Name: Analiza remodelingu adhezji powierzchni komórek w odpowiedzi na naprężenia mechaniczne za pomocą kulek magnetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Poznaj metodę badania szlaków biochemicznych aktywowanych przez naprężenia mechaniczne w adhezjach powierzchniowych komórek przy użyciu ligandowych kulek magnetycznych. Technika umożliwia stymulację wielu komórek jednocześnie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

C.G. jest wspierany przez granty z Agence National de la Recherche (ANR-13-JSV1-0008), z Siódmego Programu Ramowego Unii Europejskiej (Marie Curie Career Integration n°8304162) oraz z Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji (ERBN Starting Grant n°639300).

1. Koniugacja ligandów z koralikami magnetycznymi
Uwaga: Koniugacja ligandów odbywa się za pomocą superparamagnetycznych kulek aktywowanych tozylem o średnicy 2,8 μm (stężenie roztworu podstawowego 108 kulek/ml, 30 mg kulek/ml). Poniższy protokół opiera się na próbkach około 2 x 105 komórek, które odpowiadają komórkom MRC-5 wyhodowanym do 80% zbiegu na 60-milimetrowej płytce do hodowli tkankowej. Dostosuj odpowiednio objętość kulek i odczynników, jeśli używasz płytek o różnych rozmiarach lub komórek w różnych zbiegach. Użyj pewnej ilości koralików superparamagnetycznych, aby mieć 2 koraliki na komórkę. Dlatego do płyty 60 mm potrzebne są 4 x 105 koralików.
<ol>
	<li>Dokładnie zawiesić kulki w oryginalnej fiolce, wirując co najmniej 30 s. Porcję 40 μl zawieszonych kulek superparamagnetycznych (odpowiadających 4 x 106 kulek) do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Umieść probówkę na stojaku do separacji magnetycznej, aby oddzielić kulki magnetyczne od roztworu. Odrzucić supernatant, wyjąć probówkę ze stojaka do separacji magnetycznej i ponownie zawiesić kulki w 1 ml 0,1 M Na-fosforanu o pH 7,4.
	<ol>
		<li>Powtórzyć etap płukania dwukrotnie z 1 ml 0,1 M Na-fosforanu o pH 7,4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ostatnim praniu ponownie zawieś kulki w 1 ml 0,1 M Na-fosforanu o pH 7,4.</li>
	<li>Połączyć 100 μg bydlęcej fibronektyny (FN) lub innego liganda receptora adhezji komórek z 1 ml 0,1 M fosforanu Na-fosforanu o pH 7,4 zawierającym kulki i wymieszać pipetując.</li>
	<li>Powtórz poprzednie kroki, zastępując FN lub inny specyficzny ligand BSA, poli-D-lizyną lub apo-transferyną do kontroli ujemnych.</li>
	<li>Opcjonalnie, do analizy żelu, należy pobrać 10 μl podwielokrotności roztworu liganda do analizy skuteczności sieciowania i wymieszać z odpowiednią objętością stężonego buforu do próbek Laemmli.</li>
	<li>Inkubować kulki z roztworem zawierającym ligand przez 12-24 h w temperaturze 37 °C na rotorze.</li>
	<li>Jeśli po zajściu reakcji pojawią się agregaty perełek, należy wykonać sonikację (ciągła moc 39 W) nie dłużej niż 10-20 s.</li>
	<li>Odizoluj kulki za pomocą magnetycznego stojaka do separacji, odessaj pozostały roztwór i dodaj 1 ml PBS/0,2% roztworu BSA pH 7,6. Inkubować przez 1 godzinę na rotorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umyj koraliki za pomocą magnesu dwukrotnie w 1 ml PBS/0,2% BSA pH 7,6. Ponownie zawiesić kulki w 1 ml PBS/0,2% BSA pH 7,6.</li>
	<li>Koraliki sonikować, jeśli agregaty pojawiają się nie dłużej niż 20-30 s.</li>
	<li>Opcjonalnie usunąć podwielokrotność 10 μl w celu przeanalizowania skuteczności sprzęgania za pomocą western blot (zmieszać z odpowiednią objętością stężonego buforu do próbek Laemmli).</li>
	<li>Przejdź do testów komórkowych lub przechowuj kulki w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	<li>Opcjonalnie uruchom żel SDS-PAGE i zabarwij go kolorem Coomassie blue, aby przeanalizować usieciowanie FN z kulkami magnetycznymi.</li>
</ol>
2. Zastosowanie sił rozciągających na pokryte ligandem kulki związane z receptorami adhezyjnymi na grzbietowej powierzchni komórek
<ol>
	<li>Hodować przylegające komórki na 60-milimetrowej szalce do hodowli tkankowej w odpowiednim pożywce wzrostowej (zwykle DMEM 4,5 g/L D-glukozy uzupełnionej FCS 10%) aż do osiągnięcia 80% zbieżności.</li>
	<li>Przygotować niedenaturujący niejonowy bufor do lizy (20 mM Tris HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 0,1% NP-40) i schłodzić probówki mikrowirówkowe.</li>
	<li>Granulki pokryte ligandem zawiesić w granulkach z sekcji 1.10 i ponownie zawiesić w 1 ml PBS/0,2% BSA pH 7,6. Dodać 100 μl roztworu kulek pokrytych ligandem do 5 ml ciepłej pożywki hodowlanej i odwirować.</li>
	<li>Odessać pożywkę do naczynia hodowlanego o średnicy 60 mm i dodać 5 ml ciepłej pożywki wzrostowej uzupełnionej kulkami. </li>
	<li>Inkubować przez 20 minut w warunkach hodowli komórkowej (37 °C i 5% CO2 ), aby kulki mogły osiąść i przylgnąć do komórek. Ważne jest, aby nie przekraczać 20 minut, ponieważ koraliki mogą zostać zinternalizowane przez fagocytozę.</li>
	<li>Opcjonalnie obserwuj koraliki pod mikroskopem świetlnym za pomocą obiektywu 10X lub 20X i sprawdź przyczepność koralików, lekko potrząsając naczyniem, aby odróżnić koraliki dołączone od pływających.</li>
	<li>Trzymając naczynie hodowlane w inkubatorze, zamień normalną pokrywę naczynia na pokrywkę z okrągłym magnesem neodymowym o średnicy 38 mm przymocowanym do górnej powierzchni. Magnes jest utrzymywany na miejscu przez dwa mniejsze magnesy neodymowe o średnicy 13 mm umieszczone na dolnej powierzchni pokrywy. Ponieważ magnesy są bardzo silne, manipuluj nimi ostrożnie.</li>
	<li>Inkubować komórki poddane naprężeniu przez żądane punkty czasowe w warunkach hodowli komórkowej (37 °C i 5 % CO2 ). </li>
	<li>Po zabiegu umieść naczynie na lodzie i ostrożnie odessaj całe podłoże z naczynia.</li>
	<li>Dodać 300 μl buforu do lizy komórek i inkubować przez 10 minut na lodzie. Zebrać lizat za pomocą skrobaka do komórek i przenieść do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Granulować kulki magnetyczne za pomocą magnetycznego stojaka separacyjnego i przenieść całkowity lizat komórkowy do nowej, wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Przechowywać tę frakcję w temperaturze -20 °C do dalszej analizy.</li>
	<li>Umyj kulki 3 razy za pomocą 1 ml lodowatego buforu do lizy. Dodać 50 μl buforu do próbki Laemmli do granulki, wymieszać pipetując i gotować w temperaturze 95 °C przez 5 minut przy użyciu suchego podgrzewacza blokowego. Frakcja ta zawiera izolowane kompleksy adhezyjne. Przejść do analizy biochemicznej lub przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Z całkowitego lizatu komórkowego otrzymanego po oddzieleniu kulek (około 300 μl) usunąć 50 μl podwielokrotności do analizy western blot. 
