Badania genetyczne
Badania genetyczne są ważnymi narzędziami do identyfikacji genów i mutacji odpowiedzialnych za fenotypy będące przedmiotem zainteresowania oraz do zrozumienia, w jaki sposób geny funkcjonują w procesach biologicznych. Badania przesiewowe są wykonywane w różnych systemach modelowych, w tym na muchach, robakach, roślinach i hodowlach komórkowych, i doprowadziły do odkrycia nowych szlaków komórkowych i potencjalnych celów leków na choroby ludzkie.
Ten film zawiera przegląd różnych rodzajów genetycznych badań przesiewowych, wyjaśni dwa ogólne protokoły badań przesiewowych u nicieni i pokaże niektóre sposoby, w jakie badania przesiewowe są obecnie stosowane w laboratoriach.
Najpierw przyjrzyjmy się, czym są genetyczne badania przesiewowe i czego możemy się z nich nauczyć.
Badania genetyczne opierają się na genetyce do przodu lub do tyłu. W "klasycznym" genetycznym badaniu przesiewowym mutacje są losowo generowane w DNA organizmu za pomocą promieniowania lub substancji chemicznych znanych jako mutageny. Dodatkowe zasady mogą być również wprowadzane do DNA za pomocą, na przykład, sekwencji znanych jako transpozony, które mogą integrować się w różnych miejscach w genomie i zakłócać funkcję genów, do których się wprowadzają. Tego typu insercje są często sprzężone z fluorescencyjnymi reporterami, aby umożliwić bezpośrednie wykrywanie zmutowanych organizmów. Kiedy okaże się, że mutant wykazuje fenotyp będący przedmiotem zainteresowania, nieznany gen, który został zmutowany, można następnie zmapować do chromosomu i zsekwencjonować.
Odwrotnym podejściem do badań przesiewowych jest odwrócone genetyczne badanie przesiewowe, w którym naukowcy zakłócają ekspresję wielu genów kandydujących, a następnie szukają zmutowanych fenotypów wynikających z tych manipulacji.
Oprócz mutacji powodujących utratę funkcji, które zakłócają aktywność genu, genetyczne badania przesiewowe mogą być również oparte na mutacjach "wzmocnienia funkcji", które powodują wzrost ekspresji lub funkcjonalności genu. Można to osiągnąć poprzez losowe wstawienie elementów regulatorowych genów do genomu, co spowodowałoby nadekspresję genu, do którego element ten wstawia się wcześniej.
Alternatywnie, w metodzie zwanej "przesiewowym badaniem ekspresji", naukowcy wykorzystują biblioteki plazmidów, które zawierają sekwencje kodujące białka różnych genów i wprowadzają je do komórek, w których geny będą miały wysoką ekspresję. Uzyskane w ten sposób fenotypy można następnie wykorzystać do zrozumienia funkcji genów.
Aby uzyskać więcej informacji na temat znanego genu lub mutacji, można zastosować badania przesiewowe modyfikatorów. Badanie supresorowe rozpoczyna się od scharakteryzowanego mutanta i identyfikuje dodatkowe mutacje, które sprawiają, że zmutowany fenotyp jest mniej dotkliwy. Mutacja supresorowa znaleziona w tym samym genie, co oryginalna mutacja, jest określana jako "wewnątrzgenowa", podczas gdy mutacja supresorowa zlokalizowana w innym genie jest uważana za "ekstragenową".
W przeciwieństwie do tego, badania przesiewowe wzmacniacza identyfikują dodatkowe mutacje, które zwiększają nasilenie zmutowanego fenotypu. Mogą one być pomocne w określaniu genów, które są nadmiarowe lub mogą funkcjonalnie wchodzić w interakcje. Jeśli połączenie dwóch lub więcej mutacji powoduje poważne upośledzenie wzrostu, a nawet śmierć, stan ten nazywa się "syntetyczną chorobą lub śmiertelnością". Badania przesiewowe w kierunku syntetycznych mutacji chorobowych lub śmiertelnych ujawniają geny, które funkcjonują w nadmiarowych, ale niezbędnych szlakach biologicznych. Jest to szczególnie przydatne, na przykład, w identyfikacji wielu produktów genowych, które mogą być jednocześnie ukierunkowane na leki zabijające komórki rakowe.
