Name: Warunek hodowli redukujący parowanie zwiększa odtwarzalność tworzenia wielokomórkowych sferoidów na płytkach mikromiareczkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Poznaj technikę nakładki ciekłej zmniejszającą parowanie w hodowli sferoidów wielokomórkowych na płytkach 384-dołkowych. Ta metoda poprawia odtwarzalność i skalowalność badań nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z czeskiego Ministerstwa Edukacji, Młodzieży i Sportu (LO1304) oraz Agencji Technologicznej Republiki Czeskiej (TE01020028). Autorzy pragną podziękować dr Lakshmanowi Varanasiemu za wykonanie zdjęć pokryw środowiskowych.

1. Przygotowanie płytek pokrytych agarozą
<ol>
	<li>Odważ 0,75 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia i dodaj ją do 100 mL pożywki McCoy's 5A (z czerwienią fenolową lub bez niej) bez surowicy. Podgrzewaj roztwór w mikrofalówce, mieszając co 1-2 min, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Poddaj roztwór autoklawowaniu w celu sterylizacji.</li>
	<li>Ostudź autoklawowaną agarozę do około 70 °C i przefiltruj ją przez filtr lejkowy 0,22 µm o pojemności 500 mL za pomocą filtracji próżniowej w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Jeśli nie zamierzasz użyć całego roztworu od razu, rozdziel przefiltrowany 0,75% roztwór agarozy (FAS) na mniejsze objętości. Przechowuj ten gotowy do użycia roztwór agarozy aseptycznie w chłodni lub lodówce w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 4 tygodnie.</li>
	<li>Przymocuj małą probówkę z kasetą dozującą z plastikową lub metalową końcówką do dozownika odczynników Combi, a następnie przepłucz kasetę 70% etanolem (EtOH), a następnie sterylnym solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS) w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Przed użyciem podgrzej przechowywaną alikwot FAS w mikrofalówce, aby ją roztopić. Wypełnij kasetę dozującą roztworem agarozy i pokryj 384-dołkowe „specjalne” mikropłytki do hodowli tkankowej (TC) 15 µL FAS. Pozostaw agarozę na płytce do wystygnięcia przez 15-20 min przed zasiewem komórek. Przechowuj płytki pokryte agarozą aseptycznie, zapakowane w worek polietylenowy w chłodni lub w temperaturze 4 °C, z dala od bezpośredniego światła. 
	UWAGA: Unikaj wielokrotnego podgrzewania 0,75% FAS, aby zapobiec zmianie stężenia agarozy w roztworze zapasowym. Płytki pokryte agarozą mogą być przechowywane do 2 tygodni w wyżej wymienionych warunkach. FAS nie wymaga podgrzewania podczas pokrywania płytek.</li>
	<li>Oczyść kasetę dozującą, przepłukując ją sterylną wodą o temperaturze 70-80 °C, aby usunąć pozostałą agarozę z końcówek i rurek kasety.</li>
</ol>
2. Hodowla komórek i tworzenie MCTS
<ol>
	<li>Hodować ludzkie komórki raka jelita grubego HCT116 zgodnie z wcześniejszym opisem8.</li>
	<li>Wyjąć z przechowywania w niskiej temperaturze wymaganą liczbę 384-dołkowych mikropłytek TC-treated pokrytych agarozą i pozostawić je na 15 min w temperaturze pokojowej (RT) w celu wyrównania temperatury.</li>
	<li>Przygotuj dozownik odczynników Combi do wysiewu komórek, przepłukując standardową kasetę dozującą do probówek 70% EtOH oraz sterylnym PBS. Dostosuj objętość wysiewu do wymaganej µL oraz prędkość dozowania na średnią, używając przycisków ustawień ręcznych na dozowniku. 
	UWAGA: Cały proces wysiewania komórek jest przeprowadzany w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
	<li>Oddziel komórki adherentne od kolby do hodowli tkankowej, używając rekombinowanego enzymu dysocjującego komórki. Przygotuj w sterylnym zlewce zapas zawiesiny komórkowej z komórkami szczepionkowymi o gęstości 2,5 x 104 komórek/ml na studzienkę w 50 µL pełnego pożywki wzrostowej. Przy wysiewaniu więcej niż jednej płytki 384-WP należy mieszać komórki za pomocą mieszadła magnetycznego, aby zapobiec ich osiadaniu na dnie zlewki.</li>
	<li>Pozostawić płytki na 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przez 15 min przy 4 x g.</li>
	<li>W międzyczasie należy wziąć pokrywkę środowiskową ograniczającą parowanie i napełnić ją 8 ml sterylnej wody H2O2lub 5% dimetylosulfotlenku (DMSO) na krótkich bokach (lewym i prawym) przy użyciu pipety 5 ml (Rysunek 1A). Najpierw należy nalać 4 ml płynu wypełniającego do lewego koryta, powolnym ruchem przesuwając końcówkę pipety w górę i w dół. Powtórzyć ten krok w przypadku prawego koryta. 
