Name: Analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj metodę analizy wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów zapalnych chorób OUN oraz rozwój nowych strategii terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte przez Collaborative Research Centre CRC TR128 "Inicjacja/Efektor kontra mechanizmy regulacyjne w stwardnieniu rozsianym-Postęp w kierunku walki z chorobą" (Projekt A9 do H.W. i C.C.G., projekt B1 do N.S.).

1. Hodowla komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu człowieka (HBMEC)
<ol>
	<li>Powlekanie kolb do hodowli komórkowej
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór fibronektyny, dodać 10 mL PBS do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL. Dodać 150 µL fibronektyny i dokładnie wymieszać.</li>
		<li>Aby pokryć dno kolby do hodowli komórkowej T-25, dodać 2 mL roztworu fibronektyny. Inkubować kolbę przez co najmniej 3 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze. Kolby powleczone fibronektyną można przechowywać przez 2 tygodnie w 37 °C / 5% CO2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiew i hodowla komórek HBMEC
	<ol>
		<li>Odssać roztwór fibronektyny z dna kolby do hodowli komórkowej. Dodać 7,2 x 104 HBMEC/cm² zawieszonych w 6 mL medium ECM-b (= medium ECM-b uzupełnione o 5% płodowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny/streptomycyny oraz 1% suplementu wzrostu komórek śródbłonka). Inkubować w 37 °C / 5% CO2. Codziennie kontrolować wzrost komórek za pomocą mikroskopu.</li>
		<li>Wymieniać medium co 3 dni. Zebrać lub pasażować komórki, gdy HBMEC osiągną około 80% konfluencji. Komórek HBMEC należy używać między 1. a 15. pasażem, aby uniknąć utraty właściwości fizjologicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór komórek HBMEC
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór accutase, mieszając accutase (1x) z PBS w stosunku 1:1. Przechowywać roztwór accutase w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C do momentu użycia.</li>
		<li>Przenieść medium ECM-b z kolby do hodowli komórkowej do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL. Przemyć HBMEC, dodając 5 mL PBS na dno kolby do hodowli komórkowej. Odssać PBS i powtórzyć etap przemywania jeszcze dwa razy.</li>
		<li>Dodać 2 mL podgrzanego roztworu accutase. Inkubować w 37 °C przez 2 min. Następnie resuspendować HBMEC, kilkukrotnie energicznie opukując kolbę do hodowli komórkowej. Odłączenie komórek kontrolować za pomocą mikroskopu.</li>
		<li>Medium ECM-b, wcześniej przechowywane w probówce 15 mL, dodać z powrotem do kolby do hodowli komórkowej, gdy tylko HBMEC zaczną się odłączać. Wielokrotnie płukać dno kolby, aż większość komórek HBMEC zostanie resuspendowana.</li>
		<li>Przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej 15 mL. Wirować przy 300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej. Odrzucić nadsącz i resuspendować komórki w 1 mL medium ECM-b. Policzyć komórki i rozcieńczyć zawiesinę, aby uzyskać końcowe stężenie 3 x 105 HBMEC na mL medium ECM-b.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie wkładów do hodowli komórkowych
<ol>
	<li>Powlekanie wkładów do hodowli komórkowej 
	Ważna uwaga: Należy unikać dotykania membrany wkładów do hodowli komórkowej.
	<ol>
		<li>Do każdego wkładu do hodowli komórkowej (Rysunek 1A) oraz do jednego dołka 96-dołkowej płytki z płaskim dnem (dołek kontroli optycznej) należy dodać 100 µL roztworu fibronektyny (patrz 1.1.1). Inkubować przez co najmniej 3 h w temperaturze 37 °C. Po inkubacji odessać roztwór fibronektyny.</li>
		<li>Do wkładów do hodowli komórkowej oraz do dołka kontroli optycznej dodać 100 µL zawiesiny HBMEC. Do dolnej komory wkładów do hodowli komórkowej dodać 600 µl pożywki ECM-b. Inkubować przez 3–4 dni w temperaturze 37 °C / 5% CO2 aż do uzyskania integralności bariery (Rysunek 1B); wzrost komórek HBMEC w dołku kontroli optycznej należy weryfikować za pomocą oceny mikroskopowej. Uwaga: Nie zaleca się hodowli komórek powyżej czterech dni.</li>