Teraz, gdy znasz już kilka typowych strategii genetycznych badań przesiewowych, przyjrzyjmy się ogólnemu protokołowi badania przesiewowego w kierunku przodu w popularnym organizmie modelowym, nicieniu.
W tym przykładzie mutageneza chemiczna zostanie przeprowadzona za pomocą metanosulfonianu etylu lub EMS, który działa poprzez chemiczną modyfikację nukleotydów guaniny, powodując ich niewłaściwe parowanie z tyminą w kolejnych rundach replikacji DNA. Ponieważ EMS jest mutagenem i może być czynnikiem rakotwórczym, należy się z nim obchodzić tylko w podwójnej warstwie rękawic, a praca powinna być prowadzona pod wyciągiem.
Na początek wybiera się, myje i zbiera dużą liczbę robaków w ostatnim stadium larwalnym. EMS jest następnie dodawany do robaków, a robaki są inkubowane przez kilka godzin w celu wywołania mutacji. Po mutagenezie EMS należy usunąć z robaków i inaktywować wodorotlenkiem sodu. Robaki są następnie wielokrotnie myte w pożywce wzrostowej i powlekane na płytkach agarowych.
Następnie zdrowo wyglądające robaki są przenoszone na nowe talerze świeżo obsiane bakteriami jako źródłem pożywienia i pozwalają się rozmnażać. Potomstwo drugiego pokolenia może być wizualnie badane pod kątem zmutowanych fenotypów, takich jak wady lokomotywy.
Przejdźmy teraz przez protokół odwrotnego genetycznego badania przesiewowego u nicieni.
Powszechnym podejściem do przeprowadzania odwróconych badań przesiewowych u robaków jest karmienie zwierząt biblioteką bakterii wyrażających dwuniciowe RNA, po jednym na szczep bakteryjny, co obniży ekspresję jednego genu kandydującego u robaków. Biblioteki te są często dostępne na rynku i mogą być subkulturowe do użytku na ekranach.
Na początek hoduje się pojedyncze kolonie bakterii zawierające indywidualne klony biblioteczne i indukuje się produkcję dwuniciowego RNA. Kultury są następnie nakrapiane na oddzielnych studzienkach płytki z pożywką wzrostową nicieni i pozostawiane do wyschnięcia w sterylnym okapie oparowym.
Następnie robaki są platerowane na bakteriach i pozostawiane do karmienia w wilgotnej komorze przez trzy do czterech dni. Zmutowane fenotypy można szybko zaobserwować, zarówno u oryginalnych robaków umieszczonych na płytkach pokarmowych, jak i u potomstwa pierwszego pokolenia.
Teraz, gdy już wiesz, jak wykonywane są genetyczne badania przesiewowe do przodu i do tyłu, omówmy niektóre z ich obecnych zastosowań.
Niektóre genetyczne badania przesiewowe są wykorzystywane, aby pomóc naukowcom zidentyfikować białka, które fizycznie oddziałują lub funkcjonują w tym samym szlaku molekularnym. W tym eksperymencie naukowcy opracowali wysokoprzepustowe badanie przesiewowe oparte na mikroskopii, aby odkryć nowe receptory transbłonowe, które aktywują określoną cząsteczkę sygnałową. Poprzez nadekspresję różnych genów w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych zawierających znakowane fluorescencyjnie białko sygnałowe, naukowcy byli w stanie monitorować, które receptory wpływają na subkomórkową lokalizację białka.
