Name: Rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Poznaj metodę rekonstytucji nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami w badaniach chromatyny. Technika ta umożliwia jednoczesne mapowanie modyfikacji potranslacyjnych na obu histonach H3.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autor dziękuje Dr. Philippowi Selenko (FMP-Berlin) za udostępnienie przestrzeni i infrastruktury do przeprowadzania eksperymentów oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) za sfinansowanie pracy poprzez grant badawczy (LI 2402/2-1).

1. Rekonstytucja nukleosomów za pomocą histonów siostrzanych znakowanych izotopowo (i asymetrycznie modyfikowanych)
UWAGA: Obecny protokół opisuje odtwarzanie nukleosomów za pomocą histonu H3 znakowanego izotopami. W tym celu wykorzystano dwie pule histonu H3; jeden był znakowany 15N i zawierał znacznik 6xHhis na N-końcu, a drugi był znakowany 13C i zawierał peptyd Strep (WSHPQFEK) połączony na N-końcu. Oba znaczniki zostały oddzielone od natywnej sekwencji H3 za pomocą miejsca rozpoznawania proteazy wirusa wytrawiania tytoniu (TEV). Aby przygotować dodatkowe asymetrycznie zmodyfikowane nukleosomy, jedna z dwóch pul H3 jest zawarta w formie wstępnie zmodyfikowanej. Premodyfikacja puli histonów może być przeprowadzona poprzez reakcję znakowanego izotopowo histonu będącego przedmiotem zainteresowania z odpowiednim enzymem modyfikującym histony w obecności niezbędnych dla każdego typu kofaktorów reakcji/donorów PTM16. Efektywne rozmieszczenie odpowiedniego PTM można ocenić za pomocą spektroskopii NMR lub spektrometrii mas. Użyte tutaj ilości histonów/DNA są przybliżonymi zaleceniami dla otrzymania preparatu nukleosomów o przybliżonym stężeniu 10 μM (mierzonym jako stężenie DNA przy 260 nm). Ta końcowa wydajność jest wystarczająca do zarejestrowania dobrej jakości widm NMR przy stosunkowo krótkim czasie akwizycji.
<ol>
	<li>Rekonstytucja oktamera histonu z histonem H3 znakowanym izotopowo (i asymetrycznie zmodyfikowanym)
	UWAGA: Rekombinowane białka histonowe mogą być wytwarzane w ilościach mg w komórkach BL21(DE3)plysS14. W celu otrzymania histonów znakowanych izotopowo stosuje się ten sam protokół ekspresji/oczyszczania, z wyjątkiem użycia do wzrostu bakterii minimalnej pożywki zawierającej 15NH4Cl i / lub 13C-glukozy jako źródła azotu i węgla, odpowiednio do znakowania 15N lub 13C. Oczyszczone histony są intensywnie dializowane za pomocą 5 mM β-merkaptoetanolu i przechowywane w liofilii przed użyciem.
	<ol>
		<li>Rozpuścić liofilizowane podwielokrotności histonów, zawierające ~ 5 mg każdego histonu w 1 ml rozwijającego się buforu (7 M guanidynium-HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM DTT). Uwzględnij oba typy histonu H3. Mieszać pipetując i nie mieszać. Trzymaj rurki na lodzie przez 30 minut, aby umożliwić całkowite rozłożenie.</li>
		<li>Określ dokładne stężenie każdego histonu, mierząc absorbancję przy 280 nm w stosunku do rozwijającego się buforu i używając współczynników ekstynkcji obliczonych za pomocą narzędzia ProtParam na portalu ExPASy. 15</li>
		<li>Wymieszaj histony rdzeniowe w proporcjach równomolowych, pamiętając o tym, aby uwzględnić po 50% każdej z dwóch pul histonów H3. Zacznij od wykorzystania całej zawartości mniej skoncentrowanego histonu i odpowiednio dodaj wszystkie pozostałe.</li>
		<li>Dostosować końcowe stężenie białka do około 1 mg/ml za pomocą buforu rozwijającego.</li>
		<li>Przenieść mieszaninę do membrany dializacyjnej o natężeniu 6 kDa i dializować na 1-2 litrach schłodzonego buforu do ponownego fałdowania (10 mM Tris pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) w temperaturze 4 °C. Zmienić bufor co najmniej raz po przeprowadzeniu dializy przez co najmniej 3 godziny. Przeprowadzić końcową dializę O/N w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zebrać materiał dializowany i usunąć wszelkie osady przez odwirowanie w mikrodymie przez 5 minut w temperaturze 4 °C na maksymalnej prędkości (zwykle nie należy obserwować opadów). Oznaczyć stężenie oktamerów, mierząc absorbancję przy 280 nm. W obliczeniach użyj dodanych współczynników ekstynkcji histonów, pamiętając o podwojeniu każdej wartości.</li>
		<li>Zagęścić do końcowej objętości ~2 ml za pomocą odśrodkowego filtra odśrodkowego o sile 10 kDa. Przelicz stężenie oktamera i oszacuj straty. W tym momencie należy uzyskać stężenie oktamera w przedziale 50 - 100 μM.</li>
		<li>Podłączyć żelową kolumnę filtracyjną (podaną w tabeli materiałów) do systemu FPLC i zrównoważyć z 2 objętościami kolumny (CV) przefiltrowanego i odgazowanego buforu do ponownego składania 0,22 μm przy natężeniu przepływu 1 ml/min i ciśnieniu granicznym 0,5 MPa, 
		UWAGA: Przebieg filtracji żelu powinien być wykonywany w chłodni lub w chłodni.</li>
		<li>Wstrzyknąć skoncentrowany materiał z natężeniem przepływu 1 ml/min i zebrać frakcje 1,0 - 1,5 ml.</li>
		<li>Postępuj zgodnie z profilem chromatograficznym i obserwuj elucję oktamera histonów w temperaturze ~65 - 68 ml. 
		UWAGA: Małe ramię piku elucji i pik przy ~ 80 ml wskazują na istnienie odpowiednio wolnych tetramerów H3-H4 i dimerów H2A-H2B.</li>
		<li>Wprowadzić 20 μl każdej zebranej frakcji w 18% żelu SDS-PAGE. 
