Name: Przedłużona inkubacja ostrej tkanki neuronalnej do elektrofizjologii i obrazowania wapnia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Poznaj metodę przedłużonej inkubacji ostrej tkanki neuronalnej do elektrofizjologii i obrazowania wapnia. Technika ta utrzymuje żywotność tkanek powyżej 24 godzin, zmniejszając liczbę zwierząt potrzebnych do badań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Colinowi Symonsowi i Jamesowi Wrightowi za pomoc techniczną. Prace te zostały wsparte grantem zalążkowym (WSU) dla Y.B. oraz biurem innowacji na Western Sydney University. M.C. jest wspierany przez stypendium ARC (DECRA).

Poniższy protokół opisuje przygotowanie tkanki neuronalnej myszy C57BL/6 i C3H/He (zwyrodniałej siatkówki), ale podobne techniki można zastosować do innych gatunków. Wszystkie zwierzęta były zdrowe i traktowane w standardowych warunkach temperatury, wilgotności, 12-godzinnego cyklu światło/ciemność, swobodny dostęp do pożywienia i wody oraz bez zamierzonych bodźców stresowych. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z komisją ds. opieki nad zwierzętami i etyki Uniwersytetu Western Sydney oraz zgodnie z wytycznymi dotyczącymi użytkowania i pielęgnacji zwierząt (Animal Research Authority #A9452, #A10396 i #A8967).
1. Przygotowanie plastra mózgu
<ol>
	<li>Znieczulić zwierzę przez wdychanie izofluranu (5%) i odciąć głowę za pomocą gilotyny dla gryzoni. Usuń mózg szybko, jak opisano wcześniej9 i umieść go w lodowatym roztworze fizjologicznym (aCSF) zawierającym (w mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1 MgCl2, 1,25 NaH2PO4, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 dekstroza i nasycone karbogenem (95% mieszaniny O2/5% CO2; 310 mOsm; pH 7,4).</li>
	<li>Wytnij plastry mózgu w obszarze zainteresowania o grubości 300 μm za pomocą wibrującego mikrotomu.</li>
	<li>Przenieś plastry do specjalnie zbudowanego systemu inkubacji, który ściśle monitoruje i kontroluje poziom pH (pH 7,2 - 7,4), przepływ karbogenu i temperaturę, jak opisano wcześniej10,11.</li>
	<li>Ustaw początkową temperaturę komory na 35 °C na 15 - 30 minut, a następnie powoli zmniejszaj do 15 - 16 °C, jak pokazano na rysunku 1C. Następnie inkubuj plastry w systemie inkubacji, aż będą potrzebne, do elektrofizjologii lub obrazowania. 
	UWAGA: Jeśli plastry mają być używane do obrazowania wapnia, wykonaj poniższe czynności przed schłodzeniem tkanki poniżej RT.</li>
</ol>
2. Przygotowanie całej siatkówki i usunięcie wewnętrznej błony ograniczającej
<ol>
	<li>Przygotuj całe cewki siatkówki w normalnych warunkach oświetlenia laboratoryjnego lub w słabym świetle czerwonym/podczerwonym.</li>
	<li>Poddać zwierzę eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy i natychmiast wyłuszczyć oczy. Wykonaj małe nacięcie wzdłuż ora serrata i umieść w pożywce Amesa lub CSF zawierającym (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 glukozy, 0,5 L-glutaminy i nasącz karbogenem (mieszanina 95% O2/5% CO2; ~300 mOsm; pH 7,4), w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Natychmiast usuń rogówkę, soczewkę i ciało szkliste, przecinając wzdłuż ora serrata małymi nożyczkami i usuwając soczewkę i ciało szkliste za pomocą kleszczy. Umieścić tkankę w systemie inkubacji w RT. 
	UWAGA: Tkanka siatkówki może być przechowywana w muszli ocznej, po powolnym obniżeniu temperatury do 15 - 16 °C, przez >24 godziny w systemie inkubacji, aż będzie potrzebna.</li>
	<li>Aby usunąć ILM, przenieś muszlę oczną zawierającą siatkówkę do małego szklanego słoika zawierającego 30 U/ml papainy, 1 mM L-cystyny, 0,5 mM EDTA i 0,005% DNazy w roztworze soli Earl's Balanced (BSS) w temperaturze 37 °C przez 20 minut. Nałóż 95% O2/5% CO2 na roztwór przez pokrywkę, ale nie bąbelkuj. W przypadku stosowania tkanek pochodzących od młodych zwierząt (<6 tygodni) roztwór należy rozcieńczyć do połowy mocy.
	<ol>
		<li>Zatrzymaj trawienie enzymatyczne, umieszczając tkankę w roztworze ovomukoid (10 mg/ml) i BSA (10 mg/ml) na 10 minut w Earl's BSS. Przed przeniesieniem do systemu inkubacji dokładnie umyć tkankę płynem mózgowo-rdzeniowym i obniżyć temperaturę do 15 - 16 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Utrzymuj tkankę siatkówki w muszli ocznej, aż będzie potrzebna. W celu przeniesienia do mikroskopu odizoluj siatkówkę od muszli ocznej i pokrój na 4 części żyletką. Jeśli wymagana jest cała siatkówka, wykonaj cztery małe nacięcia na obrzeżach siatkówki, aby mogła leżeć płasko. 
	UWAGA: W przypadku eksperymentów obrazowych, przed przeniesieniem do systemu inkubacji należy obciążyć barwnikami wapniowymi, patrz poniżej.</li>
</ol>
3. Utrzymanie tkanki w inkubatorze
<ol>
	<li>Umieść tkankę w głównej komorze zawierającej sondy do pomiarów pH i temperatury (rysunek 1A, B).</li>