Innym zastosowaniem genetycznych badań przesiewowych jest charakterystyka interakcji gen-lek. W tym przypadku wygenerowano bibliotekę zmutowanych drożdży przy użyciu mutagenezy losowej na dużą skalę z insercjami transpozonów. Każdy zmutowany szczep był następnie hodowany w obecności leku. Wzrost każdego szczepu określono ilościowo za pomocą PCR, a następnie mikromacierzy lub analizy sekwencjonowania w celu określenia, które mutanty, w porównaniu z niezmutowanymi kontrolami, były wrażliwe na leczenie farmakologiczne.
Wreszcie, badania przesiewowe mogą być wykorzystane do zrozumienia genów i sieci molekularnych zaburzonych w chorobach ludzkich. Naukowcy w tym eksperymencie hodowali neurony w obecności wirusów kodujących RNA, aby obniżyć ekspresję wielu różnych genów docelowych. Następnie wykorzystano zautomatyzowaną analizę komórek wybarwionych immunologicznie, aby ujawnić geny, które wpływają na właściwości fizyczne neuronów, takie jak rozrost neurytów. W ramach tego podejścia udało się zidentyfikować geny odpowiedzialne za choroby neurodegeneracyjne.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat genetycznych ekranów – potężnej techniki odkrywania genów zaangażowanych w kluczowe procesy biologiczne. W tym filmie dokonaliśmy przeglądu niektórych głównych rodzajów genetycznych badań przesiewowych, ogólnych protokołów wykonywania badań przesiewowych zarówno do przodu, jak i do tyłu, a także omówiliśmy, w jaki sposób te metody są obecnie stosowane w laboratoriach. Dzięki za oglądanie!
Badania genetyczne są kluczowymi narzędziami do definiowania funkcji genów i zrozumienia interakcji genów. Badania przesiewowe zazwyczaj obejmują muta…
Badania genetyczne są ważnymi narzędziami do identyfikacji genów i mutacji odpowiedzialnych za fenotypy będące przedmiotem zainteresowania oraz do zrozumienia, w jaki sposób geny funkcjonują w procesach biologicznych. Badania przesiewowe są wykonywane w różnych systemach modelowych, w tym na muchach, robakach, roślinach i hodowlach komórkowych, i doprowadziły do odkrycia nowych szlaków komórkowych i potencjalnych celów leków na choroby ludzkie.
Ten film zawiera przegląd różnych rodzajów genetycznych badań przesiewowych, wyjaśni dwa ogólne protokoły badań przesiewowych u nicieni i pokaże niektóre sposoby, w jakie badania przesiewowe są obecnie stosowane w laboratoriach.
Najpierw przyjrzyjmy się, czym są genetyczne badania przesiewowe i czego możemy się z nich nauczyć.
Badania genetyczne opierają się na genetyce do przodu lub do tyłu. W "klasycznym" genetycznym badaniu przesiewowym mutacje są losowo generowane w DNA organizmu za pomocą promieniowania lub substancji chemicznych znanych jako mutageny. Dodatkowe zasady mogą być również wprowadzane do DNA za pomocą, na przykład, sekwencji znanych jako transpozony, które mogą integrować się w różnych miejscach w genomie i zakłócać funkcję genów, do których się wprowadzają. Tego typu insercje są często sprzężone z fluorescencyjnymi reporterami, aby umożliwić bezpośrednie wykrywanie zmutowanych organizmów. Kiedy okaże się, że mutant wykazuje fenotyp będący przedmiotem zainteresowania, nieznany gen, który został zmutowany, można następnie zmapować do chromosomu i zsekwencjonować.
Odwrotnym podejściem do badań przesiewowych jest odwrócone genetyczne badanie przesiewowe, w którym naukowcy zakłócają ekspresję wielu genów kandydujących, a następnie szukają zmutowanych fenotypów wynikających z tych manipulacji.
