Name: Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Poznaj metodę przygotowania mejotycznych rozprzestrzenień chromosomów ze spermatocytów myszy. Technika umożliwia obserwację różnych stadiów mejozy, szczególnie podstadiów profazy 1, w badaniach biologii rozrodu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Abigail Harris za pomoc techniczną. Doceniają również Paulę Cohen i Kima Hollowaya za pomoc w optymalizacji protokołu przygotowania jąder rozsianych powierzchniowo ze spermatocytów myszy. Autorzy doceniają również krytyczną lekturę rękopisu przez Karen Schindler.
Ta praca była wspierana przez NIH R01 GM106262 do K.M.B.

Wszystkie metody z udziałem myszy wykorzystywały wysokie standardy etyczne i dobrostanowe, i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania w Drexel University College of Medicine.
1. Przygotowanie potrzebnych roztworów i instrumentów
<ol>
	<li>Przygotować hipotoniczny bufor ekstrakcyjny (HEB) w 50 ml ultraczystej wody laboratoryjnej o pH 8,2 - 8,4 (Tabela 1). Roztwór powinien być za każdym razem świeży, przechowywać na lodzie i zużyć w ciągu 2 godzin od przygotowania past; jest to konieczne, aby zoptymalizować działanie redukujące i hamujące proteazę odpowiednio DTT i PMSF. Użyj 10 ml HEB na każdą parę jąder myszy.</li>
	<li>Przygotuj 100 ml roztworu sacharozy (za każdym razem świeżego), dodając 0,342 g sacharozy do 10 ml ultraczystej wody laboratoryjnej. Dostosuj pH do 8,2</li>
	<li>Przygotuj świeży roztwór utrwalający (1% paraformaldehydu (PFA), 0,15% Triton X-100, pH dostosowane do 9,2 z 1 N HCl lub 1 N NaOH) świeży co miesiąc i przechowuj w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Rozcieńczyć 16% dostępny na rynku zapas wyjściowy PFA do 4% w 1X PBS do użycia jako zapas roboczy, a następnie przechowywać 4% podwielokrotności w temperaturze -20 °C.
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór utrwalający, dodaj 10 ml 4% roztworu PFA i 600 μl 10% Triton X-100 do 30 ml 1X PBS, dobrze wymieszaj i dostosuj pH do 9,2 za pomocą 1 N HCl lub 1 N NaOH. Roztwór utrwalający należy przechowywać w stożkowej probówce o pojemności 50 ml owiniętej folią aluminiową w temperaturze pokojowej (nie dłużej niż 4 tygodnie).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj roztwory do mycia (podczas schnięcia szkiełek przez ostatnie 30 minut) za pomocą Photo-Flo 200: 0,4% Photo-Flo 200/PBS (320 μL Photo-Flo 200 w 80 ml 1X PBS) i 0,4% Photo-Flo 200/dH2O (160 μL Photo-Flo 200 w 40 ml ultraczystej wody laboratoryjnej). Użyj słoika Coplin o pojemności 50 ml wypełnionego 40 ml roztworów, aby umyć 10 lub mniej szkiełek na raz.</li>
	<li>Przygotuj następujące narzędzia: 1 para nożyczek chirurgicznych (do nacinania skóry), 1 para nożyczek chirurgicznych z cienką końcówką (do nacinania otrzewnej), 2 pary prostych kleszczyków z cienką końcówką (do wypreparowania każdego jądra), 1 żyletka z prostą krawędzią (do nacinania każdego jądra), 2 pary kleszczyków z zakrzywioną końcówką (do unieruchomienia każdego jądra i wyciśnięcia kanalików nasiennych), Słoiki Coplin o pojemności 50 ml, 3 szkiełka z nadrukiem teflonowym, 1 skalpel z ostrzem w rozmiarze 11, nawilżana komora, szalki Petriego 100 x 15 mm, marker permanentny lub ołówek z cienką końcówką oraz obrotowa wytrząsarka platformowa.
	<ol>
		<li>Umieść wysokiej jakości, nienaładowane, wstępnie oczyszczone szkiełka z matowego szkła w pozycji pionowej w słoiku o pojemności 50 ml z kopliny wypełnionym roztworem utrwalającym do czasu użycia. 
		UWAGA: Ołówek jest preferowany, jeśli szkiełka będą używane później w procedurach wymagających etanolu, takich jak fluorescencyjna hybrydyzacja in situ.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Rozprzestrzenianie się jąder spermatocytów
<ol>
	<li>Poddać eutanazji samca myszy zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (np. zwichnięcie szyjki macicy z uduszeniem CO2 lub bez).</li>
	<li>Użyj samców P10 - P20 do oceny komórek mejotycznych w pierwszej fali spermatogenezy; rutynowo używamy mężczyzn P15 - P17, aby uzyskać komórki ze wszystkich podetapów profazy I. Dorosłe jądra również dostarczą komórek z profazy I, ale dadzą również więcej komórek postmejotycznych, takich jak spermatydy.</li>