		<li>Opcjonalnie: Aby zasymulować warunki zapalne, należy odessać pożywkę z dolnej komory i zastąpić ją pożywką ECM-b uzupełnioną o 500 U/mL IFN-γ/TNF-α na 24 h przed testem migracji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Kontrola jakości z użyciem błękitu Evansa w dniu przeprowadzenia testu transmigracji
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu błękitu ewansa
	<ol>
		<li>Aby przygotować mieszaninę PBS/B27, wymieszać 10 mL PBS z 200 µl suplementu B27 w probówce wirówkowej o pojemności 15 mL. Roztwór zapasowy błękitu ewansa (20 mg/mL PBS) rozcieńczyć w stosunku 1:1 000 za pomocą PBS/B27.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza przepuszczalności błękitu ewansa
	<ol>
		<li>Odessać medium z dolnej komory, a następnie z górnej komory wkładki do hodowli komórkowej zawierającej konfluencyjną monowarstwę HBMEC. Do wkładki do hodowli komórkowej dodać 100 µL roztworu błękitu ewansa.</li>
		<li>Do dolnej komory dodać 600 µL PBS/B27 i inkubować przez 60 min w temperaturze 37 °C / 5% CO2. Ostrożnie wyjąć wkładkę do hodowli komórkowej za pomocą pęsety.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar błękitu ewansa
	<ol>
		<li>Usunąć PBS/B27 z dolnej komory i przenieść po 100 µL do dwóch studzienek czarnej polistyrenowej płytki 96-dołkowej o płaskim dnie. Włożyć płytkę do czytnika płytek Tecan Infinite M200 Pro i wyznaczyć optymalną pozycję z.</li>
		<li>Zmierzyć wzbudzenie błękitu ewansa przy użyciu odpowiednich ustawień (na przykład: wzbudzenie: 620 nm, emisja: 680 nm, szerokość pasma wzbudzenia: 9 nm, szerokość pasma emisji: 20 nm, wzmocnienie 175x, 25 błysków, czas całkowania: 20 µs).</li>
		<li>Aby określić funkcje barierowe HBMEC, porównać uzyskane dane z krzywą wzorcową przedstawiającą przenikanie błękitu ewansa przez HBMEC w różnych punktach czasowych po wysianiu komórek (Rycina 1B, prawa).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test migracji
<ol>
	<li>Przygotowanie mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC).
	<ol>
		<li>Do probówki wirówki o pojemności 15 mL dodać 10 mL RPMI oraz 200 µL suplementu B27. Policzyć PBMC i odwirować komórki przy 300 x g przez 5 min. Resuspendować PBMC do końcowego stężenia 5 x 106 komórek/mL RPMI/B27.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie testu migracji
	<ol>
		<li>Odssać medium z dolnej, a następnie z górnej komory wkładów do hodowli komórkowych zawierających konfluencyjne monowarstwy HBMEC (Rycina 1A). Dla każdego dawcy dodać 100 µL zawiesiny PBMC do wkładów do hodowli komórkowych oraz do jednego dołka płytki 24-dołkowej (kontrola in vitro).</li>
		<li>Dodać 600 µL RPMI/B27 do dolnej komory wkładów do hodowli komórkowych oraz 500 µL do PBMC w kontroli in vitro i inkubować przez 6 h w 37 °C / 5% CO2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór zmigrowanych PBMC
	<ol>
		<li>Wyjąć wkład do hodowli komórkowej za pomocą pęsety i ostrożnie wypłukać dno 400 µL PBS, nie dotykając membrany. Wyrzucić wkład do hodowli komórkowej.</li>
		<li>Do dolnej komory wkładu do hodowli komórkowej oraz do kontroli in vitro dodać 20 µL fluorosfer do liczenia przepływowego (około 1 000 kulek/µL) i dobrze wymieszać. Przenieść 1 mL otrzymanej zawiesiny PBMC do probówek do cytometrii przepływowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Przygotowanie próbek
	<ol>
		<li>Odwiruj PBMC przy 300 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Przygotuj roztwór przeciwciał, dodając przeciwciała sprzężone z fluorochromami do 100 µL buforu do cytometrii przepływowej (PBS/1% BSA/2 mM EDTA) na próbkę. Dla wyników przedstawionych poniżej na próbkę zużyto 1 µL CD4-FITC, 1 µL CD3-PerCP/Cy5.5, 1 µL CD56-PC7, 1 µL CD8-A700 oraz 1 µL CD16-A750.</li>
