Name: Tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3D (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 40 s
Description: Poznaj metodę biodruku 3D tkanki serca bez biomateriałów, wykorzystującą sferoidy komórkowe. Technika ta umożliwia tworzenie funkcjonalnych łatek kardiologicznych z potencjałem regeneracyjnym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy podają następujące źródła finansowania: Magic That Matters Fund for Cardiovascular Research oraz Maryland Stem Cell Research Fund (2016-MSCRFI-2735).

1. Przygotowanie kardiomiocytów
<ol>
	<li>Wygeneruj i hoduj ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) na 6-dołkowych płytkach pokrytych macierzą błony podstawnej, jak opisano10.</li>
	<li>Różnicowanie hiPSC na kardiomiocyty pochodzące z hiPSC (hiPSC-CMs) przy użyciu wcześniej opisanych metod11,12.</li>
	<li>W 19 dniu po różnicowaniu wyizolować kardiomiocyty za pomocą 2 ml trypsyny/EDTA 0,05% w każdym dołku przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Monitoruj kardiomiocyty pod mikroskopem optycznym, aby obserwować dysocjację komórek.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę za pomocą 2 ml inhibitora trypsyny 0,0125%.</li>
	<li>Połącz izolowane kardiomiocyty i przenieś je do jednej stożkowej rurki o pojemności 50 ml za pomocą zmotoryzowanego napełniacza pipety.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 250 x g w temperaturze pokojowej w celu uzyskania osadu.</li>
	<li>Zawiesić osad w 5 ml pożywki komórkowej Roswell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej B-27 (pożywka komórkowa RPMI/B-27).</li>
	<li>Odpipetować 20 μl komórek w pożywce komórkowej i wybarwić równą ilością 0,4% roztworu błękitu trypanowego.</li>
	<li>Użyj automatycznego licznika komórek lub ręcznego hemocytometru, aby policzyć i uzyskać stężenie i żywotność zawiesiny komórek.</li>
</ol>
2. Przygotowanie fibroblastów
<ol>
	<li>Zainicjuj linię komórkową ludzkiego fibroblastu serca (HCF) (dorosłego typu komorowego)13.</li>
	<li>Przejście i odizolowanie ich zgodnie z protokołami hodowli HCF13.</li>
	<li>Odpipetować 20 μl komórek w pożywce komórkowej i wybarwić równą ilością roztworu błękitu trypanowego 0,4%.</li>
	<li>Użyj automatycznego licznika komórek lub ręcznego hemocytometru, aby policzyć i uzyskać stężenie i żywotność nowej zawiesiny komórek.</li>
</ol>
3. Przygotowanie komórek śródbłonka
<ol>
	<li>Zainicjuj linię ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) zgodnie z opisem14. Przejdź i wyizoluj je zgodnie z protokołami hodowli HUVEC zgodnie z opisem14.</li>
	<li>Odpipetować 20 μl komórek w pożywce komórkowej i wybarwić równą ilością 0,4% roztworu błękitu trypanowego.</li>
	<li>Użyj automatycznego licznika komórek lub ręcznego hemocytometru, aby policzyć i uzyskać stężenie i żywotność zawiesiny komórek.</li>
</ol>
4. Współkultura:
<ol>
	<li>Wymieszaj trzy typy komórek (hiPSC-CM, HCF i HUVEC) w pożywkach komórkowych RPMI/B-27, aby wytworzyć zapas roztworu mieszanych komórek w stożkowej probówce o pojemności 50 ml, przy stosunku komórek hiPSC-CM:HCF:HUVEC wynoszącym 70:15:15 i stężeniu 165 000 komórek na ml.</li>
	<li>Rozprowadź roztwór mieszanych komórek na 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie litery U o bardzo niskim mocowaniu w ilości 200 μl na dołek lub 33 000 komórek na dołek, używając pipety wielokanałowej.</li>
	<li>Inkubować 96-dołkowe płytki przez 3 dni (37°C, 5% dwutlenku węgla, 95% wilgotności).</li>
	<li>Sprawdzić, czy w środku i na dnie poszczególnych studzienek znajdują się wielokomórkowe sferoidy o mieszanych komórkach, pod mikroskopem świetlnym. 
	UWAGA: W dwuwymiarowej projekcji mikroskopowej sferoidy te będą miały okrągły kształt (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Sferoidy powinny uformować się w ciągu 24 godzin, po wysianiu komórek do 96-dołkowych płytek o bardzo niskim przyłączeniu. Sferoidy powinny zacząć bić w ciągu 48 godzin, po wysianiu komórek do 96-dołkowych płytek. Sferoidy, które nie biją, nie powinny być używane do biodruku 3D, aby zapewnić, że ostateczna biodrukowana w 3D łatka serca jest funkcjonalna. Immunofluorescencja sferoidów dla koneksyny 43 (Cx43) i troponiny może być wykorzystana do oceny składu i jakości komórek sferoidalnych15.</li>
