Szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny
28 marca 2017
Tutaj prezentujemy protokół do szybkich analiz włókien mięśniowych, który pozwala na poprawę jakości barwienia, a tym samym na automatyczne pozyskiwanie i kwantyfikację populacji włókien za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania ImageJ.
Ogólnym celem tej metody jest szybkie i niezawodne przeprowadzenie ilościowej analizy włókien mięśniowych w całych mięśniach szczura w sposób automatyczny i niezależny od użytkownika, z wykorzystaniem platformy open-source. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nerwowo-mięśniowej dotyczące defektów związanych ze starzeniem się, chorobami lub urazami mięśni szkieletowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość niezawodnej analizy populacji włókien mięśniowych oraz generowania wysokiej jakości obrazów przekrojów poprzecznych mięśni.
Po całkowitym rozmrożeniu ostrożnie wypłucz preparaty w PBS z dodatkiem Triton X (PBST), wykonując jedno dziesięciominutowe i jedno pięciominutowe płukanie. Po drugim płukaniu pozostaw skrawki do wyschnięcia na powietrzu przez dwie minuty. Następnie, za pomocą pisaka hydrofobowego, obrysuj poszczególne przekroje.
Po kolejnych 15 minutach suszenia powietrzem, zablokuj niespecyficzne wiązania za pomocą PBST uzupełnionego surowicą kozią przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj preparaty i dodaj do każdej próbki odpowiedni koktajl przeciwciał pierwszorzędowych, inkubując przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, z osłoną przed światłem. Po zakończeniu inkubacji wypłucz preparaty, wykonując jedno 10-minutowe i jedno 5-minutowe płukanie w PBST.
Następnie inkubuj przekroje mięśni z odpowiednim koktajlem przeciwciał wtórnych przez jedną godzinę, chroniąc je przed światłem. Po dwukrotnym przemyciu preparatów w PBST, zgodnie z instrukcją, osusz je, a następnie zabarw jądra komórkowe za pomocą zestawu do barwienia DAPI zgodnie z instrukcją producenta. Nadmiar DAPI usuń poprzez jednominutowe płukanie w PBST, a następnie krótko wysusz preparaty na powietrzu.
Następnie próbki należy przykryć fluorescencyjnym medium montującym oraz szkiełkami nakrywkowymi, a preparaty przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza, chroniąc je przed światłem. W ciągu 24 do 48 godzin od barwienia należy włożyć preparaty do skanera slajdów i otworzyć nowy projekt w oprogramowaniu urządzenia. W celu wykonania podglądu preparatu należy wybrać kanał DAPI oraz obiektyw 2,5x, a następnie ręcznie ustawić ostrość na pierwszej próbce.
Wyznacz każdy przekrój poprzeczny, który powinien zostać uwzględniony w szczegółowym procesie akwizycji, i ustaw czasy ekspozycji dla każdego kanału. Następnie uruchom automatyczną akwizycję obrazów, sprawdzając poprawność pozyskania pierwszego pola widzenia, aby zapobiec błędnej akwizycji na wczesnym etapie procesu zautomatyzowanego. Po zakończeniu akwizycji obrazów ręcznie sprawdź, czy autofokus przekrojów poprzecznych jest prawidłowy oraz czy poszczególne włókna są wyraźnie rozróżnialne.
Kluczowe jest, aby autofokus był sprawdzany i w razie potrzeby korygowany ręcznie dla każdego obrazu. Zautomatyzowany proces ilościowego oznaczania włókien mięśniowych wymaga obrazów wysokiej jakości w celu uzyskania optymalnych wyników. Następnie, dla każdego przekroju poprzecznego, który ma zostać uwzględniony w analizach końcowych, należy wyeksportować każdy kanał poza DAPI osobno jako pliki JPEG, a następnie nazwać i posortować pliki do odpowiednio nazwanych folderów zgodnie z naświetlonymi kanałami.
Przed rozpoczęciem procesu ilościowego wyznaczania włókien mięśniowych należy przejrzeć każdy obraz w odpowiednim programie do edycji grafiki, aby potwierdzić wystarczający kontrast między barwionymi włóknami a tłem. Następnie w programie ImageJ należy użyć polecenia Plugins>Macros>Edit, aby wyświetlić kod źródłowy makra, a następnie zmienić katalog folderu dla każdego kanału w kodzie źródłowym makra. Teraz należy użyć polecenia Run, aby uruchomić makro.
