Warunek hodowli redukujący parowanie zwiększa odtwarzalność tworzenia wielokomórkowych sferoidów na płytkach mikromiareczkowych

Ogólnym celem tej procedury jest poprawa skalowalności i odtwarzalności jednorodnego tworzenia sferoidów przy użyciu techniki nakładania cieczy na płytki 384-dołkowe. Główną zaletą tej techniki jest to, że zmniejsza ona nadmierną ponowną operację pożywki z wielu płytek, a tym samym poprawia odtwarzalność tworzenia sferoidów. W naszym laboratorium opracowaliśmy i zwalidowaliśmy metodę hodowli sferoid 3D do badań przesiewowych stawonogów, a nasze badanie miało na celu ocenę, jaki jest efekt krawędzi na płytkach kultur wielokomórkowych.

Dzisiaj zademonstruję procedurę razem z Soną, plakatem z laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od odważenia punktu zerowego siedmiu pięciu gramów agarozy o niskiej temperaturze topnienia i dodaj ją do 100 mililitrów pożywki mccoy's 5a z czerwienią fenolową lub bez i bez surowicy. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej i obracaj go co jedną do dwóch minut, aby całkowicie rozpuścić agarozę.

Następnie przeprowadź roztwór w autoklawie, aby go wysterylizować. Po pozostawieniu autoklawowanej agarozy do ostygnięcia do około 70 stopni Celsjusza, przefiltruj ją przez 500-mililitrowy filtr górny z dwoma mikrometrami w butelce o pojemności 500 mililitrów w punkcie zerowym w pojemniku z przepływem laminarnym. Następnie, jeśli całe rozwiązanie nie zostanie użyte od razu, podziel je na porcje.

Gotowy do użycia roztwór agarozy należy przechowywać w warunkach aseptycznych w chłodni lub lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do czterech tygodni. Pracując w skrzynce przepływowej, zainstaluj plastikową lub metalową końcówkę kasetę dozującą w dozowniku odczynników combi. Umieść ciężar rurki w naczyniu z 70-procentowym etanolem, a następnie zalej kasetę.

Następnie przenieś ciężar rurki do naczynia z PBS i ponownie go zalej. Następnie podgrzej przechowywaną porcję przefiltrowanego roztworu agarozy w kuchence mikrofalowej, aby ją stopić. Zalać kasetę dozującą roztworem agarozy, a następnie rozpocząć protokół w celu pokrycia 384-dołkowych mikropłytek poddanych kulturom tkankowym 15 mikrolitrami przefiltrowanego roztworu agarozy.

Pozwól agarozie na płytce ostygnąć przez 15 do 20 minut przed wysiewem komórek zgodnie z opisem w następnej części filmu lub przechowywaniem ich w temperaturze czterech stopni Celsjusza i z dala od bezpośredniego światła. Na koniec, aby wyczyścić kasetę dozującą, umieść obciążnik rurki w sterylnej wodzie o temperaturze od 70 do 80 stopni Celsjusza i naciśnij przycisk zalewania na dozowniku. Spowoduje to usunięcie pozostałej agarozy z końcówek kasety i rurek.

Następujący proces wysiewu komórek powinien być przeprowadzany w sterylnych warunkach i w komorze z przepływem laminarnym. Rozpocząć od usunięcia wymaganej liczby mikropłytek poddanych działaniu 384-dołkowych kultur tkankowych pokrytych agarozą z chłodni i pozostawienia ich do zrównoważenia do temperatury pokojowej przez 15 minut. W międzyczasie przygotuj dozownik odczynników kombi do oglądania komórek, zalewając standardową kasetę dozującą probówkę 70-procentowym etanolem i sterylnym PBS.

Następnie, za pomocą przycisków ustawień ręcznych na dozowniku, dostosuj głośność widzenia do wymaganego mikrolitra, a prędkość dozowania do średniej. Użyj enzymu dysocjacji komórek rekombinowanych, aby usunąć przylegające komórki HCT116 ludzkiego raka jelita grubego z kolby do hodowli tkankowej. W sterylnej zlewce przygotuj zawiesinę komórek z komórkami o gęstości 2,5 razy 10 do czwartej komórki na mililitr na studzienkę w 50 mikrolitrach kompletnej pożywki wzrostowej.

Jeśli wysiewana będzie więcej niż jedna płytka 384-dołkowa, użyj mieszadła magnetycznego, aby zapobiec ich osiadaniu na dnie zlewki. Za pomocą dozownika dodaj 25 stu komórek do każdego dołka płytki 384-dołkowej. Pozostaw talerze na 30 minut w temperaturze pokojowej.

W międzyczasie weź pokrywkę mikropłytki redukującej parowanie i za pomocą pięciomililitrowej pipety dozuj cztery mililitry pięcioprocentowego dimetylosulfotlenku do koryta po lewej stronie, powoli zamiatając w górę iw dół. Powtórz ten proces z korytem po prawej stronie. Upewnij się, że ciecz dodana do bocznych koryt nie łączy się na środku pokrywy i pozostawia szczelinę na wymianę gazową.

