Rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami

Ogólnym celem niniejszego protokołu biochemicznego jest wytworzenie nukleosomów z różnicowo znakowanymi izotopowo histonami siostrzanymi. Służą one do jednoczesnego mapowania reakcji modyfikacji potranslacyjnych na obu histonach siostrzanych. Ogólnym celem tego protokołu biochemicznego jest wytworzenie nukleosomów z różnicowo znakowanymi izotopowo histonami siostrzanymi do zastosowania w jednoczesnym mapowaniu modyfikacji potranslacyjnych na obu histonach siostrzanych.

Metoda ta, w połączeniu z technikami wysokiej rozdzielczości służącymi do mapowania modyfikacji potranslacyjnych, takimi jak spektrometria mas, pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii chromatyny, na przykład: jakie mechanizmy przyczyniają się do powstawania symetrycznie zmodyfikowanych nukleosomów? Główną zaletą tej techniki jest możliwość łatwego wdrożenia jej w laboratorium biochemicznym, ponieważ łączy ona standardowe protokoły rekonstrukcji nukleosomów z powszechnymi metodami oczyszczania białek. Do rekonstrukcji oktameru zostaną wykorzystane dwie pulle histonu H3.

H3 znakowany azotem 15 zawierający znacznik polihistydynowy na terminusie aminowym oraz H3 znakowany węglem 13 zawierający znacznik powinowactwa do streptawidyny na terminusie aminowym. Rozpocznij procedurę od rozpuszczenia liofilizowanych alikwotów histonów, w tym dwóch typów histonu H3, w buforze do rozwijania. Do każdej probówki zawierającej około 5 mg histonów dodaj 1 mL buforu do rozwijania i wymieszaj za pomocą pipetowania, nie używając vortexera.

Przechowuj probówki w lodzie przez 30 minut, aby umożliwić całkowite rozfałdowanie. Następnie zmierz absorbancję przy 280 nanometrach, aby określić dokładne stężenie każdej histony. Wymieszaj histony rdzeniowe w równych stosunkach molowych, pamiętając o uwzględnieniu po 50% z każdej z dwóch pul histony H3.

Należy użyć buforu rozwijającego, aby dostosować końcowe stężenie białka do wartości około 1 mg/mL. Mieszaninę należy przenieść do membrany dializacyjnej o progu odcięcia 6 kDa, a następnie przeprowadzić dializę przeciwko 1–2 litrom schłodzonego buforu refoldingu w temperaturze 4 °C.

Następnego dnia należy zebrać zdializowany materiał i usunąć wszelkie osady poprzez wirowanie w mikrowirówce przez pięć minut w temperaturze 4 °C z maksymalną prędkością. Po określeniu stężenia oktameru, należy użyć wirówkowego urządzenia filtrującego z progiem odcięcia 10 kDa, aby zagęścić oktamer do objętości końcowej wynoszącej około 2 ml. Powinno zostać uzyskano stężenie oktameru w zakresie od 50 do 100 µM.

Przygotuj filtrację żelową, podłączając kolumnę do filtracji żelowej do systemu FPLC. Wyrównaj układ dwiema objętościami kolumny (CV) odgazowanego i przefiltrowanego przez filtr 0,22 µm buforu do refoldingu. Wstrzyknij zagęszczony materiał przy szybkości przepływu 1 mL/min i zbieraj frakcje o objętości od 1 do 1,5 mL.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy połączyć odpowiednie frakcje zawierające czyste oktamery i oznaczyć stężenie zgodnie z wcześniejszym opisem. Podłącz kolumnę z kwasem niklowym nitrylotrioctowym lub Ni-NTA o objętości 1 ml do systemu FPLC. Następnie przeprowadź równoważenie za pomocą 10 CV odgazowanego i przefiltrowanego przez filtr 0,22 µm buforu do refoldingu przy szybkości przepływu 1 ml/min.

Przepuść oczyszczony oktamer przez kolumnę niklową NTA z szybkością przepływu 1 mL/min. Zbierz frakcję niewiązaną. Eluuj za pomocą 10 CV buforu do refoldingu zawierającego 250 mM imidazolu, stosując szybkość przepływu 1 mL/min.

Zebrać eluat z kolumny niklowej NTA. Oczyszczanie z wykorzystaniem streptawidyny powinno być idealnie przeprowadzane w pomieszczeniu chłodniczym. Równoważyć kolumnę powinowactwa o pojemności jednej mililitra z komercyjną streptawidyną, stosując 10 CV buforu do refoldingowania zawierającego 250 millimolar imidazolu, przy użyciu układu do grawitacyjnego przepływu okresowego.