	UWAGA: Pozostałe 250 μl można wykorzystać do dalszych badań biochemicznych, takich jak badania interakcji białko-białko (immunoprecypitacja, testy GST pull-down) lub eksperymenty z aktywnością GTPazy (zmiana buforu do lizy może być konieczna w zależności od interesującej GTPazy).</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDischer%2C+DE+%22Tissue+cells+feel+and+respond+to+the+stiffness+of+their+substrate%22">Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate</a>. 310 (5751), Science. New York, N.Y. 1139-1143 (2005).</li>
<li>DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+forces%3A+architectural+control+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Balancing forces: architectural control of mechanotransduction.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (5), 308-319 (2011).</li>
<li>Guilluy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+GEFs+LARG+and+GEF-H1+regulate+the+mechanical+response+to+force+on+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Rho GEFs LARG and GEF-H1 regulate the mechanical response to force on integrins.</a> Nat Cell Biol. 13 (6), 722-727 (2011).</li>
<li>Matthews, B. D., Overby, D. R., Mannix, R., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+adaptation+to+mechanical+stress%3A+role+of+integrins%2C+Rho%2C+cytoskeletal+tension+and+mechanosensitive+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular adaptation to mechanical stress: role of integrins, Rho, cytoskeletal tension and mechanosensitive ion channels.</a> J Cell Sci. 119 (3), 508-518 (2006).</li>
<li>Zhao, X. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+activates+smooth+muscle+alpha-actin+promoter+activity+through+the+Rho+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Force activates smooth muscle alpha-actin promoter activity through the Rho signaling pathway.</a> J Cell Sci. 120 (Pt 10), 1801-1809 (2007).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Austen, K., Kluger, C., Freikamp, A., Chrostek-Grashoff, A., Grashoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+analysis+of+biosensors+to+measure+mechanical+forces+within+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation and analysis of biosensors to measure mechanical forces within cells.</a> Meth Mol Biol. 1066, 169-184 (2013).</li>
<li>Grashoff, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mechanical+tension+across+vinculin+reveals+regulation+of+focal+adhesion+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics.</a> Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).</li>
<li>Pelham, R. J., Wang, Y. l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+locomotion+and+focal+adhesions+are+regulated+by+substrate+flexibility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 94 (25), 13661-13665 (1997).</li>
<li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li>
<li>Chaudhuri, O., Parekh, S. H., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+atomic+force+microscopy+and+side-view+optical+imaging+for+mechanical+studies+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Combined atomic force microscopy and side-view optical imaging for mechanical studies of cells.</a> Nat Meth. 6 (5), 383-387 (2009).</li>
<li>Bays, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vinculin+phosphorylation+differentially+regulates+mechanotransduction+at+cell-cell+and+cell-matrix+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vinculin phosphorylation differentially regulates mechanotransduction at cell-cell and cell-matrix adhesions.</a> J Cell Biol. 205 (2), 251-263 (2014).</li>
<li>Collins, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+tensional+forces+on+PECAM-1+elicit+a+global+mechanotransduction+response+via+the+integrin-RhoA+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Localized tensional forces on PECAM-1 elicit a global mechanotransduction response via the integrin-RhoA pathway.</a> Curr Biol. 22 (22), 2087-2094 (2012).</li>
<li>Gordon, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Allostery%3A+Evidence+for+a+Force+Requirement+in+the+Proteolytic+Activation+of+Notch%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical Allostery: Evidence for a Force Requirement in the Proteolytic Activation of Notch.</a> Dev Cell. 33 (6), 729-736 (2015).</li>
<li>Lessey-Morillon, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RhoA+guanine+nucleotide+exchange+factor%2C+LARG%2C+mediates+ICAM-1-dependent+mechanotransduction+in+endothelial+cells+to+stimulate+transendothelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The RhoA guanine nucleotide exchange factor, LARG, mediates ICAM-1-dependent mechanotransduction in endothelial cells to stimulate transendothelial migration.</a> J Immunol. 192 (7), 3390-3398 (2014).</li>
<li>Osborne, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+regulates+LARG+and+GEF-H1+during+EMT+to+affect+stiffening+response+to+force+and+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">TGF-β regulates LARG and GEF-H1 during EMT to affect stiffening response to force and cell invasion.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), 3528-3540 (2014).</li>
<li>Scott, D. W., Tolbert, C. E., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+on+JAM-A+activates+RhoA+via+GEF-H1+and+p115+RhoGEF%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tension on JAM-A activates RhoA via GEF-H1 and p115 RhoGEF.</a> Mol Biol Cell. 27 (9), 1420-1430 (2016).</li>
<li>Glogauer, M., Ferrier, J., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+fields+applied+to+collagen-coated+ferric+oxide+beads+induce+stretch-activated+Ca2%2B+flux+in+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+-+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Magnetic fields applied to collagen-coated ferric oxide beads induce stretch-activated Ca2+ flux in fibroblasts.</a> Am J Physiol - Cell Physiol. 269 (5), C1093-C1104 (1995).</li>
<li>Glogauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+ions+and+tyrosine+phosphorylation+interact+coordinately+with+actin+to+regulate+cytoprotective+responses+to+stretching%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium ions and tyrosine phosphorylation interact coordinately with actin to regulate cytoprotective responses to stretching.</a> J Cell Sci. 110 (Pt 1), 11-21 (1997).</li>
<li>Kuo, J. -C., Han, X., Hsiao, C. -T., Yates, J. R., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+myosin-II-responsive+focal+adhesion+proteome+reveals+a+role+for+%CE%B2-Pix+in+negative+regulation+of+focal+adhesion+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of the myosin-II-responsive focal adhesion proteome reveals a role for β-Pix in negative regulation of focal adhesion maturation.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 383-393 (2011).</li>