		UWAGA: Rozcieńczyć próbki co najmniej 2-krotnie wodą przed załadowaniem ich do żelu, aby zmniejszyć wysokie stężenie soli, a tym samym uniknąć zniekształceń. To samo dotyczy kolejnych analiz SDS-PAGE próbek w buforze do ponownego składania.</li>
		<li>Zebrać odpowiednie frakcje zawierające czyste oktamery, oceniane na podstawie równego rozkładu 4 histonów na wybarwionym żelu i określić stężenie jak poprzednio (etap 1.1.7).</li>
		<li>Podłączyć kolumnę Ni-NTA o pojemności 1 ml (tabela materiałów) do systemu FPLC i zrównoważyć z 10 CV przefiltrowanego i odgazowanego buforu do ponownego fałdowania o średnicy 0,22 μm przy natężeniu przepływu 1 ml/min. 
		UWAGA: Chromatografię Ni-NTA należy wykonywać w chłodni lub w chłodni.</li>
		<li>Przepuścić oczyszczony oktamer przez Ni-NTA przy natężeniu przepływu 1 ml/min.</li>
		<li>Pobrać próbki przepływowe i zachować je do analizy SDS-PAGE/WB (odpowiednio 20 μl i 4 μl). Następnie przemyć kolumnę buforem do ponownego składania o mocy 10 CV lub do momentu osiągnięcia sygnału linii podstawowej.</li>
		<li>Eluować za pomocą 10 CV buforu do ponownego fałdowania zawierającego 250 mM imidazolu przy natężeniu przepływu 1 ml/min. Próbki należy przechowywać do analizy SDS-PAGE/WB (odpowiednio 20 μl i 4 μl).</li>
		<li>Zrównoważyć 1 ml kolumny powinowactwa komercyjnej streptawidyny (tabela materiałów) z buforem do ponownego fałdowania 10 CV zawierającym 250 mM imidazolu, stosując konfigurację partia/przepływ grawitacyjny. 
		UWAGA: Ten etap chromatograficzny powinien być wykonywany w chłodni.</li>
		<li>Przepuścić elucję Ni-NTA przez komercyjną kolumnę powinowactwa do streptawidyny.</li>
		<li>Pobrać próbki przepływowe i zachować je do analizy SDS-PAGE/WB (odpowiednio 20 μl i 4 μl). Następnie przemyć 10 CV bufora do ponownego składania.</li>
		<li>Eluować za pomocą 10 CV buforu do ponownego fałdowania zawierającego 2,5 mM destiobiotyny. Próbki należy przechowywać do analizy SDS-PAGE/WB (odpowiednio 20 i 4 μl).</li>
		<li>Zmierz stężenie oktamera, dodaj 10 razy mniej proteazy TEV i pozwól reakcji postępować przez noc w temperaturze 4 °C w standardowej probówce wirówkowej z tworzywa sztucznego. 
		UWAGA: Ilość TEV niezbędna do uzyskania całkowitego roztrawienia (usunięcia znaczników powinowactwa) zależy od pochodzenia (konstruktu) i aktywności (świeżo przygotowany, rekombinowany TEV jest bardziej aktywny w porównaniu z tym przechowywanym przez dłuższy czas w temperaturze -80 °C). Spróbuj początkowo dodać 10 razy mniej TEV w porównaniu z oktamerem (szacowanym jako stężenie białka) i odpowiednio dostosuj.</li>
		<li>Sprawdź skuteczne trawienie, uruchamiając 20 μl mieszaniny przed i po dodaniu TEV na 18% żelu SDS-PAGE. Jeśli trawienie nie jest całkowite, dodaj więcej proteazy TEV i kontynuuj inkubację przez kolejne 3-4 godziny.</li>
		<li>Dializować próbkę przed ponownym fałdowaniem buforu za pomocą membrany dializacyjnej o natężeniu 50 kDa, aby usunąć proteazę TEV i dostosować skład buforu.</li>
		<li>Zagęścić oczyszczony asymetryczny oktamer za pomocą odśrodkowego zespołu filtrującego o natężeniu 10 kDa (można również użyć tego samego filtra z kroku 1.1.7) do objętości 1,0-2,0 ml. Zmierz końcowe stężenie. Albo użyć wkrótce potem do rozpuszczenia nukleosomów, albo dostosować do 50% (v/v) glicerolu, aby przechowywać w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas. W tym momencie i spodziewając się co najmniej 70% straty w poprzednich krokach, stężenie oktamera powinno mieścić się w zakresie 20 - 50 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rekonstytucja nukleosomów
	<ol>
		<li>Jeśli oktamer był przechowywany w 50% glicerolu, przed przystąpieniem do rekonstytucji nukleosomów należy dializować przez noc w temperaturze 4 °C przed ponownym fałdowaniem buforu.</li>
		<li>Dostosuj stężenie soli DNA (zawierającego sekwencję pozycjonowania nukleosomów) do 2 M NaCl za pomocą roztworu podstawowego 5 M NaCl. 
		UWAGA: Oczyszczone DNA wyizolowane po oczyszczeniu plazmidu zawierającego wiele kopii pożądanej sekwencji lub zsyntetyzowane przez amplifikację PCR powinno być przechowywane skoncentrowane do ~50 μM w wodzie lub standardowym buforze Tris-EDTA.</li>
		<li>Wymieszaj oktamer i DNA, stosując optymalny stosunek określony na podstawie testu na małą skalę. Użyj bufora do ponownego składania, aby dostosować końcową objętość do ~ 3.0 ml. Oktamer należy zawsze dodawać na końcu, aby zapobiec możliwości zmieszania się oktamera i DNA przy stężeniu soli <2 M.
		<ol>
			<li>Wykonaj wstępne rekonstytucje na małą skalę, aby określić stosunek oktameru do DNA, który prowadzi do optymalnej wydajności nukleosomów. W tym celu zbierz trzy reakcje o proporcjach 0,9:1,0, 1,0:1,0 i 1,1:1,0 DNA:oktamer w objętości między 50-100 μL. Zazwyczaj stosuje się stężenie 5 μM DNA.</li>