	UWAGA: Należy upewnić się, że ciecz dodana do bocznych korytek nie łączy się w centralnej części pokrywy i pozostawić przerwę w celu wymiany gazowej (Rycina 1A). Dodanie nadmiaru H2O prowadzi do przesiąkania H2O na zewnętrzną stronę pokrywki, a następnie do zewnętrznych studzienek płytek TC z 384 studzienkami.</li>
	<li>Napełnij zbiornik na ciecz płytki TC z 384 dołkami sterylnym H2i zastąp zwykłe pokrywki płytek pokrywkami środowiskowymi wypełnionymi cieczą (Rycina 2A).</li>
	<li>Umieść płytki w 37 °C inkubator obrotowy z wilgotnością 95% i 5% CO22, i 20% O22i pozostawić komórki do agregacji w MCTSE przez 4 dni. W kolejnych dniach należy unikać zbyt długiego otwierania drzwi inkubatora, aby zapobiec gwałtownemu spadkowi poziomu wilgotności.</li>
</ol>
3. Wymiana pożywki przy użyciu systemu robotycznego
<ol>
	<li>W 4. dniu po utworzeniu MCTS, za pomocą automatycznego dozownika myjki do mikropłytek, dodać 30 µL uprzednio ogrzanej pożywki do każdej studzienki. Pozostawić MCTS do wzrostu przez kolejne 3 dni. Pożywkę wymieniać regularnie co 3 dni, aż sferoidy osiągną pożądaną wielkość do przeprowadzenia eksperymentu.</li>
	<li>Aby odessać określoną objętość pożywki z każdej studzienki, empirycznie dostosować wysokość z głowicy myjki. Odessać 30 µL pożywki z każdej studzienki i zastąpić ją 30 µL świeżej, uprzednio ogrzanej pożywki. 
	UWAGA: Prędkość dozowania oraz prędkość opuszczania głowicy myjki do studzienek należy ustawić na najniższą wartość, aby zminimalizować turbulencje w studzienkach.</li>
</ol>
4. Obrazowanie wysokotreściowe MCTS i półautomatyczna analiza obrazu
<ol>
	<li>Wykonaj obrazowanie MCTS w zautomatyzowanym systemie obrazowania wysokoprzepustowego (high-content), używając obiektywu powietrznego 4X (N.A. 16).</li>
	<li>Ustaw czas ekspozycji na 11 ms oraz binning na 4 x 4. Dostosuj liczbę i odstępy stosów z-stacks oraz binning pikseli zgodnie z wymogami eksperymentu, aby uchwycić cały MCTS w każdej studzience.</li>
	<li>Przetwarzaj obrazy krok po kroku, zgodnie z opisem w pliku „readme”, korzystając z wewnętrznej procedury napisanej w języku programowania. 
	UWAGA: Kod .m oraz pliki readme .txt są dostępne jako uzupełniające pliki z kodem (Rysunek 1B). Procedura ta mierzy powierzchnię MCTS, osie główną i pomocniczą, obwód oraz zwartość (solidity) na podstawie obrazów 2D.</li>
</ol>
<img alt="Prawidłowe napełnienie vs nadmiar cieczy w płytce; schemat blokowy preprocessingu i segmentacji dla analizy obrazu." src="/files/ftp_upload/55403/55403fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przygotowanie pokrywek środowiskowych oraz schemat blokowy rutyny półautomatycznej. (A) Obraz pokrywki środowiskowej ograniczającej parowanie, napełnionej prawidłową (lewo) oraz nadmierną (prawo) ilością cieczy wypełniającej (tutaj 5% DMSO). Strzałka wskazuje rynienkę na krótszym boku służącą do dodawania cieczy. Gwiazdka pokazuje przerwę na środku pokrywki po dodaniu prawidłowej objętości DMSO. (B) Schemat przedstawiający kroki wchodzące w skład rutyny półautomatycznej analizy obrazu. <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55403/55403fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update.</a> Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiologically+relevant+in+vitro+tumor+models+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Pathophysiologically relevant in vitro tumor models for drug screening.</a> Drug Discov. Today. 20 (7), 848-855 (2015).</li>
<li>Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , 69-70 (2014).</li>
<li>Fischbach, C., Kong, H. J., Hsiong, S. X., Evangelista, M. B., Yuen, W., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+angiogenic+capability+is+regulated+by+3D+culture+and+integrin+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer cell angiogenic capability is regulated by 3D culture and integrin engagement.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 399-404 (2009).</li>
<li>Lao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Methods+to+Generate+Spheroid+Cultures+from+Tumor+Cells%2C+Tumor+Cells+%26+Fibroblasts+or+Tumor-Fragments%3A+Microenvironment%2C+Microvesicles+and+MiRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Improved Methods to Generate Spheroid Cultures from Tumor Cells, Tumor Cells & Fibroblasts or Tumor-Fragments: Microenvironment, Microvesicles and MiRNA.</a> PLoS ONE. 10 (7), e0133895(2015).</li>