<li>Schiller, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B21-+and+%CE%B1v-class+integrins+cooperate+to+regulate+myosin+II+during+rigidity+sensing+of+fibronectin-based+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">β1- and αv-class integrins cooperate to regulate myosin II during rigidity sensing of fibronectin-based microenvironments.</a> Nat Cell Biol. 15 (6), 625-636 (2013).</li>
<li>Guilluy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+nuclei+adapt+to+force+and+reveal+a+mechanotransduction+pathway+in+the+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus.</a> Nat Cell Biol. 16 (4), 376-381 (2014).</li>
<li>Plopper, G. E., McNamee, H. P., Dike, L. E., Bojanowski, K., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+integrin+and+growth+factor+receptor+signaling+pathways+within+the+focal+adhesion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Convergence of integrin and growth factor receptor signaling pathways within the focal adhesion complex.</a> Mol Biol Cell. 6 (10), 1349-1365 (1995).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Gauthier, N. C., Del Rio,, A,, Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+of+alpha%285%29beta%281%29+integrins+determines+adhesion+strength+whereas+alpha%28v%29beta%283%29+and+talin+enable+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Clustering of alpha(5)beta(1) integrins determines adhesion strength whereas alpha(v)beta(3) and talin enable mechanotransduction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (38), 16245-16250 (2009).</li>
<li>Ajeian, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+integrin-associated+complexes+from+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of integrin-associated complexes from mesenchymal stem cells.</a> Proteomics Clin Appl. 10 (1), 51-57 (2016).</li>
<li>Horton, E. R., Astudillo, P., Humphries, M. J., Humphries, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitivity+of+integrin+adhesion+complexes%3A+Role+of+the+consensus+adhesome%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitivity of integrin adhesion complexes: Role of the consensus adhesome.</a> Exp Cell Res. , (2015).</li>
<li>Jones, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+integrin-based+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of integrin-based adhesion complexes.</a> Curr Protoc Cell Biol. 66, 9.8.1-9.8.15 (2015).</li>
<li>Ng, D. H. J., Humphries, J. D., Byron, A., Millon-Frémillon, A., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-dependent+modulation+of+adhesion+complex+composition%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Microtubule-dependent modulation of adhesion complex composition.</a> PloS One. 9 (12), e115213(2014).</li>
<li>Byron, A., Humphries, J. D., Bass, M. D., Knight, D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+integrin+adhesion+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Sign%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of integrin adhesion complexes.</a> Sci Sign. 4 (167), pt2(2011).</li>
<li>Byron, A., Humphries, J. D., Craig, S. E., Knight, D., Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+%CE%B14%CE%B21+integrin+adhesion+complexes+reveals+%CE%B1-subunit-dependent+protein+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of α4β1 integrin adhesion complexes reveals α-subunit-dependent protein recruitment.</a> Proteomics. 12 (13), 2107-2114 (2012).</li>
<li>Marjoram, R. J., Guilluy, C., Burridge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+magnets+and+magnetic+beads+to+dissect+signaling+pathways+activated+by+mechanical+tension+applied+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Using magnets and magnetic beads to dissect signaling pathways activated by mechanical tension applied to cells.</a> Methods. , San Diego, Calif. (2015).</li>
<li>Pasapera, A. M., Schneider, I. C., Rericha, E., Schlaepfer, D. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+activity+regulates+vinculin+recruitment+to+focal+adhesions+through+FAK-mediated+paxillin+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myosin II activity regulates vinculin recruitment to focal adhesions through FAK-mediated paxillin phosphorylation.</a> J Cell Biol. 188 (6), 877-890 (2010).</li>
<li>Sawada, Y., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+transduction+by+Triton+cytoskeletons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Force transduction by Triton cytoskeletons.</a> J Cell Biol. 156 (4), 609-615 (2002).</li>
<li>Grinnell, F., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+fibronectin-coated+beads+with+attached+and+spread+fibroblasts.+Binding%2C+phagocytosis%2C+and+cytoskeletal+reorganization%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Interaction of fibronectin-coated beads with attached and spread fibroblasts. Binding, phagocytosis, and cytoskeletal reorganization.</a> Exp Cell Res. 162 (2), 449-461 (1986).</li>
<li>Schroeder, F., Kinden, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+phagocytosis+using+fluorescent+latex+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem+Biophys+Meth%22%5BJournal%5D)">Measurement of phagocytosis using fluorescent latex beads.</a> J Biochem Biophys Meth. 8 (1), 15-27 (1983).</li>
<li>Hoffman, B. D., Grashoff, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+processes+mediate+cellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular processes mediate cellular mechanotransduction.</a> Nature. 475 (7356), 316-323 (2011).</li>
<li>Seo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanogenetic+Toolkit+for+Interrogating+Cell+Signaling+in+Space+and+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mechanogenetic Toolkit for Interrogating Cell Signaling in Space and Time.</a> Cell. 165 (6), 1507-1518 (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Opisana tutaj metoda stanowi proste podejście do naprężenia receptorów adhezyjnych na powierzchni komórki i umożliwienia ich późniejszego oczyszczenia. Jednak niektóre kroki mają kluczowe znaczenie dla przeprowadzenia skutecznego oczyszczania adhezji, a potencjalną optymalizację można przeprowadzić w zależności od docelowych receptorów adhezyjnych. Poniżej przedstawiamy potencjalne problemy, które użytkownik może napotkać.
Użyliśmy kulek magnetycznych o średnicy 2,8 μm, ale można użyć większyc...