	<li>Zbierz i zważ jądra (zapisz sparowane wagi), a następnie umieść je na szalce Petriego zawierającej kilka kropli zimnego HEB, aby były wilgotne.</li>
	<li>Przytrzymaj jądro przy dnie naczynia za pomocą kleszczy z zakrzywioną końcówką i użyj żyletki o prostej krawędzi, aby wykonać małe pionowe nacięcie w linii środkowej przez torebkę jądra. Nadal trzymając jądro przy dnie naczynia za pomocą jednego kleszcza, użyj drugiego zestawu kleszczyków z zakrzywioną końcówką lub żyletki z prostą krawędzią, aby delikatnie ścisnąć kanaliki nasienne z jądra.
	<ol>
		<li>Umieścić kanaliki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml zimnego HEB, uważając, aby nie wkładać kawałków kapsułki do probówki. Powtórz te kroki z drugim jądrem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować zdekapsulowane kanaliki nasienne w stożkowej probówce zawierającej HEB na lodzie przez 30 - 60 minut, w zależności od wielkości jąder. Inkubować kanaliki nasienne z pary jąder o masie 30 mg lub mniej przez 30 minut, kanaliki z pary jąder o wadze od 31 do 50 mg przez 30 - 45 minut, a większe jądra przez 60 minut. Nie zmieniaj czasów dla pojedynczego jądra. 
	UWAGA: Optymalny czas inkubacji może się różnić w zależności od doświadczenia eksperymentatora, użytych odczynników i analizowanych myszy.</li>
	<li>Podczas inkubacji kanalików nasiennych w HEB użyj markera lub ołówka, aby oznaczyć matowe końce wstępnie oczyszczonych szkiełek numerem myszy, numerem slajdu i datą. Następnie umieść wstępnie oczyszczone szkiełka w słoiku Coplin zawierającym roztwór utrwalający.</li>
	<li>Po inkubacji wlać kanaliki i HEB do czystej szalki Petriego i rozdzielić kanaliki na grudki o średnicy około 3 mm. Z każdej kępy powstają 2 szkiełka, a liczba uzyskanych szkiełek zależy od wielkości jąder. 
	UWAGA: Otrzymujemy 8 szkiełek z typu dzikiego i 6 szkiełek z jądra P16 o zerowej płodności Chtf18 (które są mniejsze ze względu na zmniejszoną liczbę mejotycznych i mitotycznych komórek rozrodczych8). Oczekuje się, że jedno dorosłe jądro o masie 100 mg lub więcej da 16 szkiełek.</li>
	<li>Umieścić 23 μl 100 mM roztworu sacharozy w jednym pierścieniu z drukowanym teflonem, 3-pierścieniowym szkiełku podstawowym i dodać jedną grudkę kanalików nasiennych do pierścienia. Następnie za pomocą kleszczyków z zakrzywioną końcówką, aby przytrzymać grudkę, delikatnie zmielić kanaliki żyletką w rozmiarze 11, aż roztwór stanie się mętny. 
	UWAGA: Nie miażdż zbyt mocno, ponieważ spowoduje to fragmentację chromosomów. Należy zauważyć, że pofragmentowane chromosomy mogą również wskazywać na zmutowany fenotyp.</li>
	<li>Usuń zanieczyszczenia, dodaj kolejne 23 μl roztworu sacharozy i za pomocą mikropipety delikatnie odpipetuj mieszaninę kilka razy w górę i w dół, aby pomóc oddzielić komórki w zawiesinie.</li>
	<li>Wyjmij szkiełko nasączone w słoiku Coplin zawierającym roztwór utrwalający i przechyl szkiełko nad słoikiem tak, aby jedna obfita kropla zebrała się w dolnym rogu szkiełka.
	<ol>
		<li>Odpipetować 20 μl zawiesiny komórek sacharozy z pierścienia 3-pierścieniowego szkiełka z nadrukiem teflonowym do kropli utrwalacza na wysokiej jakości szkiełku podstawowym z matowego szkła i pipetować zawiesinę w górę iw dół 2-3 razy. 
		UWAGA: Kropla utrwalacza powinna mieć wystarczająco dużą objętość, aby dodanie do niej 20 μl zawiesiny komórek sacharozy umożliwiło pokrycie całego szkiełka podczas rozprowadzania mieszaniny (patrz 2.11 poniżej).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powoli przechyl szkiełko na bok przeciwny do kropli, aby rozprowadzić zawiesinę komórek na całej długości szkiełka. Następnie powoli odchyl suwak do tyłu, aby rozłożyć zawieszenie komórek na całej szerokości zjeżdżalni, aby całkowicie je zakryć. Unikaj rozprowadzania zawiesiny na tym samym obszarze szkiełka więcej niż jeden raz, w przeciwnym razie komórki będą się na siebie nakładać.</li>
