Po odwirowaniu kulek pokrytych ligandem, zawiesić osad w 1 ml roztworu PBS uzupełnionego o 0,2% albuminy surowicy bydlęcej. Dodać 100 µL roztworu kulek pokrytych ligandem do 5 ml ciepłej pożywki hodowlanej i wymieszać na wirówce vorex. Następnie odessać pożywkę z 60 ml naczynia hodowlanego i dodać 5 ml ciepłej pożywki wzrostowej z zawiesiną kulek.

Inkubować zawiesinę przez 20 minut w warunkach hodowli komórkowej, aby umożliwić sedymentację kuleczek i ich przyleganie do komórek. Kluczowe jest, aby nie przekroczyć 20 minut, ponieważ kuleczki mogą zostać zinternalizowane w procesie fagocytozy. Następnie obserwować kuleczki pod mikroskopem świetlnym, używając obiektywu 10X lub 20X.

Sprawdzić adhezję kulek, lekko potrząsając szalką, aby odróżnić kulki przytwierdzone od tych pływających. Umieścić okrągły magnes neodymowy o średnicy 38 mm na górnej powierzchni standardowej pokrywki szalki hodowlanej o średnicy 60 mm i utrzymać go w miejscu za pomocą dwóch mniejszych magnesów neodymowych o średnicy 13 mm umieszczonych na dolnej powierzchni pokrywki. Inkubować komórki poddane naprężeniu przez wymagany czas i w określonych warunkach hodowli komórkowej.

Zastąp zwykłą pokrywkę szalki pokrywką z magnesem. Ponieważ magnesy są bardzo silne, należy nimi operować ostrożnie. Po zakończeniu inkubacji umieść szalkę na lodzie i ostrożnie odessij całe medium z szalki.

Dodaj 300 µL buforu do lizy komórek i inkubuj przez 10 minut w lodzie. Następnie zbierz lizat za pomocą skrobaczki do komórek i przenieś go do schłodzonej wcześniej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Odwirowuj kuleczki magnetyczne przy użyciu statywu do separacji magnetycznej i przenieś całkowity lizat komórkowy do nowej, schłodzonej wcześniej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.

Pobrać 15 µL aliquoty całkowitego lizatu komórkowego uzyskanego po oddzieleniu kulek do analizy western blot. Przemyć kulki trzykrotnie 1 mL lodowatego buforu do lizy. Następnie dodać 50 µL buforu do próbek do osadu z kulek.

Po wymieszaniu zawiesiny za pomocą vorteza, gotować ją w temperaturze 95 °C przez pięć minut, używając suchego grzejnika blokowego. Frakcja ta zawiera wyizolowane kompleksy adhezyjne. Przejść do analizy biochemicznej lub przechowywać frakcję w temperaturze -20 °C.

Rysunek ten przedstawia oczyszczanie kompleksów adhezyjnych. Immunoblotting GAPDH został wykorzystany jako kontrola załadunku dla całkowitego lizatu komórkowego oraz w celu sprawdzenia czystości kompleksów adhezyjnych. Zastosowano długi czas ekspozycji, aby potwierdzić brak sygnału cytoplazmatycznego w oczyszczonej frakcji kompleksów adhezyjnych.

Do zbadania procesów mechanotransdukcji zachodzących w czasie w kompleksach adhezyjnych w odpowiedzi na naprężenia wykorzystano koraliki powlekane fibronektyną. Po separacji magnetycznej frakcji kompleksów adhezyjnych, lizat oraz frakcja kompleksów adhezyjnych zostały poddane analizie metodą western blot. Wykonano immunoblotting dla kontroli załadunku oraz kandydatów znanych z rekrutacji lub fosforylacji w kompleksach adhezyjnych w odpowiedzi na naprężenie mechaniczne.

Chociaż napięcie nie wpłynęło na rekrutację paxylliny do kompleksów adhezyjnych, jej fosforylacja w pozycji tyrozyny 31 była zwiększona w odpowiedzi na napięcie mechaniczne zarówno w całkowitym lizacie komórkowym, jak i w frakcji kompleksów adhezyjnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przykładać siły napięcia do białek powierzchni adhezyjnej przy użyciu kulek magnetycznych. Po opanowaniu techniki, w przypadku jej prawidłowego wykonania, procedura ta może zająć dwie godziny.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie ostrożności w kontakcie z silnymi magnesami. Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać badania biochemiczne, takie jak western blot, test polimeryzacji aktyny lub test enzymatyczny, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład czy aktywność kinazy jest regulowana przez napięcie. Technika ta może pomóc badaczom w dziedzinie biologii komórki w eksploracji magnetycznie wrażliwych szlaków sygnalizacyjnych w komórkach.