W metazoa, napięcie mechaniczne kieruje rozwojem tkanek i homeostazą poprzez regulację niezliczonych procesów komórkowych, takich jak proliferacja, różnicowanie i przeżycie 1,2. Napięcie mechaniczne może powstawać z macierzy zewnątrzkomórkowej lub może być generowane przez przylegające komórki, które pobierają próbki środowiska zewnątrzkomórkowego za pomocą kurczliwej maszynerii aktomiozyny, która ciągnie macierz zewnątrzkomórkową i bada jej sztywność przez cząsteczki wrażliwe na napięcie. W odpowiedzi na napięcie mechanowrażliwe białka adhezyjne ulegają zmianom konformacyjnym, które wyzwalają złożone kaskady sygnałowe. Z kolei te szlaki sygnałowe koordynują mechanoodpowiedź obejmującą proliferację, różnicowanie i przeżycie, która dostosowuje zachowanie komórki do środowiska zewnątrzkomórkowego. Takie procesy można rozliczyć w krótkim okresie czasu (od sekund do minut), aby szybko przekazać je z powrotem do pętli mechanotransdukcji poprzez modyfikację struktur mechanowrażliwych. Na przykład zrosty oparte na integrynie wzmacniają się w odpowiedzi na napięcie poprzez przebudowę cytoszkieletu za pośrednictwem Rho GTPazy 3,4,5. Równolegle, inne szlaki sygnałowe są aktywowane przez godziny i dni, aby kontrolować programy genetyczne, które ostatecznie wpływają na los komórki 6. Podczas gdy wiele badań podkreśliło wpływ sztywności macierzy na determinizm komórek i rozwój choroby 1,2 , dokładne mechanizmy molekularne mechanotransdukcji za pośrednictwem adhezji nadal pozostają nieuchwytne.
Opracowano różne podejścia do badania wpływu sił generowanych przez komórkę lub sił zewnętrznych na zachowanie komórek, w tym systemy przepływu, czujniki transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET)-czujniki napięcia 7,8, zgodne podłoża 9, pęsety magnetyczne, pęsety optyczne 10 i mikroskopia sił atomowych (AFM) 11. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystujący kulki superparamagnetyczne do scharakteryzowania szlaków mechanotransdukcji w odpowiedzi na siły rozciągające przyłożone do określonych receptorów adhezyjnych. Koraliki superparamagnetyczne to cząstki, które odwracalnie magnetyzują się po umieszczeniu w polu magnetycznym. Po pokryciu ligandem dla określonego receptora, kulki te stanowią potężne narzędzie do badania skutków zastosowania siły zewnątrzkomórkowej. Metoda ta została potwierdzona w kilku badaniach 3,5,12-17 i prezentują zaletę, która znacznie ułatwia analizę biochemiczną na przylegających komórkach. Korzystając z podobnych kulek magnetycznych pokrytych kolagenem, a następnie analizie biochemicznej, wczesne prace wykazały wzrost fosforylacji tyrozyny białek i aktywacji RhoA w odpowiedzi na napięcie 5,18,19. Opisana poniżej metoda została również wykorzystana z kulkami pokrytymi fibronektyną (FN) w celu scharakteryzowania szlaków sygnałowych poniżej napięcia przyłożonego do integryn 3. W tym badaniu Guilluy i in. wykazali, że napięcie aktywuje RhoA poprzez rekrutację dwóch czynników wymiany nukleotydów guaniny (GEF), LARG i GEF-H1, do integracyjnych kompleksów adhezyjnych. Od tego czasu inne badania wykazały, że GEF-H1 jest rekrutowany do kompleksów adhezyjnych w odpowiedzi na napięcie generowane przez komórki przy użyciu różnych metod 20,21, co dowodzi solidności opisanej tutaj metodologii. W rezultacie wykazano, że aktywowany RhoA sprzyja wzmocnieniu przyczepności poprzez przebudowę cytoszkieletu. System ten został również wykorzystany do zbadania napięcia wywieranego na receptory adhezyjne komórka/komórka. Przyłożenie sił do kulek magnetycznych pokrytych zewnątrzkomórkową domeną E-kadheryny indukowało wzrost rekrutacji winkuliny, podobnie jak w przypadku kompleksów adhezyjnych związanych z integryną 12. Collins i współpracownicy zaobserwowali, że przyłożenie napięcia do PECAM-1 sprzyja aktywacji integryny i RhoA 13. Innym podejściem eksperymentalnym wykorzystującym kulki magnetyczne jest badanie napięcia przyłożonego do izolowanych jąder. Używając kulek pokrytych przeciwciałami przeciwko białku otoczki jądrowej nesprin-1, kompleksy otoczki jądrowej oczyszczono, aby pokazać, że są one dynamicznie regulowane w odpowiedzi na napięcie mechaniczne 22. Wyniki te potwierdzają skuteczność tej metody w badaniu szlaków mechanotransdukcji. Co więcej, podczas gdy systemy przepływu lub siły trakcyjnej stymulują ogólne procesy komórkowe, kulki magnetyczne celują w receptor adhezyjny komórki za pomocą ligandów receptorowych 3 lub przeciwciał monoklonalnych przeciwko receptorowi powierzchni komórki 13,15.
Kolejną zaletą tej metody jest izolacja kompleksów adhezyjnych poprzez prostą procedurę oczyszczania powinowactwa do ligandów. Powszechnie wiadomo, że dodanie do komórek kulek pokrytych ligandem wiąże receptory adhezyjne i indukuje rekrutację kilku białek adhezyjnych23. Dalsze przyłożenie sił do kulek magnetycznych pokrytych ligandem przekształca te kompleksy adhezyjne w platformy makromolekularne, które pośredniczą w różnych szlakach sygnałowych zależnych od napięcia4,24. Liza komórek, a następnie zagęszczenie kulek za pomocą magnesu pozwala na odizolowanie platform adhezyjnych. Inne metody stosowane do oczyszczania kompleksów adhezyjnych były już stosowane w komórkach adherentnych. Łączą one chemiczne sieciowanie w celu zachowania interakcji białko-białko oraz etap lizy komórek za pomocą detergentu i przepływu ścinającego lub sonikacji 20,21,25,26,27,28. Ostatnim etapem jest pobranie powstałych brzusznych błon plazmatycznych zawierających kompleksy adhezyjne. W przeciwieństwie do tych metod, kulki magnetyczne pozwalają na większy poziom oczyszczenia kompleksów adhezyjnych komórek poprzez selektywne celowanie w określoną rodzinę receptorów adhezyjnych. Kulki magnetyczne były już używane do oczyszczania kompleksów adhezyjnych w nieprzylegających komórkach przyczepionych do mikrokulek pokrytych ligandem29,30. Opisana poniżej metoda naśladuje sytuacje biologiczne, w których siła jest przykładana przez krótki czas (od sekund do minut). W związku z tym stanowi potężne narzędzie do badania zarówno składu molekularnego oczyszczonych kompleksów adhezyjnych, jak i dalszych szlaków sygnalizacji mechanowrażliwej.
Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół eksperymentalny dotyczący użycia kulek magnetycznych do przyłożenia sił rozciągających do adhezji białek powierzchniowych. Stały magnes neodymowy umieszcza się na powierzchni naczynia hodowlanego. Powierzchnia bieguna magnesu jest umieszczona na wysokości 6 mm, tak aby siła działająca na pojedynczy koralik magnetyczny o wielkości 2,8 μm była stała (około 30-40 pN)31. Czas trwania stymulacji napięcia jest określany przez operatora w zależności od interesującej nas cząsteczki i skali czasowej jej aktywacji. Komórki są ostatecznie poddawane lizie, kompleksy adhezyjne są oczyszczane przez separację kulek za pomocą magnesu i przetwarzane są analizy biochemiczne. Protokół ten obejmuje przygotowanie kulek superparamagnetycznych pokrytych ligandem oraz zastosowanie napięcia za pomocą magnesu, a następnie analizy biochemiczne. Dodatkowo przedstawiamy reprezentatywną próbkę danych wykazujących, że napięcie przyłożone do adhezji na bazie integryny indukuje przebudowę adhezji i zmienia fosforylację tyrozyny białek.

