Analiza wynaczynienia limfocytów przy użyciu modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg

Ogólnym celem tego testu transmigracji jest zbadanie wynaczynienia limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego in vitro. Metoda ta może pomóc w pogłębieniu naszej wiedzy na temat chorób zapalnych ośrodkowego układu nerwowego oraz w opracowaniu nowych podejść terapeutycznych. Jedną z zalet tej techniki jest to, że jest łatwo dostępna i umożliwia analizę rzadkich populacji limfocytów na poziomie pojedynczej komórki.

Metoda ta może dostarczyć informacji na temat transmigracji limfocytów przez barierę krew-mózg i może być zastosowana do badania transmigracji przez barierę krew-płyn mózgowo-rdzeniowy. Ponadto można przeprowadzić analizę przenikania niebieskiego Evansa w celu oceny integralności modelu bariery krew-mózg. Zacznij od przykrycia dna kolby do hodowli komórkowej T-25 dwoma mililitrami świeżo przygotowanego roztworu fibronektyny na co najmniej trzygodzinną inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Pod koniec inkubacji zastąp roztwór fibronektyny roztworem 7,2 razy 10 do czwartej ludzkiej komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu lub HBMEC, w sześciu mililitrach kompletnej pożywki ECM-b i włóż kolbę z powrotem do inkubatora. Gdy HBMEC osiągnie 80% konfluencję, przenieś supernatant do 15-mililitrowej stożkowej probówki i przemyj przylegające komórki trzykrotnie pięcioma mililitrami PBS. Po trzecim praniu dodaj dwa mililitry podgrzanego roztworu Accutase do komórek na dwie minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie kilkakrotnie mocno postukaj w kolbę, potwierdzając oderwanie komórek za pomocą mikroskopii świetlnej. Gdy komórki zaczną podnosić się z dna kolby, należy użyć zebranego supernatantu do wielokrotnego przepłukania kolby, aż większość HBMEC zostanie ponownie zawieszona. Następnie przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki w celu odwirowania i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze świeżej pożywki ECM-b do liczenia.

Aby przygotować wkładki do hodowli komórkowych do testu transmigracji, najpierw dodaj 100 mikrolitrów roztworu fibronektyny do każdej wkładki i do jednego dołka 96-dołkowej płytki o płaskim dnie. Po trzech godzinach w temperaturze 37 stopni Celsjusza zastąp roztwór fibronektyny 100 mikrolitrami HBMEC i dodaj 600 mikrolitrów świeżej pożywki ECM-b do dolnych komór wkładek do hodowli komórkowych. Następnie umieść płytki z powrotem w inkubatorze kultur komórkowych na trzy do czterech dni.

Aby sprawdzić, czy osiągnięto integralność bariery, należy odessać pożywkę z dolnej i górnej komory jednej wkładki do hodowli komórkowej i dodać do niej 100 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu niebieskiego Evansa. Dodać 600 mikrolitrów PBS uzupełnionego witaminą B27 do dolnej komory i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Po godzinie ostrożnie wyjmij wkładkę za pomocą kleszczy i przenieś 100 mikrolitrów PBS B27 z dolnej komory do dwóch pojedynczych dołków czarnej, polistyrolowej, 96-dołkowej płaskiej płyty dennej.

Następnie załaduj płytkę do wielomodowego czytnika mikropłytek i określ optymalną pozycję z. Aby określić funkcję bariery HBMEC, zmierz wzbudzenie roztworu niebieskiego barwnika Evansa przy użyciu odpowiednich ustawień i porównaj uzyskane dane ze standardową krzywą przedstawiającą przenikanie niebieskiego barwnika Evansa przez HBMEC w różnych punktach czasowych po wysiewie. Po potwierdzeniu powstania monowarstwy komórki, ponownie zawieś jednojądrzastą komórkę krwi obwodowej lub PBMC próbkę do stężenia pięć razy 10 do szóstych komórek na mililitr w pożywce RPMI uzupełnionej witaminą B27.