			<li>Kontynuuj rozpuszczenie zgodnie z opisem poniżej (kroki 1.2.4-1.2.8), a na końcu oszacuj ilość rozpuszczalnego i dobrej jakości odtworzonego nukleosomu, mierząc stężenie DNA przy 260 nm i uruchamiając 6% natywny żel DNA PAGE, barwiony odpowiednio bromkiem etydyny (ryc. 5A).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przenieść mieszaninę do membrany dializacyjnej o natężeniu 6 kDa i dializować na 1 l buforu do ponownego składania przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Stężenie soli w buforze dializacyjnym należy stopniowo zmniejszać odpowiednio z 2 do 0,85, 0,64 i 0,2 M NaCl. Próbkę należy przechowywać w każdym buforze przez co najmniej 3 godziny. Czasami osad powstaje po ostatnim przejściu. W takim przypadku należy kontynuować dializę zgodnie z planem i usunąć osad za pomocą odwirowania mikrodymki na końcu następnego etapu.</li>
		<li>Przenieść membranę dializacyjną do zlewki z 1 litrem buforu do oznaczania (25 mM NaH2PO4/Na2HPO4 pH 6,8, 25 mM NaCl, 2 mM DTT) i kontynuować dializę O/N w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Pobrać próbkę, usunąć osad powstały w kroku 1.2.5 przez odwirowanie w mikrodymie przez 5 minut w temperaturze 4 °C na maksymalnej prędkości i zagęścić za pomocą odśrodkowego filtra odśrodkowego o sile 30 kDa do końcowej objętości ~300 μl.</li>
		<li>Zmierzyć stężenie DNA przy 260 nm, uruchomić 18% żel białkowy SDS-PAGE (4 μl próbki) i 6% żel natywnego DNA PAGE (0,2 μl próbki) i przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni. Końcowe stężenie powinno mieścić się w przedziale 10-20 μM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza NMR reakcji modyfikacji dwóch siostrzanych histonów
UWAGA: Przypisanie widm korelacji 2D 1 H-15N nukleosomalnych ogonów histonów można znaleźć na stronie references16,17,18. Dodatkowo, przypisania grup CHx lizyn, seryny i treoniny na widmach korelacji 2D 1 H-13C można znaleźć pod adresem reference16.
<ol>
	<li>Konfiguracja NMR i rejestracja widm referencyjnych 
	UWAGA: Testy enzymatyczne przeprowadzono przy użyciu 140 μl próbki nukleosomu w buforze testowym do 3-milimetrowej probówki NMR w temperaturze 300 K. Można również użyć różnych probówek NMR o innych objętościach próbki. Powyższa temperatura jest odpowiednia do uzyskania dobrej jakości widm korelacji 1 H-15N nukleosomalnych ogonów histonów oraz dobrej aktywności enzymatycznej. Widma 2D-SOFAST-HMQC 1 H-15N i 2D-HSQC 1 H-13C zarejestrowano odpowiednio w konfiguracji, która zapewnia podobne czasy akwizycji. Typowymi parametrami akwizycji są 128 stanów nieustalonych o punktach zespolonych 1,024 (1H) x 128 (15N) oraz 32 stany nieustalone o punktach zespolonych 1,024 (1H) x 64 (13C) dla dwóch różnych typów widm korelacji. Dla obu widm 2D czas akwizycji wynosił ~30 min.
	<ol>
		<li>Ustawić 300 K jako temperaturę próbki w spektrometrze. Dodać 10% D2O (v/v) do próbki, która ma być użyta do blokady częstotliwości spektrometru.</li>
		<li>Umieść próbkę w spektrometrze i wykonaj podstawowe operacje (blokowanie, strojenie, podkładkowanie). Dodatkowo określ optymalne długości impulsów i ogólne parametry akwizycji.</li>
		<li>Rejestrować widma odniesienia 1D i 2D, 1 H-15N i 1 H-13C.</li>
		<li>Przetwarzaj widma referencyjne i upewnij się, że sygnały, które mają być użyte do mapowania reakcji modyfikacji, są dobrze rozdzielone i mają dobrą intensywność.</li>
		<li>Odzyskaj próbkę i przenieś ją do probówki do mikrofuge.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie reakcji enzymatycznej, monitorowanie NMR i analiza ilościowa
	<ol>
		<li>Skopiuj i ułóż serię przeplatanych widm 2D 1 H-15N i 1 H-13C. Dąż do całkowitego czasu akwizycji wynoszącego kilka godzin i odpowiednio dostosuj w nowym przebiegu w oparciu o szybkości enzymatyczne uzyskane z pierwszej reakcji.</li>
		<li>Dodać do próbki kofaktory niezbędne dla odpowiedniego typu reakcji modyfikacji (1 mM ATP/2 mM MgCl2 do fosforylacji, 1 mM acetylo-CoA do acetylacji, 1 mM SAM do metylacji itp.).</li>
		<li>Dodać interesujący enzym, wymieszać pipetując, przenieść próbkę z powrotem do probówki NMR, a następnie do spektrometru (wykonać te operacje szybko). 
		UWAGA: Jeśli nie ma danych na temat oczekiwanej aktywności enzymatycznej, dostosuj stosunek molowy substratu do enzymu do 10:1. Wykonaj pierwszy przejazd próbny i odpowiednio dostosuj go do rzeczywistego przebiegu.</li>
		<li>Wykonaj szybkie automatyczne podkładkowanie i wykorzystaj resztę parametrów z widm referencyjnych.</li>
		<li>Zainicjuj serię przeplatanych widm 2D 1 H-15N i 1 H-13C.</li>
		<li>Śledź postęp reakcji w czasie rzeczywistym i zatrzymaj akwizycję, gdy reakcja osiągnie zakończenie lub pożądany poziom.</li>
		<li>Przetwarzaj widma jak poprzednio z dokładnie tymi samymi parametrami.</li>
		<li>Powtórz cały przebieg, stosując inną kolejność akwizycji dla dwóch typów widm korelacji. Jeśli w pierwszym eksperymencie korelacja 1 H-15N była pierwsza w serii, zacznij teraz od korelacji 1 H-13C. Dzięki temu i przy tym samym czasie akwizycji dla obu widm, możliwe jest wykreślenie i porównanie reakcji PTM na obu histonach znakowanych izotopami w tej samej skali czasowej. Dodatkowo możliwe jest obliczanie średnich i wykreślanie słupków błędów. 
		UWAGA: Dokładny opis metodologii analizy sygnału NMR i późniejszej kwantyfikacji reakcji enzymatycznych można znaleźć tutaj19.</li>
		<li>Wybierz sygnały NMR z każdego widma NMR w czasie przebiegu, które informują o postępie reakcji i oblicz ich względne intensywności sygnału za pomocą oprogramowania do wizualizacji i analizy widm NMR. Zrób to dla sygnałów, które zgłaszają zarówno stan niezmodyfikowany, jak i zmodyfikowany. Wyodrębnij poziomy modyfikacji</li>.