<table><tbody><tr><td>Magnesy neodymowe (na górnej powierzchni szalki 60 mm)</td><td>K& J Magnetics, Inc</td><td>DX88-N52</td><td>klasa N52 wymiar: 1 1/2 "średnica x 1/2" grubość</td></tr><tr><td>magnesów neodymowych (na dolnej powierzchni czaszy 60 mm)</td> <td>K& J Magnetics, Inc</td><td>D84PC-BLK</td><td>klasa N42 wymiar: średnica 1/2 "x grubość 1/4" Powlekany czarnym tworzywem sztucznym&nbsp;</td></tr><tr><td>Dynabeads M280 Tosylactivated</td><td>Thermofisher</td><td>14203</td><td>koraliki superparamagnetyczne&nbsp;</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnes</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektyna&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-5MG</td><td>Fibronektyna z osocza bydlęcego</td></tr><tr><td>Poli-D-Lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1428-50MG</td><td>Bydlęca Apo-Transferyna</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-500G</td><td></td></tr><tr><td>DMEM wysoka glukoza, suplement GlutaMAX, pirogronian&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31966-021</td><td>DMEM+GlutaMAX-I 500 ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Naczynie hodowlane 60*15 mm</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza remodelingu adhezji powierzchni komórek w odpowiedzi na naprężenia mechaniczne za pomocą kulek magnetycznych