	<li>Natychmiast umieścić szkiełko płasko w wilgotnej komorze i powtarzać kroki od 2,8 do 2,11, aż wszystkie grudki kanalików nasiennych zostaną wykorzystane do wykonania szkiełek. Ważne jest, aby nie przesuwać nawilżonej komory podczas procesu suszenia, aby uniknąć rozdarcia i zachodzenia na siebie komórek.</li>
	<li>Pozostaw szkiełka do inkubacji w zakrytej, wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny, aby wyschły powoli i nie do końca. Wysoka wilgotność i powolne schnięcie na tym etapie są ważne, aby zapewnić odpowiednie rozprowadzenie chromatyny. Następnie zdejmij pokrywę komory i pozostaw szkiełka do całkowitego wyschnięcia na powietrzu przez dodatkowe 30 minut.</li>
	<li>Umieść szkiełka (tyłem do siebie lub zygzakiem) w słoiku Coplin zawierającym 0,4% roztworu Photo-Flo 200/1X PBS i umyj szkiełka dwukrotnie, po 5 minut każde, delikatnie mieszając słoik Coplin na obrotowej wytrząsarce platformowej. Używaj świeżego roztworu do każdego prania i przechowuj szkiełka z różnych myszy w osobnych słoikach dla każdego z prań.</li>
	<li>Umyj szkiełka w słoiku Coplin zawierającym 0,4% roztworu Photo-Flo 200/dH2O przez 5 minut jednorazowo podczas mieszania.</li>
	<li>Wyjmij szkiełka ze słoika Coplin (ostatnie mycie), ostrożnie wytrzyj krawędzie i spody szkiełek, aby usunąć nadmiar płynu, i umieść szkiełka pod kątem, prawie pionowo do wyschnięcia. Eksperymentator, który jest biegły w tej technice, może przetworzyć i przygotować rozsiane powierzchniowo jądra od 4 lub 5 myszy w ciągu jednego dnia.</li>
	<li>Po wyschnięciu (15 - 20 min) natychmiast przetworzyć szkiełka do barwienia immunofluorescencyjnego lub przechowywać w temperaturze -80 °C w szczelnie zamkniętym pudełku szkiełkowym, chronionym przed światłem, przez maksymalnie 3 tygodnie (w zależności od ocenianych białek docelowych; optymalne wyniki można uzyskać, jeśli zostaną zabarwione tego samego dnia lub w ciągu 2 tygodni).
	<ol>
		<li>W przypadku przechowywania w temperaturze -80 °C, pozwól szkiełkom osiągnąć temperaturę pokojową i umyj je w słoiku Coplin zawierającym 1X PBS lub Block przez 5 minut przed barwieniem. 
		UWAGA: Wiele różnych protokołów barwienia immunofluorescencyjnego zapewni dobre wyniki; patrz Berkowitz et al., aby zapoznać się z protokołem barwienia immunologicznego8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+mammalian+meiosis%3A+regulation%2C+dynamics+and+impact+on+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li>
<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li>
<li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li>
<li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li>
<li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li>
<li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li>
<li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li>
<li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996(2012).</li>
<li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li>
<li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+cohesins+in+mitosis%2C+meiosis%2C+and+human+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li>
<li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+in+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li>
<li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+elaboration%3A+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li>
<li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li>
<li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li>
<li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+premature+G2%2FM-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby uzyskać dużą liczbę dobrze rozsianych, dobrej jakości jąder spermatocytów, najbardziej krytycznymi etapami tego protokołu są odpowiedni czas inkubacji kanalików nasiennych w HEB, odpowiednie mielenie kanalików nasiennych oraz technika stosowana do rozprowadzania zawiesiny komórek sacharozy na szkiełku (szkiełkach) powlekanym utrwalaczem. Wysiadujemy kanaliki nasienne z jąder samców typu dzikiego od 15 dnia po urodzeniu do dorosłości w HEB przez 45 minut, podczas gdy jądra od myszy o porównywalnym wieku Chtf18-nul...