		<li>Wykreślić obliczone wartości poziomów modyfikacji w funkcji czasu reakcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hansen, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Dynamics+of+the+Chromatin+Fiber+in+Solution%3A+Determinants%2C+Mechanisms%2C+and+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Chromatin+Remodeling+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The Biology of Chromatin Remodeling Complexes.</a> Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).</li>
<li>Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li>
<li>Suganuma, T., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+and+Combinatorial+Functions+of+Histone+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications.</a> Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).</li>
<li>Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Language+of+Histone+Crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Language of Histone Crosstalk.</a> Cell. 142 (5), 682-685 (2010).</li>
<li>Liokatis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+histone+H3+Ser10+establishes+a+hierarchy+for+subsequent+intramolecular+modification+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).</li>
<li>Voigt, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23021224">Asymmetrically Modified Nucleosomes.</a> Cell. 151 (1), 181-193 (2012).</li>
<li>Egelhofer, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assessment+of+histone-modification+antibody+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">An assessment of histone-modification antibody quality.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).</li>
<li>Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Proteomic+Analysis+of+Histone+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications.</a> Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).</li>
<li>Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Detection%2C+of+Protein+Phosphorylation+and+Acetylation+by+High-Resolution+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).</li>
<li>Binolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+repair+of+oxidation-damaged+%CE%B1-synuclein+fails+to+target+C-terminal+modification+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites.</a> Nat. Commun. 7, 10251(2016).</li>
<li>Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOFAST-HMQC+experiments+for+recording+two-dimensional+heteronuclear+correlation+spectra+of+proteins+within+a+few+seconds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds.</a> J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).</li>
<li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling%2C+post-translational+protein+modifications+and+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy.</a> J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).</li>
<li>Dyer, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+Nucleosome+Core+Particles+from+Recombinant+Histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA.</a> Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).</li>
<li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy+%3ASIB+bioinformatics+resource+portal%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy :SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).</li>
<li>Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+Isotope-Labeled+Nucleosomes+to+Study+Asymmetric+Histone+Modification+Crosstalk+by+Time-Resolved+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).</li>
<li>Stützer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulations+of+DNA+Contacts+by+Linker+Histones+and+Post-translational+Modifications+Determine+the+Mobility+and+Modifiability+of+Nucleosomal+H3+Tails%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails.</a> Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).</li>
<li>Zhou, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H4+K16Q+Mutation%2C+an+Acetylation+Mimic%2C+Causes+Structural+Disorder+of+Its+N-terminal+Basic+Patch+in+the+Nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome.</a> J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).</li>
<li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+NMR+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+serine+and+threonine+phosphorylation+in+reconstituted+kinase+reactions+and+mammalian+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts.</a> Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoselective+ligation+and+modification+strategies+for+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).</li>
<li>Theillet, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+mapping+and+time-resolved+monitoring+of+lysine+methylation+by+high-resolution+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).</li>
<li>Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceless+Synthesis+of+Asymmetrically+Modified+Bivalent+Nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).</li>
<li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bivalent+chromatin+structure+marks+key+developmental+genes+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells.</a> Cell. 125 (2), 315-326 (2006).</li>
</ol>