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Mechanowrażliwe kompleksy adhezyjne powierzchni komórek pozwalają komórkom wyczuwać właściwości mechaniczne swojego otoczenia. Ostatnie badania zidentyfikowały zarówno cząsteczki wykrywające siłę w miejscach adhezji, jak i zależne od siły czynniki transkrypcyjne, które regulują ekspresję genów specyficznych dla linii i napędzają wyniki fenotypowe. Jednak sieci sygnalizacyjne przekształcające napięcie mechaniczne w szlaki biochemiczne pozostały nieuchwytne. Aby zbadać szlaki sygnałowe zaangażowane pod wpływem napięcia mechanicznego przyłożonego do receptora na powierzchni komórki, można użyć mikrokulek superparamagnetycznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół wykorzystania kulek magnetycznych do przykładania sił do białek adhezyjnych na powierzchni komórki. Korzystając z tego podejścia, możliwe jest zbadanie nie tylko zależnych od siły cytoplazmatycznych szlaków sygnałowych za pomocą różnych podejść biochemicznych, ale także przebudowy adhezji poprzez magnetyczną izolację kompleksów adhezyjnych przyłączonych do kulek pokrytych ligandem. Protokół ten obejmuje przygotowanie kulek superparamagnetycznych pokrytych ligandem oraz zastosowanie określonych sił rozciągających, a następnie analizy biochemiczne. Dodatkowo przedstawiamy reprezentatywną próbkę danych wykazujących, że napięcie przyłożone do adhezji opartej na integrynie wyzwala remodeling adhezji i zmienia fosforylację tyrozyny białek.