Myszy są szeroko wykorzystywane jako organizm modelowy do badania mejozy u ssaków. Można ocenić zarówno normalne procesy rozwojowe, jak i defekty, które występują podczas mejozy. Oś czasu i progresję istotnych cech, które występują podczas profazy I i podetapów, a także mnogość specyficznych białek zaangażowanych w procesy kluczowe dla regulacji mejozy, można scharakteryzować zarówno u myszy typu dzikiego, jak i zmutowanego. Kilka wyspecjalizowanych procesów, które zachodzą podczas mejozy I, można szczegółowo zbadać (recenzja w Handel i Schimenti1). Obejmują one tworzenie i naprawę pękania podwójnej nici DNA (DSB), rekombinację, tworzenie kompleksów synaptonemalnych i segregację chromosomów.
Ważnym aspektem badania procesów mejotycznych jest możliwość badania jąder zawierających homologiczne chromosomy, które są wizualnie i optycznie rozdzielone, aby lepiej rozróżnić i zidentyfikować podetapy profazy I. Profaza I składa się z 5 podetapów, które charakteryzują się specyficznymi cechami, w tym tworzeniem kompleksu synaptonemalnego (SC). SC jest trójdzielnym rusztowaniem białkowym, które umożliwia parowanie i naprawę pęknięć dwuniciowych DNA homologów. Podczas leptonema homologi wyrównują się, gdy układane są elementy osiowe SC. Następnie przyłączenie elementów centralnych do kompleksu synaptonemalnego podczas zygonemy ułatwia parowanie i fizyczne połączenie (synapsę) między parami homologów. Podczas pachynema synapsa homologów staje się kompletna, a krzyżówki DNA powstają w wyniku naprawy wybranej populacji pęknięć dwuniciowych DNA poprzez rekombinację homologiczną. SC rozkłada się podczas diplonemy, umożliwiając homologom desynapsę, ale pozostają przyłączone w swoich centromerach i w miejscach krzyżowania DNA. Wreszcie, podczas diakinezy, homologi ponownie się kondensują i następuje przejście do metafazy1.
Historycznie rzecz biorąc, powierzchniowe rozprzestrzenianie się chromatyny mejotycznej dało niewiele jąder, szczególnie tych z wczesnych stadiów profazy I2. W rezultacie metody te zostały zmodyfikowane w celu poprawy separacji komórek od tkanek (tj. jądra lub jajnika), techniki rozprowadzania chromatyny mejotycznej oraz uzyskania wysokiej jakości jąder mejotycznych do oceny2,3,4. Ponadto metoda ta okazała się przydatna w zachowaniu białek związanych z jądrami jądrowymi i chromatyną w jądrach mejotycznych, jak wykazano za pomocą opublikowanych technik immunolokalizacji5,6,7. W związku z tym metoda początkowo opisana przez Peters2 i zademonstrowana tutaj daje wiele oddzielnych pękniętych jąder spermatocytów zawierających homologi poddawane podetapom leptotenu, zygotenu, pachytenu, diplotenu i diakinezy profazy I.
Technika przygotowania jąder rozprzestrzeniania się powierzchniowego (zwana również analizą rozprzestrzeniania chromatyny) jest szeroko stosowana do badania mejozy w dziedzinie biologii reprodukcyjnej i komórkowej. Szkiełka zawierające jądra rozsiane powierzchniowo mogą być następnie wybarwione immunologicznie przeciwciałami przeciwko białkom będącym przedmiotem zainteresowania lub poddane barwieniu srebrem, a następnie analizowane pod mikroskopem. Metoda jest podobna zarówno dla samców, jak i samic myszy, chociaż modyfikacje zostały opisane dla samic myszy 2. Ważne jest, aby nie przemielić kanalików nasiennych. Jądra muszą być również dobrze rozsiane, tak aby następujące homologi immunobarwiące i związane z nimi białka były wyraźnie widoczne pod mikroskopią. Jądra rozsiane powierzchniowo można przygotować w ciągu zaledwie kilku godzin i natychmiast wybarwić immunologicznie lub przechowywać w temperaturze -80 °C przez maksymalnie 3 tygodnie przed rozmrożeniem i barwieniem immunologicznym. Jednak optymalne wyniki najlepiej uzyskuje się dla niektórych białek, jeśli barwienie immunologiczne zostanie przeprowadzone natychmiast lub w ciągu 2 tygodni od przygotowania jąder rozsianych powierzchniowo. Preparaty mogą być barwione immunologicznie za pomocą standardowego protokołu przy użyciu przeciwciał przeciwko białkom będącym przedmiotem zainteresowania, a następnie inkubowane z przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z białkami fluorescencyjnymi lub barwnikami, a następnie obrazowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej8. W dniu po urodzeniu 15 - 21 na parę jąder typu dzikiego przypada wystarczająca ilość tkanki, aby uzyskać 6-10 szkiełek, a starsze myszy (w tym dorosłe) dadzą więcej szkiełków. Jednak myszy typu dzikiego w wieku 6 tygodni i starsze również dadzą więcej komórek postmejotycznych (tj. plemników) na szkiełkach po barwieniu immunologicznym. Ponadto wszystkie podetapy profazy I można zaobserwować u myszy młodocianych i dorosłych. Jądra od samców w dniach po urodzeniu od 10 do 15 dadzą znacznie więcej komórek leptotenu i zygotenu. Myszy starsze niż 14 do 15 dni po urodzeniu wydadzą więcej jąder pachytenu i diplotenu.
Tutaj opisujemy i demonstrujemy szeroko stosowaną metodę przygotowania jąder rozsianych powierzchniowo z mysich spermatocytów.