</ol>
5. 3D Bioprinting tkanek serca bez rusztowań
<ol>
	<li>Załaduj płytki zawierające sferoidy do magazynków biodrukarki 3D opartej na sferoidach bez rusztowań.</li>
	<li>Włącz biodrukarkę 3D i uruchom oprogramowanie do biodruku 3D.
	<ol>
		<li>Kliknij "Pomocniczy", "Przygotowanie do operacji", "Tryb inspekcji", a następnie "Powrót do domu".</li>
		<li>Kliknij zieloną ikonę w obszarze "Start", aby rozpocząć inspekcję sferoidów.</li>
		<li>Zwróć uwagę, czy średnice sferoid pojawią się pod kolumną "(2) Dia (μm)" na ekranie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby oszacować średnią średnicę sferoidy z dokładnością do 100 μm, kliknij "Ustawienia początkowe" i wprowadź średnią średnicę sferoidy w polu Podziałka stosu Z (μm).</li>
	<li>Kliknij "Łącznie", liczba w sekcji "Warstwy" powinna zostać automatycznie dostosowana. Kliknij "Zastosuj", aby potwierdzić ustawienia.</li>
	<li>Kliknij "Mapa macierzy igieł", przejdź do "Nr warstwy", wybierz żądaną warstwę do biodruku 3D i narysuj żądany projekt biodruku 3D na mapie po lewej stronie ekranu, wybierając poszczególne pozycje sferoidów. Kliknij "Zastosuj", aby potwierdzić projekt biodruku 3D.</li>
	<li>Kliknij "Kontrola szyku igieł", aby rozpocząć inspekcję szyku igieł. Jeśli układ igieł jest nieostry, wprowadź wartości do "OffsetZ (μm)", w zakresie od 0 do 500 μm, aby dostosować ostrość kamery, zaczynając od 500 μm i zmniejszając o 100 μm do 0 μm.</li>
	<li>Kliknij "Parametry kontroli", "Typ 1" i ustaw "Średnica (μm)" na żądany zakres średnic. Ustaw "Zaokrąglenie (%)" i "Gładkość (%)" na żądane wartości procentowe. Kliknij "Zastosuj", aby potwierdzić ustawienia. 
	UWAGA: Tutaj średnice sferoid zostały ustawione w zakresie od 450 μm do 550 μm. "Okrągłość (%)" i "Gładkość (%)" są obliczoną komputerowo oceną każdej pojedynczej sferoidy. Tutaj ustawienia używane dla "Zaokrąglenia (%)" to 60%, a "Gładkość (%)" to 70%.</li>
	<li>Kliknij "Obecność" i zaktualizuj "Średnicę (μm)" do tych samych ustawień co w poprzednim kroku. Kliknij "Zastosuj", aby potwierdzić ustawienia.</li>
	<li>Kliknij "Tryb stosu", a następnie zieloną ikonę w obszarze "Start", aby rozpocząć pobieranie sferoidów za pomocą dyszy biodrukarki 3D poprzez odsysanie próżniowe i umieszczanie sferoid w określonych miejscach w układzie igieł. 
	UWAGA: W przypadku plastra serca składającego się z 81 sferoid (9 sferoid x 9 sferoidów), biodrukowanie 3D powinno zająć około 20 do 30 minut.</li>
	<li>Po bioprintingu, za pomocą sterylnych kleszczy, podnieś matrycę igieł zawierającą biodrukowaną łatkę 3D i przenieś ją do sterylnej zlewki o pojemności 250 ml zawierającej 150 ml pożywki komórkowej RPMI/B-27.</li>
	<li>Inkubuj biodrukowany plaster 3D za pomocą zestawu igieł przez 3 dni (37°C, 5% dwutlenku węgla, 95% wilgotności).</li>
</ol>
6. Usunięcie biodrukowanej łatki 3D z matrycy igieł i dojrzewanie łaty
<ol>
	<li>Po 3 dniach inkubacji, trzymając jedną rękę u podstawy układu igieł, a drugą na plastikowej osłonie pod plastrem, delikatnie przesuń plastikową osłonę do góry, aby usunąć biodrukowaną łatkę 3D z matrycy igieł. 
	UWAGA: W razie potrzeby można nasmarować igły solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), w razie potrzeby, w celu płynniejszego i łatwiejszego usuwania.</li>
	<li>Za pomocą pary sterylnych kleszczy podnieś plastikową osłonę z biodrukowaną naszywką 3D na wierzchu i przenieś plaster i plastikową osłonę do naczynia o średnicy 35 mm zawierającego pożywkę komórkową RPMI/B-27.</li>
	<li>Delikatnie potrząśnij plastikową osłoną z plastrem w pożywce z ogniwami RPMI/B-27, trzymając kleszcze nadal trzymające się plastikowej osłony, aby uwolnić plaster do podłoża.</li>
	<li>Sprawdź biodrukowaną łatkę 3D pod mikroskopem świetlnym, aby zobaczyć, czy bije, aby upewnić się, że biodrukowana łatka 3D jest funkcjonalna.</li>
	<li>Inkubuj biodrukowany plaster 3D w naczyniu 35 mm przez 3 dni lub dłużej (37°C, 5% dwutlenku węgla, 95% wilgotności). 
	UWAGA: Po 3 dniach sferoidy łączą się ze sobą, a otwory w plastrze, w których znajdowały się igły, nie powinny być już widoczne.</li>
</ol>