	<li>Cyrkuluj CSF przez drugą komorę (komorę UVC, zbudowaną zgodnie z wcześniejszym opisem12) odizolowaną od głównej komory i wystawioną na działanie światła UVC o mocy 1,1 W (254 nm, lampa UV sterylizatora 5W/2P) w celu wypromieniowania bakterii unoszących się w roztworze (Rysunek 1A). Kontroluj czas światła UVC za pomocą programowalnego timera za pomocą losowej funkcji, która włącza się w godzinach wahających się od 15 do 26 minut co 15 - 30 minut, aby uniknąć nadmiernego nagrzewania się aCSF.</li>
	<li>Ustaw natężenie przepływu w komorze UVC na 12 ml/min, jak wcześniej raportowano12. Przykryj komorę UVC folią aluminiową, aby zapobiec świeceniu UVC na zewnątrz komory, które może uszkodzić tkankę neuronalną. 
	UWAGA: W przypadku tkanki siatkówki przystosowanej do ciemności nałóż niestandardową osłonę na główną komorę, aby wykluczyć światło.</li>
	<li>Za pomocą pompy perystaltycznej należy przeprowadzić cyrkulację roztworu (aCSF) przez dwie komory oraz termoelektrycznej chłodnicy z zimną płytą Peltiera w celu schłodzenia lub ogrzania komory głównej do żądanych temperatur w zakresie 0 - 50 °C. Aby uzyskać optymalną inkubację tkanek, należy stosować temperaturę 15 - 16 °C dla długoterminowej żywotności.</li>
</ol>
4. Ładowanie barwnika wapniowego
<ol>
	<li>Wybierz barwniki wapniowe w oparciu o preferencje indywidualnego badacza. Tutaj używamy Fura-2AM, Fluo-8AM lub Fluo-4AM. Jednak metodę tę można zastosować również do innych barwników: rozpuścić barwniki wapniowe w DMSO do roztworu 1 mM i 1% kopolimerów blokowych (np. kwasu pluronowego-127) do końcowej objętości 50 μL i sonikować przez 10 min.</li>
	<li>Dodać roztwór do aCSF do końcowego stężenia 10 μM, 0,01% kopolimerów blokowych dla plasterków mózgu i 20 μM (siatkówka), 0,02% kopolimerów blokowych dla siatkówki. W siatkówkach (leczonych papainą) i wycinkach mózgu młodych zwierząt załadować do kąpieli na 45 minut w temperaturze 37 °C (Fura-2 AM) lub w temperaturze RT (Fluo-4 AM; Fluo-8 rano).
	<ol>
		<li>W przypadku dorosłych zwierząt (>12 tygodni) pipetować barwniki (50 μl) bezpośrednio na wycinki mózgu i utrzymywać przez 75 minut, aby umożliwić lepszą penetrację barwnika do głębokich warstw.</li>
		<li>Aby zapewnić odpowiednie natlenienie zanurzonego plastra podczas inkubacji barwnika, należy przygotować szklaną komorę załadowczą z zamkniętą pokrywką (okrągły słoik o średnicy 2,5 cm, wysokości 3,5 cm) z barwnikami wapniowymi rozcieńczonymi w 2,5 ml aCSF. Natleniać w sposób ciągły 95% O2/5% CO2 . Nie bąbelkuj.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po załadowaniu barwnikiem przemyć tkankę płynem CSF i przenieść do systemu inkubacji, powoli zmniejszać temperaturę do 15 - 16 °C aż do użycia eksperymentalnego.</li>
</ol>
5. Zapisy elektrofizjologiczne i obrazowanie
<ol>
	<li>Umieścić tkankę w zanurzonej komorze rejestracyjnej pod mikroskopem i perfuzjonować natlenionym aCSF z szybkością przepływu 4 - 5 ml / min w temperaturze RT (~ 22 °C) lub fizjologicznej (~ 35 °C). Przytrzymaj tkankę na miejscu za pomocą specjalnie wykonanej "harfy", wykonanej z nylonowych lub złotych nici rozciągniętych i przyklejonych do kawałka złotego lub platynowego drutu w kształcie litery U.</li>
	<li>Dla elektrofizjologii:
	<ol>
		<li>Przygotuj pipety rejestrujące ze szkła borokrzemianowego 1,5 mm (1,19 mm ID) za pomocą ściągacza do mikropipet, aby uzyskać rezystancję końcową 5-6 MΩ.</li>
		<li>Napełnij pipetę 3 - 4 μl roztworu wewnętrznego, jak opisano wcześniej13 i zwizualizuj komórki w podczerwieni z kontrastem różnicowym zakłóceń (IR-DIC) za pomocą kamery CCD. Roztwór wewnątrzkomórkowy powinien być starannie dostosowany do każdego eksperymentu, aby osiągnąć wyniki eksperymentalne.</li>
		<li>Umieść pipetę, utrzymując nadciśnienie przyłożone przez port ssący na uchwycie pipety, na membranie komórki za pomocą mikromanipulatora. Ponieważ ILM został usunięty z siatkówki, nie jest wymagane wcześniejsze skrobanie błony. Gdy pipeta znajdzie się na kuwecie, zastosuj delikatne podciśnienie do pipety, aby uzyskać gigaomowe uszczelnienie. Następnie rozerwij błonę komórkową za pomocą krótkiego podciśnienia.</li>
		<li>Wykonaj zapisy cęgów prądowych lub napięciowych całego ogniwa przy użyciu standardowych technik, w zależności od potrzeb.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie wapnia:
	<ol>
		<li>Do obrazowania ratiometrycznego Fura-2 należy użyć ultraszybkiego przełącznika długości fali, aby zapewnić długości fal wzbudzenia 340 nm i 380 nm. Przepuszczaj światło emitowane z poszczególnych komórek przez filtr emisyjny 510 ±20 nm i rejestruj je za pomocą szybkiej kamery cyfrowej o wysokiej czułości.</li>
		<li>Dla pojedynczej długości fali wzbudzenia Fluo-4 należy przefiltrować światło wzbudzenia przez filtr pasmowy 460 - 490 nm i wyemitować światło przez filtr pasmowo-przepustowy 515 - 550 nm. Aby uzyskać najszybsze i najbardziej czułe nagrywanie, użyj szybkiej kamery cyfrowej, takiej jak. Uzyskaj obrazy zgodnie z wymaganiami.</li>