<li>Wenzel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-content+screening+for+the+identification+of+compounds+that+target+cells+in+dormant+tumor+spheroid+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions.</a> Exp. Cell Res. 323 (1), 131-143 (2014).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Models+of+Epithelial-Mesenchymal+Transition+in+Breast+Cancer+Metastasis%3A+High-Throughput+Screening+Assay+Development%2C+Validation%2C+and+Pilot+Screen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">3D Models of Epithelial-Mesenchymal Transition in Breast Cancer Metastasis: High-Throughput Screening Assay Development, Validation, and Pilot Screen.</a> J. Biomol. Screen. 16 (2), 141-154 (2011).</li>
<li>Das, V., Fürst, T., Gurská, S., Džubák, P., Hajdúch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+of+Uniform+Spheroid+Formation+in+384-Well+Plates%3A+The+Effect+of+Medium+Evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Reproducibility of Uniform Spheroid Formation in 384-Well Plates: The Effect of Medium Evaporation.</a> J. Biomol. Screen. , (2016).</li>
<li>Celli, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+imaging-based+platform+for+high-content%2C+quantitative+evaluation+of+therapeutic+response+in+3D+tumour+models%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">An imaging-based platform for high-content, quantitative evaluation of therapeutic response in 3D tumour models.</a> Sci. Rep. 17 (4), 3751(2014).</li>
<li>Solomon, M. A., Lemera, J., D'Souza, G. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+in+vitro+tumor+spheroid+culture+model+amenable+to+high-throughput+testing+of+potential+anticancer+nanotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome+Res%22%5BJournal%5D)">Development of an in vitro tumor spheroid culture model amenable to high-throughput testing of potential anticancer nanotherapeutics.</a> J. Liposome Res. 26 (3), 246-260 (2016).</li>
<li>Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+liquid+overlay+technique+to+formulate+heterogenic+3D+co-cultures+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1672-1685 (2014).</li>
<li>Walzl, A., et al. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1177/1087057114532352">A Simple and Cost Efficient Method to Avoid Unequal Evaporation in Cellular Screening Assays, Which Restores Cellular Metabolic Activity.</a> Int. J. Appl. Sci. Technol. 2 (6), 17-25 (2012).</li>
<li>Berthier, E., Warrick, J., Yu, H., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+evaporation+for+more+robust+microscale+assays.+Part+1.+Volume+loss+in+high+throughput+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Managing evaporation for more robust microscale assays. Part 1. Volume loss in high throughput assays.</a> Lab Chip. 8 (6), 852-859 (2008).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+a+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci. Rep. 6, 19103(2016).</li>
<li>Zimmermann, H. F., John, G. T., Trauthwein, H., Dingerdissen, U., Huthmacher, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Evaluation+of+Oxygen+and+Water+Permeation+through+Microplate+Sealing+Tapes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Rapid Evaluation of Oxygen and Water Permeation through Microplate Sealing Tapes.</a> Biotechnol. Prog. 19 (3), 1061-1063 (2003).</li>
<li>Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Assays+for+Characterizing+the+Viability+and+Morphology+of+3D+Cancer+Spheroid+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">High-Content Assays for Characterizing the Viability and Morphology of 3D Cancer Spheroid Cultures.</a> Assay Drug Dev. Technol. 13 (7), 402-414 (2015).</li>
<li>Chen, W., Wong, C., Vosburgh, E., Levine, A. J., Foran, D. J., Xu, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Image+Analysis+of+Tumor+Spheroids%3A+A+User-friendly+Software+Application+to+Measure+the+Size+of+Spheroids+Automatically%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically.</a> J. Vis. Exp. (89), e51639(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Powlekanie płytek TC z 384 studzienkami filtrowaną agarozą
Standardową praktyką w LOT jest stosowanie 1-1,5% agarozy o niskiej temperaturze topnienia do pokrywania płytek, co wymaga utrzymywania agarozy i/lub jednostki dozującej w cieple, aby zapobiec żelowaniu agarozy6. Żelowanie agarozy może stanowić problem podczas przygotowywania wielu płytek przy użyciu kaset do dozowania cieczy z małymi otworami rurek o średnicy od 0,2 do 0,4 mm. Aby wyeliminować potencjalny problem ...