Następnie odessać pożywkę z dolnych i górnych komór odpowiedniej liczby wkładek do hodowli komórkowych zawierających zlewające się monowarstwy HBMEC i dodać 100 mikrolitrów PBMC na dawcę do wkładek do hodowli komórkowych i do jednego dołka 24-dołkowej płytki na kontrolę in vitro. Dodać 600 mikrolitrów RPMI plus B27 do dolnych komór wkładek do hodowli komórkowych i 500 mikrolitrów do studzienek kontrolnych in vitro i umieścić płytki z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na sześć godzin. Pod koniec inkubacji za pomocą kleszczy usuń wkładki z kultur komórkowych, ostrożnie spłukując dno 400 mikrolitrami PBS bez dotykania błon

Następnie dokładnie wymieszaj 20 mikrolitrów fluorosfer zliczających przepływ z komórkami w studzienkach doświadczalnych i kontrolnych in vitro i przenieś jeden mililitr powstałych zawiesin PBMC do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej. Zebrać komórki przez odwirowanie i dodać do każdej próbki przeciwciała sprzężone z fluorochromem w 100 mikrolitrach buforu cytometrii przepływowej. Po 30 minutach w temperaturze czterech stopni Celsjusza umyć komórki 250 mikrolitrami świeżego buforu cytometrii przepływowej i ponownie zawiesić granulki w odpowiedniej objętości buforu cytometrii przepływowej do analizy.

Po uzyskaniu wszystkich danych otwórz odpowiednie oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej. Aby przeanalizować transmigrację podzbioru komórek NK, najpierw wybierz limfocyty na wykresie kanału rozproszonego bocznego i do przodu, a następnie wyświetl komórki na wykresie punktowym CD3 i CD56. Następnie wybierz CD56-dodatnie, CD3-ujemne komórki NK.

Aby rozróżnić transmigrowane podzbiory komórek NK, wyświetl komórki na wykresie CD56 i CD16 i bramie dla komórek CD56bright, CD16dim lub ujemnych oraz CD56dim, CD16-dodatnich. Następnie wybierz fluorosfery zliczające przepływ z wykresu rozproszenia do przodu i z boku. Aby określić liczbę kulek, wyświetl wybrane dane na wykresie kanału obejmującym długość fali emisji od 525 do 700 nanometrów w funkcji czasu.

Na koniec określ procent migrowanych komórek NK jako stosunek całkowitej liczby migrowanych komórek do całkowitej liczby komórek w kontroli in vitro. Po trzech do czterech dniach hodowli, HBMEC eksprymował cząsteczkę ścisłego połączenia Zonula occludens-1 i rósł w monowarstwach, które wykazują transśródbłonkowy opór elektryczny i zmniejszone przenikanie niebieskiego barwnika Evansa. Stymulacja monowarstwy komórek śródbłonka interferonem gamma i TNF alfa przez 24 godziny przed testem transmigracji całego PBMC powoduje zwiększoną migrację wszystkich analizowanych populacji limfocytów.

Co ciekawe, komórki NK CD56bright, CD16dim lub ujemne wykazują wyższą zdolność migracji niż CD56dim, CD16-dodatnie NK zarówno w niestymulowanym, jak i aktywowanym cytokinami HBMEC. Chociaż względny wzrost transmigracji przez monowarstwę komórkową objętą stanem zapalnym jest wyższy dla komórek CD56dim ogółem, naśladując obserwacje in vivo, że CD56bright, CD16dim-ujemne komórki NK są wzbogacone w przedziale śródoponowym. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu 10 godzin.

Wstępne traktowanie układu transmigracji in vitro interferonem gamma i TNF alfa umożliwia badanie migracji limfocytów w warunkach zapalnych. Nasz protokół może być modyfikowany przez zastosowanie sił ścinających lub przez współhodowlę z innymi komórkami bariery krew-mózg, takimi jak astrocyty, aby zapewnić wyrafinowany model transmigracji limfocytów do ośrodkowego układu nerwowego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak badać transmigrację limfocytów za pomocą modelu in vitro ludzkiej bariery krew-mózg.