		<li>Zmierz zmiany fluorescencji w funkcji czasu albo dla pojedynczej długości fali (Fluo-4), albo przy użyciu metody stosunku długości fali (Fura-2), jak opisano wcześniej8,14.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Colbert, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cortical+brain+slices+for+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+mol+biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording.</a> Meth mol biol. 337, Clifton, N.J. 117-125 (2006).</li>
<li>Gibb, A., Edwards, F. <a target="_blank" href="http://www.utdallas.edu/~tres/microelectrode/microelectrodes_ch10.pdf">Patch clamp recording from cells in sliced tissues.</a> Microelect Techniq. , 255-274 (1994).</li>
<li>Kantevari, S., Buskila, Y., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+cell-permeant+6-nitrodibenzofuranyl-caged+IP3%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+photobiol+sci%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of cell-permeant 6-nitrodibenzofuranyl-caged IP3.</a> Photochem photobiol sci. 11 (3), 508-513 (2012).</li>
<li>Blankenship, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+and+Extrasynaptic+Factors+Governing+Glutamatergic+Retinal+Waves%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic and Extrasynaptic Factors Governing Glutamatergic Retinal Waves.</a> Neuron. 62 (2), 230-241 (2009).</li>
<li>Sargoy, A., Barnes, S., Brecha, N. C., Perez De Sevilla Muller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+Calcium+Imaging+Methods+in+Wholemount+Rat+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and Calcium Imaging Methods in Wholemount Rat Retina.</a> J Vis Exp. (92), e51396(2014).</li>
<li>Kulkarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Ca2%2B+dynamics+in+cone+photoreceptor+axon+terminals+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Imaging Ca2+ dynamics in cone photoreceptor axon terminals of the mouse retina.</a> J Vis Exp. (99), e52588(2015).</li>
<li>Velte, T. J., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials+in+the+dendrites+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Action potentials in the dendrites of retinal ganglion cells.</a> J neurophysiol. 81 (3), 1412-1417 (1999).</li>
<li>Cameron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+AM+dyes+following+prolonged+incubation+in+acute+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of AM dyes following prolonged incubation in acute neuronal tissue.</a> PLoS ONE. 11 (5), (2016).</li>
<li>Buskila, Y., Morley, J. W., Tapson, J., van Schaik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adaptation+of+spike+backpropagation+delays+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The adaptation of spike backpropagation delays in cortical neurons.</a> Front Cell Neurosci. 7, (2013).</li>
<li>Breen, P. P., Buskila, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braincubator%3A+An+incubation+system+to+extend+brain+slice+lifespan+for+use+in+neurophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Braincubator: An incubation system to extend brain slice lifespan for use in neurophysiology.</a> Eng Med Biol Soc. , 4864-4867 (2014).</li>
<li>Buskila, Y., Breen, P., Wright, J. Device for storing a tissue sample. WIPO Patent. , WO2015021513A1 (2015).</li>
<li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+viability+of+acute+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Extending the viability of acute brain slices.</a> Sci Rep. 4, 4-10 (2014).</li>
<li>Buskila, Y., Farkash, S., Hershfinkel, M., Amitai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reactive+nitric+oxide+production+by+astrocytes+in+mouse+neocortical+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Rapid and reactive nitric oxide production by astrocytes in mouse neocortical slices.</a> Glia. 52 (3), 169-176 (2005).</li>
<li>Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+cortical+neurons+using+Fura-2+AM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM.</a> J Vis Exp. (23), e3-e5 (2009).</li>
<li>Buskila, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Astrocytic+Nitric+Oxide+Production+and+Neuronal+Modifications+in+the+Neocortex+of+a+NOS2+Mutant+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Enhanced Astrocytic Nitric Oxide Production and Neuronal Modifications in the Neocortex of a NOS2 Mutant Mouse.</a> PLoS ONE. 2 (9), 9(2007).</li>
<li>Russell, W. M. S., Burch, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRussell%2C+WMS+%22The+Principles+of+Humane+Experimental+Technique%22">The Principles of Humane Experimental Technique</a>. , Methuen. London, UK. (1959).</li>
</ol>