Wszystkie obrazy z folderu zostaną wczytane do makra i poddane kwantyfikacji w kolejności następującej. Po zakończeniu kwantyfikacji wyeksportuj wyniki do odpowiedniego arkusza kalkulacyjnego i określ wartości dla dodatnio policzonych włókien wolnokurczliwych, pośrednich oraz szybkokurczliwych. Następnie można obliczyć całkowitą liczbę włókien.
Barwienie immunofluorescencyjne włókien mięśniowych jest szybkie i charakteryzuje się niewielką reaktywnością krzyżową, a uzyskane obrazy wykazują wysoki kontrast między barwionymi włóknami a otaczającą tkanką, a także wyraźne rozróżnienie między różnymi typami włókien. Analiza automatyczna pozwala na wykrycie względnych populacji włókien mięśniowych z dokładnością plus lub minus 4% w porównaniu z analizą manualną, przy czym całkowite wartości bezwzględne są wyższe w porównaniu z analizą manualną. Wartości względne pozostają jednak podobne, w zakresie plus lub minus 4%.
Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać tę metodę do automatyzacji ilościowego oznaczenia włókien mięśniowych. Należy pamiętać, że praca z DAPI może być niebezpieczna. Dlatego podczas wykonywania barwienia należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szybki, wiarygodny i powtarzalny protokół automatycznej kwantyfikacji populacji włókien mięśniowych w pełnych przekrojach poprzecznych mięśni szkieletowych szczura. Wykorzystując barwienie immunohistochemiczne izoform ciężkich łańcuchów miozyny oraz zautomatyzowaną analizę obrazu programem ImageJ, metoda ta umożliwia wysokoprzepustową, niezależną od operatora ocenę włókien mięśniowych wolnych, pośrednich i szybkich, znacząco redukując czas analizy oraz zmienność między użytkownikami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia mięśni
- Histologia
- Immunohistochemia
- Analiza obrazu
Wstęp
- Skład włókien mięśniowych ulega zmianom pod wpływem chorób, urazów oraz procesów starzenia.
- Tradycyjne metody typowania włókien są czasochłonne i pracochłonne.
- Barwienie immunohistochemiczne izoform ciężkiego łańcucha miozyny pozwala na identyfikację wielu typów włókien w jednym przekroju.
- Zautomatyzowana analiza obrazu może zwiększyć powtarzalność i efektywność ilościowego oznaczania populacji włókien mięśniowych.
Cel badania
- Opracowanie i zaprezentowanie szybkiego i niezawodnego protokołu ilościowego oznaczania włókien mięśniowych.
- Umożliwienie automatycznej, niezależnej od użytkownika analizy przekrojów poprzecznych całych mięśni.
- Skrócenie czasu analizy oraz zmniejszenie zmienności między użytkownikami przy użyciu narzędzi open-source.
Zastosowane metody
- Przygotowanie i krojenie zatopionych w parafinie próbek mięśni szkieletowych.
- Barwienie immunofluorescencyjne z wykorzystaniem przeciwciał pierwszorzędowych specyficznych dla ciężkich łańcuchów miozyny, fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych oraz DAPI do barwienia jąder komórkowych.
- Zautomatyzowane skanowanie całych przekrojów poprzecznych za pomocą skanera do preparatów w celu uzyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości.
- Zautomatyzowana kwantyfikacja populacji włókien przy użyciu dedykowanego makra w programie ImageJ, a następnie eksport i analiza danych.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na uzyskanie wysokokontrastowych, wysokiej jakości obrazów z wyraźnym rozróżnieniem między typami włókien.
- Zautomatyzowana analiza wykrywa względne populacje włókien mięśniowych z dokładnością ±4% w porównaniu z analizą manualną.
- Bezwzględna liczba włókien jest wyższa przy analizie zautomatyzowanej, jednak proporcje względne pozostają spójne.
- Metoda ta znacząco skraca czas analizy i zmniejsza zmienność między użytkownikami.
Wnioski
- Niniejszy protokół umożliwia szybką, powtarzalną i dokładną kwantyfikację typów włókien mięśniowych w przekrojach całego mięśnia.