Komórki rakowe w nowotworach są fizjologicznie ułożone w złożoną, trójwymiarową (3D) strukturę otoczoną macierzą zewnątrzkomórkową i oddziałującymi komórkami. Ponieważ prawie wszystkie komórki w tkankach znajdują się w środowisku 3D, potrzeba bardziej fizjologicznie istotnych modeli nowotworów in vitro, które naśladują cechy guza, zaowocowała opracowaniem kilku technik hodowli 3D1,2,3. Modele te stają się obecnie podstawowymi narzędziami badawczymi do badania roli mikrośrodowiska guza w przerzutach i odpowiedzi komórek na terapie w 3D2. Co więcej, w porównaniu z dwuwymiarowymi (2D) hodowlami komórkowymi 4, modele 3D pozwalają lepiej zrozumieć interakcje guz-zręb, które wpływają na szlaki sygnalizacji komórkowej.
Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe (MCTSes) linii komórek nowotworowych są często używane w modelach hodowli komórkowych 3D ze względu na ich względną bliskość do nowotworów in vivo. Spośród kilku stosowanych technik, technika nakładania płynem (LOT) wytwarzania MCTS na płytkach pokrytych agarozą zyskała znaczne zainteresowanie optymalizacją ołowiu i walidacją celu5,6,7,8,9,10,11. Wynika to z ostatnich badań, w których udało się przeprowadzić pilotażowe badania przesiewowe bibliotek złożonych w kulturach MCTS przy użyciu LOT6,7. Jednak zmienność morfologii i wzrostu MCTS między studniami spowodowana nierównomierną utratą pożywki spowodowaną parowaniem jest częstą przeszkodą, która towarzyszy LOT przy użyciu płytek do mikromiareczkowania (MP). W związku z tym powstawanie niejednorodnych MCTS wpływa negatywnie na istotność i istotność danych z testów farmakologicznych8,12,13. Oprócz kwestii odtwarzalności, innym praktycznym problemem, który wpływa na wysokoprzepustowe testy oparte na LOT, jest powlekanie MP agarozą podczas korzystania z automatycznych urządzeń dozujących ciecze. Chociaż jednostka dozująca może być utrzymywana w cieple, aby zapobiec żelowaniu agarozy, zatkanie kasety dozującej i rurki jest potencjalnym problemem dla systemów zrobotyzowanych6.
Aby przezwyciężyć niektóre z tych wyzwań, niedawno opracowaliśmy kilka modyfikacji w LOT dla kultury MCTS8. Modyfikacje te opierają się głównie na możliwych sposobach zapobiegania nierównomiernym stratom medium z MP za pomocą instrumentów, które są powszechnie spotykane w wysokowydajnych laboratoriach przesiewowych. Szczegółowa procedura zmodyfikowanej LOT do generowania MCTS o jednolitych rozmiarach i odtwarzalności na płytkach 384-dołkowych (WP) została przedstawiona tutaj. W manuskrypcie przedstawiono również półautomatyczną procedurę oceny wielkości MCTS, szczególnie w częściowo rozpadłych, leczonych lekami MCTS, które nie mają jasno określonej granicy pomiaru pola przekroju poprzecznego.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9414</td><td>Niskotopliwy</td></tr><tr><td>McCOY's 5A Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8403</td><td></td></tr><tr><td>" szybki" Filtr Filtermax</td><td>TPP</td><td>99505</td><td>0,22 &mu; m, 500 ml</td></tr><tr><td>Multidrop&trade; Dozownik odczynników Combi&nbsp;</td>Kaseta dozująca <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>z małą tubą&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24073295</td><td>Metalowa końcówka&nbsp;</td></tr><tr><td>384-dołkowa płytka TC&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>6057308</td><td>Typ płytki - CellCarrier</td></tr><tr><td>Standardowa kaseta dozująca rurki</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>MicroClime Środowiskowa pokrywka</td><td>Labcyte</td><td>LLS-0310</td><td></td></tr> Inkubator obrotowy <tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D4540</td><td></td></tr><tr><td>(SteriStore )</td> <td>HighRes Biosolutions</td><td>23641</td><td>Nr. seryjny: D00384</td></tr><tr><td>Dozownik do myjek do mikropłytek&nbsp;</td><td>Nieokreślony model BioTek</td><td></td><td>: EL406&nbsp;</td></tr><tr><td>System obrazowania o wysokiej zawartości (CellVoyager)</td> <td>Yokogawa Electric</td><td>Corporation</td><td>Nieokreślony model: CV7000</td></tr><tr><td>Orange G</td><td>New England Biolabs</td><td>B7022S</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE i handel; Ekspresyjny odczynnik do dysocjacji komórek rekombinowanych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12604021</td><td>Bez czerwieni fenolowej</td></tr></tbody></table>