Yossi Buskila i Paul Breen deklarują, że są współwłaścicielami PAYO Scientific Pty Ltd, firmy specjalizującej się w budowie systemów inkubacji dla ostrej tkanki nerwowej. Wszyscy pozostali autorzy nie zgłaszają żadnych interesów finansowych ani potencjalnych konfliktów interesów związanych z obecnym badaniem.

W artykule opisano metodę inkubacji mającą na celu przedłużenie żywotności ostrej tkanki neuronalnej do obrazowania i eksperymentów elektrofizjologicznych, zmniejszając w ten sposób liczbę zwierząt potrzebnych do realizacji celów eksperymentalnych. Dwa główne procesy regulują degradację tkanki neuronalnej w czasie: i) zwiększony poziom bakterii i towarzyszący mu wzrost uwalnianej endotoksyny bakteryjnej oraz ii) ekscytotoksyczność, która następuje po traumatycznej procedurze krojenia10. Ponieważ o...

Elektrofizjologia i obrazowanie funkcjonalne (wapń, barwniki wrażliwe na napięcie) to dwie najczęściej używane techniki eksperymentalne w neurobiologii. Preparaty do wycinków mózgu i cała masa siatkówki, które zostaną tutaj zbadane, zapewniają środki do badania właściwości elektrofizjologicznych i połączeń synaptycznych bez zanieczyszczenia środkami znieczulającymi lub zwiotczającymi mięśnie. Wycinki mózgu i cała siatkówka zachowują swoją integralność strukturalną, w przeciwieństwie do kultur lub homogenatów komórkowych, co pozwala na badanie określonych obwodów i sieci mózgowych1. Zapisy z izolowanej tkanki mają przewagę nad zapisami in vivo, ponieważ eliminowane są ruchy związane z biciem serca i oddychaniem. Co więcej, bezpośrednia wizualizacja pozwala na celowanie w określone klasy komórek i lokalne zastosowanie narzędzi farmakologicznych 2,3.
Zapisy patch-clamp i ładowanie barwnikiem wapniowym w całym siatkówce jest skomplikowane ze względu na istnienie wewnętrznej błony ograniczającej (ILM), która zakrywa warstwę komórek zwojowych siatkówki (RGC) i uniemożliwia bezpośredni dostęp do komórek. Zazwyczaj membrana ta jest zeskrobywana szklaną pipetą, aby umożliwić bezpośrednie nałożenie pipety krosowej i utworzenie gigaomowej uszczelki na pojedynczej komórce. Ponadto, barwniki wapniowe stosowane w kąpieli nie przenikają przez ILM i muszą być albo wstrzykiwane pod tę membranę4, transportowane wstecznie po wstrzyknięciu do nerwu wzrokowego5, albo elektroporowane przez tissue6. Ponadto, przy użyciu modelu barwnikowego zwyrodnienia siatkówki u gryzoni, myszy rd/rd, ILM jest grubszy i bardziej nieprzepuszczalny. W tym przypadku używamy techniki usuwania ILM za pomocą trawienia enzymatycznego7, aby umożliwić zarówno wszechobecne ładowanie barwnikiem wapniowym, jak i bezpośredni dostęp do komórek zwojowych siatkówki w celu nagrań patch-clamps8.
Udane nagrania zarówno z wycinków mózgu, jak i całego siatkówki zależą od sekcji i inkubacji żywotnej tkanki neuronalnej. Zazwyczaj tkanka jest pobierana rano w dniu eksperymentu i inkubowana w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF) do momentu wykorzystania jej do nagrań. Zwykle tkanka pozostaje żywotna przez 6 - 8 godzin, ze znaczną degradacją po tym oknie czasowym. Jednak zarówno wycinki mózgu, jak i preparaty całych siatkówk zwykle wytwarzają więcej tkanki, niż można zarejestrować w tym krótkim czasie. W związku z tym tkanka jest często wyrzucana pod koniec dnia, a sekcja jest ponownie zakończona w kolejnych dniach. Oznacza to, że wykorzystywane jest inne zwierzę i powtarzane jest ~2 godziny ustawiania i preparowania/barwienia. Poniższy protokół opisuje metodę przedłużania życia tkanki neuronalnej o ponad 24 godziny, co oznacza, że wykorzystuje się mniej zwierząt i dostępnych jest więcej czasu na eksperymenty. Żywotność tkanek oceniano poprzez rejestrację właściwości elektrofizjologicznych i dynamiki wapnia, a właściwości te były nie do odróżnienia między <4 godzinami a >24 godzinami po sekcji.
Te wyniki wskazują, że nie tylko właściwości pojedynczej komórki są nienaruszone i funkcjonalne po długotrwałej inkubacji, ale aktywność sieci, oceniana za pomocą obrazowania wapniowego i zapisów elektrofizjologicznych, pozostaje niezmieniona >24 godziny po sekcji. Co więcej, wykazaliśmy, że barwniki wapniowe mogą pozostawać w komórkach przez dłuższy czas, nie powodując żadnych szkodliwych skutków. Zastosowanie tego protokołu pokazuje, że aktywność funkcjonalna neuronów w ostrej tkance neuronalnej może być utrzymywana przez długi czas, gdy środowisko zewnętrzne jest wysoce regulowane. Co więcej, ponieważ żywotność tkanek różni się znacznie w zależności od laboratoriów ze względu na różne protokoły inkubacji, metoda ta ustanawia złoty standard dla idealnych parametrów, które należy zastosować w celu zmniejszenia zmienności stanu zdrowia ostrej tkanki neuronalnej.