Name: Szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Poznaj szybką, zautomatyzowaną metodę analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny i ImageJ.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie było wspierane przez Christian Doppler Research Foundation. Chcielibyśmy podziękować Sabine Rauscher z Core Facility Imaging na Uniwersytecie Medycznym w Wiedniu w Austrii za wsparcie przez cały czas trwania projektu. Przeciwciała pierwszorzędowe zostały opracowane przez Schiaffino, S., uzyskane z Banku Hybrydomy Badań Rozwojowych, utworzonego przez NICHD NIH i utrzymywanego na Uniwersytecie Iowa, Wydział Biologii, Iowa City, IA.

Wszystkie zabiegi z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi zgodnie z zaleceniami FELASA26. Przed badaniem uzyskano zgodę instytucjonalnej komisji rewizyjnej Uniwersytetu Medycznego w Wiedniu oraz austriackiego Ministerstwa Badań i Nauki (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, numer referencyjny: BMWF-66.009/0222-WF/II/3b/2014).
1. Żniwo mięśni
UWAGA: Poprzednia publikacja Meng et al.Dostępny jest 27 opisujący bardzo szczegółowo prawidłowe zamrażanie próbek mięśni.
<ol>
	<li>Uzyskać całe mięśnie lub tkankę wystarczającą do uzyskania całych przekrojów poprzecznych natychmiast po eutanazji zwierząt.
	<ol>
		<li>Usuń cały mięsień od znieczulonego lub uśpionego szczura. Usuń całą tkankę łączną i ścięgna otaczające mięsień za pomocą kleszczy i nożyczek. W przypadku znieczulenia lub eutanazji należy postępować zgodnie z międzynarodowymi wytycznymi FELASA28.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zważ mięśnie za pomocą skalibrowanej wagi precyzyjnej. Ten szybki krok pozwala na analizę porównawczą między próbkami mięśni, zwłaszcza po zabiegach interwencyjnych.</li>
	<li>Umieść mięsień w naczyniu wypełnionym w całości związkiem O.C.T., zgodnie z wielkością mięśnia z marginesem bezpieczeństwa około 1 mm ze wszystkich stron (np. wykonanym z folii aluminiowej).</li>
	<li>Zamrozić go w około 2 minutach wstępnie schłodzonego izopentanu przy użyciu ciekłego azotu. Na dnie pojemnika muszą zacząć pojawiać się białe kryształy. 
	UWAGA: Ten krok jest niezbędny do zachowania prawidłowej architektury mięśnia, a tym samym umożliwia prawidłowe barwienie i analizę włókien27.</li>
	<li>Próbki zakonserwowane w O.C.T. przechowywać przez co najmniej 24 godziny w temperaturze -80 °C. Próbki mogą być jednak przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy, a nawet lat, jeśli są prawidłowo schłodzone.</li>
	<li>Wyciąć 10 μm przekrojów poprzecznych ze środkowej części mięśnia w temperaturze -20 °C za pomocą kriotomii. Jeśli cięcie z prędkością 10 μm nie jest możliwe, należy zwiększyć grubość w krokach co 2 μm do maksymalnie 20 μm. Na tym etapie niezbędne są wystarczająco ostre ostrza tnące.</li>
	<li>Zastosuj sekcje do szkiełek samoprzylepnych, aproksymując szkiełka do przekrojów poprzecznych. Przekroje automatycznie przykleją się do szkiełek samoprzylepnych. Szkiełka należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez noc przed barwieniem.</li>
</ol>
2. Barwienie
UWAGA: Dostępna jest duża liczba przeciwciał przeciwko białkom łańcucha ciężkiego miozyny, jednak wysokiej jakości przeciwciała są niezbędne do automatycznego pozyskiwania i analizy. Rozcieńczenia i odniesienie do przeciwciał znajdują się w Tabeli 1. Aby uzyskać plik arkusza kalkulacyjnego do obliczenia prawidłowych rozcieńczeń i sprawdzenia liczby wymaganych ilości roztworu, zobacz <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Plik uzupełniający 1</a>.
<ol>
	<li>Rozmrozić i wysuszyć zamrożone sekcje mięśni na powietrzu przez 10 minut przed zabiegiem barwienia.</li>
	<li>Preparaty należy dokładnie myć roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) + 0,05% Triton X przez 10 minut, a następnie przez 5 minut. Wykazano, że Triton znacznie poprawia jakość barwienia. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.</li>
	<li>Pozostaw sekcje do wyschnięcia na powietrzu przez 2 minuty i obrysuj poszczególne przekroje na każdym szkiełku za pomocą pisaka hydrofobowego (aby zminimalizować wymaganą ilość przeciwciała) i pozwól na dodatkowe suszenie przez 15 minut.</li>
	<li>Zablokuj wszystkie preparaty PBS + 0,05% Triton X (PBST) zawierającym 10% koziej surowicy przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć wszystkie przeciwciała pierwszorzędowe (Tabela 1) w koktajlu PBS + 0,05% Triton X (PBST) zawierającym 10% surowicy koziej. Dokładnie wymieszać przed aplikacją. Triton X jest niezbędny do równomiernego barwienia całych przekrojów. Obliczyć około 30 μl pierwszorzędowego koktajlu przeciwciał na przekrój poprzeczny.</li>
	<li>W przypadku kroków 2.7-2.13 należy zapewnić wystarczającą ochronę przed światłem. Przyciemnione światła w pomieszczeniu i zakryte tace do barwienia zapewniają odpowiednią ochronę. Dodatkowo napełnij tackę do barwienia płynem na dnie, aby zapewnić wilgotne środowisko podczas barwienia i zapobiec wysychaniu.</li>