		<li>Resuspenduj PBMC w 100 µL roztworu przeciwciał i inkubuj przez 30 min w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodaj 250 µL buforu do cytometrii przepływowej i odwiruj przy 300 x g przez 5 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nabywanie danych z próbek
	<ol>
		<li>Resuspenduj PBMC w wymaganej ilości buforu do cytometrii przepływowej (zależnie od użytego cytometru przepływowego).</li>
		<li>Nabyj dane z barwionych PBMC, używając cytometru przepływowego z aktywnym detektorem w zakresie długości fali od 525 do 700 nm w celu wykrycia fluorosfer do zliczania komórek (wzbudzenie 488 nm, emisja 525 - 700 nm). 
		(Kolejne kroki stanowią przykład w przypadku użycia cytometru przepływowego Gallios obsługiwanego oprogramowaniem Kaluza G: (1) Uruchom komputer. (2) Po pełnym załadowaniu systemu operacyjnego uruchom cytometr przepływowy, naciskając przycisk „cytometer on”. (3) Wczytaj odpowiedni protokół akwizycji, naciskając przycisk „open protocol”. (4) Wybierz wymagany protokół i kliknij „open”. (5) Powiel protokół dla każdej próbki, klikając prawym przyciskiem myszy na protokół widoczny w wirtualnym karuzeli, a następnie lewym przyciskiem na polu „duplicate”. (6) Opisz każdą próbkę na liście próbek. (7) Przenieś próbki na wskazane pozycje karuzeli i rozpocznij akwizycję.)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza próbek
	<ol>
		<li>Otwórz uzyskane dane z cytometrii przepływowej, używając odpowiedniego oprogramowania. Określ liczbę interesujących podpopulacji dla PBMC, które migrowały, a także komórek z kontrolnych studni in vitro oraz fluorosfer do zliczania komórek, korzystając z odpowiedniego oprogramowania analitycznego. 
		(Przykład strategii bramkowania podano w sekcji wyników (Rycina 1 C: Aby przeanalizować migrację subpopulacji komórek NK, najpierw wybierz limfocyty na wykresie rozproszenia bocznego (SSC) względem rozproszenia przedniego (FSC). Następnie limfocyty są wyświetlane na wykresie CD3 względem CD56 i wybierane są komórki NK CD56+CD3-. Aby rozróżnić subpopulacje komórek NK, komórki NK są wyświetlane na wykresie CD56 względem CD16 i wybierane są komórki NK CD56brightCD16dim/- oraz CD56dimCD16+. Dodatkowo, fluorosfery do zliczania komórek są wybierane z wykresu FSC względem SSC, a następnie wyświetlane na wykresie kanału z emisją między 525 a 700 nm względem czasu w celu określenia ich liczby.)</li>
		<li>Aby obliczyć całkowitą liczbę komórek dla każdej próbki, znormalizuj wykrytą liczbę komórek za pomocą fluorosfer do zliczania komórek: 
		<img alt="Wzór na ilościowe oznaczenie komórek; równanie dla zliczania komórek przy użyciu cytometrii przepływowej, referencja fluorosfery." src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Równanie"></li>
		<li>Wyznacz procent zmigrowanych komórek jako stosunek całkowitej liczby komórek zmigrowanych do całkowitej liczby komórek w kontroli in vitro .</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autor (autorzy) zadeklarował następujące potencjalne konflikty interesów w odniesieniu do badań, autorstwa i/lub publikacji tego artykułu: A.S.-M. i U.B. nie ujawniają żadnych informacji finansowych. T. S.-H. otrzymał od firmy Biogen koszty podróży i konferencji. N.S. otrzymał honoraria prelegentów i rad doradczych od firm Biogen i Novartis Pharma, a także zwrot kosztów podróży od firmy Biogen. H.W. otrzymał wynagrodzenie za zasiadanie w Naukowych Radach Doradczych/Komitetach Sterujących dla Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis i Sanofi-Genzyme. Otrzymał również honoraria prelegentów i wsparcie w podróżach od Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis i Sanofi-Genzyme. Jako konsultant otrzymał wynagrodzenie od firm Biogen, Merck Serono, Novartis i Sanofi-Genzyme. Firma H.W. otrzymała wsparcie badawcze od firm Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germany i Sanofi US. C.C.G. otrzymało honoraria prelegentów i zwrot kosztów podróży za udział w spotkaniach od Genzyme, Novartis Pharma GmbH i Bayer Health Care.