Schemat techniki przedstawiono na Rysunku 1a. Po sprzężeniu ligandów kulki magnetyczne inkubuje się z komórkami przez 20 min, a następnie za pomocą magnesu trwałego przykłada się siły rozciągające o wartości około 30-40 pN przez różny czas. Rysunek 1b przedstawia kulki magnetyczne o średnicy 2.8 µm powlekane FN, związane z receptorami adhezyjnymi komórek MRC5.
Etapy płukania kulek superparamagnetycznych po lizie komórek są kluczowe i determinują stopień oczysz...

Zrosty powierzchniowe komórek są kluczowe w mechanotransdukcji, ponieważ przenoszą napięcie mechaniczne i inicjują szlaki sygnałowe zaangażowane w homeostazę i rozwój tkanek. W tym miejscu przedstawiamy protokół preparowania szlaków biochemicznych, które są aktywowane w odpowiedzi na napięcie, przy użyciu mikrokulek magnetycznych pokrytych ligandem i przyłożenia siły do receptorów adhezyjnych.

Analiza remodelingu adhezji powierzchni komórek w odpowiedzi na naprężenia mechaniczne za pomocą kulek magnetycznych

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest zbadanie szlaków biochemicznych aktywowanych w odpowiedzi na napięcie, z wykorzystaniem powlekanych ligandami magnetycznych mikrokulek oraz wymuszonego przyłożenia siły do receptorów adhezyjnych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytania z dziedziny mechanotransdukcji, takie jak to, w jaki sposób napięcie mechaniczne z elementów helometrycznych kieruje ich różnicowaniem lub w jaki sposób podatność tkanki napędza ich transformację. Główną zaletą tej techniki jest możliwość stymulacji wielu komórek do analizy chemicznej poprzez zastosowanie kulek w celu przyłożenia napięcia do konkretnego podzbioru receptorów adhezyjnych.Na początek należy dokładnie resuspendować superparamagnetyczne kulek aktywowane tosylem w oryginalnej fiolce, mieszając w wirówce typu vortex przez co najmniej 30 sekund. Odmiarkować 40 µL resuspendowanych kulek superparamagnetycznych do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml 0,1 M fosforanu sodu pH 7,4. Następnie umieścić probówkę na statywie do separacji magnetycznej, aby oddzielić kulki magnetyczne od roztworu.Odlej nadsącz i wyjmij probówkę ze statywu do separacji magnetycznej. Resuspenduj