Autor nie ma nic do zdradzienia.

Do rekonstytucji nukleosomów obecny protokół wykorzystuje matrycę DNA o długości 165 pz zawierającą sekwencję pozycjonowania nukleosomów 601-Widom20, ale oczekuje się podobnej wydajności przy użyciu różnych długości matryc DNA. Protokół został zaprojektowany i zastosowany przy użyciu asymetrycznych typów histonu H3. Na tej samej zasadzie metoda może być stosowana również do innych histonów rdzeniowych, a dodatkowo może być stosowana do rekonstytucji kompleksów zawierających dwa odrębne histony rdz...

DNA eukariotyczne jest ciasno upakowane w jądrach komórkowych w chromatynie. Podstawowym budulcem chromatyny jest cząstka rdzenia nukleosomu, która zawiera ~ 147 pz DNA owiniętego wokół kompleksu oktamerycznego składającego się z dwóch kopii każdego z czterech histonów rdzenia (H3, H4, H2A, H2B). Białka histonowe zawierają mnóstwo modyfikacji potranslacyjnych (PTM). Te substytucje kowalencyjne wywołują zmiany w strukturze chromatyny, zarówno bezpośrednio, wpływając na chemię fizyczną układu, jak i pośrednio poprzez rekrutację działań związanych z przebudową chromatyny1,2,3. W ten sposób histonowe PTM kontrolują dostępność chromatyny, a tym samym regulują wszystkie funkcje komórkowe oparte na DNA4.
PTM są instalowane przez systemy enzymatyczne modyfikujące histony, głównie na niestrukturalnych N-końcowych segmentach (ogonach) rdzeniowych histonów włączonych do nukleosomów. Ze względu na wiele miejsc modyfikacji w stosunkowo krótkiej sekwencji ogonów histonowych, PTM wpływają na siebie nawzajem, indukując lub blokując kolejne reakcje modyfikacji, efekt znany jako przesłuch modyfikacji5. Ze względu na ogólną symetryczną architekturę nukleosomu, uważano, że reakcje modyfikacji i mechanizmy przesłuchów zachodzą podobnie na dwóch kopiach każdego histonu nukleosomalnego (histonach siostrzanych). Koncepcja ta została niedawno zakwestionowana, a następnie obalona. W szczególności testy enzymatyczne in vitro na wolnych peptydach ogonowych histonu H3 i nukleosomach wykazały, że zestaw kinaz H3 wprowadził fosforylację w sposób asymetryczny6. Dodatkowo, analiza LC-MS/MS oparta na oczyszczaniu powinowactwa ujawniła istnienie asymetrycznie metylowanych nukleosomów H3 w kilku typach komórek eukariotycznych7. W związku z tym asymetrycznie zmodyfikowane nukleosomy stanowią nowy gatunek i potrzebne są narzędzia do odkrycia mechanizmów kontrolujących ich powstawanie i przeanalizowania efektów przesłuchów, jakie może wywierać ta asymetria.
Powszechnie, analiza Western Blotting (WB) i spektrometria mas (MS) były używane do wykrywania histonów PTM. Pomimo łatwej aplikacji, WB cierpi na problemy ze specyficznością/reaktywnością krzyżową. Co więcej, nie jest w stanie przeprowadzić jednoczesnej analizy multi-PTM i bezpośredniej kwantyfikacji reakcji modyfikacji8. Z drugiej strony, analiza MS wykorzystuje wyrafinowane oprzyrządowanie, które wymaga szkolenia na wysokim poziomie, ale zapewnia wysoką specyficzność, a także jednoczesne mapowanie i kwantyfikację wielu PTM9.  Jednak obie metody są destrukcyjne, a kompleksy nukleosomalne są dysocjowane przed analizą, co prowadzi do powstania mieszaniny histonów i/lub peptydów pochodzących z histonów. Ta manipulacja usuwa możliwość rozróżnienia niezależnych reakcji modyfikacji, które zachodzą na każdym z dwóch siostrzanych histonów i raportowania specyficznego dla kopii stanu modyfikacji histonów nukleosomalnych.
Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) rozwinęła się jako alternatywna metoda mapowania reakcji PTM. NMR nie zakłóca pracy, a tym samym umożliwia monitorowanie zdarzeń PTM w czasie rzeczywistym w odtworzonych mieszaninach, a nawet w nienaruszonych komórkach10,11. Opracowanie procedur do szybkiego pozyskiwania danych, a także do mapowania w wysokiej rozdzielczości w oparciu o metody korelacji heterojądrowej 2D próbek znakowanych izotopowo (15N i/lub 13C) 12 pozwoliło na jednoczesne mapowanie różnych typów PTM, takich jak fosforylacja seryny/treoniny/tyrozyny, acetylacja/metylacja lizyny i metylacja argininy13. W zależności od badanego PTM, można zastosować 15protokołów znakowania N lub 13C do oznaczania białkowej grupy funkcyjnej, która służy jako reporter modyfikacji. W związku z tym mapowanie PTM można przeprowadzić, śledząc charakterystyczne przemieszczenie chemiczne odpowiedniej grupy funkcyjnej "wyczuwającej" zmianę w środowisku chemicznym. W większości przypadków zarówno grupy chemiczne NH, jak i C-H mogą być używane do raportowania ewolucji PTM będącego przedmiotem zainteresowania.
Obecny protokół opisuje generowanie nukleosomów zawierających histony siostrzane znakowane izotopami. Łączy w sobie elastyczność spektroskopii NMR do mapowania PTM przy użyciu widm korelacji 1 H-15N i 1 H-13C z wykorzystaniem różnych znaczników powinowactwa do białek do oczyszczania wybranych odtworzonych kompleksów histonowych. Warto zauważyć, że protokół wykorzystuje dwie różne pule określonego histonu do rekonstytucji nukleosomów. Pule te są znakowane izotopowo w różny sposób (jedna z 15N, druga z 13C) i są połączone odpowiednio ze znacznikiem powinowactwa do polihistydyny i streptawidyny. Tandemowy schemat oczyszczania powinowactwa z chromatografią na bazie Ni-NTA i streptawidyny, początkowo stosowany przez Voigt i wsp. 7 służy do oczyszczania gatunków asymetrycznych z symetrycznych odpowiedników (Rysunek 1A). Asymetryczne oktamery histonowe są następnie używane do odtwarzania równoważnych kompleksów nukleosomalnych (ryc. 1B), przy użyciu standardowej metody dializy solnej14. Dodatkowo, dzięki tej samej procedurze i wstępnej modyfikacji jednej z pul histonów, PTM może zostać asymetrycznie wbudowany w powstałe nukleosomy. Reakcja tych substratów z enzymami modyfikującymi histony i późniejsze mapowanie zdarzeń modyfikacji NMR umożliwiają scharakteryzowanie mechanizmów przesłuchów zarówno in-cis (wstępnie zmodyfikowana kopia histonu), jak i in-trans (niezmodyfikowana kopia histonu) (Figura 1C).