W tym artykule przedstawiamy technikę badania transmigracji limfocytów przez barierę krew-mózg człowieka. Analiza in vitro migracji limfocytów do OUN jest ważna dla zbadania podstawowych procesów wynaczynienia limfocytów, potencjalnych zmian związanych z chorobą i nowych podejść terapeutycznych.
Możliwych jest kilka modyfikacji modelu bariery krew-mózg. Na przykład komórki z górnego przedziału mogą być analizowane w celu zbadania składu populacji komórek niemigrowanych. Ponadto leczen...

Migracja limfocytów z krwi do tkanek jest kluczowa dla nadzoru immunologicznego. Sekwencja specyficznych oddziaływań molekularnych zapewnia specyficzne dla miejsca wynaczynienie do jelita cienkiego, skóry, węzłów chłonnych, ośrodkowego układu nerwowego (OUN) i innych tkanek1. Zmiany w migracji limfocytów są zaangażowane w patofizjologię wielu szeroko rozpowszechnionych chorób2. Migracja do OUN uprzywilejowanego immunologicznie jest ściśle regulowana i w związku z tym zmiany w tym procesie są zaangażowane w choroby związane z OUN, takie jak zapalenie mózgu i rdzenia3, zapalenie nerwu wzrokowego, udar mózgu i stwardnienie rozsiane (SM)2,4,5,6,7. Dlatego ważne jest, aby badać wynaczynienie limfocytów, aby lepiej zrozumieć patofizjologię choroby i opracować narzędzia do łagodzenia obciążenia chorobowego8,9,10,11,12.
Limfocyty migrują do OUN różnymi drogami. Opisano wynaczynienie przez żyłki pozakapilarne do przestrzeni podpajęczynówkowej przez barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy w obrębie splotu naczyniówkowego i przez barierę krew-mózg1,13,14,15. Migracja przez barierę krew-mózg odbywa się w wyniku interakcji limfocytów z komórkami śródbłonka14. W przeciwieństwie do komórek śródbłonka na obrzeżach, komórki śródbłonka OUN wyrażają duże ilości cząsteczek o ścisłym połączeniu, ściśle ograniczając w ten sposób ilość komórek i białek zdolnych do przekraczania bariery krew-mózg16. Stan zapalny powoduje rozluźnienie połączeń ścisłych i indukuje ekspresję cząsteczek adhezyjnych; w ten sposób zwiększając migrację limfocytów do OUN 1,17,18.
Wynaczynienie przez barierę krew-mózg jest procesem wieloetapowym. Limfocyty łączą się z komórkami śródbłonka, a następnie toczą się wzdłuż śródbłonka w procesie, w którym pośredniczą głównie selektyny1,15. Następnie, interakcje między chemokinami wydzielanymi przez śródbłonek a odpowiednimi receptorami chemokiny wyrażonymi na limfocytach indukują zmiany konformacyjne integryn, promując w ten sposób mocne przyleganie do komórek śródbłonka1. Wreszcie, limfocyty albo pełzają wzdłuż bariery śródbłonka przed przepływem krwi przed transmigracją do przestrzeni okołonaczyniowej, albo zatrzymują się natychmiast i bezpośrednio transmigrują w miejscu mocnego zrostu1,19,20. Wszystkie te etapy wynaczynienia limfocytów mogą być analizowane in vitro przy użyciu różnych technik21. Mikroskopia filmów poklatkowych służy do badania początkowego tetheringu i zwijania15. Testy adhezji dostarczają szczegółowych informacji na temat mocnego zatrzymania barier śródbłonkowych22. Testy transmigracji, jak pokazano tutaj, umożliwiają analizę transmigracji komórek odpornościowych21,23,24,25,26,27,28,29.
Korzystając z modelu ludzkiej bariery krew-mózg in vitro, mogliśmy ostatnio pokazać, że wyższa zdolność migracyjna jasnych komórek CD16CD16 dim/- NK w porównaniu do ich odpowiednikówCD56 dimCD16+ została odzwierciedlona przez dominację tego podzbioru komórek NK w przedziale dokanałowym21. W związku z tym nasza konfiguracja eksperymentalna wydaje się być odpowiednia do naśladowania sytuacji in vivo.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>bez CaCl2 lub MgCl2</td></tr><tr><td>Fibronektyna 1 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td> z kolby do hodowli komórek T-25 <td>z osocza bydlęcego</td></tr><tr><td></td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Suplement na wzrost komórek śródbłonka</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>przezroczysty, średnica 6,5 mm, 3,0 & Mikro; m Rozmiar porów</td></tr><tr><td>96-dołkowa płaska płyta dolna</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>roztwór podstawowy: 1 g/50 ml PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x skoncentrowany</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płaska płytka dolna</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Liczba przepływów Fluorosfery</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios 10-kolorowy cytometr przepływowy</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>klon UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>klon N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>klon 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>klon RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>klon B9.11</td></tr></tbody></table>

analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Wynaczynienie limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) jest kluczowe dla nadzoru immunologicznego. Związane z chorobą zmiany wynaczynienia limfocytów mogą powodować zmiany patofizjologiczne w OUN. Dlatego badanie migracji limfocytów do OUN jest ważne dla zrozumienia zapalnych chorób OUN i opracowania nowych podejść terapeutycznych. W tym artykule przedstawiamy model in vitro ludzkiej bariery krew-mózg do badania wynaczynienia limfocytów. Ludzkie komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (HBMEC) są zlewnie hodowane na porowatej wkładce transwell z politereftalanu etylenu, aby naśladować śródbłonek bariery krew-mózg. Funkcja bariery jest potwierdzona za pomocą immunohistochemii zonula occludens, pomiarów przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) oraz analizy przenikania niebieskiego Evansa. Model ten umożliwia badanie diapedezy rzadkich podzbiorów limfocytów, takich jak CD56,jasneCD16dim/- komórki NK. Ponadto można badać wpływ innych komórek, cytokin i chemokin, zmian związanych z chorobą i różnych schematów leczenia na zdolność migracyjną limfocytów. Na koniec można przeanalizować wpływ bodźców zapalnych, a także różnych schematów leczenia na barierę śródbłonkową.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki obrazujące transmigrację subpopulacji komórek NK i limfocytów T z wykorzystaniem ludzkiego modelu bariery krew-mózg (Rycina 1A). Integralność monowarstwy HBMEC została potwierdzona poprzez barwienie cząsteczki białek połączeń ścisłych ZO-1, pomiary transendotelialnej oporności elektrycznej (TEER) oraz przenikanie błękitu Evansa (Rycina 1B). Po 3 - 4 dniach hodowli HBMEC wykazywały ekspresję białka połączeń ścisłych ZO-...

Tutaj opisujemy model ludzkiej bariery krew-mózg, umożliwiający badanie transmigracji limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego in vitro.

Analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Ogólnym celem tego testu transmigracji jest zbadanie ekstrawazacji limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego in vitro. Metoda ta może pomóc w pogłębieniu wiedzy na temat chorób zapalnych ośrodkowego układu nerwowego oraz w opracowaniu nowych podejść terapeutycznych. Do zalet tej techniki należą łatwa dostępność oraz możliwość analizy rzadkich populacji limfocytów na poziomie pojedynczych komórek.Metoda ta pozwala uzyskać wgląd w transmigrację limfocytów przez barierę krew-mózg i może być zastosowana w badaniach nad transmigracją przez barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy. Dodatkowo, w celu oceny szczelności modelu bariery krew-mózg, można przeprowadzić analizę przenikania błękitu Evansa. Należy rozpocząć od pokrycia dna kolby hodowlanej T-25 dwiema mililitrami świeżo przygotowanego roztworu fibronektyny i inkubacji przez co najmniej trzy godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2.Po zakończeniu inkubacji roztwór fibronekcyny należy zastąpić 7,2 × 10⁴ ludzkimi komórkami śródbłonka mikrokrążenia mózgowego (HBMEC) w 6 ml pełnej pożywki ECM-b, a następnie umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze. Po osiągnięciu przez HBMEC 80% konfluencji supernatant należy przenieść do 15-mililitrowej probówki stożkowej, a komórki przylegające przemyć trzykrotnie 5 ml PBS. Po trzecim przemyciu do komórek należy dodać 2 ml uprzednio ogrzanego roztworu Accutase na 2 minuty w temperaturze 37 °C.Następnie kilkukrotnie energicznie opukaj kolbę, potwierdzając odklejenie komórek za pomocą mikroskopii świetlnej. Gdy komórki zaczną odrywać się od dna kolby, użyj zebranego supernatantu do wielokrotnego przepłukania kolby, aż większość HBMEC zostanie zawieszona. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki stożkowej w celu odwirowania, a osad zawieś w 1 mililitrze świeżego medium ECM-b w celu policzenia komórek.Aby przygotować wkłady do hodowli komórkowej do testu transmigracji, najpierw należy dodać 100 µl roztworu fibronektyny do każdego wkładu oraz do jednego dołka 96-dołkowej płytki z płaskim dnem. Po trzech godzinach w temperaturze 37 °C roztwór fibronektyny należy zastąpić 100 µl HBMEC, a do dolnych komór wkładów do hodowli komórkowej dodać 600 µl świeżego medium ECM-b. Następnie płytki należy umieścić z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na trzy do czterech dni.Aby sprawdzić, czy osiągnięto szczelność bariery, odessać medium z dolnej i górnej komory jednego insertu do hodowli komórek, a następnie dodać do insertu 100 µL świeżo przygotowanego roztworu błękitu Evansa. Do dolnej komory dodać 600 µL PBS uzupełnionego o B27 i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Po jednej godzinie ostrożnie wyjąć insert za pomocą pęsety i przenieść 100 µL PBS B27 z dolnej komory do dwóch oddzielnych studni czarnej polistyrenowej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem.Następnie należy umieścić płytkę w wielofunkcyjnym czytniku mikropłytek i wyznaczyć optymalną pozycję z. Aby ocenić funkcję barierową HBMEC, należy zmierzyć ekscytację roztworu barwnika błękitu Evansa przy użyciu odpowiednich ustawień, a następnie porównać uzyskane dane z krzywą wzorcową obrazującą przenikanie błękitu Evansa przez HBMEC w różnych punktach czasowych po wysianiu. Po potwierdzeniu utworzenia monowarstwy komórek, próbkę mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) należy resuspendować do stężenia 5 × 10⁶ komórek/mL w medium RPMI uzupełnionym o B27.Następnie odessaj pożywkę z przedziałów dolnych i górnych odpowiedniej liczby wkładów do hodowli komórkowej zawierających