warunek hodowli redukujący parowanie zwiększa odtwarzalność tworzenia wielokomórkowych sferoidów na płytkach mikromiareczkowych

Evaporation-reducing Culture Condition Increases the Reproducibility of Multicellular Spheroid Formation in Microtiter Plates

Modele nowotworów, które ściśle imitują warunki in vivo, stają się coraz bardziej popularne w odkrywaniu i opracowywaniu leków do badań przesiewowych potencjalnych leków przeciwnowotworowych. Wielokomórkowe sferoidy nowotworowe (MCTS) skutecznie naśladują warunki fizjologiczne guzów litych, co czyni je doskonałymi modelami in vitro do optymalizacji odprowadzeń i walidacji celu. Spośród różnych dostępnych technik hodowli MCTS, metoda płynnego nakładania agarozy jest jedną z najtańszych metod wytwarzania MCTS. Jednak niezawodny transfer kultur MCTS przy użyciu płynnego nakładania do wysokoprzepustowych badań przesiewowych może być zagrożony przez szereg ograniczeń, w tym powlekanie płytek mikromiareczkowych (MP) agarozą i nieodtwarzalność równomiernego tworzenia MCTS we wszystkich studzienkach. MP są znacznie podatni na efekty krawędziowe, które wynikają z nadmiernego parowania pożywki z zewnętrznej strony płytki, uniemożliwiając użycie całej płytki do testów narkotykowych. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowe ulepszenia techniczne techniki nakładania cieczy w celu zwiększenia skalowalności i odtwarzalności jednolitego tworzenia MCTS. Ponadto przedstawiono szczegółowe informacje na temat prostego, półautomatycznego i uniwersalnego narzędzia programowego do oceny cech MCTS po leczeniu farmakologicznym.

Nierównomierna utrata pożywki, szczególnie z studzienek peryferyjnych, jest często występującym problemem w przypadku wielodołkowych płyt (MPs) o małych objętościach hodowli. Znacznie poprawione warunki hodowli, takie jak inkubatory z dobrze kontrolowanymi systemami temperatury i wilgotności oraz płyty i pokrywy ograniczające parowanie, redukują istotną utratę pożywki pomiędzy studzienkami8. Aby zmierzyć względne parowanie, do każdej studzienki dodano równe objętoś...

Nierównomierna utrata podłoża z płytek mikromiareczkowych wpływa na odtwarzalność jednorodnego tworzenia sferoidów guza wielokomórkowego. Poprawa warunków hodowli w celu zmniejszenia znacznych strat pożywki poprawi odtwarzalność tworzenia sferoidów oraz wyniki testów opartych na sferoidach z wykorzystaniem techniki nakładania cieczy.

Warunek hodowli redukujący parowanie zwiększa odtwarzalność tworzenia wielokomórkowych sferoidów na płytkach mikromiareczkowych