<ol><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).</li>
<li>Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+biofabrication+strategies+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).</li>
<li>Patra, S., Young, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+3D+Printing+Techniques+and+the+Future+in+Biofabrication+of+Bioprinted+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophy%22%5BJournal%5D)">A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue.</a> Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).</li>
<li>Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+the+Kenzan+Method+for+Robotic+Cell+Spheroid-Based+Three-Dimensional+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting.</a> Tissue Eng Part B Rev. , (2017).</li>
<li>Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+inkjet+printing+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+Drug+Deliv+Formul%22%5BJournal%5D)">Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).</li>
<li>Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+mean+pore+size+on+cell+attachment%2C+proliferation+and+migration+in+collagen-glycosaminoglycan+scaffolds+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater%22%5BJournal%5D)">The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomater. 31, 461-466 (2010).</li>
<li>Noguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+pre-vascularized+scaffold-free+contractile+cardiac+patch+for+treating+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transpl%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease.</a> J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).</li>
<li>Mironov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater%22%5BJournal%5D)">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomater. 30, 2164-2174 (2009).</li>
<li>Itoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-Free+Tubular+Tissues+Created+by+a+Bio-3D+Printer+Undergo+Remodeling+and+Endothelialization+when+Implanted+in+Rat+Aortae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae.</a> PloS One. 10, e0136681(2015).</li>
<li>Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+CytoTune%2C+a+non-integrating+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus.</a> Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).</li>
<li>Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+basis+of+excitation-contraction+coupling+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+ventricular+cardiomyocytes+revealed+by+Ca2%2B+spark+characteristics%3A+direct+evidence+of+functional+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release.</a> Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).</li>
<li>Boheler, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Surface+N-Glycoproteome+Resource+Reveals+Markers%2C+Extracellular+Epitopes%2C+and+Drug+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets.</a> Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).</li>
<li>ScienCell Research Laboratories. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Human+Cardiac+Fibroblasts+%28adult+ventricular%29+Product+Sheet%22">Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf ">https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf </a> (2017).</li>
<li>Lonza Walkersville, Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Endothelial+Cell+Systems+-+Technical+Information+%26+Instructions.%2C%22">Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf ">http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf </a> (2015).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific, Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Immunofluorescence+Method+for+IHC+Detection%22">Immunofluorescence Method for IHC Detection</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html ">https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html </a> (2017).</li>
<li>Murata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preliminary+study+of+osteochondral+regeneration+using+a+scaffold-free+three-dimensional+construct+of+porcine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> J Orthop Surg Res. 10, (2015).</li>
<li>Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+3D+printing+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering.</a> Biomed Mater. 10, 034002(2015).</li>
<li>Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-write+Bioprinting+Three-Dimensional+Biohybrid+Systems+for+Future+Regenerative+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res.+Part+B%2C+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies.</a> J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).</li>
<li>Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+in+cardiovascular+tissue+engineering%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+J+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review.</a> International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ważne jest, aby do biodruku 3D używać bijących, funkcjonalnych sferoidów. Jeśli sferoidy nie biją, dalsze ich używanie niezmiennie spowoduje powstanie niefunkcjonalnej biodrukowanej łatki 3D.
Jedną z zalet tego podejścia jest możliwość manipulowania zawartością komórek w plastrze poprzez zmianę całkowitej liczby komórek i procentu kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów w sferoidach. Pozwala to na drukowanie wielu różnych rodzajów plastrów na serce, o różnych właściwościach histologi...