konfluente monowarstwy HBMEC, a następnie dodaj 100 µL PBMC od jednego dawcy do wkładów do hodowli komórkowej oraz do jednego dołka płytki 24-dołkowej dla każdej kontroli in vitro. Dodaj 600 µL RPMI z dodatkiem B27 do przedziałów dolnych wkładów do hodowli komórkowej oraz 500 µL do dołków kontrolnych in vitro, a następnie umieść płytki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowej na sześć godzin. Po zakończeniu inkubacji za pomocą pęsety wyjmij wkłady do hodowli komórkowej, ostrożnie płucząc ich dna 400 µL PBS, nie dotykając membran.Następnie dokładnie wymieszaj 20 µL Flow-Count Fluorospheres z komórkami w studzienkach eksperymentalnych oraz kontrolnych in vitro, a następnie przenieś 1 mL otrzymanych zawiesin PBMC do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej. Odwirowuj komórki, a do każdej próbki dodaj przeciwciała sprzężone z fluorochromami w 100 µL buforu do cytometrii przepływowej. Po 30 minutach w temperaturze 4 °C przemyj komórki 250 µL świeżego buforu do cytometrii przepływowej i resuspenduj osady w odpowiedniej objętości buforu do cytometrii przepływowej w celu przeprowadzenia analizy.Po zebraniu wszystkich danych otwórz odpowiednie oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej. Aby przeanalizować transmigrację subpopulacji komórek NK, najpierw zaznacz limfocyty na wykresie rozrzutu bocznego względem przedniego (SSC vs FSC), a następnie wyświetl komórki na wykresie kropkowym CD3 względem CD56. Następnie zaznacz komórki NK CD56-dodatnie i CD3-ujemne.Aby rozróżnić podgrupy transmigrowanych komórek NK, wyświetl komórki na wykresie CD56 względem CD16 i wyznacz bramki dla komórek CD56bright, CD16dim lub negatywnych, oraz komórek CD56dim, CD16-dodatnich. Następnie wybierz kulki Flow-Count Fluorospheres z wykresu rozprosiania przedniego względem bocznego. Aby określić liczbę kulek, wyświetl wybrane dane na wykresie kanału obejmującego długość fali emisji między 525 a 700 nanometrów względem czasu.Na koniec wyznacz procent migrujących komórek NK jako stosunek całkowitej liczby komórek migrujących do całkowitej liczby komórek w kontroli in vitro. Po trzech do czterech dniach hodowli komórki HBMEC wykazują ekspresję cząsteczki połączeń ścisłych Zonula occludens-1 i rosną w monowarstwach, które charakteryzują się transendotelialną opornością elektryczną oraz zmniejszoną przenikalnością barwnika Evans blue. Stymulacja monowarstwy komórek śródbłonka interferonem gamma i TNF alpha przez 24 godziny przed przeprowadzeniem pełnego testu transmigracji PBMC prowadzi do zwiększonej migracji wszystkich analizowanych populacji limfocytów.Co ciekawe, komórki NK typu CD56bright, CD16dim lub CD16-ujemne wykazują wyższą zdolność migracyjną niż komórki NK typu CD56dim, CD16-dodatnie, zarówno w przypadku niepobudzonych, jak i aktywowanych cytokinami HBMEC. Chociaż względny wzrost transmigracji przez zapalną monowarstwę komórek jest ogólnie wyższy dla komórek CD56dim, co odzwierciedla obserwacje in vivo, według których komórki NK typu CD56bright, CD16dim-ujemne są wzbogacone w przestrzeni wewnątrzoponowej. Po opanowaniu tej techniki, procedurę można ukończyć w ciągu 10 godzin.Wstępna obróbka układu do transmigracji in vitro za pomocą interferonu gamma i TNF alfa umożliwia badanie migracji limfocytów w warunkach zapalnych. Nasz protokół można zmodyfikować poprzez zastosowanie sił ścinających lub kokultywację z innymi komórkami bariery krew-mózg, takimi jak astrocyty, aby stworzyć bardziej dopracowany model transmigracji limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat badania transmigracji limfocytów z wykorzystaniem modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg.