Oprócz mutacji powodujących utratę funkcji, które zakłócają aktywność genu, genetyczne badania przesiewowe mogą być również oparte na mutacjach "wzmocnienia funkcji", które powodują wzrost ekspresji lub funkcjonalności genu. Można to osiągnąć poprzez losowe wstawienie elementów regulatorowych genów do genomu, co spowodowałoby nadekspresję genu, do którego element ten wstawia się wcześniej.
Alternatywnie, w metodzie zwanej "przesiewowym badaniem ekspresji", naukowcy wykorzystują biblioteki plazmidów, które zawierają sekwencje kodujące białka różnych genów i wprowadzają je do komórek, w których geny będą miały wysoką ekspresję. Uzyskane w ten sposób fenotypy można następnie wykorzystać do zrozumienia funkcji genów.
Aby uzyskać więcej informacji na temat znanego genu lub mutacji, można zastosować badania przesiewowe modyfikatorów. Badanie supresorowe rozpoczyna się od scharakteryzowanego mutanta i identyfikuje dodatkowe mutacje, które sprawiają, że zmutowany fenotyp jest mniej dotkliwy. Mutacja supresorowa znaleziona w tym samym genie, co oryginalna mutacja, jest określana jako "wewnątrzgenowa", podczas gdy mutacja supresorowa zlokalizowana w innym genie jest uważana za "ekstragenową".
W przeciwieństwie do tego, badania przesiewowe wzmacniacza identyfikują dodatkowe mutacje, które zwiększają nasilenie zmutowanego fenotypu. Mogą one być pomocne w określaniu genów, które są nadmiarowe lub mogą funkcjonalnie wchodzić w interakcje. Jeśli połączenie dwóch lub więcej mutacji powoduje poważne upośledzenie wzrostu, a nawet śmierć, stan ten nazywa się "syntetyczną chorobą lub śmiertelnością". Badania przesiewowe w kierunku syntetycznych mutacji chorobowych lub śmiertelnych ujawniają geny, które funkcjonują w nadmiarowych, ale niezbędnych szlakach biologicznych. Jest to szczególnie przydatne, na przykład, w identyfikacji wielu produktów genowych, które mogą być jednocześnie ukierunkowane na leki zabijające komórki rakowe.
Teraz, gdy znasz już kilka typowych strategii genetycznych badań przesiewowych, przyjrzyjmy się ogólnemu protokołowi badania przesiewowego w kierunku przodu w popularnym organizmie modelowym, nicieniu.
W tym przykładzie mutageneza chemiczna zostanie przeprowadzona za pomocą metanosulfonianu etylu lub EMS, który działa poprzez chemiczną modyfikację nukleotydów guaniny, powodując ich niewłaściwe parowanie z tyminą w kolejnych rundach replikacji DNA. Ponieważ EMS jest mutagenem i może być czynnikiem rakotwórczym, należy się z nim obchodzić tylko w podwójnej warstwie rękawic, a praca powinna być prowadzona pod wyciągiem.
Na początek wybiera się, myje i zbiera dużą liczbę robaków w ostatnim stadium larwalnym. EMS jest następnie dodawany do robaków, a robaki są inkubowane przez kilka godzin w celu wywołania mutacji. Po mutagenezie EMS należy usunąć z robaków i inaktywować wodorotlenkiem sodu. Robaki są następnie wielokrotnie myte w pożywce wzrostowej i powlekane na płytkach agarowych.
Następnie zdrowo wyglądające robaki są przenoszone na nowe talerze świeżo obsiane bakteriami jako źródłem pożywienia i pozwalają się rozmnażać. Potomstwo drugiego pokolenia może być wizualnie badane pod kątem zmutowanych fenotypów, takich jak wady lokomotywy.
Przejdźmy teraz przez protokół odwrotnego genetycznego badania przesiewowego u nicieni.