<table><tbody><tr><td>Guanidinium HCl</td><td>Applichem</td><td>A14199</td><td>Użyj wysokiej jakości Gu-HCl</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Roth</td><td>4855.2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>DTT Applichem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR chemicals</td><td>27810.364</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8043.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2H2PO4</td><td>Applichem</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Applichem</td><td>A3902</td><td></td></tr><tr><td>Aplikacja</td><td>imidazolowa</td><td>A1073</td><td></td></tr><tr><td>d-Desthiobiotin</td><td>Sigma</td><td>D1411</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>1034557</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin Superflow</td><td>IBA</td><td>2-1207-001</td><td></td></tr> Przeciwciało przeciwko paciorkowcom <tr><td></td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8036</td><td></td></tr><tr><td>Sprzężona z paciorkowcem HRP</td><td>IBA</td><td>2-1502-001</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Load 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-35</td><td></td></tr><tr><td>Membrana dializowa 6 - 8 kDa</td><td>Spectrumlabs</td><td>spectra/por 1, 132650</td><td></td></tr><tr><td>50 kDa membrana dializacyjna</td><td>Spectrumlabs</td><td>spectra/por 7, 132129</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa filtr odśrodkowy</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa jednostka</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr NMR w stanie roztworu&nbsp;</td><td></td><td></td><td>o częstotliwości roboczej co najmniej 500 MHz, wyposażony w kriosondę z potrójnym rezonansem</td></tr><tr><td>Buffer name</td><td>Component</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Unfolding Buffer</td><td>7 M Guanidinium HCl</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>20 mM Tris, pH 7,5</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>10 mM Bufor do ponownego składania naziemnej telewizji cyfrowej</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>10 mM Tris, pH 7,5</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 M NaCl</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>1 mM EDTA</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 mM DTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bufor testowy</td><td>25 mM Na2H2PO4, pH 6,8</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>25 mM NaCl</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>2 mM DTT</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymetrycznie zmodyfikowane nukleosomy zawierają dwie kopie histonu (histony siostrzane) ozdobione odrębnymi zestawami modyfikacji potranslacyjnych (PTM). Są to nowo zidentyfikowane gatunki o nieznanych sposobach osiedlania się i implikacjach funkcjonalnych. Obecne metody analityczne są niewystarczające do wykrycia specyficznego dla kopii występowania PTM na siostrzanych histonach nukleosomalnych. Protokół ten przedstawia biochemiczną metodę odtwarzania in vitro nukleosomów zawierających histony siostrzane znakowane izotopowo. Powstały kompleks może być również modyfikowany asymetrycznie, po włączeniu wstępnie zmodyfikowanej puli histonów podczas ponownego fałdowania podkompleksów histonowych. Te asymetryczne preparaty nukleosomów mogą być łatwo reagowane z enzymami modyfikującymi histony w celu zbadania mechanizmów przesłuchów modyfikacji narzuconych przez asymetrycznie wstępnie włączony PTM za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). W szczególności reakcje modyfikacji w czasie rzeczywistym mogą być odwzorowywane niezależnie na dwóch siostrzanych histonach, wykonując różne typy eksperymentów korelacji NMR, dostosowanych do odpowiedniego typu izotopu. Metodologia ta zapewnia środki do badania mechanizmów przesłuchów, które przyczyniają się do powstawania i propagacji asymetrycznych wzorców PTM w kompleksach nukleosomalnych.

Właściwie refoldowane formy oktameryczne są izolowane po przepuszczeniu mieszaniny rekonstytuującej przez kolumnę do filtracji żelowej (Rysunek 2). Rekonstytuowana pula oktamerów zawierająca trzy różne typy oktamerów jest poddawana schematowi tandemowego oczyszczania powinowactwa. Próbki są pobierane na każdym etapie i analizowane metodą SDS-PAGE, a następnie WB. Weryfikację prawidłowego wykonania protokołu prowadzącego do izolacji form asymetrycznych przeprowadza się pop...

Ten protokół opisuje rekonstytucję nukleosomów zawierających różnie znakowane izotopowo histony siostrzane. Jednocześnie asymetrycznie zmodyfikowane potranslacyjnie nukleosomy mogą być generowane po użyciu wstępnie zmodyfikowanej kopii histonu. Preparaty te mogą być z łatwością wykorzystywane do badania mechanizmów przesłuchów modyfikacji, jednocześnie na obu siostrzanych histonach, przy użyciu spektroskopii NMR o wysokiej rozdzielczości.

Rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu biochemicznego jest wytworzenie nukleosomów z różnicowo znakowanymi izotopowo histonami siostrzanymi. Służą one do jednoczesnego mapowania reakcji modyfikacji potranslacyjnych na obu histonach siostrzanych. Ogólnym celem tego protokołu biochemicznego jest wytworzenie nukleosomów z różnicowo znakowanymi izotopowo histonami siostrzanymi do zastosowania w jednoczesnym mapowaniu modyfikacji potranslacyjnych na obu histonach siostrzanych.Metoda ta, w połączeniu z technikami wysokiej rozdzielczości służącymi do mapowania modyfikacji potranslacyjnych, takimi jak spektrometria mas, pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii chromatyny, na przykład: jakie mechanizmy przyczyniają się do powstawania symetrycznie zmodyfikowanych nukleosomów? Główną zaletą tej techniki jest możliwość łatwego wdrożenia jej w laboratorium biochemicznym, ponieważ łączy ona standardowe protokoły rekonstrukcji nukleosomów z powszechnymi metodami oczyszczania białek. Do rekonstrukcji oktameru zostaną wykorzystane dwie pulle histonu H3.H3 znakowany azotem 15 zawierający znacznik polihistydynowy na terminusie aminowym oraz H3 znakowany węglem 13 zawierający znacznik powinowactwa do streptawidyny na terminusie aminowym. Rozpocznij procedurę od rozpuszczenia liofilizowanych alikwotów histonów, w tym dwóch typów histonu H3, w buforze do rozwijania. Do każdej probówki zawierającej około 5 mg histonów dodaj 1 mL buforu do rozwijania i wymieszaj za pomocą pipetowania, nie używając vortexera.Przechowuj probówki w lodzie przez 30 minut, aby umożliwić całkowite rozfałdowanie. Następnie zmierz absorbancję przy 280 nanometrach, aby określić dokładne stężenie każdej histony. Wymieszaj histony rdzeniowe w równych stosunkach molowych, pamiętając o uwzględnieniu po 50% z każdej z dwóch pul histony H3.Należy użyć buforu rozwijającego, aby dostosować końcowe stężenie białka do wartości około 1 mg/mL. Mieszaninę należy przenieść do membrany dializacyjnej o progu odcięcia 6 kDa, a następnie przeprowadzić dializę przeciwko 1–2 litrom schłodzonego buforu refoldingu w temperaturze 4 °C.Następnego dnia należy zebrać zdializowany materiał i usunąć wszelkie osady poprzez wirowanie w mikrowirówce przez pięć minut w temperaturze 4 °C z maksymalną prędkością. Po określeniu stężenia oktameru, należy użyć wirówkowego urządzenia filtrującego z progiem odcięcia 10 kDa, aby zagęścić oktamer do objętości końcowej wynoszącej około 2 ml. Powinno zostać uzyskano stężenie oktameru w zakresie od 50 do 100 µM.Przygotuj filtrację żelową, podłączając kolumnę do filtracji żelowej do systemu FPLC. Wyrównaj układ dwiema objętościami kolumny (CV) odgazowanego i przefiltrowanego przez filtr 0,22 µm buforu do refoldingu. Wstrzyknij zagęszczony materiał przy szybkości przepływu 1 mL/min i zbieraj frakcje o objętości od 1 do 1,5 mL.Aby rozpocząć tę procedurę, należy połączyć odpowiednie frakcje zawierające czyste oktamery i oznaczyć stężenie zgodnie z wcześniejszym opisem. Podłącz kolumnę z kwasem niklowym nitrylotrioctowym lub Ni-NTA o objętości 1 ml do systemu FPLC. Następnie przeprowadź równoważenie za pomocą 10 CV odgazowanego i przefiltrowanego przez filtr 0,22 µm buforu do refoldingu przy szybkości przepływu 1 ml/min.Przepuść oczyszczony oktamer przez kolumnę niklową NTA z szybkością przepływu 1 mL/min. Zbierz frakcję niewiązaną. Eluuj za pomocą 10 CV buforu do refoldingu zawierającego 250 mM imidazolu, stosując szybkość przepływu 1 mL/min.Zebrać eluat z kolumny niklowej NTA. Oczyszczanie z wykorzystaniem streptawidyny powinno być idealnie przeprowadzane w pomieszczeniu chłodniczym. Równoważyć kolumnę powinowactwa o pojemności jednej mililitra z komercyjną streptawidyną, stosując 10 CV buforu do refoldingowania zawierającego 250 millimolar imidazolu, przy użyciu układu do grawitacyjnego przepływu okresowego.Przenieś eluat z kolumny niklowej NTA na kolumnę powinowactwa do streptawidyny. Zbierz frakcję przepływową. Przeprowadź elucję przy użyciu 10 CV buforu do refoldingu zawierającego 2,5 millimolar desthiobiotiny.Zebierz eluat. Po zmierzeniu stężenia oktameru w eluacie dodaj 10-krotnie mniejszą ilość proteazy TEV i pozostaw reakcję na noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przenieś mieszaninę na membranę dializacyjną z progiem odcięcia 50 kilodaltonów i dializuj przeciwko buforowi refoldingowemu przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Oczyszczony asymetryczny oktamer należy zagęścić do objętości od 1 do 2 ml, używając wirówki z filtrem o progu odcięcia 10 kDa. Oczekiwane stężenie oktameru wynosi od 20 do 50 µM. Rekonstytucja nukleosomu wymaga DNA zawierającego sekwencję pozycjonującą nukleosom.Dostosuj stężenie soli w DNA do poziomu 2 M NaCl, wykorzystując roztwór stokowy 5 M NaCl. Wymieszaj DNA z oktamerem i buforem do refoldingu, stosując optymalny stosunek oktameru do DNA, wyznaczony w teście w małej skali. Oktamer dodaj na samym końcu, aby zapobiec możliwości zmieszania oktameru i DNA przy stężeniu soli niższym niż 2 M.Przenieść mieszaninę do membrany dializacyjnej o progu odcięcia 6 kDa i dializować przeciwko jednemu litrowi buforu do refoldingowania przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia stopniowo obniżać stężenie soli w buforze do dializy, utrzymując próbkę w każdym buforze chlorku sodu przez co najmniej trzy godziny.Następnie przenieś membranę dializacyjną do zlewki zawierającej jeden litr buforu do analizy i kontynuuj dializę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia pobierz zdializowaną próbkę. Usuń powstały osad poprzez wirowanie w mikrowirówce przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy maksymalnej prędkości.Skoncentruj próbkę za pomocą wirówkowej jednostki filtrującej z progiem odcięcia 30 kilodalton do objętości końcowej wynoszącej około 300 µL. Zmierz stężenie DNA przy 260 nm. Stężenie końcowe powinno mieścić się w zakresie od 10 do 20 µM.Przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C przez maksymalnie kilka tygodni. Profil elucji mieszaniny refałdowanych histonów w żelowej filtracji wykazuje elucję oktamerów histonowych przy około 70 ml. Żel SDS-PAGE potwierdza prawidłową stechiometrię histonów.Zrekonstytuowany pulu oktamerów zawierający trzy typy oktamerów poddaje się schematowi tandemnego oczyszczania powinowactwa. Izolację gatunków asymetrycznych weryfikuje obecność znacznika powinowactwa. Znaczniki powinowactwa są następnie usuwane za pomocą proteazy TEV.Małoskalowa rekonstytucja nukleosomów przy użyciu różnych stosunków molowych DNA do oktameru wykazała, że optymalny jest stosunek jeden do jednego. Przeprowadzono wielkoskalową rekonstytucję nukleosomów z zastosowaniem zoptymalizowanego stosunku molowego DNA do oktameru, w wyniku czego zaobserwowano prawidłową stechiometrię czterech histonów rdzeniowych. Spektroskopia NMR nukleosomów z różnym znakowaniem izotopowym potwierdziła obecność siostrzanych histonów H3 znakowanych azotem 15 oraz węglem 13.W tym przykładzie zastosowania nukleosomy, które zostały różnicowo znakowane izotopowo i asymetrycznie fosforylowane w pozycji C ring 10 histony H3, poddano reakcji z acetylotransferazą GCN5. Acetylację lizyny 14 histony H3 w obu kopiach H3 monitorowano w czasie rzeczywistym za pomocą spektroskopii NMR. Analiza wykazała, że fosforylowanie C ring 10 histony H3 stymuluje acetylację lizyny 14 histony H3 przez GCN5 w cis w porównaniu do trans.Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w ciągu pięciu dni, pod warunkiem jej prawidłowego wykonania. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób rekonstytucji nukleosomów zawierających histony siostrzane o różnych właściwościach.