	<li>Nakładaj koktajle przeciwciał pierwszorzędowych (Tabela 1) na szkiełka przez 1 godzinę w wilgotnej tacy do barwienia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Myć szkiełka preparatem PBS + 0,05% Triton X przez 10 minut, a następnie nowym PBST przez 5 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe w koktajlu PBS + 0,05% Triton X (PBST) + 10% surowicy koziej. Obliczyć 30 μl pierwszorzędowego koktajlu przeciwciał na przekrój poprzeczny.</li>
	<li>Nakładaj wtórny koktajl przeciwciał na szkiełka przez 1 godzinę.</li>
	<li>Myć szkiełka z PBS + 0,05% Triton X (PBST) przez 10 minut, a z nowym PBST przez kolejne 5 minut.</li>
	<li>Zastosuj zestaw do barwienia jądrowego DAPI (najlepiej roztwory do użycia) na 15 minut lub zgodnie z instrukcjami producenta do barwienia jąder komórkowych.</li>
	<li>Preparaty myć krótko preparatem PBS + 0,05% Triton X (PBST) przez 1 minutę. Następnie pozostaw szkiełka do krótkiego wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Nałożyć fluorescencyjne podłoże montażowe i szkiełka nakrywkowe. Przechowywać w temperaturze 4 °C chronić przed światłem i optymalnie wykonać obrazowanie w ciągu 24-48 godzin.</li>
</ol>
3. Mikroskopia
<ol>
	<li>Załaduj slajdy do skanera slajdów. W zależności od skanera slajdów można wykonać maksymalnie 12 slajdów.</li>
	<li>Rozpocznij nowy projekt. Dla podglądu ustaw kanał DAPI i obiektyw 2.5X. Do szczegółowej analizy wykorzystaj kanały DAPI, GFP, FITC i Cy5 oraz obiektyw 20X. Autofokus jest rejestrowany przez cały czas trwania projektu w kanale DAPI.</li>
	<li>Użyj następujących kolorów dla każdego kanału: DAPI -niebieski, FITC: zielony, Texas Red: czerwony, Cy5: żółty.</li>
	<li>Twórz podglądy każdego slajdu za pomocą kanału DAPI. W tym celu należy ręcznie ustawić ostrość na pierwszej próbce i używać jej przez cały czas trwania analizy podglądu, aby uzyskać obrazy podglądu każdej próbki.</li>
	<li>Przedstaw każdy przekrój, który powinien zostać uwzględniony w szczegółowym procesie nabycia. Nie rysuj konturów blisko krawędzi próbki, aby zapewnić podpis całego obszaru zainteresowania.</li>
	<li>Ustaw czasy ekspozycji dla każdego kanału. W większości przypadków parametry ekspozycji różnych kanałów są identyczne dla wszystkich przekrojów.</li>
	<li>Uruchom automatyczne pobieranie obrazu. Sprawdź poprawność akwizycji dla pierwszego pola widoków, aby zapobiec nieprawidłowemu pozyskiwaniu na wczesnym etapie zautomatyzowanego procesu.</li>
	<li>W razie potrzeby nawiąż zdalne sterowanie za pomocą oprogramowania do tworzenia kopii lustrzanych pulpitu. Pozwala to na zdalne monitorowanie procesu akwizycji obrazu poprzez odbicie lustrzane ekranu komputera skanera slajdów na innym komputerze za pośrednictwem dowolnej sieci lub połączenia internetowego. Chociaż nie można wprowadzić żadnych zmian w fizycznej konfiguracji dotyczącej używanych slajdów, wirtualne środowisko oprogramowania do akwizycji obrazu umożliwia monitorowanie prawidłowego czasu ostrości lub ekspozycji obrazów. Ponadto szacowany czas realizacji może być regularnie sprawdzany.</li>
	<li>Po zakończeniu akwizycji obrazu kontroluj poprawny autofokus wszystkich obrazów, ręcznie kontrolując, czy można rozróżnić architekturę światłowodu, poszczególne włókna i różne typy światłowodów.</li>
	<li>Ponowne uzyskanie nieprawidłowo wyostrzonych obszarów obrazu dla pojedynczych pól widzenia lub całych obszarów zainteresowania. W celu ponownego pozyskania pojedynczych obszarów należy oznaczyć obszary lub obrazy w całym projekcie i ponownie uzyskać obszary z ręcznym ustawianiem ostrości. W większości przypadków dodatkowy szczegół obrazu przy innym poziomie ostrości prowadzi do nieprawidłowej ostrości obrazów</li>
	<li>Dla każdego przekroju, który powinien zostać uwzględniony w analizach końcowych, wyeksportuj każdy kanał (z wyłączeniem DAPI) osobno jako pliki jpeg. Nazwij i posortuj pliki zgodnie z uwidocznionymi kanałami w folderach o nazwach Texas Red, FITC i Cy5.</li>
</ol>
4. Automatyczna analiza włókien
UWAGA: Makro można pobrać z następującej strony internetowej: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/
<ol>
	<li>Przed analizą należy wyświetlić podgląd każdego obrazu za pomocą konwencjonalnego oprogramowania do edycji obrazu i sprawdzić, czy kontrast między poplamionymi włóknami a tłem jest wystarczający. W razie potrzeby dostosuj kontrast i jasność, aby zwiększyć różnicę, używając poleceń regulacji jasności i kontrastu.</li>
	<li>Otwórz ImageJ lub Fidżi. Otwórz makro za pomocą polecenia "Wtyczki - Makra - Edycja". Spowoduje to wyświetlenie kodu źródłowego makr i umożliwi szybkie dostosowanie parametrów. W razie potrzeby zmień katalog folderów dla każdego kanału w kodzie źródłowym makra. 
	UWAGA: Wartości do analizy włókien mięśniowych są oparte na bicepsach i mięśniach lędźwiowych szczurów, inne gatunki lub mięśnie mogą wymagać innych wartości.</li>
	<li>Użyj polecenia "uruchom", aby uruchomić makro. Wszystkie obrazy folderu są teraz ładowane do makra i określane ilościowo w kolejnej kolejności. Wyniki zostaną wyświetlone w nowym oknie. Ten krok może potrwać od kilku sekund do kilku godzin, w zależności od ilości analizowanych danych.</li>
	<li>Wyeksportuj okno wyników jako plik arkusza kalkulacyjnego. Zidentyfikuj wartości dla dodatnio zliczonych włókien Cy5 (wolnych), FITC (pośrednich) i Texas Red (szybkich) i zsumuj całkowitą liczbę włókien.</li>
</ol>