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich VETEC</td><td>V800372</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>N-metylo-D-glukamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2004&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9272&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>System dysocjacji papainy</td><td>Worthington&nbsp;</td><td></td><td></td>LK003150</tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek bezwodny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 Niska absorbancja UV*</td><td>Technologie życia</td><td>P-6867</td><td>20% roztwór w DMSO&nbsp;</td></tr><tr><td>Fura-2 AM&nbsp; &nbsp;</td><td>Anaspec</td><td>84017</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM&nbsp; &nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>F23917</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 AM</td><td>Abcam</td><td>Ab142773</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom z ostrzem wibracyjnym&nbsp;</td><td>Leica Biosystem</td><td>VT1200 S</td><td>wyposażony w Leica' s Vibrocheck&handel; urządzenie pomiarowe&nbsp;</td></tr><tr><td>Stół antywibracyjny</td><td>Kinetic Systems Vibraplane&nbsp;</td><td>Wibrator 9100/9200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy stolikowy</td><td>Olympus</td><td>BX51WI&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopowy</td><td>Olympus</td><td>XLUMPlanFLN 20x/1.00w</td><td>20X&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop Obiektyw</td><td>Olympus</td><td>LUMPlanFLN 60x/1.00w</td><td>60X</td></tr><tr><td>CCD Kamera</td><td>Andor</td><td>Ixon +</td><td></td></tr> <tr><td>Szybki przełącznik długości fal</td><td>Instrument</td><td>Sutter Lambda DG-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz z zaciskiem krosowym</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>MultiClamp 700B</td><td></td></tr><tr><td>System akwizycji danych</td><td>Urządzenia molekularne</td><td>Digidata 1440A</td><td>Axon Digidata&reg; System</td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>BF150-86-10</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz mikroelektrod</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td>Ściągacz do mikropipet typu płomieniowego/brązowego</td></tr><tr><td>Komora nagrywająca/perfuzyjna</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-40LP</td><td>Niskoprofilowe otwarte komory kąpielowe</td></tr><tr><td></td><td>Oprogramowanie Urządzenia molekularne</td><td>pClamp 10.2</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania komórek na żywo Andor iQ</td> Braincubator <td>Andor</td><td>Andor iQ3</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Payo Scientific BR26021976</td><td></td><td>www.braincubator.com.au</td></tr><tr><td>Termoelektryczna chłodnica z zimną płytą Peltiera</td><td>TE Technology</td><td>CP-121</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>TE Technology</td><td>TC-36-25 RS232</td><td></td></tr></tbody></table>

przedłużona inkubacja ostrej tkanki neuronalnej do elektrofizjologii i obrazowania wapnia

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Ostre preparaty tkanki nerwowej, wycinki mózgu i całe retinal, zwykle mogą być utrzymywane tylko przez 6 - 8 godzin po sekcji. Ogranicza to czas eksperymentu i zwiększa liczbę zwierząt, które są wykorzystywane w jednym badaniu. To ograniczenie dotyczy w szczególności protokołów, takich jak obrazowanie wapnia, które wymagają długotrwałej wstępnej inkubacji z barwnikami nakładanymi w kąpieli. Wykładniczy wzrost bakterii w ciągu 3 - 4 godzin po pokrojeniu jest ściśle skorelowany z pogorszeniem zdrowia tkanek. W pracy opisano metodę ograniczania namnażania się bakterii w ostrych preparatach w celu utrzymania żywotności tkanki neuronalnej przez dłuższy czas (>24 godziny) bez konieczności stosowania antybiotyków, sterylnych procedur lub pożywek do hodowli tkankowych zawierających czynniki wzrostu. Poprzez cykliczne przepuszczanie płynu zewnątrzkomórkowego przez promieniowanie UV i utrzymywanie tkanki w niestandardowej komorze trzymania w temperaturze 15 - 16 °C, tkanka nie wykazuje różnicy we właściwościach elektrofizjologicznych ani sygnalizacji wapniowej przez wewnątrzkomórkowe barwniki wapniowe w >24 godziny po rozwarstwieniu. Metody te nie tylko wydłużą czas eksperymentu dla osób wykorzystujących ostrą tkankę neuronalną, ale także zmniejszą liczbę zwierząt wymaganych do osiągnięcia celów eksperymentalnych i ustanowią złoty standard dla ostrej inkubacji tkanki neuronalnej.