reconstitution-nucleosomes-with-differentially-isotope-labeled-sister

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisujemy zestaw analiz służących do badania poziomów ekspresji histonów łączących H1. Ilościowy pomiar mRNA poszczególnych genów H1 przeprowadzono za pomocą odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem randomowych starterów, a następnie w czasie rzeczywistym za pomocą techniki PCR, natomiast do ilościowego oznaczenia białek histonów H1 wykorzystano analizę HPLC.

Analiza ekspresji podtypów histonów łączących u ssaków

W tym filmie demonstrujemy szybką mikroskopię sił atomowych w czasie poklatkowym, AFM, techniki obrazowania do badania dynamiki kompleksów nukleosomów. Gdy końcówka AFM skanuje powierzchnię nukleosomu, wykrywa zmiany wysokości nukleosomu i rejestruje rozwijanie się DNA w czasie.

Szybka poklatkowa mikroskopia sił atomowych w celu uchwycenia dynamiki nukleosomów

Przedstawiono metodę rekonstytucji modelowych macierzy nukleosomalnych z rekombinowanych histonów rdzeniowych i tandemowo powtarzanego DNA do pozycjonowania nukleosomów.  Opisujemy również, w jaki sposób eksperymenty z prędkością sedymentacji w ultrawirówce analitycznej i mikroskopia sił atomowych (AFM) są wykorzystywane do monitorowania stopnia nasycenia macierzy nukleosomalnej po rekonstytucji.

Składanie macierzy nukleosomalnych z rekombinowanych histonów rdzenia i pozycjonowania nukleosomów DNA

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Tutaj opisujemy testy biochemiczne, które mogą być użyte do scharakteryzowania zależnych od ATP enzymów przebudowujących chromatynę pod kątem ich zdolności do 1) katalizowania przesuwania się nukleosomów zależnych od ATP, 2) angażowania się w substraty nukleosomów i 3) hydrolizy ATP w sposób zależny od nukleosomu lub DNA.

Testy biochemiczne do analizy aktywności enzymów remodelujących chromatynę zależnych od ATP

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący cząstki nukleosomów na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą technik obrazowania statycznej i poklatkowej mikroskopii sił atomowych (AFM). Opisana metoda funkcjonalizacji powierzchni pozwala na uchwycenie struktury i dynamiki nukleosomów w wysokiej rozdzielczości w nanoskali.

Badanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania mikroskopowego sił atomowych

Ubikwitynacja to modyfikacja potranslacyjna, która odgrywa ważną rolę w procesach komórkowych i jest ściśle koordynowana przez deubikwitynację. Defekty w obu reakcjach leżą u podstaw ludzkich patologii. Udostępniamy protokoły do przeprowadzania reakcji ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych składników.

Testy ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro histonów nukleosomalnych

Tutaj prezentujemy metodę ekspresji acetylowanych białek histonowych za pomocą ekspansji kodu genetycznego i składania odtworzonych nukleosomów in vitro.

Specyficzna dla miejsca acetylacja lizyny histonów do rekonstytucji nukleosomów przy użyciu ekspansji kodu genetycznego w Escherichia coli

Ten protokół szczegółowo opisuje przygotowanie kompleksów nukleosomalnych przy użyciu dwóch metod przygotowania próbek do zamrażania siatek TEM.

Przygotowanie cząstek rdzenia nukleosomów skompleksowanych z czynnikami naprawy DNA do oznaczania strukturalnego w mikroskopii krioelektronowej

Ten artykuł przedstawia szczegółową procedurę eksperymentalną odtwarzania nukleosomów DNA dla siły korelacji pojedynczej cząsteczki i mikroskopii fluorescencyjnej. Dalej opisano kilka dalszych eksperymentów, które można przeprowadzić w celu wizualizacji zachowania wiązania białek oddziałujących z chromatyną i analizy zmian właściwości fizycznych nukleosomów.

Składanie nukleosomów in situ do mikroskopii korelacyjnej i fluorescencyjnej pojedynczej cząsteczki

Warianty genetyczne u członka rodziny Spindlin 4 (SPIN4) zostały niedawno zidentyfikowane u pacjentów z przerostem kości, co jest nowym zaburzeniem rozwojowym. Przedstawiono protokół oraz nowe wyniki opisujące biochemiczną identyfikację zmodyfikowanych histonów w kontekście nukleosomów jako substratów wiążących SPIN4.

Identyfikacja zmodyfikowanych histonów jako substratów wiążących członka ludzkiej rodziny spindlin 4 (SPIN4) za pomocą matryc peptydowych i natywnego pulldownu nukleosomów

Poznaj metodę rekonstytucji nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami w badaniach chromatyny. Technika ta umożliwia jednoczesne mapowanie modyfikacji potranslacyjnych na obu histonach H3.

Rekonstytucja nukleosomów z histonami siostrzanymi znakowanymi różnicowo izotopami

Przeglądaj więcej filmów