<ol><li>Kung, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+Unit+Changes+Seen+With+Skeletal+Muscle+Sarcopenia+in+Oldest+Old+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).</li>
<li>Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+muscle+fiber+clustering+in+the+diaphragm+muscle+of+sarcopenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice.</a> Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).</li>
<li>Claflin, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high-+and+low-velocity+resistance+training+on+the+contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibers+from+young+and+older+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans.</a> J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).</li>
<li>Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+Between+Muscle+Fiber+Type+and+Reactive+Balance%3A+A+Preliminary+Study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mot+Behav%22%5BJournal%5D)">Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study.</a> J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).</li>
<li>Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -X., Yu, J. -G., Stål, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unilateral+Muscle+Overuse+Causes+Bilateral+Changes+in+Muscle+Fiber+Composition+and+Vascular+Supply%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply.</a> PLoS ONE. 9 (12), 116455(2014).</li>
<li>Hopker, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+training+status%2C+age%2C+and+muscle+fiber+type+on+cycling+efficiency+and+endurance+performance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance.</a> J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).</li>
<li>Pette, D., Staron, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+isoforms%2C+muscle+fiber+types%2C+and+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions.</a> Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).</li>
<li>Suga, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+type-predominant+promoter+activity+in+lentiviral-mediated+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse.</a> PLoS One. 6 (3), 16908(2011).</li>
<li>Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+muscle+fiber+type+measurements+with+clinical+and+molecular+genetic+data+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).</li>
<li>Rader, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cleft+palate+repair+on+the+susceptibility+to+contraction-induced+injury+of+single+permeabilized+muscle+fibers+from+congenitally-clefted+goat+palates%5BTitle%5D)+AND+%22Cleft+Palate+Craniofac+J%22%5BJournal%5D)">Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates.</a> Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).</li>
<li>Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+type+II+muscle+fiber+damage+from+plyometric+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22J+Athl+Train%22%5BJournal%5D)">Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise.</a> J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).</li>
<li>Lieber, R. L., Fridén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+significance+of+skeletal+muscle+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical significance of skeletal muscle architecture.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).</li>
<li>Schiaffino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibre+types+in+skeletal+muscle%3A+a+personal+account%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Fibre types in skeletal muscle: a personal account.</a> Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).</li>
<li>Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unloaded+shortening+velocity+and+myosin+heavy+chain+and+alkali+light+chain+isoform+composition+in+rat+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres.</a> J Physiol. 478, Pt 2 341-349 (1994).</li>
<li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+isoforms+in+mammalian+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle.</a> J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).</li>
<li>Larsson, L., Moss, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+velocity+of+shortening+in+relation+to+myosin+isoform+composition+in+single+fibres+from+human+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles.</a> J Physiol. 472, 595-614 (1993).</li>
<li>Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+methods+for+the+analysis+of+skeletal+muscle+fiber+size+and+metabolic+type%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).</li>
<li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).</li>
<li>Lieber, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieber%2C+RL+%22Skeletal+muscle+structure%2C+function%2C+and+plasticity%22">Skeletal muscle structure, function, and plasticity</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD. (2009).</li>
<li>Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+muscle+fiber+typing+by+quantitative+enzyme+assays+and+by+myosin+ATPase+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining.</a> J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).</li>
<li>Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. chrijvers-, Bosman, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+fiber+typing+in+routinely+processed+skeletal+muscle+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies.</a> Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).</li>
<li>Likar, B., Pernuš, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registration+of+serial+transverse+sections+of+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Registration of serial transverse sections of muscle fibers.</a> Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+fiber-type-specific+cross-sectional+area+assessment+and+myonuclei+counting+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle.</a> J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).</li>
<li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat%2C+mouse%2C+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), 35273(2012).</li>
<li>Bergmeister, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+muscle+fiber+type+population+analysis+with+ImageJ+of+whole+rat+muscles+using+rapid+myosin+heavy+chain+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry.</a> Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).</li>
<li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FELASA+guidelines+and+recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">FELASA guidelines and recommendations.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Triage+and+Freezing+for+Models+of+Skeletal+Muscle+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease.</a> J Vis Exp. (89), e51586(2014).</li>
<li>Guillen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FELASA+Guidelines+and+Recommendations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Animal+Sci%22%5BJournal%5D)">FELASA Guidelines and Recommendations.</a> J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).</li>
<li>Ribarič, S., ČebaŠek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Visualization+of+Myosin+Heavy+Chain+Isoforms+in+Single+Muscle+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections.</a> Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu demonstrujemy szeroko dostępną metodologię badania i automatycznego oznaczania ilościowego populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych szczurów za pomocą immunohistochemii w sposób efektywny czasowo. W celu zapewnienia odtwarzalności przedstawiamy szczegółowy opis krok po kroku i potencjalne modyfikacje dla zastosowań u innych gatunków, które nie zostały opisane w tym badaniu. Ponadto omawiamy zalety zabiegu, warunki optymalnego działania i jego ograniczenia.
Obecnie...