<table><tbody><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>Kodak</td><td>1464510</td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd (wodny roztwór formaldehydu)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td>Rozcieńczyć 16% roztwór do 4% zapasów roboczych za pomocą 1X PBS i zamrozić podwielokrotności w temperaturze -20 &deg; C</td></tr><tr><td>3 szkiełka z nadrukiem teflonowym</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>63418-11</td><td></td></tr><tr><td>Wysokiej jakości nienaładowane szkiełka z matowego szkła Kilka</td><td>marek</td><td></td> komercyjnych <td>Wyczyść szkiełka w alkoholu etylowym lub izopropylowym i pozostaw do wyschnięcia przed użyciem; Oznaczaj szkiełka na matowym końcu markerem permanentnym lub ołówkiem, w zależności od późniejszego użycia szkiełek</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne (ostre i końcówki)</td><td>Narzędzia</td> <td>do nauki pięknej14001-12</td><td>Będą działać różne marki podobnego typu</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne z cienką końcówką (ostre końcówki)</td><td>Narzędzia do nauki</td> o wysokiej jakości <td>14058-11</td><td>Będą działać różne marki podobnego typu</td></tr><tr><td>Proste kleszcze z cienką końcówką</td><td>Narzędzia do nauki o</td> wysokiej jakości <td>11050-10</td><td>Sprawdzi się inna marka podobnego typu</td></tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze ze średnią końcówką</td><td>Fisher</td><td>16100110</td><td>Sprawdzi się</td></tr> <tr><td>inna marka podobnego typuRękojeść skalpela</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>Będzie działać inna marka podobnego typu</td></tr><tr><td>Mysz anty-SYCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>Użyj w 1:300</td></tr><tr><td>Białko anty-centromerowe (pochodzące z ludzkiej surowicy pacjenta CREST)</td> <td>Przeciwciała Włączone</td><td>15-234-0001</td><td>Użyj w 1:50</td></tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td> nawilżana <td>Używamy kwadratowych naczyń hodowlanych Nunc 500 cm2 / studnia z nawilżanym papierem ręczniki</td></tr><tr><td>Mikroskop szerokokątny z epifluorescencją</td><td>Mikrosystemy</td><td></td> Leica <td>Dowolny model standardowy</td></tr><tr><td>Słoiki z kopiny</td><td>Kilka marek</td><td></td> komercyjnych <td>Pojemność 50 ml; Średnica 40 mm (1,6 cala), mieści 10 szkiełek (tyłem do siebie)Szalki</td></tr> <tr><td>Petriego</td><td>Kilka marek</td><td></td> komercyjnych <td>Średnica 100 x 15 mm, polistyren sterylny, nieobrobiony</td></tr></tbody></table>

przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów myszy

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

Mejoza ssaków to dynamiczny proces rozwojowy, który zachodzi w komórkach rozrodczych i może być badany i charakteryzowany. Stosując metodę rozprowadzania jąder na powierzchni szkiełek (zamiast zrzucania ich z wysokości), demonstrujemy zoptymalizowaną technikę na spermatocytach myszy, która została po raz pierwszy opisana w 1997 roku. Metoda ta jest szeroko stosowana w laboratoriach do badania mejozy ssaków, ponieważ daje mnóstwo wysokiej jakości jąder przechodzących podetapy profazy I. Kanaliki nasienne są najpierw umieszczane w roztworze hipotonicznym w celu pęcznienia spermatocytów. Następnie spermatocyty są uwalniane do roztworu sacharozy w celu wytworzenia zawiesiny komórkowej, a jądra są rozprowadzane na szkiełkach nasączonych utrwalaczem. Po barwieniu immunologicznym można zbadać różnorodność białek związanych z procesami mejotycznymi. Na przykład białka kompleksu synaptonemalnego, trójdzielnej struktury, która łączy ze sobą osie/rdzenie chromosomów homologów, można łatwo zwizualizować. Białka rekombinacji mejotycznej, które biorą udział w naprawie pęknięć dwuniciowych DNA przez rekombinację homologiczną, mogą być również barwione immunologicznie w celu oceny progresji profazy I. Tutaj opisujemy i szczegółowo demonstrujemy technikę szeroko stosowaną do badania mejozy ssaków w spermatocytach młodych lub dorosłych samców myszy.

Zdolność tej metody do uzyskania dużej liczby rozprzestrzenionych na powierzchni jąder zawierających nienaruszone homologi zależy od trzech głównych czynników: 1) odpowiedniego czasu inkubacji kanalików nasiennych w buforze hipotonicznym (tj. HEB), aby uzyskać odpowiednio obrzęknięte jądra spermatocytów, które pękają, ale nie ulegają dezintegracji w wyniku przedłużonej inkubacji w HEB, 2) mikropipetowania kropel sacharozy z komórkami w celu uzyskania rozdzielonej zawiesiny jąder, które ni...

Mejoza to proces rozwojowy, w którym gamety są formowane przez pojedynczą rundę replikacji DNA i dwie kolejne rundy segregacji chromosomów. Mejozę ssaków można zbadać, wykorzystując technikę przygotowania mejotycznych rozsiewów chromosomów. W tym miejscu przedstawiono metodę przygotowania jąder rozsianych powierzchniowo ze spermatocytów myszy.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów myszy