Ścisła regulacja obciążenia bakteryjnego oraz temperatury aCSF podczas inkubacji jest niezbędna dla zachowania żywotności tkanki neuronalnej. Można to zoptymalizować poprzez naświetlanie światłem UVC i utrzymywanie temperatury aCSF w zakresie 15 - 16 °C (Rysunek 1). Ponadto karta parametrów aCSF (APS; Rysunek 1C) zapewnia eksperymentatorowi zapis warunków środowiskowych (pH i temp.), stanowiąc tym samym złoty standard parametrów podczas inkubacji tkanki n...

Po usunięciu z organizmu, tkanka neuronalna jest bardzo podatna na wpływ warunków środowiskowych, co prowadzi do ostatecznej degradacji tkanki po 6 - 8 godzinach. Dzięki unikalnej metodzie inkubacji, która ściśle monitoruje i reguluje zewnątrzkomórkowe środowisko tkanki, żywotność tkanek może być znacznie przedłużona przez >24 godziny.

Przedłużona inkubacja ostrej tkanki neuronalnej do elektrofizjologii i obrazowania wapnia

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Ogólnym celem tej techniki jest utrzymanie tkanki neuronalnej przez dłuższy czas bez znaczącej degradacji tkanek. Zastosowanie tej metody pozwala na przeprowadzenie rejestracji elektrofizjologicznych oraz obrazowania wapnia ponad 24 godziny po ekstrakcji tkanki. Metoda ta znacznie zwiększy żywotność świeżo wyizolowanej tkanki neuronalnej i utrzyma ją przez ponad 24 godziny, wyznaczając nowy złoty standard inkubacji tkanki ostrej.Główną zaletą tej techniki jest znaczne wydłużenie czasu, w którym można wykorzystać tkankę w eksperymencie. Pozwala to na zmniejszenie liczby potrzebnych zwierząt i maksymalizację ilości danych możliwych do uzyskania z każdego doświadczenia. Braincubator jest zautomatyzowanym systemem, który utrzymuje temperaturę tkanki i zapobiega namnażaniu się bakterii w płynie zewnątrzkomórkowym.Zapewnia to ściśle kontrolowane środowisko dla tkanki. Procedurę tę zaprezentują Orsolya Kekesi oraz Alba Bellot-Saez, doktorantki z mojego laboratorium. Do przygotowania skrawków mózgu należy użyć wibratomu, aby uzyskać skrawki o grubości 300 µm zawierające obszar zainteresowania.Następnie przenieś plastry do specjalnie zbudowanego systemu inkubacyjnego z przepływem karbogenu, kontrolowanym poziomem pH i temperaturą. Ustaw początkową temperaturę komory na 35 °C na 15 do 30 minut, a następnie powoli obniż ją do 15 °C. Po tym czasie inkubuj plastry w systemie inkubacyjnym aż do momentu rejestracji elektrofizjologicznej lub obrazowania.W celu przygotowania preparatu całej siatkówki (whole mount) należy niezwłocznie usunąć gałki oczne z uśpionego zwierzęcia. Wykonaj niewielkie nacięcie wzdłuż ora serrata, a następnie umieść oczy w pożywce Ames'media lub aCSF z dopływem karbogenu w temperaturze pokojowej. Następnie bezzwłocznie usuń rogówkę, soczewkę i ciało szkliste, wykonując nacięcie wzdłuż ora serrata małymi nożyczkami, a następnie usuwając je pęsetą.Umieść tkankę w systemie inkubacyjnym w temperaturze pokojowej. Aby usunąć błonę ograniczającą wewnętrzną, przenieś pojemnik z gałką oczną zawierającą siatkówkę do małego szklanego słoika z papainą, L-cysteina, EDTA i DNase w temperaturze 37 °C na 20 minut. Podawaj karbogen do roztworu przez pokrywkę, ale nie doprowadzaj do bąbelkowania.Zatrzymać trawienie enzymatyczne, umieszczając tkankę na 10 minut w roztworze owomukoidu i BSA w soli zrównoważonej Earle'a (Earle's BSS). Następnie dokładnie wypłukać tkankę za pomocą aCSF. Po tym czasie przenieść tkankę do systemu inkubacyjnego i obniżyć temperaturę do około 15–16 °C.Następnie przenieś tkankę siatkówki pod mikroskop. Odizoluj siatkówkę od rogówki i przetnij ją na cztery części za pomocą żyletki. Jeśli wymagana jest cała siatkówka, wykonaj cztery niewielkie nacięcia na obrzeżach siatkówki, aby umożliwić jej płaskie ułożenie.Tkankę tę można teraz przenieść pod mikroskop w celu przeprowadzenia badań elektrofizjologicznych lub pozostawić w inkubatorze Braincubator. Tkanka jest utrzymywana w komorze głównej zawierającej sondy do pomiaru pH i temperatury. Druga komora jest odizolowana od komory głównej i naświetlana światłem UVC o mocy 1,1 W w celu naświetlania bakterii unoszących się w roztworze.Użyj pompy perystaltycznej do cyrkulacji aCSF przez dwie komory oraz termoelektrycznej płytki chłodzącej Peltiera do chłodzenia lub ogrzewania komory głównej. W tej procedurze rozpuść barwnik wapniowy w DMSO, aby przygotować roztwór o stężeniu 1 mM. Do mieszaniny dodaj 1% kwasu pluronic F-127, aby uzyskać objętość końcową 50 µL.Następnie poddaj próbkę sonikacji przez 10 minut. Przygotuj szklaną komorę do wprowadzania próbek z barwnikiem wapniowym rozcieńczonym w 2,5 mililitrach aCSF, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mikromol dla skrawków mózgu oraz 20 mikromol dla