Skład mięśni szkieletowych ulega głębokim zmianom podczas procesów fizjologicznych, takich jak starzenie się1,2, exercise3,4,5,6,7, lub procesy patofizjologiczne, takie jak choroba8,9,10 lub trauma11. W związku z tym kilka dziedzin badań koncentruje się na skutkach strukturalnych tych procesów, aby zrozumieć zmiany funkcjonalne. Jednym z kluczowych aspektów decydujących o funkcjonowaniu mięśni jest skład włókien mięśniowych. Włókna mięśniowe wyrażają różne białka ciężkiego łańcucha miozyny (MHC) i dlatego są klasyfikowane jako wolne, pośrednie lub szybkie włókna7,12,13,14,15,16,17. Fizjologicznie mięśnie mają różny skład włókien mięśniowych w zależności od ich funkcji w organizmie. Korzystając z typowania włókien mięśniowych, można określić ilościowo populacje włókien w celu określenia adaptacji do procesów fizjologicznych lub patofizjologicznych7,17. Historycznie rzecz biorąc, w celu rozróżnienia typów włókien mięśniowych zastosowano szereg czasochłonnych metod. W tym celu włókna mięśniowe sklasyfikowano albo na podstawie reaktywności ATPazy miozyny przy różnych poziomach pH, albo aktywności enzymów mięśniowych. Ponieważ nie można było ocenić różnych jakości włókien w jednej sekcji, potrzeba było wielu przekrojów, aby zidentyfikować wszystkie włókna mięśniowe i umożliwić ręczną kwantyfikację14,16,17,18,19,20,21,22. W przeciwieństwie do tego, w ostatnich publikacjach wykorzystano immunohistochemię (IHC) przeciwko białku ciężkiego łańcucha miozyny, aby szybko wybarwić wiele rodzajów włókien w jednym przekroju poprzecznym. Opierając się na zaletach tej procedury, jest ona obecnie uważana za złoty standard w analizie populacji włókien mięśniowych19,23,24. Korzystając z ulepszonych protokołów barwienia IHC, udało nam się niedawno wykazać, że w pełni automatyczne pozyskiwanie przekrojów poprzecznych całych mięśni, a następnie automatyczna kwantyfikacja włókien mięśniowych jest możliwa przy użyciu platformy open source ImageJ. W porównaniu z ręczną kwantyfikacją, nasza procedura zapewniła znaczne skrócenie czasu (około 10% ręcznych analiz) wymaganych na slajd, a jednocześnie była dokładna do ±4%25.
Ogólnym celem tej metody jest opisanie szybkiego, niezawodnego, niezależnego od użytkownika przewodnika do automatycznego oznaczania ilościowego włókien mięśniowych w całych mięśniach szczurów za pomocą platformy open source. Ponadto opisujemy potencjalne modyfikacje, które pozwoliłyby na zastosowanie go do innych okazów, takich jak myszy czy ludzkie mięśnie.