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przygotowanie preparatów rozciśniętych chromosomów meiotycznych z spermatocytów myszy w celu umożliwienia badania mejozy u samców. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozrodu dotyczące mechanizmów regulujących rekombinację meiotyczną i segregację chromosomów. Główną zaletą tej techniki jest uzyskanie licznych jąder spermatocytów na różnych etapach mejozy, w szczególności komórek znajdujących się w podetapach profazy I.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ technika rozprzestrzeniania jąder spermatocytów na szkiełkach jest trudna do opisania w formie pisemnej. Należy rozpocząć od zważenia sparowanych jąder pobranych od samców myszy w wieku od postnatalnego do dorosłego, a następnie umieścić zważone próbki w szalce Petri zawierającej kilka kropli zimnego hipotonicznego buforu do ekstrakcji. Aby pobrać kanaliki, należy za pomocą końcówek zakrzywionej pęsety przycisnąć jedno jądro do dna szalki i użyć ostrza brzytwy, aby wykonać niewielkie, pionowe nacięcie w linii środkowej przez torebkę jądra.Użyj drugiej pary pęsety zakrzywionej lub ostrza brzytwy, aby delikatnie wycisnąć kanaliki nasi

preparation-of-meiotic-chromosome-spreads-from-mouse-spermatocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Celem tej techniki zgniatania kanalików jest szybka ocena cech cytologicznych rozwijających się mysich spermatocytów przy jednoczesnym zachowaniu integralności komórkowej. Metoda ta pozwala na badanie wszystkich etapów spermatogenezy i może być łatwo stosowana wraz z innymi biochemicznymi i molekularnymi podejściami biologicznymi do badania mejozy myszy.

Technika squasha kanalików nasiennych do cytologicznej analizy spermatogenezy z wykorzystaniem modelu mysiego

Wiadomo, że oogeneza u ssaków jest podatna na błędy, szczególnie z powodu błędnej segregacji chromosomów. W tym manuskrypcie opisano metody przygotowania rozprzestrzeniania się chromatyny dla mysich oocytów z profazą, metafazą I i II stopnia. Te podstawowe techniki pozwalają na badanie białek związanych z chromatyną i morfologii chromosomów w trakcie oogenezy ssaków.

Preparaty do rozprzestrzeniania chromatyny do analizy progresji oocytów myszy od profazy do metafazy II

Prezentowany tutaj jest protokół wzbogacania spermatocytów pachytenowych, okrągłych spermatyd i wydłużania spermatyd z jąder dorosłych myszy za pomocą nieciągłego gradientu gęstości albuminy surowicy bydlęcej za pomocą standardowego sprzętu laboratoryjnego.

Wzbogacanie spermatocytów pachytenowych i spermatydów z jąder myszy przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego

Rozprzestrzenianie się powierzchni jądrowej jest niezbędnym narzędziem do badania zdarzeń chromosomowych podczas mejozy. Tutaj demonstrujemy metodę przygotowania i wizualizacji chromosomów mejotycznych podczas profazy I ze spermatocytów danio pręgowanego.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

Ten artykuł opisuje in-vivo hamowanie CENP-E poprzez operację jamy brzusznej i wstrzyknięcie do jąder GSK923295, cenny model męskiego podziału mejotycznego. Korzystając z testów immunofluorescencji, cytometrii przepływowej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej, pokazujemy, że hamowanie CENP-E powoduje niewspółosiowość chromosomów i niestabilność genomu w spermatocytach myszy.

Ocena funkcjonalna kinezyny-7 CENP-E w spermatocytach za pomocą inhibicji in vivo, immunofluorescencji i cytometrii przepływowej

Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania kultur neuronalnych z kory mózgu myszy w późnym stadium embrionalnym i wczesnym okresie postnatalnym. Kultury te mogą być wykorzystywane do immunocytochemii, biochemii, elektrofizjologii, obrazowania wapnia i sodu, a także stanowią platformę do badania rozwoju neuronalnego zwierząt transgenicznych posiadających postnatalnie letalną mutację genu.

Przygotowanie dysocjowanych kultur neuronów korowych myszy

Niniejszy film opisuje prostą i oszczędzającą czas technikę automatycznej dysocjacji tkanek z użyciem dysocjatora gentleMACS w celu przygotowania zawiesin pojedynczych komórek splenocytów mysich.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek ze śledziony myszy z użyciem dysocjatora gentleMACS

Poznaj metodę przygotowania mejotycznych rozprzestrzenień chromosomów ze spermatocytów myszy. Technika umożliwia obserwację różnych stadiów mejozy, szczególnie podstadiów profazy 1, w badaniach biologii rozrodu.

Przygotowanie mejotycznych rozprzestrzeniania się chromosomów ze spermatocytów myszy

Przeglądaj więcej filmów