Powszechnym podejściem do przeprowadzania odwróconych badań przesiewowych u robaków jest karmienie zwierząt biblioteką bakterii wyrażających dwuniciowe RNA, po jednym na szczep bakteryjny, co obniży ekspresję jednego genu kandydującego u robaków. Biblioteki te są często dostępne na rynku i mogą być subkulturowe do użytku na ekranach.
Na początek hoduje się pojedyncze kolonie bakterii zawierające indywidualne klony biblioteczne i indukuje się produkcję dwuniciowego RNA. Kultury są następnie nakrapiane na oddzielnych studzienkach płytki z pożywką wzrostową nicieni i pozostawiane do wyschnięcia w sterylnym okapie oparowym.
Następnie robaki są platerowane na bakteriach i pozostawiane do karmienia w wilgotnej komorze przez trzy do czterech dni. Zmutowane fenotypy można szybko zaobserwować, zarówno u oryginalnych robaków umieszczonych na płytkach pokarmowych, jak i u potomstwa pierwszego pokolenia.
Teraz, gdy już wiesz, jak wykonywane są genetyczne badania przesiewowe do przodu i do tyłu, omówmy niektóre z ich obecnych zastosowań.
Niektóre genetyczne badania przesiewowe są wykorzystywane, aby pomóc naukowcom zidentyfikować białka, które fizycznie oddziałują lub funkcjonują w tym samym szlaku molekularnym. W tym eksperymencie naukowcy opracowali wysokoprzepustowe badanie przesiewowe oparte na mikroskopii, aby odkryć nowe receptory transbłonowe, które aktywują określoną cząsteczkę sygnałową. Poprzez nadekspresję różnych genów w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych zawierających znakowane fluorescencyjnie białko sygnałowe, naukowcy byli w stanie monitorować, które receptory wpływają na subkomórkową lokalizację białka.
Innym zastosowaniem genetycznych badań przesiewowych jest charakterystyka interakcji gen-lek. W tym przypadku wygenerowano bibliotekę zmutowanych drożdży przy użyciu mutagenezy losowej na dużą skalę z insercjami transpozonów. Każdy zmutowany szczep był następnie hodowany w obecności leku. Wzrost każdego szczepu określono ilościowo za pomocą PCR, a następnie mikromacierzy lub analizy sekwencjonowania w celu określenia, które mutanty, w porównaniu z niezmutowanymi kontrolami, były wrażliwe na leczenie farmakologiczne.
Wreszcie, badania przesiewowe mogą być wykorzystane do zrozumienia genów i sieci molekularnych zaburzonych w chorobach ludzkich. Naukowcy w tym eksperymencie hodowali neurony w obecności wirusów kodujących RNA, aby obniżyć ekspresję wielu różnych genów docelowych. Następnie wykorzystano zautomatyzowaną analizę komórek wybarwionych immunologicznie, aby ujawnić geny, które wpływają na właściwości fizyczne neuronów, takie jak rozrost neurytów. W ramach tego podejścia udało się zidentyfikować geny odpowiedzialne za choroby neurodegeneracyjne.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat genetycznych ekranów – potężnej techniki odkrywania genów zaangażowanych w kluczowe procesy biologiczne. W tym filmie dokonaliśmy przeglądu niektórych głównych rodzajów genetycznych badań przesiewowych, ogólnych protokołów wykonywania badań przesiewowych zarówno do przodu, jak i do tyłu, a także omówiliśmy, w jaki sposób te metody są obecnie stosowane w laboratoriach. Dzięki za oglądanie!
Badania genetyczne są ważnymi narzędziami do identyfikacji genów i mutacji odpowiedzialnych za fenotypy będące przedmiotem zainteresowania oraz do zrozumienia, w jaki sposób geny funkcjonują w procesach biologicznych. Badania przesiewowe są wykonywane w różnych systemach modelowych, w tym na muchach, robakach, roślinach i hodowlach komórkowych, i doprowadziły do odkrycia nowych szlaków komórkowych i potencjalnych celów leków na choroby ludzkie.