<table><tbody><tr><td>Związek O.C.T</td><td>Tissue-Tek, Sakura, Holandia</td><td></td><td>Do zatapiania tkanki mięśniowej</td></tr><tr><td>Izopentan</td><td></td><td></td><td>do odpowiedniego zamrażania tkanki mięśniowej</td></tr><tr><td>Prowadnice Superfrost Ultra Plus</td><td>Thermo Scientific, Niemcy</td><td>1014356190</td><td>szkiełka samoprzylepne sól fizjologiczna</td></tr><tr><td>buforowana fosforanami&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Scientific, Niemcy</td><td>85112</td><td>Detergent Soluation</td></tr><tr><td>Kozia surowica</td><td>Thermo Scientific, Niemcy</td><td>50197Z</td><td>Kozia surowica</td></tr><tr><td>DAKO Fluorescencyjne medium montażowe</td><td>Dako Dania</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Długopis Dako</td><td>Dania</td><td>S200230-2</td><td></td></tr><tr><td>TissueFAXSi plus</td><td>TissueGnostics, Wiedeń, Austria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primary przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td><td></td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td><td></td><td>Supernatant</td></tr><tr><td>MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA)</td><td></td><td>Przeciwciała supernatant</td></tr><tr><td>drugorzędowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa&nbsp; Fluor&nbsp; 633&nbsp; Kozioł Anty-Mysz IgG2b&nbsp;</td><td>Thermo Scientific, Niemcy</td><td>A-21146</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Koza Anty-Mysz IgG1&nbsp;( &gamma; 1)</td> <td>Thermo Scientific, Niemcy</td><td>A-21121</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (& mikro-łańcuch)</td> <td>Thermo Scientific, Niemcy</td><td>A-21426</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik NucBlue Fixed Cell ReadyProbes</td><td>Thermo Scientific, Niemcy</td><td>R37606</td><td></td></tr></tbody></table>

szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Kwantyfikacja populacji włókien mięśniowych dostarcza głębszego wglądu w skutki chorób, urazów i różnych innych czynników wpływających na skład mięśni szkieletowych. Różne czasochłonne metody są tradycyjnie stosowane do badania populacji włókien w wielu dziedzinach badań. Jednak niedawno opracowane metody immunohistochemiczne oparte na ekspresji białek łańcucha ciężkiego miozyny stanowią szybką alternatywę dla identyfikacji wielu rodzajów włókien w jednym przekroju. W tym miejscu przedstawiamy szybki, niezawodny i powtarzalny protokół poprawiający jakość barwienia, umożliwiający automatyczną akwizycję całych przekrojów i automatyczną kwantyfikację populacji włókien za pomocą ImageJ. W tym celu osadzone mięśnie szkieletowe są cięte w przekrojach, barwione za pomocą przeciwciał przeciwko ciężkim łańcuchom miozyny z drugorzędowymi przeciwciałami fluorescencyjnymi i DAPI do barwienia jąder komórkowych. Całe przekroje poprzeczne są następnie automatycznie skanowane za pomocą skanera do slajdów w celu uzyskania złożonych zdjęć o wysokiej rozdzielczości całej próbki. Następnie przeprowadza się analizy populacji włókien w celu ilościowego określenia wolnych, pośrednich i szybkich włókien przy użyciu zautomatyzowanego makra dla ImageJ. Wcześniej wykazaliśmy, że ta metoda może niezawodnie identyfikować populacje włókien w stopniu ±4%. Ponadto metoda ta znacznie zmniejsza zmienność między użytkownikami i czas analiz przy użyciu platformy open source ImageJ.

Przekroje poprzeczne całych mięśni szczura poddano szybkiemu barwieniu immunohistochemicznemu w celu identyfikacji włókien mięśniowych MHC I, IIA i IIB. Następnie, przy użyciu fluorescencyjnego skanera slajdów mikroskopowych, automatycznie wykonano akwizycję całych przekrojów do zautomatyzowanej analizy włókien mięśniowych w programie ImageJ. Koncepcja procedury opiera się na zapewnieniu prostego, niezawodnego i efektywnego czasowo schematu postępowania w celu ilościowego oznaczenia włóki...

Tutaj prezentujemy protokół do szybkich analiz włókien mięśniowych, który pozwala na poprawę jakości barwienia, a tym samym na automatyczne pozyskiwanie i kwantyfikację populacji włókien za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania ImageJ.

Szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...

Ogólnym celem tej metody jest szybkie i niezawodne przeprowadzenie ilościowej analizy włókien mięśniowych w całych mięśniach szczura w sposób automatyczny i niezależny od użytkownika, z wykorzystaniem platformy open-source. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie nerwowo-mięśniowej dotyczące defektów związanych ze starzeniem się, chorobami lub urazami mięśni szkieletowych. Główną zaletą tej techniki jest możliwość niezawodnej analizy populacji włókien mięśniowych oraz generowania wysokiej jakości obrazów przekrojów poprzecznych mięśni.Po całkowitym rozmrożeniu ostrożnie wypłucz preparaty w PBS z dodatkiem Triton X (PBST), wykonując jedno dziesięciominutowe i jedno pięciominutowe płukanie. Po drugim płukaniu pozostaw skrawki do wyschnięcia na powietrzu przez dwie minuty. Następnie, za pomocą pisaka hydrofobowego, obrysuj poszczególne przekroje.Po kolejnych 15 minutach suszenia powietrzem, zablokuj niespecyficzne wiązania za pomocą PBST uzupełnionego surowicą kozią przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj preparaty i dodaj do każdej próbki odpowiedni koktajl przeciwciał pierwszorzędowych, inkubując przez jedną godzinę w tem