siatkówki. W przypadku siatkówki i skrawków mózgu od młodych zwierząt inkubuj próbkę w kąpieli przez 45 minut.W przypadku zwierząt dorosłych nanieść pipetą 25 µL barwnika bezpośrednio na skrawek mózgu i inkubować przez 75 minut, aby umożliwić lepszą penetrację barwnika do głębszych warstw. Aby zapewnić odpowiednie natlenienie zanurzonej tkanki podczas inkubacji z barwnikiem, należy ją stale natleniać karbogenem przez pokrywkę, unikając jednak bąbelkowania. Po wprowadzeniu barwnika tkankę należy przemyć roztworem aCSF i przenieść do systemu inkubacyjnego.Powoli obniżaj temperaturę do około 15–16 °C do momentu użycia. W celu przeprowadzenia rejestracji umieść tkankę w zanurzonej komorze rejestracyjnej pod mikroskopem i perfunduj ją natlenionym aCSF z prędkością przepływu od 4 do 5 ml/min. Unieruchom tkankę za pomocą specjalnie wykonanej harfy.Następnie przygotuj pipety rejestrujące za pomocą wypalarki do mikropipet, aby uzyskać końcową rezystancję od pięciu do sześciu megaomów. Napełnij pipetę od trzema do czterech mikrolitrów roztworu wewnętrznego, a następnie umieść roztwór w lodzie. Następnie zwizualizuj komórki za pomocą kamery CCD w trybie IR-DIC.Używając mikromanipulatora, ustaw pipetę na błonie komórkowej. Utrzymuj dodatnie ciśnienie poprzez port ssący w uchwycie pipety. Gdy pipeta znajdzie się na komórce, przyłóż do niej delikatne podciśnienie, aby uzyskać uszczelnienie rzędu gigaoma (gigaohm seal).Następnie przerwij błonę komórkową za pomocą krótkiego podciśnienia. Następnie rozpocznij rejestrację prądową lub napięciową w konfiguracji whole-cell. Do obrazowania ratiometrycznego Fura-2 należy użyć ultraszybkiego przełącznika długości fali, aby zapewnić długości fali wzbudzenia 340 nanometrów i 380 nanometrów.Następnie zarejestruj emitowane światło za pomocą filtra emisyjnego i wysokiej czułości, szybkiej kamery cyfrowej. Dla pojedynczej długości fali wzbudzenia Fluo-4, przefiltruj światło wzbudzenia przez filtr pasmowy 460 do 490 nm, a światło emitowane przez filtr pasmowy 515 do 550 nm. Po trawieniu komórki zwojowe siatkówki oraz przemieszczone komórki amacryne można wyraźnie zwizualizować w oświetleniu DIC i można je wytypować do rejestracji metodą patch-clamp bez konieczności uprzedniego usuwania wewnętrznej błony ograniczającej.Przedstawiono tutaj reprezentatywne rejestracje metodą clampingu prądowego z komórki zwojowej siatkówki. Depolaryzacja komórki za pomocą pipety patch spowodowała zależne od dawki generowanie potencjałów czynnościowych, co wskazuje na żywotność komórek po traktowaniu papainą. Usunięcie wewnętrznej błony ograniczającej umożliwiło również powszechne barwienie warstwy komórek zwojowych barwnikiem Fura-2 AM. Komórki odpowiedziały na aplikację 30 millimolarnego chlorku potasu znacznym wzrostem wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia, co potwierdzono wzrostem stosunku 342 do 380 nanometrów względem F0. Po aplikacji chlorku potasu poziomy wapnia powróciły do wartości bazowej po stymulacji.Następnie komórki można było stymulować w celu wywołania odpowiedzi o podobnej amplitudzie. Co więcej, odpowiedzi te były nieodróżnialne pomiędzy siatkówkami rejestrowanymi w czasie krótszym niż cztery godziny oraz dłuższym niż 24 godziny po sekcji. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że ostra tkanka neuronalna jest bezbronna wobec czynników środowiskowych.W związku z tym ścisła regulacja aCSF poprzez monitorowanie pH, temperatury oraz poziomu zanieczyszczeń bakteryjnych jest niezbędna dla zachowania aktywności komórkowej i integralności sieci. Niniejsza procedura może być wykorzystana do utrzymania tkanki neuronalnej przez ponad 24 godziny bez konieczności stosowania technik aseptycznych lub pożywek hodowlanych zawierających czynniki wzrostu lub antybiotyki, które mogłyby wpłynąć na fizjologię. Mamy nadzieję, że metoda ta wyznaczy złoty standard w zakresie optymalnych parametrów maksymalizujących żywotność tkanki.Zmniejsza to zmienność stanu zdrowotnego samej tkanki, a w konsekwencji ogranicza zmienność eksperymentalną. Zastosowanie protokołu z użyciem papainy do trawienia wewnętrznej błony ograniczającej siatkówki umożliwia uzyskanie powszechnego barwienia barwnikami wapniowymi. Protokół ten może być również wykorzystany do wielopunktowych rejestracji wewnątrzkomórkowych z neuronów warstwy komórek zwojowych.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dokładną wiedzę na temat tego, jak utrzymywać żywotność tkanki przez ponad 24 godziny na potrzeby obrazowania i eksperymentów elektrofizjologicznych. Należy pamiętać, że praca ze światłem ultrafioletowym może być niebezpieczna. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak ochronne okulary.