Tumor models that closely imitate in vivo conditions are becoming increasingly popular in drug discovery and development for the screening of potential ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest poprawa skalowalności i powtarzalności tworzenia jednolitych sferoidów z wykorzystaniem techniki nakładania cieczy (liquid overlay) w płytkach 384-dołkowych. Główną zaletą tej techniki jest ograniczenie nadmiernych operacji wymiany medium w wielu płytkach, co tym samym poprawia powtarzalność formowania sferoidów. W naszym laboratorium opracowaliśmy i zwalidowaliśmy metodę hodowli sferoidów 3D na potrzeby testów przesiewowych stawonogów, a celem naszego badania była ocena efektu brzegowego w płytkach z kulturami wielokomórkowymi.Dzisiaj wraz z Soną, członkinią laboratorium, zaprezentuję tę procedurę. Rozpocznij procedurę od odważenia 0,75 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia i dodaj ją do 100 mL pożywki McCoy's 5a z fenolową czerwienią lub bez niej oraz bez surowicy. Podgrzewaj roztwór w mikrofalówce, mieszając go co 1-2 minuty, aż agaroza całkowicie się rozpuści.Następnie poddaj roztwór autoklawowaniu w celu jego sterylizacji. Po schłodzeniu autoklawowanej agarozy do temperatury około 70 °C, przefiltruj ją przez filtr nakrętkowy o rozmiarze porów 0,22 µm i pojemności 500 mL w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Następnie, jeśli cały roztwór nie zostanie zużyty jednorazowo, podziel go na aalikwoty.Przechowywać ten gotowy do użycia roztwór agarozy aseptycznie w chłodni lub lodówce w temperaturze 4°C przez maksymalnie cztery tygodnie. Pracując w kopule z przepływem laminarnym, zainstalować plastikową lub metalową kasetę dozującą w kombnowanym dozowniku do odczynników. Umieścić obciążnik rurki w naczyniu z 70% etanolem, a następnie przygotować kasetę do pracy.Następnie przenieś obciążnik przewodu do naczynia z PBS i ponownie go zapraw. W dalszej kolejności podgrzej w mikrofalówce przechowywaną alikwot filtruowanego roztworu agarozy, aby go stopić. Zapraw kasetę dozującą roztworem agarozy, a następnie uruchom protokół w celu pokrycia 384-dołkowych płytek mikrotitracyjnych do hodowli tkankowej 15 µL filtruowanego roztworu agarozy.Pozostaw agarozę na płytce do ochłodzenia przez 15 do 20 minut przed wysianiem komórek zgodnie z opisem w następnej sekcji filmu lub ich przechowywaniem w temperaturze czterech stopni Celsjusza, z dala od bezpośredniego światła. Na koniec, aby wyczyścić kasetę dozującą, umieść końcówkę drenu w sterylnej wodzie o temperaturze 70 do 80 stopni Celsjusza i naciśnij przycisk przygotowania (prime) w dozowniku. Usunie to pozostałą agarozę z końcówek kasety i przewodów.Następujący proces wysiewania komórek należy przeprowadzić w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza. W pierwszej kolejności należy wyjąć z przechowywania w niskiej temperaturze odpowiednią liczbę 384-dołkowych mikro płytek do hodowli tkanek powlekanych agarozy i pozostawić je na 15 minut w celu wyrównania temperatury do temperatury pokojowej. W międzyczasie należy przygotować dozownik odczynników kombi do wysiewania komórek, płucząc standardową kasetę dozującą do probówek 70% etanolem oraz sterylnym PBS.Następnie, korzystając z przycisków ustawień ręcznych w dozowniku, ustaw objętość dozowania na wymaganą wartość w mikrolitrach, a prędkość dozowania na średnią. Użyj rekombinowanego enzymu do dysocjacji komórek, aby usunąć przylegające komórki raka jelita grubego człowieka HCT116 z kolby do hodowli tkanek. W sterylnym zlewku przygotuj roztwór stokowy zawiesiny komórkowej o gęstości 2,5 × 10⁴ komórek na mililitr na studzienkę w 50 µL pełnej pożywki wzrostowej.Jeśli planowane jest wysianie więcej niż jednej płytki 384-dołkowej, należy użyć mieszadła magnetycznego, aby zapobiec osiadaniu komórek na dnie zlewki. Za pomocą dyspensera należy dodać 2500 komórek do każdego dołka płytki 384-dołkowej. Płytki należy pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej.W tym czasie należy wziąć pokrywkę do mikropłytek ograniczającą parowanie i za pomocą pipety o objętości 5 ml nanieść 4 ml 5% dimetylosulfotlenku do lewego rynienki, powoli rozprowadzając płyn w górę i w dół. Powtórz tę czynność w przypadku prawej rynienki. Upewnij się, że ciecz dodana do bocznych rynienek nie łączy się na środku pokrywki, pozostawiając przerwę dla wymiany gazowej.Jeśli dodano zbyt dużo cieczy, przesiąknie ona na zewnątrz