a-rapid-automated-protocol-for-muscle-fiber-population-analysis-rat

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Opisujemy nowatorską technikę eksperymentalną, którą nazywamy Minimalnie Inwazyjnym Osadzaniem Mięśni (MIME), która opiera się na dowodach, że tkanka mięśni szkieletowych zawiera żywotne komórki miogenne, które mogą ułatwić miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy, gdy zostaną wszczepione do mięśnia gospodarza.

Minimalnie inwazyjne osadzanie mięśni (MIME) - nowatorska technika eksperymentalna ułatwiająca miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy

Immunohistochemiczne barwienie izoform łańcucha ciężkiego miozyny stało się najnowocześniejszym dyskryminatorem włókien mięśni szkieletowych typu (tj. typu I, typu IIA, typu IIX, typu IIB). W tym miejscu przedstawiamy protokół barwienia wraz z nowatorskim półautomatycznym algorytmem, który ułatwia szybką ocenę rodzaju włókien i morfologii włókien.

Półautomatyczna analiza morfologii mięśni szkieletowych myszy i składu włókien

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Coraz więcej dowodów wskazuje, że nadmierna infiltracja lipidów wewnątrz mięśni szkieletowych prowadzi do lipotoksyczności i cukrzycy. Tutaj przedstawiamy kompletny protokół, w tym przetwarzanie tkanek, barwienie za pomocą Bodipy, akwizycję obrazu i analizę, w celu ilościowego określenia wielkości, gęstości i subkomórkowego rozkładu kropelek lipidów w sposób specyficzny dla rodzaju włókna.

Analiza zawartości kropelek lipidów w mięśniach szkieletowych pod kątem rodzaju włókien i subkomórek

Protokół pokazuje metodę badania korelacji przestrzennej między zakończeniami presynaptycznymi, receptorami postsynaptycznymi i okołosynaptycznymi komórkami Schwanna w mięśniu brzuchatym łydki szczura przy użyciu immunohistochemii fluorescencyjnej z różnymi biomarkerami, a mianowicie: neurofilamentem 200, pęcherzykowym transporterem acetylocholiny, alfa-bungarotoksyną i S100.

Wizualizacja cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowym szczura

Tutaj prezentujemy protokół do analizy zmian w gęstości mitochondriów i dystrybucji podłużnej za pomocą obrazowania mięśni szkieletowych na żywo przy użyciu mikroskopii konfokalnej do skanowania sieci mitochondrialnej.

Analiza gęstości mitochondrialnej i rozmieszczenia podłużnego we włóknach mięśni szkieletowych żywych szczurów za pomocą mikroskopii konfokalnej

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Miejscowe wstrzyknięcia barwnika mitochondrialnego oznacza końcowe mitochondria komórek Schwanna in vivo do mikroskopii konfokalnej. Ta metoda wykorzystuje dowód koncepcji wykazany w tkance mięśniowej szkieletowej myszy ze zdrową lub chorą tkanką mięśniową, aby zapewnić wysoką rozdzielczość wizualizacji mitochondriów.

Metody in situ ilościowej oceny morfologii mitochondriów w mięśniach i komórkach Schwanna końcowych myszy

Ten protokół opisuje izolację nienaruszonych pojedynczych włókien mięśniowych z utlenianego mięśnia podkolanowego oraz ustanowienie wysoce czystych kultur mioblastów pochodzących z tych włókien. Zoptymalizowana procedura niezawodnie przynosi około 300–500 nienaruszonych miofibryli na jednego mysza, umożliwiając dalszą molekularną i komórkową analizę.

Test izolacji pojedynczych włókien do oceny utleniania zachowania miofibrili

Poznaj szybką, zautomatyzowaną metodę analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny i ImageJ.

Szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny (Wideo) | JoVE Journal

Szybki zautomatyzowany protokół analizy populacji włókien mięśniowych w przekrojach poprzecznych mięśni szczurów przy użyciu immunohistochemii łańcuchów ciężkich miozyny

Przeglądaj więcej filmów