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film przedstawia eksperymentalne badanie transmigracji limfocytów przez model śródbłonka bariery krew-mózg (BBB). Monowarstwa komórek śródbłonka mikronaczyniowego ludzkiego mózgu (HBMEC) jest generowana in vitro, a komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) zawierające limfocyty są dodawane do monowarstwy. Komórki są następnie inkubowane, aby umożliwić transmigrację limfocytów, a migrowane komórki są oznaczane ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej.

Badanie migracji limfocytów przez monowarstwę komórek śródbłonka mikronaczyniowego

Stworzenie ludzkich modeli bariery krew-mózg (BBB) może przynieść korzyści badaniom nad chorobami mózgu związanymi z niewydolnością bariery krew-mózg. Opisujemy tutaj ulepszoną technikę przygotowania kontaktowego modelu BBB, która umożliwia kokulturację ludzkich astrocytów i komórek śródbłonka mózgu po przeciwnych stronach porowatej błony.

Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

Tutaj opisujemy mysi model bariery krew-mózg in vitro, który wykorzystuje impedancję spektroskopii komórek, koncentrując się na konsekwencjach dla integralności i przepuszczalności komórek śródbłonka po interakcji z aktywowanymi limfocytami T.

Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

Tutaj demonstrujemy metody ilościowego oznaczania in vivo wyjścia leukocytów z naiwnej, zapalnej i złośliwej skóry myszy. Przeprowadzamy bezpośrednie porównanie dwóch modeli: transdermalnej aplikacji FITC i fotokonwersji in situ. Ponadto wykazujemy przydatność fotokonwersji do śledzenia wychodzenia leukocytów z guzów skóry.

Kwantyfikacja wychodzenia leukocytów przez naczynia limfatyczne z mysiej skóry i guzów

Prezentujemy test fluorescencyjny, aby wykazać, że Lucyfer Żółty (LY) jest solidnym markerem do określenia pozornej przepuszczalności parakomórkowej monowarstw komórek hCMEC/D3, modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg. Użyliśmy tego testu do określenia kinetyki konfluentnego tworzenia się monowarstwy w hodowanych komórkach hCMEC / D3.

Lucyfer Żółty - solidny marker przepuszczalności parakomórkowej w modelu komórkowym ludzkiej bariery krew-mózg

Tutaj prezentujemy protokoły do badania upośledzenia jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia in vivo. W szczególności zajmujemy się tym, jak określić przepuszczalność bariery krew-mózg i aktywność żelatynazy zaangażowaną w migrację leukocytów przez limity gleju.

Wizualizacja upośledzenia barier śródbłonkowych i glejowych jednostki nerwowo-naczyniowej podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia mięśniowego in vivo

W tym protokole, limfocyty są umieszczane w górnej komorze systemu transmigracyjnego, oddzielone od dolnej komory porowatą błoną. Do dolnej komory dodaje się chemokinę, która indukuje aktywną migrację wzdłuż gradientu chemokin. Po 48 godzinach limfocyty są liczone w obu komorach w celu ilościowego określenia transmigracji.

Ocena migracji limfocytów w systemie transmigracji ex vivo

Ten manuskrypt przedstawia protokół indukcji aktywnego eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia (EAE) u myszy. Przedstawiono również metodę izolacji i charakterystyki naciekających limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), aby pokazać, w jaki sposób limfocyty są zaangażowane w rozwój choroby autoimmunologicznej OUN.

Analiza cytometryczna przepływowa nacieku limfocytów w ośrodkowym układzie nerwowym podczas eksperymentalnego autoimmunologicznego zapalenia mózgu i rdzenia kręgowego

Tutaj opisujemy protokół, rozszerzoną metodę hodowli komórek śródbłonka (EECM), która umożliwia różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do komórek mikronaczyniowych śródbłonka mózgu (BMEC). Komórki te wykazują ekspresję cząsteczki adhezyjnej komórek śródbłonka, a zatem są modelem bariery krew-mózg odpowiednim do badania interakcji komórek odpornościowych in vitro.

Różnicowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych do komórek podobnych do mikronaczyń śródbłonka mózgu o dojrzałym fenotypie immunologicznym

Ten raport zawiera protokoły montażu, hodowli komórek i testów na platformie μSiM do budowy modeli bariery krew-mózg.

Wykorzystanie platformy tkankowej bariery mikroSiM (μSiM) do modelowania bariery krew-mózg

Opracowano metodę wizualizacji wynaczynienia barwnika z powodu uszkodzenia bariery krew-mózg (BBB) poprzez podanie myszom dwóch barwników fluorescencyjnych w różnych punktach czasowych. Zastosowanie glicerolu jako krioprotektantu ułatwiło immunohistochemię na tej samej próbce.

Ocena przełamania bariery krew-mózg w mysim modelu łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu

Poznaj metodę analizy wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów zapalnych chorób OUN oraz rozwój nowych strategii terapeutycznych.

Analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg

Przeglądaj więcej filmów