pokrywki, a następnie dostanie się do zewnętrznej studni płytki hodowlanej 384. Po upływie 30 minut należy zbadać komórki pod mikroskopem. Odstawienie płytek na 30 minut pozwala komórkom całkowicie osiąść na dnie studni i zbliżyć się do siebie, co jest istotne dla powstania pojedynczych sferoidów w każdej studni.Odwiruj wysiane płytki przez 15 minut przy przyspieszeniu 4×g. Po wirowaniu napełnij rezerwuar z cieczą w 384-dołkowej płytce do hodowli tkanek sterylną wodą i zastąp zwykłe pokrywki płytek pokrywkami środowiskowymi wypełnionymi cieczą. Umieść płytki w rotacyjnym inkubatorze w temperaturze 37 °C, przy wilgotności 95%, 5% CO2 i 20% tlenu, umożliwiając komórkom agregację w wielokomórkowe sferoidy nowotworowe (MCTS) przez cztery dni. Unikaj zbyt długiego otwierania drzwiczek inkubatora w kolejnych dniach, aby poziom wilgotności nie spadł gwałtownie.W czwartym dniu po utworzeniu NCTS, używając zautomatyzowanego dozownika i myjki do mikropłytek, należy dodać 30 µL uprzednio ogrzanej pożywki do każdej studzienki. Umieść MCTS z powrotem w inkubatorze i pozwól im rosnąć, aż osiągną pożądany do eksperymentu rozmiar. Co trzy dni, w celu wymiany pożywki, empirycznie dostosuj wysokość Z manifoldu myjki oraz ustaw prędkość dozowania i prędkość opuszczania manifoldu myjki do studzienek na najniższą wartość, aby zminimalizować turbulencje w studzienkach.Odssać 30 µL pożywki z każdej studni i zastąpić ją 30 µL świeżej, uprzednio ogrzanej pożywki. Następnie przenieść komórki z powrotem do inkubatora. Wykonać obrazowanie MCTS w zautomatyzowanym systemie obrazowania wysokiej treści, używając obiektywu powietrznego 4X o aperturze numerycznej 16.Korzystając z oprogramowania do obrazowania, ustaw czas ekspozycji na 11 milliseconds oraz binning na cztery na cztery. Dostosuj liczbę i odstępy stosów z-stack oraz binning pikseli zgodnie z wymogami eksperymentu, aby uchwycić cały MCTS w każdej studzience. Przetwarzaj obrazy 2D krok po kroku, aby zmierzyć powierzchnię, oś główną i pomocniczą, obwód oraz solidność MCTS.Szczególne instrukcje znajdują się w załączonych plikach m-code oraz plikach tekstowych read me. Aby określić potencjalną przydatność procedury, siedmiodniowe MCTSy poddano działaniu różnych stężeń leków przeciwnowotworowych: paklitakselu (PTX), winkrystyny (VCR), oksaliplatyny (OXA), doksorubicyny (DOX) oraz 5-fluorouracylu (5-FU), w trzech różnych stężeniach przez cztery dni. Obrazy MCTSów przedstawiono tutaj.Obrazy te przeanalizowano w celu określenia pola powierzchni, osi głównej i pomocniczej, obwodu oraz zwartości MCTS traktowanych lekiem w porównaniu z kontrolami, CTL. Oś główną i pomocniczą wykorzystano do obliczenia objętości geometrycznej. Po zastosowaniu leku zaobserwowano zależny od stężenia spadek pola powierzchni i objętości MCTS.Chociaż stężenia 0,01 µg/mL winrystyny, 0,4 µg/mL doksorubicyny oraz 5-fluorouracylu spowodowały zwiększenie powierzchni MCTS, objętość wzrosła znacząco tylko po zastosowaniu 0,001 µg/mL winrystyny. Obwód MCTS różnił się znacząco jedynie przy najwyższych stężeniach paklitakselu, doksorubicyny i 5-fluorouracylu, co całkowicie wpłynęło na wielkość MCTS. Leczenie paklitakselem i winrystyną w dawkach odpowiednio 0,25 µg/mL i 0,06 µg/mL oraz doksorubicyną i 5-fluorouracylem w stężeniu 100 µg/mL doprowadziło do znaczącego spadku zwartości, co wskazuje na całkowity lub częściowy rozpad MCTS.Wzięte razem, dane te demonstrują użyteczność tej metody w badaniu potencjalnych leków przeciwnowotworowych. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu dwóch godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Przy próbach zastosowania tej procedury należy zauważyć, że nie wszystkie linie komórkowe nadają się do danej metody hodowli 3D, a różne linie komórkowe tworzą sferoidy wykazujące różnice w kształcie, wielkości, histologii i kinetyce wzrostu.Opracowana przez nas rutyna stymulacyjna pozwala na efektywną ocenę wielkości sferoidów, szczególnie w przypadku częściowo zdezintegrowanych sferoidów poddanych działaniu leków, które nie posiadają wyraźnie zdefiniowanej granicy do pomiaru pola powierzchni przekroju poprzecznego. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć pełną wiedzę na temat tego, że przedstawiona tutaj modyfikacja nie wymaga żadnego dodatkowego sprzętu ani materiałów eksploatacyjnych i może być rutynowo wdrożona w laboratorium przesiewowym zajmującym się stawonogami.