Istnieje wiele różnych metod biodruku 3D1,2,3. 3D bioprinting jest często klasyfikowany według technologii druku1, z przykładami takimi jak bioprinting atramentowy, bioprinting mikroekstruzyjny, bioprinting wspomagany laserowo, kombinacja metod lub nowsze approaches. 3D bioprinting można również zaklasyfikować do metod wolnych od rusztowań lub zależnych od rusztowań4. Większość metod biodruku 3D jest zależna od rusztowań, gdzie istnieje zapotrzebowanie na biomateriały, np. bioinks5 lub scaffolds6. Jednak biodruk 3D zależny od rusztowania napotyka wiele problemów i ograniczeń4,7, takich jak immunogenność materiału rusztowania, koszt zastrzeżonych biotuszy, niska prędkość i toksyczność produktów degradacji.
Podjęto próbę inżynierii tkanek serca bez rusztowań przy użyciu sferoidów8, z potencjałem do przezwyciężenia tych wad inżynierii tkankowej zależnej od rusztowań. Jednak, jak przyznali autorzy w tym artykule, trudno było solidnie obsługiwać i umieszczać sferoidy w stałych miejscach w procesie biofabrykacji. Jednoczesne zastosowanie biodruku 3D i inżynierii tkankowej opartej na sferoidach ma potencjał, aby przezwyciężyć te trudności. W tym protokole opisujemy biodruk 3D tkanki serca bez innych biomateriałów, przy użyciu wyłącznie komórek w postaci sferoid.
Biodrukarki 3D bez rusztowań sferoidalne9 mają możliwość podnoszenia pojedynczych sferoid za pomocą ssania próżniowego i umieszczania ich na układzie igieł. Koncepcja pozycjonowania sferoid na tablicy igieł w biodruku 3D jest inspirowana zastosowaniem układów igieł (znanych jako "kenzan") w starożytnej japońskiej sztuce układania kwiatów, ikebanie. System ten pozwala na precyzyjne ustawienie sferoid w dowolnej konfiguracji i powoduje, że poszczególne sferoidy łączą się ze sobą w krótkim czasie, tworząc biodrukowaną tkankę 3D. Metoda ta pozwala zatem na łatwe manipulowanie sferoidami, co może mieć potencjalne implikacje dla przyszłości biofabrykacji narządów bez rusztowań.