Ten film zawiera przegląd różnych rodzajów genetycznych badań przesiewowych, wyjaśni dwa ogólne protokoły badań przesiewowych u nicieni i pokaże niektóre sposoby, w jakie badania przesiewowe są obecnie stosowane w laboratoriach.
Najpierw przyjrzyjmy się, czym są genetyczne badania przesiewowe i czego możemy się z nich nauczyć.
Badania genetyczne opierają się na genetyce do przodu lub do tyłu. W "klasycznym" genetycznym badaniu przesiewowym mutacje są losowo generowane w DNA organizmu za pomocą promieniowania lub substancji chemicznych znanych jako mutageny. Dodatkowe zasady mogą być również wprowadzane do DNA za pomocą, na przykład, sekwencji znanych jako transpozony, które mogą integrować się w różnych miejscach w genomie i zakłócać funkcję genów, do których się wprowadzają. Tego typu insercje są często sprzężone z fluorescencyjnymi reporterami, aby umożliwić bezpośrednie wykrywanie zmutowanych organizmów. Kiedy okaże się, że mutant wykazuje fenotyp będący przedmiotem zainteresowania, nieznany gen, który został zmutowany, można następnie zmapować do chromosomu i zsekwencjonować.
Odwrotnym podejściem do badań przesiewowych jest odwrócone genetyczne badanie przesiewowe, w którym naukowcy zakłócają ekspresję wielu genów kandydujących, a następnie szukają zmutowanych fenotypów wynikających z tych manipulacji.
Oprócz mutacji powodujących utratę funkcji, które zakłócają aktywność genu, genetyczne badania przesiewowe mogą być również oparte na mutacjach "wzmocnienia funkcji", które powodują wzrost ekspresji lub funkcjonalności genu. Można to osiągnąć poprzez losowe wstawienie elementów regulatorowych genów do genomu, co spowodowałoby nadekspresję genu, do którego element ten wstawia się wcześniej.
Alternatywnie, w metodzie zwanej "przesiewowym badaniem ekspresji", naukowcy wykorzystują biblioteki plazmidów, które zawierają sekwencje kodujące białka różnych genów i wprowadzają je do komórek, w których geny będą miały wysoką ekspresję. Uzyskane w ten sposób fenotypy można następnie wykorzystać do zrozumienia funkcji genów.
Aby uzyskać więcej informacji na temat znanego genu lub mutacji, można zastosować badania przesiewowe modyfikatorów. Badanie supresorowe rozpoczyna się od scharakteryzowanego mutanta i identyfikuje dodatkowe mutacje, które sprawiają, że zmutowany fenotyp jest mniej dotkliwy. Mutacja supresorowa znaleziona w tym samym genie, co oryginalna mutacja, jest określana jako "wewnątrzgenowa", podczas gdy mutacja supresorowa zlokalizowana w innym genie jest uważana za "ekstragenową".
W przeciwieństwie do tego, badania przesiewowe wzmacniacza identyfikują dodatkowe mutacje, które zwiększają nasilenie zmutowanego fenotypu. Mogą one być pomocne w określaniu genów, które są nadmiarowe lub mogą funkcjonalnie wchodzić w interakcje. Jeśli połączenie dwóch lub więcej mutacji powoduje poważne upośledzenie wzrostu, a nawet śmierć, stan ten nazywa się "syntetyczną chorobą lub śmiertelnością". Badania przesiewowe w kierunku syntetycznych mutacji chorobowych lub śmiertelnych ujawniają geny, które funkcjonują w nadmiarowych, ale niezbędnych szlakach biologicznych. Jest to szczególnie przydatne, na przykład, w identyfikacji wielu produktów genowych, które mogą być jednocześnie ukierunkowane na leki zabijające komórki rakowe.
Teraz, gdy znasz już kilka typowych strategii genetycznych badań przesiewowych, przyjrzyjmy się ogólnemu protokołowi badania przesiewowego w kierunku przodu w popularnym organizmie modelowym, nicieniu.
