Krzyżówki genetyczne

Krzyżówka genetyczna to celowe krycie dwóch osobników, w wyniku którego powstaje połączenie materiału genetycznego u potomstwa. Krzyżówki mogą być przeprowadzane w wielu systemach modelowych - w tym roślinach, drożdżach, muchach i myszach - i mogą być wykorzystywane do analizowania procesów genetycznych lub tworzenia organizmów o nowych cechach.

W tym filmie omówione zostaną niektóre zasady krzyżowania genetycznego, zbadana zostanie jedna z metod przeprowadzania krzyżówek znana jako analiza tetrada oraz omówione zostaną kilka zastosowań tej techniki.

Najpierw przedstawmy podstawowe zasady dziedziczenia, które umożliwiają krzyżowanie genetyczne.

Na fenotyp organizmu, czyli skład cech, wpływa jego skład genetyczny lub genotyp. W większości organizmów rozmnażających się płciowo pokolenie rodzicielskie wytwarza haploidalne komórki gametowe, które mają jedną kopię każdego odrębnego chromosomu. Następnie łączą się one podczas krycia, tworząc diploidalne potomstwo z dwiema homologicznymi kopiami każdego chromosomu. Jeśli oba chromosomy zawierają ten sam allel lub wariant formy genu, to organizm jest "homozygotyczny" w tym locus genetycznym; w przeciwnym razie jest "heterozygotyczny".

Aby rozpocząć cykl od nowa, organizm diploidalny ponownie wytwarza haploidalne gamety poprzez mejozę. Podczas tego procesu dwa homologiczne chromosomy ulegają "rekombinacji", w której między parą wymieniane są fragmenty równoważnych sekwencji. Proces ten tasuje allele rodzicielskie odziedziczone przez każde potomstwo, zwiększając w ten sposób ich różnorodność genetyczną.

Jedną z pierwszych osób, które przeprowadziły systematyczne krzyżówki genetyczne, był "ojciec genetyki", Gregor Mendel. Używając łatwego do manipulowania grochu i badając szereg cech o spójnych wzorcach dziedziczenia, Mendel był w stanie wyprowadzić trzy podstawowe prawa dziedziczenia, które stanowiły podstawę genetyki.

Pierwszym prawem Mendla jest prawo jednolitości, które mówi, że heterozygotyczne potomstwo pierwszego pokolenia (F1) dwóch homozygotycznych osobników będzie miało fenotyp tylko jednego rodzica. Allel ustanawiający ten fenotyp nazywany jest "dominującym", podczas gdy "ukryty" allel jest "recesywny". Obecnie wiemy, że relacje dominacji są często mniej jednoznaczne, z przypadkami takimi jak niepełna dominacja, w których heterozygoty wyrażają fenotyp mieszany; i kodominacji, w której prezentowane są oba fenotypy.

Prawo segregacji mówi, że jeden allel jest losowo przypisywany do każdej gamety. Obserwując, że potomstwo F2 z samozapłodnienia heterozygoty F1 wykazywało stosunek fenotypowy 3:1, ale że dwa z fenotypowo dominujących osobników są w rzeczywistości heterozygotami, Mendel wywnioskował, że dwa allele rodzicielskie muszą być dziedziczone oddzielnie. Dziś wiemy, że segregacja zachodzi podczas mejozy, kiedy dwa homologiczne chromosomy diploidalnego rodzica są losowo dzielone na haploidalne komórki potomne, z których każdy dziedziczy jeden z dwóch alleli.

Trzecim prawem Mendla jest prawo niezależnego asortymentu, które mówi, że indywidualne cechy są dziedziczone niezależnie. Obecnie wiemy, że absolutna niezależność istnieje tylko w przypadku cech kontrolowanych przez geny na oddzielnych chromosomach w zestawie haploidalnym, które są dystrybuowane niezależnie do komórek potomnych podczas mejozy. W przypadku dwóch genów na tym samym chromosomie odległość między nimi jest odwrotnie proporcjonalna do prawdopodobieństwa, że zostaną one ponownie połączone na różne chromosomy homologiczne, a co za tym idzie, do prawdopodobieństwa, że zostaną odziedziczone razem u tego samego potomstwa. Dlatego analiza czterech produktów mejotycznych organizmu diploidalnego zapewnia naukowcom sposób na mapowanie lokalizacji genów.

Po zapoznaniu się z zasadami stojącymi za krzyżówkami genetycznymi, przyjrzyjmy się protokołowi analizy tetradowej.