prolonged-incubation-acute-neuronal-tissue-for-electrophysiology

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Prezentujemy sposób jednoczesnego monitorowania zmian stężenia wewnątrzkomórkowego wolnego wapnia oraz skuteczności synaptycznej w preparacie zwojowym Aplysia. Obrazujemy wapń wewnątrzkomórkowy z wykorzystaniem barwnika fluorescencyjnego Calcium Orange, a transmisję synaptyczną indukujemy i monitorujemy za pomocą elektrod ostrych (wewnątrzkomórkowych).

Monitorowanie zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia i skuteczności synaptycznej u mięczaka Aplysia

Ten film demonstruje metodę długotrwałej inkubacji tkanki neuronalnej siatkówki. Muszle oczne zawierające siatkówkę uzyskuje się z oka myszy; wewnętrzna błona ograniczająca (ILM) jest trawiona enzymatycznie w celu odsłonięcia komórek nerwowych siatkówki, a leczona muszla oczna lub izolowana siatkówka jest przenoszona do specjalistycznego inkubatora w celu przedłużonej inkubacji w niskiej temperaturze.

Technika przedłużonej inkubacji tkanki neuronalnej siatkówki

Ten film demonstruje protokół rejestracji całej komórki i dwufotonowego obrazowania wapnia w wycinkach hipokampa mózgu. Metoda ta pozwala na badanie dynamiki lokalnych stanów przejściowychCa2+ (CaT) w dendrytach różnych typów neuronów w ostrych wycinkach mózgu.

Ustalenie konfiguracji całej komórki do dwufotonowego obrazowania wapnia wycinków mózgu

Ten film demonstruje technikę pomiaru aktywności neuronalnej w wycinkach mózgu myszy za pomocą obrazowania wapnia i zapisów elektrofizjologicznych. Poprzez perfuzję tkanki jonami potasu i rejestrowanie wewnątrzkomórkowych zmian wapnia za pomocą szybkiego obrazowania cyfrowego, metoda ta ujawnia odpowiedzi neuronalne w czasie rzeczywistym.

Pomiar aktywności neuronalnej w wycinku mózgu myszy po długotrwałej inkubacji

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Opisujemy połączenie ogniskowej fotoaktywacji związków neuroaktywnych wywołanej promieniowaniem UV z całokomórkowym patch-clampem i wielofotonowym obrazowaniem wewnątrzkomórkowych tranustów sodu w dendrytach i kolcach neuronów hipokampa w ostrych wycinkach tkanki mózgu myszy.

Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1

Jelitowy układ nerwowy (ENS) to sieć neuronów i komórek glejowych znajdujących się w ścianie jelita, która kontroluje odruchy jelitowe. Protokół ten opisuje metody rejestrowania aktywności neuronów jelitowych i gleju w żywych preparatach ENS przy użyciu obrazowania Ca2+.

In Situ Ca2+ Obrazowanie jelitowego układu nerwowego

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Tutaj opisujemy podstawowe kroki dla zapisów całokomórkowych krosówek z neuronów istoty żelowej (SG) w przekroju rdzenia kręgowego in vitro. Metoda ta pozwala na badanie wewnętrznych właściwości błony, przekaźnictwa synaptycznego i charakterystyki morfologicznej neuronów SG.

Przygotowanie wycinków ostrego rdzenia kręgowego do zapisu całokomórkowego patch-clamp w neuronach istoty żelatynowej

Mikroglej, komórki odpornościowe rezydujące w mózgu, szybko reagują zmianami morfologicznymi na modyfikacje swojego środowiska. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać mikroskopię dwufotonową do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku serotoniny lub ATP w ostrych wycinkach mózgu myszy.

Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Poznaj metodę przedłużonej inkubacji ostrej tkanki neuronalnej do elektrofizjologii i obrazowania wapnia. Technika ta utrzymuje żywotność tkanek powyżej 24 godzin, zmniejszając liczbę zwierząt potrzebnych do badań.

Przedłużona inkubacja ostrej tkanki neuronalnej do elektrofizjologii i obrazowania wapnia

Przeglądaj więcej filmów