W tym przykładzie mutageneza chemiczna zostanie przeprowadzona za pomocą metanosulfonianu etylu lub EMS, który działa poprzez chemiczną modyfikację nukleotydów guaniny, powodując ich niewłaściwe parowanie z tyminą w kolejnych rundach replikacji DNA. Ponieważ EMS jest mutagenem i może być czynnikiem rakotwórczym, należy się z nim obchodzić tylko w podwójnej warstwie rękawic, a praca powinna być prowadzona pod wyciągiem.
Na początek wybiera się, myje i zbiera dużą liczbę robaków w ostatnim stadium larwalnym. EMS jest następnie dodawany do robaków, a robaki są inkubowane przez kilka godzin w celu wywołania mutacji. Po mutagenezie EMS należy usunąć z robaków i inaktywować wodorotlenkiem sodu. Robaki są następnie wielokrotnie myte w pożywce wzrostowej i powlekane na płytkach agarowych.
Następnie zdrowo wyglądające robaki są przenoszone na nowe talerze świeżo obsiane bakteriami jako źródłem pożywienia i pozwalają się rozmnażać. Potomstwo drugiego pokolenia może być wizualnie badane pod kątem zmutowanych fenotypów, takich jak wady lokomotywy.
Przejdźmy teraz przez protokół odwrotnego genetycznego badania przesiewowego u nicieni.
Powszechnym podejściem do przeprowadzania odwróconych badań przesiewowych u robaków jest karmienie zwierząt biblioteką bakterii wyrażających dwuniciowe RNA, po jednym na szczep bakteryjny, co obniży ekspresję jednego genu kandydującego u robaków. Biblioteki te są często dostępne na rynku i mogą być subkulturowe do użytku na ekranach.
Na początek hoduje się pojedyncze kolonie bakterii zawierające indywidualne klony biblioteczne i indukuje się produkcję dwuniciowego RNA. Kultury są następnie nakrapiane na oddzielnych studzienkach płytki z pożywką wzrostową nicieni i pozostawiane do wyschnięcia w sterylnym okapie oparowym.
Następnie robaki są platerowane na bakteriach i pozostawiane do karmienia w wilgotnej komorze przez trzy do czterech dni. Zmutowane fenotypy można szybko zaobserwować, zarówno u oryginalnych robaków umieszczonych na płytkach pokarmowych, jak i u potomstwa pierwszego pokolenia.
Teraz, gdy już wiesz, jak wykonywane są genetyczne badania przesiewowe do przodu i do tyłu, omówmy niektóre z ich obecnych zastosowań.
Niektóre genetyczne badania przesiewowe są wykorzystywane, aby pomóc naukowcom zidentyfikować białka, które fizycznie oddziałują lub funkcjonują w tym samym szlaku molekularnym. W tym eksperymencie naukowcy opracowali wysokoprzepustowe badanie przesiewowe oparte na mikroskopii, aby odkryć nowe receptory transbłonowe, które aktywują określoną cząsteczkę sygnałową. Poprzez nadekspresję różnych genów w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych zawierających znakowane fluorescencyjnie białko sygnałowe, naukowcy byli w stanie monitorować, które receptory wpływają na subkomórkową lokalizację białka.
Innym zastosowaniem genetycznych badań przesiewowych jest charakterystyka interakcji gen-lek. W tym przypadku wygenerowano bibliotekę zmutowanych drożdży przy użyciu mutagenezy losowej na dużą skalę z insercjami transpozonów. Każdy zmutowany szczep był następnie hodowany w obecności leku. Wzrost każdego szczepu określono ilościowo za pomocą PCR, a następnie mikromacierzy lub analizy sekwencjonowania w celu określenia, które mutanty, w porównaniu z niezmutowanymi kontrolami, były wrażliwe na leczenie farmakologiczne.