<table><tbody><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>A1413202</tr><tr><td>Trypsyna/EDTA 0,05%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>zdefiniowany inhibitor trypsyny 0,0125%</td><td>Thermo Fisher</td><td>R007100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Pożywka komórkowa</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>RPMI uzupełniony witaminą B27 stanowi pożywkę hodowlaną HIPSC-CM</td></tr><tr><td>Suplement B-27</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td>RPMI uzupełniony o B27 stanowi HIPSC-CM pożywka</td></tr><tr><td>hodowlana Countess Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie fibroblasty serca (typ komorowy dla dorosłych)</td><td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSurface ultra-low attachment 96-dołkowe płyty dolne w kształcie litery U&nbsp;</td><td>Akita Sumitomo Bakelit Co.</td><td>MS-9096UZ</td><td></td></tr><tr><td>Regenova Bio Drukarka 3D</td><td>Cyfuse Biomedical Kk</td><td>Nie dotyczy</td><td>www.cyfusebio.com/en/</td></tr> <tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało Troponiny T</td><td>Thermo Fisher</td><td>701620</td><td></td></tr><tr><td>Connexin 43 (Cx43) Przeciwciało</td><td>Chemicon</td><td>MAB3068</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant z DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36935</td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3d

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

Ten protokół opisuje biodrukowanie 3D tkanki serca bez użycia biomateriałów, przy użyciu tylko komórek. Kardiomiocyty, komórki śródbłonka i fibroblasty są najpierw izolowane, liczone i mieszane w pożądanych proporcjach komórek. Są one hodowane wspólnie w indywidualnych studzienkach na 96-dołkowych płytkach o bardzo niskim przyłączeniu. W ciągu 3 dni tworzą się bijące sferoidy. Te sferoidy są następnie zbierane przez dyszę za pomocą ssania próżniowego i montowane na matrycy igieł za pomocą biodrukarki 3D. Sferoidy są następnie pozostawione do stopienia na układzie igieł. Trzy dni po biodruku 3D sferoidy są usuwane jako nienaruszona plama, która już spontanicznie bije. Biodrukowane w 3D plastry serca wykazują mechaniczną integrację sferoid składowych i są bardzo obiecujące w regeneracji tkanki serca oraz jako modele 3D chorób serca.

Pod koniec kroku 4.4 (kokultura), komórki w każdej studzience powinny zagregować się na dnie płytek 96-dołkowych z dnem w kształcie litery U o ultra-niskiej adhezji, tworząc pod wpływem grawitacji sferoidy. Sferoidy te zawierają hiPSC-CM, HCFs oraz HUVECs i mogą być oglądane pod mikroskopem świetlnym, gdzie w projekcji dwuwymiarowej powinny mieć kształt okrągły (Rysunek 1). Pod koniec kroku 6.3, biodrukowany w 3D łatka serca powinna zawierać pustki tkankowe, ...

Ten protokół opisuje biodrukowanie 3D tkanki serca bez użycia biomaterials. 3D biodrukowane plastry serca wykazują mechaniczną integrację sferoid składowych i są bardzo obiecujące w regeneracji tkanki serca oraz jako modele 3D chorób serca.

Tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Celem niniejszego filmu jest zademonstrowanie biodruku 3D tkanki serca bez użycia biomateriałów, wyłącznie z wykorzystaniem komórek. W pierwszej kolejności kardiomiocyty, komórki śródbłonka i fibroblasty są izolowane, liczone i mieszane w pożądanych proporcjach komórkowych. Następnie są one rozdzielane za pomocą pipety wielokanałowej do poszczególnych studni płytek 96-dołkowych o ultra niskim przywieraniu.Komórki w płytkach 96-dołkowych są inkubowane przez trzy dni, po których tworzą sferoidy wykazujące spontaniczne skurcze. Mikroskopia konfokalna ujawnia ekspresję koneksyn 43, które są znakowane fluorescencyjnie na zielono w kardiomiocytach pozytywnych pod kątem troponiny T, znakowanych fluorescencyjnie na kolor dalekiej czerwieni w obrębie sferoidów. Płytki 96-dołkowe zawierające sferoidy są następnie umieszczane w biodrukarce 3D.Drukarka 3D do biodruku rozpoczyna od przeniesienia płytki 96-dołkowej w miejsce bezpośrednio obok matrycy igieł za pomocą ruchomej platformy. Następnie drukarka 3D do biodruku analizuje wszystkie sferoidy w płytce 96-dołkowej, aby uzyskać istotne dane dotyczące każdego sferoidu, takie jak jego średnica i kształt. Jest to widok z bliska procesu biodruku 3D.Sferoid jest pobierany z płytki 96-dołkowej po lewej stronie za pomocą dyszy z wykorzystaniem ssania próżniowego i umieszczany w określonym miejscu w matrycy igieł po prawej stronie. Proces ten jest powtarzany aż do zakończenia procesu biodruku 3D. Po wydrukowaniu wszystkich sferoidów z płytki 96-dołkowej, biodrukarka 3D odłoży aktualną płytkę 96-dołkową i za pomocą ruchomej platformy załaduje nową płytkę.Jest to film w przyspieszeniu (timelapse) przedstawiający widok z góry na biodruk 3D łaty o wymiarach dziewięć na dziewięć z prędkością 100-krotną; igły w macierzy igieł są rozmieszczone w formacji grupowej, a sferoidy są załadowywane na każdą igłę od góry. Po trzech dniach w warunkach sterylnych, biodrukowana 3D łata sercowa jest bardzo ostrożnie usuwana z macierzy igieł poprzez delikatne przesunięcie w górę kawałka twardego plastiku znajdującego się w macierzy igieł pod łatą. W tym kroku, w razie potrzeby, można zastosować smarowanie igieł roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby ułatwić i wygładzić proces usuwania.Biodrukowany w 3D płat sercowy jest bardzo delikatny bezpośrednio po zdjęciu z macierzy igieł, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby go nie uszkodzić. Następnie biodrukowany w 3D płat sercowy przenosi się do 35 milimetrowej szalki hodowlanej zawierającej odpowiednią pożywkę komórkową. Bezpośrednio po zdjęciu z macierzy igieł zauważa się, że płat już pulsuje, a otwory po igłach zmieniają swoją wielkość przy każdym skurczu.Łatka sercowa wydrukowana w technologii 3D bioprinting poddawana jest dojrzewaniu, podczas którego pustki tkankowe powstałe w wyniku zastosowania matrycy igieł są wypełniane przez tkankę otaczającą. Łatka sercowa wydrukowana w technologii 3D bioprinting nadal spontanicznie bije. Podsumowując, możliwe jest wydrukowanie tkanki serca w technologii 3D bioprinting bez użycia biomateriałów.Biodrukowane w technologii 3D łaty sercowe wykazują mechaniczną integrację sferoidów składowych. Biodrukowanie 3D tkanki serca ma obiecujące zastosowania kliniczne w regeneracji tkanki serca, umożliwia tworzenie trójwymiarowych modeli tkanki serca, replikację w predykcyjnej farmakologii i toksykologii oraz opracowywanie terapii skierowanych na komórki i genom.

creation-cardiac-tissue-exhibiting-mechanical-integration-spheroids

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Dostarczamy uogólniony protokół oparty na strategii mikroprzepływowego biodruku do inżynierii mikrowłóknistego łożyska naczyniowego, gdzie wtórny typ komórek może być dalej umieszczany w przestrzeni śródmiąższowej tej mikrofibrowej struktury w celu wytworzenia unaczynionych tkanek i organoidów.