analyzing-cell-surface-adhesion-remodeling-response-to-mechanical

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Mechaniczne cechy glikokaliksu śródbłonka zostały zmierzone za pomocą wgłębień za pomocą kulek o rozmiarach mikronowych na wspornikach AFM. Komórki śródbłonka hodowano w niestandardowej komorze w fizjologicznych warunkach przepływu w celu wywołania ekspresji glikokaliksu. Dane analizowano przy użyciu modelu cienkowarstwowego w celu określenia grubości i modułu glikokaliksu.

Kwantyfikacja właściwości mechanicznych glikokaliksu śródbłonka za pomocą mikroskopii sił atomowych

Pęseta magnetyczna, potężna technika manipulacji pojedynczymi cząsteczkami, może być dostosowana do bezpośrednich pomiarów skrętu (przy użyciu konfiguracji zwanej pęsetą magnetyczną swobodnie orbitującą) i momentu obrotowego (przy użyciu konfiguracji określanej jako pęseta magnetyczna) w makrocząsteczkach biologicznych. Podano wytyczne dotyczące wykonywania takich pomiarów, w tym zastosowania do badania DNA i związanych z nim włókien nukleotywo-białkowych.

Pęseta magnetyczna do pomiaru skrętu i momentu obrotowego

Tutaj prezentujemy prostą, szybką metodę charakteryzowania wewnętrznych właściwości adhezyjnych domniemanych cząsteczek adhezyjnych komórek.  Wydzielana, znakowana epitopem ektodomena cząsteczki adhezyjnej komórki jest wychwytywana z pożywki hodowlanej na małych, jednorodnych funkcjonalizowanych kulkach.  Kulki te można następnie natychmiast wykorzystać w prostych testach agregacji kulek.

Testy agregacji kulek w celu scharakteryzowania przypuszczalnych cząsteczek adhezyjnych komórek

Tradycyjne techniki wytwarzania żeli poliakrylamidowych (PA) zawierających sondy fluorescencyjne polegają na umieszczaniu żelu pomiędzy przylegającą powierzchnią a szkiełkiem. Tutaj pokazujemy, że pokrycie tego szkiełka poli-D-lizyną (PDL) i sondami fluorescencyjnymi lokalizuje sondy z dokładnością do 1,6 μm od powierzchni żelu.

Nowatorska metoda lokalizacji reporterowych kulek fluorescencyjnych w pobliżu powierzchni hodowli komórkowej na potrzeby mikroskopii sił trakcyjnych

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Powierzchnia TGT to innowacyjna platforma do badania przesłuchów czynnika wzrostu z integryną. Elastyczna konstrukcja sondy, specyficzność liganda adhezyjnego i precyzyjna modulacja warunków stymulacji pozwalają na solidną ocenę ilościową wzajemnych oddziaływań EGFR-integryna. Wyniki wskazują, że EGFR jest "mechano-organizatorem" dostrajającym mechanikę integryny, wpływającym na ogniskowy montaż adhezyjny i rozprzestrzenianie się komórek.

Sondy mocujące do pomiaru naprężenia do ilościowego określania mechaniki integryny i adhezji za pośrednictwem czynnika wzrostu

Opisujemy ulepszenia standardowej metody pomiaru sił trakcyjnych komórek, opartej na drukowaniu mikrokontaktowym z pojedynczym krokiem subtraktywnego tworzenia wzorów układów punktowych białek macierzy zewnątrzkomórkowej na miękkich hydrożelach. Metoda ta pozwala na prostsze i bardziej spójne wytwarzanie wzorów wyspowych, niezbędnych do kontrolowania kształtu klastrów komórek.

Generowanie wzorców dla mikroskopii trakcyjnej mikrowzorców

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Poznaj metodę badania szlaków biochemicznych aktywowanych przez naprężenia mechaniczne w adhezjach powierzchniowych komórek przy użyciu ligandowych kulek magnetycznych. Technika umożliwia stymulację wielu komórek jednocześnie.

Analiza remodelingu adhezji powierzchni komórek w odpowiedzi na naprężenia mechaniczne za pomocą kulek magnetycznych

Przeglądaj więcej filmów