Wreszcie, badania przesiewowe mogą być wykorzystane do zrozumienia genów i sieci molekularnych zaburzonych w chorobach ludzkich. Naukowcy w tym eksperymencie hodowali neurony w obecności wirusów kodujących RNA, aby obniżyć ekspresję wielu różnych genów docelowych. Następnie wykorzystano zautomatyzowaną analizę komórek wybarwionych immunologicznie, aby ujawnić geny, które wpływają na właściwości fizyczne neuronów, takie jak rozrost neurytów. W ramach tego podejścia udało się zidentyfikować geny odpowiedzialne za choroby neurodegeneracyjne.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat genetycznych ekranów – potężnej techniki odkrywania genów zaangażowanych w kluczowe procesy biologiczne. W tym filmie dokonaliśmy przeglądu niektórych głównych rodzajów genetycznych badań przesiewowych, ogólnych protokołów wykonywania badań przesiewowych zarówno do przodu, jak i do tyłu, a także omówiliśmy, w jaki sposób te metody są obecnie stosowane w laboratoriach. Dzięki za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between forward and reverse genetic screens?
Forward genetic screens randomly generate mutations in an organism's DNA using mutagens or transposons, then identify unknown genes responsible for phenotypes of interest. Reverse genetic screens take the opposite approach: researchers target specific candidate genes for disruption, then observe resulting mutant phenotypes. Both methods help uncover gene function and biological pathways.
Q2: How do loss-of-function and gain-of-function mutations differ in genetic screens?
Loss-of-function mutations disrupt a gene's activity, reducing its expression or function. Gain-of-function mutations increase a gene's expression or functionality, often by inserting regulatory elements that drive overexpression. Expression screening uses plasmid libraries containing protein-coding sequences to achieve gain-of-function effects and understand gene function.
Q3: What are suppressor and enhancer screens used for?
Suppressor screens identify mutations that reduce the severity of an existing mutant phenotype, revealing genes that interact or compensate for the original mutation. Enhancer screens find mutations that increase phenotype severity, helping determine redundant or functionally interacting genes. Synthetic lethality screens reveal genes in essential but redundant pathways, useful for identifying drug targets in cancer therapy.
Q4: How is chemical mutagenesis performed in nematode worms?
In forward screens using nematodes, worms at the last larval stage are exposed to ethyl methanesulfonate (EMS), a chemical mutagen that modifies guanine nucleotides, causing mispairing with thymine during DNA replication. After several hours of incubation, EMS is removed and inactivated with sodium hydroxide. Worms are then washed, plated on agar with bacterial food, and allowed to reproduce for screening.
Q5: What is the protocol for reverse genetic screening in nematodes?
Reverse screens in nematodes use bacterial libraries expressing double-stranded RNA targeting individual candidate genes. Bacteria are cultured, spotted onto plates with nematode growth medium, and allowed to dry. Worms feed on the bacteria for three to four days in a humidified chamber, and mutant phenotypes are observed in original worms or first-generation progeny.
Q6: How are genetic screens applied to identify protein interactions and drug targets?
Researchers use high-throughput microscopy-based screens to discover receptors affecting signaling protein localization by overexpressing genes in cultured cells. For drug interactions, mutant libraries are grown with drugs, and growth is quantified using detection and quantification of nucleic acids by real time PCR followed by microarray or sequencing analysis to identify drug-sensitive strains.
Q7: How can genetic screens help understand genes involved in neurodegenerative diseases?
Researchers culture neurons in the presence of RNA-encoding viruses to knock down expression of many target genes. Automated analysis of immunostained cells reveals genes influencing neuronal properties like neurite outgrowth. This approach has successfully identified genes involved in neurodegenerative diseases, demonstrating how screens uncover molecular networks disrupted in human disease.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:48
Genetic Screens
3:56
General Protocol for Forward Genetic Screen
5:22
General Protocol for Reverse Genetic Screen
6:30
Applications
8:21
Summary