Przenieś eluat z kolumny niklowej NTA na kolumnę powinowactwa do streptawidyny. Zbierz frakcję przepływową. Przeprowadź elucję przy użyciu 10 CV buforu do refoldingu zawierającego 2,5 millimolar desthiobiotiny.

Zebierz eluat. Po zmierzeniu stężenia oktameru w eluacie dodaj 10-krotnie mniejszą ilość proteazy TEV i pozostaw reakcję na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś mieszaninę na membranę dializacyjną z progiem odcięcia 50 kilodaltonów i dializuj przeciwko buforowi refoldingowemu przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Oczyszczony asymetryczny oktamer należy zagęścić do objętości od 1 do 2 ml, używając wirówki z filtrem o progu odcięcia 10 kDa. Oczekiwane stężenie oktameru wynosi od 20 do 50 µM. Rekonstytucja nukleosomu wymaga DNA zawierającego sekwencję pozycjonującą nukleosom.

Dostosuj stężenie soli w DNA do poziomu 2 M NaCl, wykorzystując roztwór stokowy 5 M NaCl. Wymieszaj DNA z oktamerem i buforem do refoldingu, stosując optymalny stosunek oktameru do DNA, wyznaczony w teście w małej skali. Oktamer dodaj na samym końcu, aby zapobiec możliwości zmieszania oktameru i DNA przy stężeniu soli niższym niż 2 M.

Przenieść mieszaninę do membrany dializacyjnej o progu odcięcia 6 kDa i dializować przeciwko jednemu litrowi buforu do refoldingowania przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia stopniowo obniżać stężenie soli w buforze do dializy, utrzymując próbkę w każdym buforze chlorku sodu przez co najmniej trzy godziny.

Następnie przenieś membranę dializacyjną do zlewki zawierającej jeden litr buforu do analizy i kontynuuj dializę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia pobierz zdializowaną próbkę. Usuń powstały osad poprzez wirowanie w mikrowirówce przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy maksymalnej prędkości.

Skoncentruj próbkę za pomocą wirówkowej jednostki filtrującej z progiem odcięcia 30 kilodalton do objętości końcowej wynoszącej około 300 µL. Zmierz stężenie DNA przy 260 nm. Stężenie końcowe powinno mieścić się w zakresie od 10 do 20 µM.

Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez maksymalnie kilka tygodni. Profil elucji mieszaniny refałdowanych histonów w żelowej filtracji wykazuje elucję oktamerów histonowych przy około 70 ml. Żel SDS-PAGE potwierdza prawidłową stechiometrię histonów.

Zrekonstytuowany pulu oktamerów zawierający trzy typy oktamerów poddaje się schematowi tandemnego oczyszczania powinowactwa. Izolację gatunków asymetrycznych weryfikuje obecność znacznika powinowactwa. Znaczniki powinowactwa są następnie usuwane za pomocą proteazy TEV.

Małoskalowa rekonstytucja nukleosomów przy użyciu różnych stosunków molowych DNA do oktameru wykazała, że optymalny jest stosunek jeden do jednego. Przeprowadzono wielkoskalową rekonstytucję nukleosomów z zastosowaniem zoptymalizowanego stosunku molowego DNA do oktameru, w wyniku czego zaobserwowano prawidłową stechiometrię czterech histonów rdzeniowych. Spektroskopia NMR nukleosomów z różnym znakowaniem izotopowym potwierdziła obecność siostrzanych histonów H3 znakowanych azotem 15 oraz węglem 13.

W tym przykładzie zastosowania nukleosomy, które zostały różnicowo znakowane izotopowo i asymetrycznie fosforylowane w pozycji C ring 10 histony H3, poddano reakcji z acetylotransferazą GCN5. Acetylację lizyny 14 histony H3 w obu kopiach H3 monitorowano w czasie rzeczywistym za pomocą spektroskopii NMR. Analiza wykazała, że fosforylowanie C ring 10 histony H3 stymuluje acetylację lizyny 14 histony H3 przez GCN5 w cis w porównaniu do trans.

Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu pięciu dni, pod warunkiem jej prawidłowego wykonania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób rekonstytucji nukleosomów zawierających histony siostrzane o różnych właściwościach.