Technika ta jest zwykle stosowana do niektórych jednokomórkowych glonów lub grzybów, takich jak drożdże, w celu wypreparowania czterech haploidalnych produktów mejotycznych lub zarodników, które u tych gatunków pozostają razem jako "tetrada" w ciele pojedynczej komórki.

Aby przeprowadzić analizę tetradową drożdży, pożądane szczepy są najpierw hodowane na odpowiednich pożywkach. Komórki drożdży z poszczególnych kolonii mogą się kojarzyć, na przykład poprzez układanie każdego szczepu na krzyżu na nowej płytce. Płytka ta jest następnie replikowana na selektywnych pożywkach w celu wyizolowania tylko diploidalnego produktu krzyżówki.

Wybrane komórki diploidalne są hodowane na pożywkach ubogich w składniki odżywcze w celu wywołania zarodnikowania i tworzenia tetrad. Worki, które są strukturami utrzymującymi tetrady zarodników, są trawione w roztworach zawierających enzym zymolyazę. Po trawieniu poszczególne worki są manipulowane za pomocą mikroskopu do preparowania tetrady. Są one ułożone w określonych miejscach na płytce wzrostowej i przerywane, aby uwolnić poszczególne zarodniki. Można je umieścić we wzorze przypominającym siatkę, w którym każdy zarodnik wygeneruje indywidualną kolonię, którą można dalej analizować.

Teraz, gdy wiesz już, jak przeprowadzana jest analiza tetrada, przyjrzyjmy się niektórym z wielu zastosowań lub modyfikacji tej techniki.

Ręczna sekcja tetrad jest czasochłonna, a naukowcy opracowali alternatywne rozwiązania o wysokiej przepustowości, takie jak sekwencjonowanie tetrad za pomocą kodów kreskowych. W tej metodzie diploidalne potomstwo krzyżówki drożdży zostało przekształcone za pomocą biblioteki plazmidów, z których każdy zawiera krótką, unikalną sekwencję znaną jako "kod kreskowy", który działa jako identyfikator dla każdego potomstwa. Plazmidy wykazują również ekspresję GFP, co pozwala na selekcję worków drożdżowych za pomocą cytometrii przepływowej i sortowanie ich na płytkach agarowych. Worki były masowo lizowane na płytkach, a zarodniki pozwolono wyrosnąć na małe kolonie. Kolonie zostały następnie losowo rozmieszczone na 96-dołkowych płytkach w celu genotypowania. Unikalny kod kreskowy sekwencji pozwala naukowcom pogrupować cztery kolonie, które powstały z zarodników z każdej tetrady.

Krzyżówki genetyczne mogą być również wykorzystywane do generowania komórek drożdży z dużą liczbą delecji genów. W procesie zielonego potwora haploidalne zmutowane drożdże niosące różne delecje genów oznaczone GFP są krzyżowane i zarodnikowane. To haploidalne potomstwo, z których niektóre mają delecje odziedziczone po obojgu rodzicach, sortuje się za pomocą cytometrii przepływowej aktywowanej fluorescencją, w której wykazano, że intensywność GFP koreluje z liczbą delecji obecnych w danym szczepie drożdży. Te wybrane komórki zostały następnie wyhodowane i ponownie skrzyżowane. Powtórzenie tego cyklu wygenerowało szczepy drożdży zawierające liczne delecje.

Wreszcie, krzyżówki genetyczne zostały przystosowane do stosowania w wielu systemach modelowych, takich jak wywołujący malarię wewnątrzkomórkowy pasożyt Plasmodium. Ponieważ pasożyt może rozmnażać się tylko w innych komórkach, wszystkie etapy krzyżowania muszą być wykonywane u myszy lub komarów, odpowiednio naturalnego żywiciela i wektora pasożyta. W tym przypadku myszy zostały zarażone dwoma unikalnymi szczepami Plasmodium na etapie pasożyta krwi. Pasożyty zostały następnie przeniesione do komarów poprzez karmienie krwią, a po wejściu do środka dojrzały do gamet, które zapłodniły się, tworząc diploidalne zygoty. Dojrzałe sporozoity zostały następnie zebrane od komara i wykorzystane do zarażenia naiwnych myszy, gdzie pasożyty rozmnażano w celu wyizolowania interesującego nas potomstwa krzyżowego.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat krzyżówek genetycznych. W tym filmie przedstawiliśmy zasady dziedziczenia, sposób, w jaki krzyżówki genetyczne w niektórych organizmach mogą być analizowane za pomocą sekcji tetradowej oraz kilka aktualnych zastosowań. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!