Bioprinting mikroprzepływowy do inżynierii unaczynionych tkanek i organoidów

Ten protokół opisuje metodę opartą na pleśni sieciowej do tworzenia trójwymiarowych, wolnych od rusztowań tkanek serca o zadowalającej integralności strukturalnej i synchronicznym zachowaniu bicia.

Oparta na formie metoda trójwymiarowego tworzenia tkanki serca bez rusztowań

Ten protokół ma na celu przeszczepienie biodrukowanej łatki 3D na nasierdzie myszy z zawałem, modelując niewydolność serca. Zawiera szczegóły dotyczące znieczulenia, chirurgicznego otwarcia klatki piersiowej, trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej (LAD) i nałożenia biodrukowanego plastra na obszar serca po zawale.

Przeszczep biodrukowanego plastra 3D w mysim modelu zawału mięśnia sercowego

Tutaj opisujemy łatwą w użyciu metodologię generowania 3D samodzielnie składających się układów mikrotkanek serca składających się z wcześniej zróżnicowanych, indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, fibroblastów serca i komórek śródbłonka. Ta przyjazna dla użytkownika i wymagająca niewielkiej liczby komórek technika generowania mikrotkanek serca może zostać wdrożona do modelowania chorób i wczesnych etapów opracowywania leków.

Wytwarzanie matryc mikrotkanek serca 3D przy użyciu ludzkich kardiomiocytów pochodzących z iPSC, fibroblastów serca i komórek śródbłonka

Ten protokół ma na celu wytworzenie sferoid 3D serca (CS) poprzez kokulturację komórek w wiszących kroplach. CS z kolagenem są leczone doksorubicyną (DOX, środek kardiotoksyczny) w stężeniach fizjologicznych w celu modelowania niewydolności serca. Badania in vitro z wykorzystaniem CS poddanych działaniu DOX mogą być wykorzystane do identyfikacji nowych terapii dla pacjentów z niewydolnością serca.

Sferoidy serca jako bioinżynieryjne tkanki serca in vitro do badania patofizjologii ludzkiego serca

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Tutaj opisujemy produkcję na dużą skalę sferoidów zrębu/komórek macierzystych (ASC) pochodzących z tkanki tłuszczowej przy użyciu automatycznego systemu pipetowania do zasiewania zawiesiny komórkowej, zapewniając w ten sposób jednorodność wielkości i kształtu sferoidy. Te sferoidy ASC mogą być używane jako elementy budulcowe dla podejść do biodruku 3D.

Wielkoskalowa, zautomatyzowana produkcja sferoid komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do biodruku 3D

Prezentowany tutaj jest zestaw protokołów do generowania i kriokonserwacji sferoid serca (CS) z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych, hodowanych w wysokoprzepustowym, wielowymiarowym formacie. Ten trójwymiarowy model funkcjonuje jako solidna platforma do modelowania chorób, wysokoprzepustowych badań przesiewowych i zachowuje swoją funkcjonalność po krioprezerwacji.

Generowanie, wysokoprzepustowe badania przesiewowe i biobankowanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych sferoid serca pochodzących z komórek macierzystych

Trójwymiarowe tkanki serca bioinżynieryjne wykorzystujące kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych okazały się obiecującymi modelami do badania zdrowego i chorego ludzkiego mięśnia sercowego in vitro, jednocześnie podsumowując kluczowe aspekty rodzimej niszy sercowej. Manuskrypt ten opisuje protokół wytwarzania i analizy zmodyfikowanych tkanek serca o wysokiej zawartości wygenerowanych z ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych.

Projektowanie bioreaktora w celu usprawnienia pozyskiwania danych i modelowania przepustowości zmodyfikowanych tkanek serca

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

Poznaj metodę biodruku 3D tkanki serca bez biomateriałów, wykorzystującą sferoidy komórkowe. Technika ta umożliwia tworzenie funkcjonalnych łatek kardiologicznych z potencjałem regeneracyjnym.

Tworzenie tkanki serca wykazującej mechaniczną integrację sferoid za pomocą biodruku 3D

Przeglądaj więcej filmów