- Zautomatyzowana analiza z wykorzystaniem oprogramowania ImageJ jest skuteczna w badaniach na dużą skalę i minimalizuje błąd subiektywny badacza.
- Metoda ta jest odpowiednia do badania zmian w składzie mięśni wynikających z chorób, urazów lub starzenia się organizmu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zautomatyzowana kwantyfikacja populacji włókien mięśniowych z wykorzystaniem immunohistochemii ciężkiego łańcucha miozyny odpowiada na zapotrzebowanie na powtarzalne, wysokoprzepustowe fenotypowanie tkanek w badaniach przedklinicznych. Niniejszy protokół redukuje zmienność między użytkownikami i przyspiesza generowanie danych, wspierając rzetelną walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków w obszarze neuromuscular i musculoskeletal. Podejście to umożliwia skalowalną, ilościową ocenę przebudowy tkanek w odpowiedzi na chorobę, uraz lub interwencję terapeutyczną, zwiększając pewność prognostyczną w kluczowych punktach zwrotnych procesu odkrywania leków.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia ilościową analizę składu włókien mięśniowych w celu wyjaśnienia mechanizmów chorobowych i hipotez terapeutycznych.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez rozróżnienie populacji włókien wolnokurczliwych, pośrednich i szybkokurczliwych w pełnych przekrojach tkanek.
- Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną dzięki ustandaryzowanym, zautomatyzowanym przepływom pracy analitycznej.
- Ułatwia selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczanie powtarzalnych, ilościowych danych z fenotypowania tkanek.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane skrawki tkanek do późniejszego przesiewania związków kandydackich lub interwencji.
- Standaryzuje wyniki analizy dzięki zautomatykowanej, niezależnej od użytkownika kwantyfikacji z wykorzystaniem makr ImageJ z otwartym kodem źródłowym.
- Umożliwia powtarzalne obrazowanie o wysokim kontraście oraz rozróżnianie typów włókien w celu wiarygodnej oceny związków.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w wielu badaniach i przez różne zespoły badawcze.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie fenotypowania na poziomie tkanki do punktów końcowych istotnych dla choroby w celu opracowania translacyjnych biomarkerów.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkrywania po walidację przedkliniczną dzięki umożliwieniu spójnych, ilościowych odczytów.
- Minimalizuje ryzyko przy podejmowaniu decyzji o dalszym rozwoju poprzez dostarczenie solidnych, porównywalnych między badaniami danych na temat przebudowy mięśni.
- Zwiększa wartość prognostyczną w zakresie skuteczności terapeutycznej w modelach chorób, urazów lub starzenia.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół integruje kontinuum odkryć – od wczesnych badań mechanistycznych, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po walidację przedkliniczną – zapewniając wielokrotnego użytku platformę do fenotypowania tkanek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kwantyfikację zmian typów włókien w odpowiedzi na zmienne eksperymentalne.
- Przesiewanie: Dostarcza zestandaryzowane, powtarzalne wyniki analiz do oceny związków chemicznych lub interwencji.
- Analityka: Zapewnia ilościowe dane o populacjach włókien, gotowe do wprowadzenia do arkusza kalkulacyjnego, co umożliwia porównania statystyczne między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Wspiera strategie biomarkerowe poprzez powiązanie zmian w składzie tkanki z przebiegiem choroby lub odpowiedzią terapeutyczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Ustanawia skalowalny, otwartoźródłowy przepływ pracy, który można dostosować do różnych programów badawczych i systemów modelowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach na poziomie tkanki.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i automatyzuje kwantyfikację, minimalizując błąd użytkownika oraz nakład pracy ręcznej.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepiej uzasadnionych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywne zarządzanie portfelem kapitałowym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów w obszarze układu nerwowo-mięśniowego i mięśniowo-szkieletowego.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w zakresie immunohistochemii oraz cyfrowej analizy obrazu.
- Wymaga dostępu do skanera preparatów oraz otwartoźródłowego oprogramowania ImageJ.
- Wymaga standaryzacji protokołów barwienia, obrazowania i analizy pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji w różnych modelach mięśniowych, lecz zależy od specyficzności przeciwciał i jakości obrazowania.
- Ręczna kontrola jakości akwizycji obrazów pozostaje kluczowa dla optymalnej analizy zautomatyzowanej.