Jeśli doda się zbyt dużo płynu, przedostanie się on na zewnątrz pokrywy, a następnie dostanie się do zewnętrznej studzienki płytki do hodowli tkankowej 384. Po upływie 30 minut zbadaj komórki pod mikroskopem. Odpoczynek płytek przez 30 minut pozwala komórkom całkowicie osiąść na dnie studzienki i blisko siebie, co jest ważne dla tworzenia pojedynczych sferoid na studzienkę.

Wirować płytki z nasionami przez 15 minut w czterokrotnym G. Po wirowaniu napełnij zbiornik płynu na płytce do hodowli tkankowej 384 sterylną wodą i zastąp zwykłe pokrywki płytek pokrywkami środowiskowymi wypełnionymi płynem. Umieść płytki w inkubatorze obrotowym o temperaturze 37 stopni Celsjusza o wilgotności 95 procent, pięciu procentach CO2 i 20 procentach tlenu i pozwól komórkom agregować się w wielokomórkowe sferoidy guza lub MCTS przez cztery dni. Unikaj zbyt długiego otwierania drzwi inkubatora w kolejnych dniach, aby poziom wilgotności nie spadł gwałtownie.

Czwartego dnia po utworzeniu NCTS użyj automatycznego dozownika do myjki do mikropłytek, aby dodać 30 mikrolitrów wstępnie podgrzanego podłoża do każdej studzienki. Umieść MCTS z powrotem w inkubatorze i pozwól MCTS rosnąć, aż osiągną pożądany rozmiar do eksperymentów. Co trzy dni, aby wymienić pożywkę, empirycznie wyreguluj wysokość Z kolektora spryskiwacza i ustaw prędkość dozowania oraz prędkość, z jaką kolektor myjący spływa do studzienek z najniższą prędkością, aby zminimalizować turbulencje w studzienkach.

Odessać 30 mikrolitrów pożywki na studzienkę i zastąpić ją 30 mikrolitrami świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki. Następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora. Zobrazuj MCTS w zautomatyzowanym systemie obrazowania o wysokiej zawartości przy użyciu czterech obiektów powietrznych X z aperturą numeryczną 16.

Korzystając z oprogramowania do obrazowania, ustaw czas naświetlania na 11 milisekund, a binning na cztery na cztery. Dostosuj liczbę i odstępy między stosami z oraz grupowanie pikseli zgodnie z potrzebami, aby eksperyment przechwycił cały MCTS w każdym dołku. Przetwarzaj obrazy 2D krok po kroku, aby zmierzyć obszar MCTS, oś główną i pomocniczą, obwód i bryłę.

Zapoznaj się z dołączonymi plikami m-code i text read me, aby uzyskać szczegółowe instrukcje. Aby określić potencjalną przydatność rutyny, siedmiodniowe MCTS leczono różnymi stężeniami leków przeciwnowotworowych, paklitakselu, PTX, winkrystyny, magnetowidu, oksaliplatyny, OXA, doksyrubicyny, DOX i pięciu flurouracylu, 5-FU, w trzech różnych stężeniach przez cztery dni. Zdjęcia MCTS są pokazane tutaj.

Obrazy te analizowano w celu określenia obszaru, osi głównej i pomocniczej, obwodu i solidności MCTS leczonych lekami w porównaniu z kontrolnymi, CTL. Osie główna i mniejsza zostały użyte do obliczenia objętości geometrycznej. Po leczeniu farmakologicznym obserwowano zależne od stężenia zmniejszenie powierzchni i objętości MCTS.

Chociaż punkt zero jeden mikrogram na mililitr Winkrystyny i punkt zerowy cztery mikrogramy na mililitr Doksyrubicyny i pięć Fluorouracylu spowodowały wzrost powierzchni MCTS, objętość została znacznie zwiększona dopiero po punkcie zero jeden mikrogram na mililitr Winkrystyny. Obwód MCTS różnił się istotnie tylko przy najwyższych stężeniach Packlitaxelu, Doksyrubicyny i Five Fleurouracylu, które całkowicie wpływały na wielkość MCTS. Leczenie paklitakselem i winkrystyną w punkcie zerowym dwa pięć mikrogramów na mililitr i punkt zerowy zero sześć mikrogramów na mililitr oraz doksyrubicyną i pięcioma fleurouracylem w dawce 100 mikrogramów na mililitr spowodowało znaczny spadek stałości, co wskazuje na całkowity lub częściowy rozpad MCTS.

Podsumowując, dane te pokazują użyteczność tej metody w badaniu potencjalnych leków przeciwnowotworowych. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując tej procedury, należy pamiętać, że nie wszystkie linie komórkowe nadają się do określonej metody hodowli 3D, a różne linie komórkowe tworzą sferoidy, które wykazują różnice w kształtach sferoidalnych, rozmiarze, histologii i kinetyce wzrostu.

Opracowana przez nas rutyna stymulująca pozwala na skuteczną ocenę wielkości sferoidy, szczególnie w częściowo rozpadających się sferoidach leczonych lekami, które nie mają jasno określonej granicy pomiaru pola przekroju poprzecznego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć fakt, że obecna tutaj modyfikacja nie wymaga żadnego dodatkowego sprzętu ani materiałów eksploatacyjnych i może być rutynowo wdrażana w twoim laboratorium przesiewowym stawonogów.