evaporation-reducing-culture-condition-increases-reproducibility

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Wprowadzamy protokół generowania dużych liczb (od tysięcy do setek tysięcy) sferoid guza o jednakowej wielkości i składzie, używając dostępnych na rynku płytek mikrodołkowych.

Produkcja dużej liczby sferoid guza o kontrolowanej wielkości przy użyciu płytek mikrodołkowych

Tutaj opisujemy szybki i elastyczny protokół tworzenia sferoid 3D komórek poprzez agregację komórek. Można go łatwo dostosować do wielu typów komórek i nadaje się do stosowania w różnych zastosowaniach, w tym w testach migracji komórek, inwazji lub anoikis, a także do obrazowania i ilościowego określania interakcji komórka-macierz.

Wydajna i elastyczna metoda agregacji komórek do produkcji sferoidów 3D

Ilościowa ocena wzrostu bakterii jest niezbędna do zrozumienia fizjologii drobnoustrojów jako zjawiska na poziomie systemu. Wprowadzono protokół manipulacji eksperymentalnej i podejście analityczne, pozwalające na precyzyjną, wysokoprzepustową analizę wzrostu bakterii, który jest kluczowym przedmiotem zainteresowania biologii systemów.

Precyzyjna, wysokoprzepustowa analiza wzrostu bakterii

Tutaj prezentujemy kilka prostych metod oceny żywotności i śmierci w sferoidach komórek rakowych 3D, które znacznie lepiej naśladują gradienty fizykochemiczne guzów in vivo niż hodowla 2D. Model sferoidalny umożliwia zatem ocenę skuteczności leku przeciwnowotworowego z lepszą translacją do warunków in vivo.

Ocena żywotności i śmierci komórek w sferoidalnych kulturach 3D komórek nowotworowych

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Tutaj opisujemy protokół systematycznej hodowli sferoidów naskórka w hodowli zawiesinowej 3D. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do stosowania w różnych typach tkanek nabłonkowych oraz do modelowania kilku chorób i stanów u ludzi.

Opracowanie wysokoprzepustowego systemu hodowli sferoidów naskórka do modelowania plastyczności komórek macierzystych keratynocytów

Te protokoły pomogą użytkownikom badać metabolizm energii mitochondrialnej w sferoidach 3D pochodzących z linii komórek rakowych za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse.

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Obecny protokół opisuje technikę wytwarzania sferoidów tkankowych na dużą skalę przy użyciu wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel.

Generowanie sferoid tkankowych za pomocą wydrukowanego w 3D urządzenia przypominającego stempel

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Przedstawiamy protokół do hodowli sferoidów o wysokiej powtarzalności i ich charakterystyki fenotypowej za pomocą przechwytywania obrazów i proteomiki.

Półautomatyczna analiza fenotypowa funkcjonalnych hodowli komórek sferoidalnych 3D

Tutaj opisujemy różne metody tworzenia wielokomórkowych sferoidów, aby przeprowadzić następczą wieloparametrową mikroskopię żywych komórek. Wykorzystując mikroskopię obrazowania czasu życia fluorescencji (FLIM), autofluorescencję komórkową, barwniki barwiące i nanocząstki, przedstawiono podejście do analizy metabolizmu komórkowego, niedotlenienia i śmierci komórki w żywych trójwymiarowych (3D) nowotworach i sferoidach pochodzących z komórek macierzystych.

Produkcja i wieloparametrowa mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji żywych komórek (FLIM) sferoid wielokomórkowych

Poznaj technikę nakładki ciekłej zmniejszającą parowanie w hodowli sferoidów wielokomórkowych na płytkach 384-dołkowych. Ta metoda poprawia odtwarzalność i skalowalność badań nowotworowych.

Warunek hodowli redukujący parowanie zwiększa odtwarzalność tworzenia wielokomórkowych sferoidów na płytkach mikromiareczkowych

Przeglądaj więcej filmów